CN117771354A - 一种预防O型口蹄疫的mRNA-LNP疫苗及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请公开一种预防O型口蹄疫的mRNA‑LNP疫苗及其制备方法，属于核酸疫苗技术领域。本申请提供的一种预防O型口蹄疫的mRNA‑LNP疫苗，该疫苗包括mRNA分子和脂质纳米颗粒，mRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。该疫苗经体外豚鼠脾脏淋巴细胞、体内豚鼠实验都验证了该疫苗具有安全性高和免疫保护效果好的优势，为急性恶性传染病疫苗的研制提供设计思路和策略。
Description
技术领域
本申请涉及核酸疫苗技术领域，尤其涉及一种预防O型口蹄疫的mRNA-LNP疫苗及其制备方法。
背景技术
口蹄疫（Foot-and-Mouth Disease，FMD）是由口蹄疫病毒（foot-and-mouthdisease virus，FMDV）引起，可以说是全球最可怕的动物疫病，口蹄疫有7种血清型（A、O、C、Asia1、SAT1、SAT2、SAT3）和多达100种血清亚型，不同血清型没有交叉免疫。O型口蹄疫病毒会引起猪、牛、羊等常规大宗家养动物以及偶蹄类野生动物极易感染的急性热性传染性疾病。造成了严重畜牧业生产损失，动物流产和年幼动物受感染的高死亡率，也往往造成严重的经济损失，对区域贸易造成严重影响，被世界动物卫生组织（World Organization forAnimal Health，OIE）列为法定上报的动物传染病。
长期以来，国内O型口蹄疫的预防和控制主要依赖灭活疫苗，灭活疫苗存在热不稳定，免疫力短，成本高，生产要求苛刻和散毒的风险，与野生菌株重组的风险以及病原体的逆转的可能。灭活疫苗大量使用存在活病毒残留的可能。此外，动物机体在疫苗接种部位有副作用，产生疫苗安全问题和母源性抗体的干扰等。国内外也持续开展O型口蹄疫的灭活疫苗替代研究。口蹄疫多表位合成肽疫苗、重组亚单位疫苗、DNA疫苗也相继进入研究和应用研究，然而就目前出现的新型疫苗仍存在诸多弊端，如多肽疫苗、DNA疫苗存在保护率不高，保护效果不如灭活苗，注射剂量大等问题，仍不能应对可能爆发的疫情风险，对口蹄疫的防治仍迫切需要更加安全的疫苗。因此，O型口蹄疫的防控依然迫切需要更加安全、可靠、新型的疫苗以支撑疫情防控的需要。
发明内容
为了克服上述技术问题，本申请提供一种预防O型口蹄疫病毒mRNA-LNP疫苗。本申请提供的mRNA-LNP疫苗的制备方法在普通实验室条件下就可以制备完成，具有较高的安全性，免疫保护效果良好的优点。
具体包括以下内容：
本申请一方面提供了一种预防O型口蹄疫病毒mRNA-LNP疫苗，包括mRNA分子和脂质纳米颗粒；mRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。
本申请另一方面提供了一种制备预防O型口蹄疫病毒mRNA-LNP疫苗的方法，具体步骤为：在mRNA分子的抗原序列上依次添加T7启动子、5'UTR、Kozak序列、SP序列、噬菌体T4纤维蛋白的三聚体基序Foldon序列、3'UTR、终止序列和PolyAA尾，连接到pTNTR载体上构建质粒模板；质粒模板经线性化、体外转录、加帽酶加帽、纯化获得mRNA分子，mRNA分子经脂质纳米颗粒包裹形成mRNA-LNP疫苗；mRNA分子的抗原序列为O型口蹄疫云南太保毒株VP1（200-213）-VP1（134-161）-VP1（134-161）-3A（21-35）-3D（56-70）。
