CN113388641B - 一种禽4型腺病毒载体、构建方法及其减毒活疫苗和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种禽4型腺病毒载体、构建方法及其减毒活疫苗和应用。本发明的禽4型腺病毒载体包括pBR322质粒的复制起点核酸序列、卡那霉素抗性基因核酸序列和禽4型腺病毒的基因组序列；所述禽4型腺病毒的基因组序列中，ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM‑1基因均失活。将线性化后的禽4型腺病毒载体转染细胞后拯救获得的禽4型腺病毒作为减毒活疫苗，不具备致病性，安全性高，具有很好的免疫保护效果，可以用于制备预防禽腺病毒感染引起的疾病的药物。

Description

一种禽4型腺病毒载体、构建方法及其减毒活疫苗和应用
技术领域
本发明属于重组疫苗领域，具体地说，涉及一种禽4型腺病毒载体、构建方法及其减毒活疫苗和应用。
背景技术
禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)是一种无包膜的双链DNA病毒，病毒呈二十面体对称结构，直径约为70nm～90nm，属于腺病毒科(Adenoviridae)鸟腺病毒属(Aviadenovirus)。基于分子结构的不同，可将禽腺病毒分为A，B，C，D，E共5组；依据交叉中和试验结果，又可将其分为12个血清型(FAdV-1至FAdV-8a及FAdV-8b至FAdV-11)。腺病毒的二十面体外壳主要由240个六邻体(hexon)及分布于各顶点的12个五邻体(penton)所组成，五邻体包括五邻体基和突出的fiber蛋白，大多数腺病毒都只编码一种fiber蛋白，但FAdV-A与FAdV-C都包含两种fiber蛋白，并且两个fiber蛋白都位于同一个五邻体基上。
FAdV可以诱发禽类多种疾病，包括包涵体肝炎(Inclusion body hepatitis,IBH)、心包积液综合征(Hydropericardium syndrome，HPS)和肌胃糜烂(Gizzard erosion,GE)。FAdV-4感染最初于1987年发现于巴基斯坦的安卡拉地区，因此也叫“安卡拉病”。自2014年秋季后，我国鸡群中心包积液-肝炎综合征(Hydropericardium-hepatitessyndrome，HHS)病例逐渐增加，尤其是在肉鸡中迅速蔓延，2015年6月份以来，该病在中国大部分地区暴发流行，给家禽业造成了极其严重的经济损失。对其进行分析后发现，近年广泛流行的FAdV属于C组禽4型腺病毒FAdV-4，该病主要发生于3～6周龄的肉鸡，其病死率可达20％～80％。
FAdV-4的感染宿主非常广泛，除了感染规模养殖的蛋鸡和肉鸡外，也可以感染鸽、鸭、鹅及多种野生鸟类，FAdV-4感染宿主多样性既增加了跨宿主传播的潜在风险，也给该病的科学防控增加了难度。FAdV-4不仅可通过消化道、呼吸道及眼结膜等途径进行水平传播，还可以通过鸡胚进行垂直传播，对鸡胚源兽用疫苗的生产构成威胁。
预防病毒感染最有效的方法是接种疫苗。目前，FAdV-4疫苗研发主要集中在灭活疫苗和亚单位疫苗两个方面，尚未见减毒活疫苗的相关报道。与灭活疫苗相比，减毒活疫苗可刺激机体产生特异性的细胞免疫反应，获得长期或终生保护的作用，减毒活疫苗具有免疫力强、作用时间长的优点。
有鉴于此特提出本发明。
发明内容
本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种禽4型腺病毒载体、构建方法及其减毒活疫苗和应用。本发明改造后的禽4型腺病毒载体的禽4型腺病毒的基因组序列中ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因的核酸序列均至少部分缺失。由该载体转染细胞、拯救获得的禽4型腺病毒减毒活疫苗不具备致病性，安全性好，且接种该疫苗的SPF鸡可完全抵抗FAdV-4的感染，具有很好的免疫保护效果。
为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：
本发明的第一目的是提供一种禽4型腺病毒载体，所述禽4型腺病毒载体包括pBR322质粒的复制起点核酸序列、卡那霉素抗性基因核酸序列和禽4型腺病毒的基因组序列；所述禽4型腺病毒的基因组序列中，ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因均失活。
本发明中，禽4型腺病毒可以简称为FAdV-4。ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因均失活的含义为前述基因均无法表达相应的蛋白。例如，可以通过删除、插入、突变、移位等技术手段使前述基因无法表达蛋白，需要说明的是，任何能够使编码基因不表达蛋白的改造方式均在本发明的范围内。
本发明中，所述禽4型腺病毒的全基因组序列的Genbank号为MG547384(Fowlaviadenovirus 4isolate NIVD2)，全长为43719bp。禽4型腺病毒的全基因组序列中，ORF1基因的核酸序列为790-1314位的碱基；ORF1B基因的核酸序列为1485-1808位的碱基；ORF2基因的核酸序列为1860-2678位的碱基；ORF19A基因的核酸序列为40239-42731位的碱基；GAM-1基因的核酸序列为37351-38166位的碱基。