进一步，SP序列位于如SEQ ID NO .1所示的序列表中第81-173位。
进一步，噬菌体T4纤维蛋白的三聚体基序Foldon序列位于如SEQ ID NO .1所示的序列表中第624-719位。
进一步，纯化是采用氯化锂纯化法。
一种预防O型口蹄疫病毒mRNA-LNP疫苗和/或一种预防O型口蹄疫病毒mRNA-LNP疫苗的制备方法在预防O型口蹄疫病毒上的应用。
有益效果：
1、本申请以O型口蹄疫病毒云南太保毒株（YNTBa）（Genbank NO.KY072818）为抗原序列，确定了VP1蛋白200-213、134-161，3A蛋白21-35，3D蛋白的56-70氨基酸位点。并在抗原序列中添加了polyAA尾，系统地提高其细胞内稳定性和翻译效率，将抗原序列与pTNTR载体连接构建重组质粒，重组质粒经线性化、体外转录获得单链mRNA模板，而后经脂质纳米颗粒包裹，最终得到了可以预防O型口蹄疫的mRNA-LNP疫苗。
2、本申请以CATHAY型（中国型）O型口蹄疫云南太保毒株（YNTBa）为研究对象。选择其VP1（200-213）-VP1（134-161）-VP1（134-161）-3A（21-35）-3D（56-70）为抗原序列开发的一种mRNA-LNP疫苗。
3、本申请制备的mRNA-LNP疫苗可以诱导较强的体液免疫与细胞免疫应答，免疫原性良好，其在不接触病毒的前提下，直接使用抗原序列进行合成，具有疫苗开发制备速度快，可快速实现规模化量产，也可根据病毒的变异切换抗原序列和设计平台，具有快速应对突发疫情，短时间实现疫苗的制备，为紧急情况下口蹄疫疫苗的研制提供了新的研究思路和策略。
4、本申请在制备mRNA-LNP疫苗的过程中，在Kozak序列之后增加人组织纤溶酶原激活序列（SP序列），在3'UTR前加噬菌体T4纤维蛋白的三聚体基序Foldon序列。该方法制备出来的疫苗效价高达2.6、抗原匹配性和免疫保护率高的O型口蹄疫mRNA-LNP疫苗；同时涉及mRNA-LNP疫苗制备的方法和应用。利用该方法制备效价高、抗原匹配性、免疫保护率高和对宿主致病性低的O型口蹄疫mRNA-LNP疫苗，提高了疫苗的生物安全性和免疫应答能力，免疫后可有效刺激机体产生免疫应答，并提供动物免疫保护作用，可用于O型口蹄疫病毒的预防和控制。
附图说明
通过结合附图对本申请示例性实施方式进行更详细的描述，本申请的上述以及其他目的、特征和优势将变得更加明显。
图1为O型口蹄疫mRNA-LNP疫苗设计概图。
图2为mRNA模板质粒单酶切；
图3为mRNA模板质粒体外转录结果。
图4为O型口蹄疫mRNA转染到BHK细胞的免疫荧光图（10um）。
图5为O型口蹄疫mRNA-LNP疫苗透射电镜图（200nm，100000倍放大）；
图6为O型口蹄疫mRNA-LNP疫苗电位图。
图7为mRNA转染豚鼠淋巴细胞的免疫荧光图（50um）。
图8为口蹄疫VP1特异性淋巴细胞增殖分析。
图9为RNA转染豚鼠脾脏淋巴细胞IgG抗体水平；
图10为RNA转染豚鼠脾脏淋巴细胞中和抗体效价。
图11为豚鼠疫苗接种和实验操作时间表。
图12为豚鼠攻毒后存活统计。
图13为豚鼠免疫后血清IgG特异性抗体；
图14为豚鼠免疫后微量血清中和抗体效价。
图15为豚鼠攻毒后脏器的HE染色结果（100μm）。
具体实施方式
下面将参照附图更详细地描述本申请的实施方式。虽然附图中显示了本申请的实施方式，然而应该理解，可以各种形式实现本申请而不应被这里阐述的实施方式所限制。相反，提供这些实施方式是为了使本申请更加透彻和完整，并且能够将本申请的范围完整地传达给本领域的技术人员。
以下实施例中所述O型口蹄疫病毒抗原序列的合成交由江苏耀海生物制药有限公司合成；BHK-21细胞由云南省畜牧兽医科学学院保存。本申请提供的疫苗制备方法具有疫苗制备速度快的特点，可快速实现规模化量产。
中国云南省保山首次从牛的皮肤囊泡中分离出一种新的口蹄疫病毒菌株，命名为云南太保株（YNTBa）。随后，研究人员开始减毒活疫苗的研制以控制中缅边境的口蹄疫疫情。YNTBa在哺乳兔中连续传代400多次，病毒毒力在黄牛中显著降低，但在水牛中仍引起临床症状。通过构建YNTBa减毒株反向遗传学操作平台，使用弱毒ZBatt株3A蛋白嵌合病毒进行研究，发现3A蛋白的改变引起了FMD病毒的复制及感染性，该研究发现了减毒关键基因位点。随后，开展了云南O型疫苗毒株的减毒分子种毒构建，进行分子种毒疫苗生产试验。
实施例1 mRNA-LNP疫苗的制备
mRNA-LNP疫苗无需进行病毒培养和扩增、缺失等，较经典灭活苗疫苗更安全、操作更简单、无需严苛的生产条件，不存在散毒的风险，且具有生产研发周期短，安全性高，可进行批量化生产。此外，其自身缺乏质粒骨架、病毒促进子等序列，不具有基因组整合、细胞转化的潜力，不存在诸如DNA疫苗可能诱发的插入突变和感染的风险，无需穿过核屏障即可抗原蛋白的表达。通过修饰和脂质纳米颗粒等载体递送方法可提高mRNA在体内的半衰期，有效实现体内的递送。同时，mRNA允许重复给药，可编码多个感兴趣的较大基因，低剂量的mRNA仍然会导致更高和更持久的蛋白表达，减少了使用剂量，使其成为具有预防和治疗的效果。mRNA-LNP疫苗的研究已经深入到包括寨卡病毒，艾滋病毒，埃博拉病毒，狂犬病等在内的重大传染病和黑色素瘤、脑癌、非小细胞肺癌、卵巢癌、前列腺癌、乳腺癌、血液和消化系统等癌症的临床研究。基于口蹄疫疫苗的迫切需求本研究以O型口蹄疫云南太保毒株（YNTBa）为研究对象进行抗原序列筛选和设计，该疫苗具有普通实验条件可迅速制备的特点为应对可能暴发的突发急性恶性动物传染病疫情防控提供可借鉴的新思路和方法，较短时间内实现疫苗研制和易感动物的接种。
1.1 预防O型口蹄疫的mRNA-LNP疫苗的设计
RNA疫苗效力的发挥最关键的是进行抗原靶点的选择，以及从序列设计到表达一系列的环节，包含了T7启动子、5'UTR、Kozak序列、3'UTR的选择，加帽和加尾。根据口蹄疫免疫反应相对应的抗原位点主要集中于VP1的G-H环路上的保守精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸（Arg-Gly-Asp RGD）基序可被宿主识别（氨基酸残基130-160、141-160、200-2013位点）在FMDV感染中具有诱导中和抗体，介导细胞和体液免疫、诱导宿主细胞凋亡、促进FMDV复制等重要作用。FMDV 3A在病毒复制、区分宿主感染范围和毒性方面起着至关重要的作用。3D蛋白是RNA依赖的RNA聚合酶，是潜在的细胞免疫和体液免疫刺激剂，能促进动物机体免疫反应。本申请提供了VP1蛋白200-213、134-161，3A蛋白21-35，3D蛋白的56-70氨基酸位点。
O型FMDV毒株 Genbank（NO.KY072818）序列信息，5'UTR的序列为：GAATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACC；3'UTR的序列为GCTGGAGCCTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGG CCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGC，5'UTR使用人的αβRNA序列，3'UTR区使用人血红蛋白亚基α1基因（HBA1）设计体外转录（IVT）mRNA质粒，包含T7启动子（核苷酸序列为：GCCACCATGG），Kozak序列（核苷酸序列为：GCCACCATGG），为了增强免疫效果在Kozak序列之后增加人组织纤溶酶原激活序列（SP序列），其核苷酸序列为：gatgcaatgaagagagggctctgctgtgtgctgctgctgtgtggagcagtcttcgtttcgcccagccaggaaatccAtgcccgattcagaaga（GenBank No. E04506.1），3'UTR前加噬菌体T4纤维蛋白的三聚体基序Foldon序列，其核苷酸序列为：GGAAGCGGCTACATCCCAGAAGCCCCTAGAGACGGACAGGCTTACGTGCGAAAAGACGGCGAGTGGGTGCTGCTGAGCACATTCCTGGGAAGGAGC。
VP1（200-213）-VP1（134-161）-VP1（134-161）-3A（21-35）-3D（56-71）序列，尾部含有120对polyAA，5'端帽与多腺嘌呤尾结合蛋白和转译启动蛋白一起，募集核糖体并且启动转录过程。修改体外转录（IVT）mRNA的结构元素包括5'帽，5'UTR和3'UTR，终止序列和polyAA尾五个重要部分，系统地提高其细胞内稳定性和翻译效率。具体步骤可以参看图1（O型口蹄疫mRNA-LNP疫苗设计概图。）
1.2 模板扩增
抗原序列交由江苏耀海生物制药有限公司合成，将合成的基因片段连接到pTNTR表达载体，再转化到大肠杆菌感受态细胞上，然后在含有氨苄青霉素LB（Luria Bertani 溶菌肉汤）固体培养皿上挑取单菌落，将经过PCR鉴定的单菌落送公司进行测序，以验证序列的正确性。然后将鉴定正确的单菌落转到LB液体培养基进行扩增，恒温水域摇床进行扩增37.3℃，200rpm/min，培养过夜，第二天按照天根生化科技（北京）有限公司购置的无内毒素质粒大提试剂盒（DP117）操作说明提取质粒。
1.3体外转录mRNA线性化模板的制备
Quickcut XhoI限制性内切酶，酶切体系，10×Quickcut Green Buffer 3μl，DNA3μg，Quickcut XhoI 1μl，DEPC水补充体积至30μl。充分涡旋混匀，37℃金属浴30min，即可完成单酶切反应。将30个的单酶切体系的产物使用柱纯化试剂盒纯化浓缩至1个PCR产物柱子中。单酶切后的产物使用1.2%琼脂糖凝胶电泳，以确定单酶切后的DNA质粒是否存在未切开的情况，并确定质粒大小。结果见图2。
1.4 O型口蹄疫mRNA T7体外转录
将纯化后的单酶切线性化的质粒DNA原液进行T7聚合酶体外转录，用于单链RNA的合成，模板用RNase-free水溶解，按照上海近岸蛋白科技股份有限公司T7 High Yield RNATranscription kit （E131）试剂盒的操作进行体外转录和氯化锂纯化法进行纯化。体外转录、纯化后的产物使用3%凝胶电泳进行验证，以确定体外转录纯化后片段的大小和纯化效果，如图3所示，片段大小与预期一致，无拖尾杂带，纯化效果良好。使用免疫荧光分析体外转录后的mRNA的定位情况，结果如图4所示，可见口蹄疫mRNA在细胞质有表达。
1.5 mRNA加帽
按照上海近岸蛋白科技股份有限公司Cap 1 Capping System（M082）试剂盒操作说明实现对单链mRNA的加帽，使用氯化锂纯化法提纯加帽后的mRNA，获得纯化的mRNA模板。
1.6 脂质纳米颗粒包裹
使用脂质纳米颗粒（LNP）对O型口蹄疫mRNA进行包裹，将纯化后的mRNA溶解在含有阳离子可电离脂质（DLin-MC3-DMA），二硬脂酰磷脂酰胆碱（DSPC），胆固醇（ethyleneglycol）和PEG化脂质（DMPE）照摩尔比50:10:38.5:1.5混合液中，与含有口蹄疫mRNA乙酸钠酸化的水相中，使用脂质纳米微流控进行快速微流体混合，具体的操作由江苏耀海生物制药有限公司使用加拿大 Precision Nanosystems公司生产的纳米颗粒合成系统完成。对最后生产的O型口蹄疫mRNA-LNP进行透射电镜观察，可见包裹后的疫苗分散均匀如图5，并使用美国麦奇克公司（Malvern）纳米粒径电位仪进行粒径的检测，结果见图6，检测平均粒径为82.39nm，该粒度≤100nm在循环系统中可逃避吞噬细胞吞噬，复制效率更高，体循环半衰期相对更长，更容易穿越血管内皮细胞，进入细胞外基质，到达靶细胞。
实施例2豚鼠细胞实验验证O型口蹄疫mRNA-LNP疫苗诱发豚鼠细胞免疫和体液免疫
2.1 mRNA转染豚鼠脾脏淋巴细胞诱导细胞免疫
将O型口蹄疫裸mRNA（未进行脂质纳米颗粒包裹的经体外转录的口蹄疫mRNA）转染到豚鼠脾脏淋巴细胞，进行免疫荧光观察，结果如图7，可见O型口蹄疫mRNA在细胞质有表达。然后用O型口蹄疫VP1重组蛋白刺激RNA转染后的豚鼠脾脏淋巴细胞，使用CCK8检测淋巴细胞增殖情况，阳性对照刺激使用刀豆蛋白A（ConA）对照，阴性使用不加任何刺激物。结果如图8，酶标仪检测结果显示以口蹄疫mRNA转染豚鼠脾脏淋巴细胞6h（刺激指数SI=0.8273）、12h（SI=0.7451）、24h（SI=0.9960）极显著高于空白对照组（SI=0.4784），24h极显著高于6h和12h。说明O型口蹄疫mRNA可以诱导豚鼠脾脏淋巴的增殖发挥细胞免疫的作用。
2.2 mRNA转染豚鼠脾脏淋巴细胞诱导体液免疫
使用ELISA法检测O型口蹄疫mRNA转染豚鼠脾脏淋巴细胞后IgG抗体水平如图9以转染后以24h的OD最高，极显著高于6h、12h，且三组均高于临界值呈现口蹄疫抗体阳性。按照GB/T18935-2018第12病毒中和试验进行中和抗体的检测，结果如图10，O型口蹄疫mRNA转染豚鼠脾脏淋巴细胞6h、12h、24h进行微量血清中和抗体试验，O型口蹄疫mRNA刺激了脾脏淋巴细胞产生了中和抗体（抗体效价2.1），且不同转染时间段抗体水平极显著高于空白组，转染24h组显著高于6h组，证明了O型口蹄疫mRNA转染可以刺激豚鼠脾脏淋巴细胞产生体液免疫。
实施例3豚鼠体内实验验证O型口蹄疫mRNA-LNP疫苗诱发豚鼠细胞免疫和体液免疫
3.1动物分组
分为空白组、空白攻毒组、0.2μg（200μL）O型口蹄疫mRNA-LNP疫苗（简称0.2μg组）、2.0μg（200μL）O型口蹄疫mRNA-LNP疫苗组（简称2.0μg组），20μg（200μL）O型口蹄疫mRNA-LNP疫苗组（简称20μg组），200μL灭活苗组。4周龄，体重200±10g，每组12只，共48只豚鼠。免疫接种程序如图11，0、2周豚鼠股直肌接种O型口蹄疫mRNA-LNP疫苗，灭活苗股直肌接种200μL，6周用100倍ID50毒剂量（O型口蹄疫毒株（Genbank NO.KY072818）进行攻毒实验，连续观察12天。
3.2 疫苗免疫攻毒保护试验
接种后的和攻毒后的动物体温、体重进行检测，制作统计表记录动物的饮食、行为等情况，观察接种后部位有无不良反应，以评估疫苗对豚鼠的安全性。经临床观察，接种疫苗后的豚鼠未出现食欲不振、行为异常、精神状态萎靡的现象，接种部位也未出现不良过敏、潮红等情况。对免疫接种42天后豚鼠进行攻毒实验，统计生存率。结果如图12，2.0μg组与灭活苗组保护率均为100%，可以提供豚鼠抵御致死剂量病毒的攻击。空白攻毒组最早出现食欲不振或不思饮食，精神萎靡，趴在笼底，远离豚鼠群体，随后脚垫和嘴上出现肿胀、发红等病变，四肢僵直、麻木、跛行，病变易感部位（包括吻、口腔和鼻镜黏膜、足垫部）发红、水疱，随后陆续死亡。死亡后的豚鼠出现耳朵边缘充血发黑紫色，脚掌肿胀、发红等症状。豚鼠死亡病例解剖多发现肝脏、心脏的血管怒张、充血，肝脏发黑色，心包膜黑色瘀血点，脾脏也有充血发黑紫，个别出现肺脏的肿胀。
3.3抗体检测
如图13所示，接种O型口蹄疫mRNA-LNP疫苗、O型口蹄疫灭活苗后均呈阳性，极显著高于图空白组。豚鼠接种疫苗后20μg组第2周抗体水平（OD值0.9163）最高，其次是灭活苗组（OD值0.3197），第3、4周抗体水平以灭活苗组IgG抗体水平最高。如图14，除了0.2μg组，豚鼠免疫后微量血清中和抗体效价在第3周达到最高水平，随后开始呈现维持或下降趋势。第3、4周2.0μg组、20μg组与灭活苗组抗体效价之间的差异不显著，第4周2.0μg疫苗组（抗体效价2.6）微量血清抗体效价水平高于20μg组（抗体效价2.4）。
3.4 疫苗保护效果评价
如图15，攻毒后的豚鼠脏器进行HE染色。空白攻毒组肺组织大面积的出血，肺泡壁增厚，有红细胞散在分布，存在炎性细胞浸润。0.2μg组出现肺泡壁增厚，炎性细胞浸润和局部出血现象但相较空白攻毒组症状要轻，20μg组肺部组织有轻微出血现象，红细胞的散在分布。2.0μg组和灭活苗组肺泡均一，肺泡管、肺泡囊等结构正常，与对照组无差异；空白攻毒组肝脏出现明显瘀血，静脉周围有淋巴细胞分布，肝细胞出现大面积空泡，肝细胞索紊乱，肝细胞核碎裂、溶解，肝细胞发生坏死。O型口蹄疫0.2μg组出现肝脏轻度瘀血、出血，肝细胞核碎裂、溶解，肝发生坏死但相较空白攻毒组症状要轻，2.0μg组、20μg组和灭活苗组肝细胞索排列整齐、均一，肝细胞核清晰可辨，与对照组无差异；空白攻毒组肾脏组织出血加剧，肾小球、肾小管瘀血，淋巴细胞浸润，肾小管上皮细胞核溶解、死亡，肾小管管腔内充满细胞碎片。O型口蹄疫0.2μg组出现肾脏出现局部性的瘀血，少量的炎性细胞浸润，相较空白攻毒组症状要轻，2.0μg组、20μg组和灭活苗相较空白组无差异，未观察到病理损伤的情况；空白攻毒组心脏出现大面积的出血，动脉周围大量的淋巴细胞浸润，血液充满大量淋巴细胞，心肌细胞浅染，有大量的细胞核发生了溶解。0.2μg组轻微的瘀血，动脉周围存在淋巴细胞浸润。2.0μg组、20μg组和灭活苗组心肌细胞结构完成，心肌细胞核清晰可见与对照组无差异；空白攻毒组脾脏观察到了明显的瘀血、出血，脾小结相对空白对照组增多，脾脏深染，炎性细胞浸润。0.2μg组脾脏出现轻微的瘀血，20μg组有炎性细胞浸润，2.0μg组灭活苗组与空白对照组相比无差异。整体上分析O型口蹄疫mRNA-LNP疫苗缓解了O型口蹄疫病毒对脏器造成的瘀血、充血，炎性细胞浸润，2.0μg组基本达到与灭活苗同等的保护效果。
以上所述的实施例仅表述了本申请的实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可做出其他改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQ ID NO:1
TAATACGACTCACTATAGGGAATAAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCGCCACCATGGATGCAATGAAGAGAGGGCTCTGCTGTGTGCTGCTGCTGTGTGGAGCAGTCTTCGTTTCGCCCAGCCAGGAAATCCATGCCCGATTCAGAAGAAGACATAAGCAGAAGATTGTGGCACCCGCAAAACAGCTTTTGGGCGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCAGCTGCAGGTACAGCAACAGCAACGTGAGCAAATTGAGAGGTGATCTCCAAGTGTTGGCTCAGAAGGCGGCGAGACCGCTGCCTACCGGCGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCAGCTGCAGGTACAGCAACAGCAACGTGAGCAAATTGAGAGGTGATCTCCAAGTGTTGGCTCAGAAGGCGGCGAGACCGCTGCCTACCGGCGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCAGCGCAGCAATTGAATTCTTTGAGGGGATGGTCCACGACTCCATTAAAGGCGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCAGCATCTTCTCCAAACACAAAGGAGACACAAAGATGTCTGAAGAGGACGGCGGAGGAGGCAGCGGCGGAGGAGGCAGCGGAAGCGGCTACATCCCAGAAGCCCCTAGAGACGGACAGGCTTACGTGCGAAAAGACGGCGAGTGGGTGCTGCTGAGCACATTCCTGGGAAGGAGCTAATAGGCTGGAGCCTCGGTGGCCTAGCTTCTTGCCCCTTGGGCCTCCCCCCAGCCCCTCCTCCCCTTCCTGCACCCGTACCCCCGTGGTCTTTGAATAAAGTCTGAGTGGGCGGCAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA-3'
Claims (5)
1.一种预防O型口蹄疫的mRNA-LNP疫苗，其特征在于，包括mRNA分子和脂质纳米颗粒；所述mRNA分子的核苷酸序列如SEQ ID NO .1所示。
2.一种制备预防O型口蹄疫的mRNA-LNP疫苗的方法，其特征在于，具体步骤为：在mRNA分子的抗原序列上依次添加T7启动子、5'UTR、Kozak序列、SP序列、噬菌体T4纤维蛋白的三聚体基序Foldon序列、3'UTR、终止序列和PolyAA尾，连接到pTNTR载体上构建质粒模板；所述质粒模板经线性化、体外转录、加帽酶加帽、纯化获得mRNA分子，所述mRNA分子经脂质纳米颗粒包裹形成mRNA-LNP疫苗；所述mRNA分子的抗原序列为O型口蹄疫云南太保毒株VP1（200-213）-VP1（134-161）-VP1（134-161）-3A（21-35）-3D（56-70）。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述SP序列位于如SEQ ID NO .1所示的序列表中第81-173位。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述噬菌体T4纤维蛋白的三聚体基序Foldon序列位于如SEQ ID NO .1所示的序列表中第624-719位。
5.根据权利要求2、3或4所述的方法，其特征在于，所述纯化是采用氯化锂纯化法。
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