进一步的，本发明中，所述失活为ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因的核酸序列均至少部分缺失；
需要指出的是，本发明中所述的缺失可以为编码基因的核酸序列部分缺失，也可以为全部缺失。本发明的至少部分缺失使编码基因无法表达相应蛋白即可。可以理解的是，为了使基因无法表达相应的蛋白，本领域技术人员可以采用本领域中现有的或者改进的任何可实现的技术手段进行改造，本发明中采用的具体实施方式不应限制本申请的保护范围。
作为一种具体的实施方式，本发明采用酶切连接和DNA组装等构建的方式进行改造。由于酶切位点的选择，本发明改造的载体中，ORF2，ORF19A和GAM-1基因的核酸序列部分缺失，ORF1和ORF1B基因的核酸序列全部缺失。
具体的，本发明中，GAM-1基因的核酸序列的37389至38011位的碱基缺失，37351至37388以及38012至38166位的碱基保留，无法编码GAM-1蛋白；ORF2基因的核酸序列的2637至2678bp保留，1860-2636位的碱基缺失，无法编码ORF2蛋白；ORF19A基因的核酸序列的40239-40280bp以及42701-42731bp保留，40281-42700位的碱基缺失，无法编码ORF19A蛋白。
本发明的重组的禽4型腺病毒载体，以现有的禽4型腺病毒(FAdV-4)的全基因组序列为骨架，插入了pBR322质粒的复制起点序列、卡那霉素抗性基因序列、报告基因(mCherry基因)等，还删除了FAdV-4基因组中的ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因的至少部分编码序列，使重组后的载体不能表达ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1蛋白。通过实验发现，以上非结构基因被删除后拯救的重组禽4型腺病毒，毒力明显下降，不具有致病性，安全性好，同时还能够产生免疫保护作用。
进一步的方案，所述禽4型腺病毒的基因组序列中，ORF1-ORF1B-ORF2的编码区可替换为外源目的基因的核酸序列。
禽4型腺病毒的基因组中，ORF1、ORF1B、ORF2基因的位置相邻。本发明所述的ORF1-ORF1B-ORF2的编码区，可以理解为禽4型腺病毒全基因组中790-2678位的编码区，易于进行遗传改造。ORF1-ORF1B-ORF2的编码区可替换为外源目的基因的核酸序列，所述外源目的基因可以为能够产生易于检测性状的报告基因，也可以为能够表达其他抗原的目的基因，以用于构建多价疫苗。本领域技术人员可以根据实际需要进行操作。
作为一种具体的实施方案，本发明中，所述的ORF1-ORF1B-ORF2的编码区由人巨细胞病毒启动子CMVp、mCherry基因和SV40 polyA加尾信号的核酸序列替代。
本发明的第二目的是提供一种如上任意一种方案或者组合方案所述的禽4型腺病毒载体的构建方法，包括：
(1)以禽4型腺病毒的完整的基因组为骨架，构建含有pBR322质粒的复制起点核酸序列、卡那霉素抗性核酸序列的载体；
(2)构建多个中间质粒，以获得ORF1和/或ORF1B和/或ORF2和/或ORF19A和/或GAM-1基因失活的禽4型腺病毒基因组的多个人工改造片段；
(3)利用(2)中获得的人工改造片段，替换(1)的载体中的禽4型腺病毒基因组的相应片段，最终获得ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因均失活的禽4型腺病毒载体。
进一步的方案，包括：
(1)以pKFAV4-CX19A载体为基础，所述pKFAV4-CX19A载体包含PBR322质粒的复制起点、卡那霉素的抗性基因以及禽4型腺病毒的基因组；并且禽4型腺病毒的基因组中，ORF19A基因缺失，同时ORF1，ORF1B和ORF2基因的编码区由人巨细胞病毒启动子CMVp、mCherry基因和SV40 polyA加尾信号核酸序列替代；
(2)构建中间质粒，获得GAM-1基因部分缺失的人工改造片段；
(3)利用(2)中获得的人工改造片段，替换pKFAV4-CX19A载体中的相应片段，获得ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因至少部分缺失的禽4型腺病毒载体。
需要说明的是，pKFAV4-CX19A载体为现有技术中已经公开的质粒，构建方法记载在YAN Bingyu，ZOU xiaohui et al.User-Friendly Reverse Genetics System forModification of the Right End of Fowl Adenovirus 4Genome.Viruses 2020,12(3),301中。
本发明的第三目的是提供一种禽4型腺病毒减毒活疫苗，包括禽4型腺病毒，所述禽4型腺病毒的全基因组序列的Genbank号为MG547384，同时，所述禽4型腺病毒的基因组序列中，ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因均失活；
优选的，ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因的核酸序列均至少部分缺失；优选的，将以上任意一种方案或者组合方案所述的禽4型腺病毒载体线性化后转染细胞，利用重组病毒拯救技术，得到禽4型腺病毒减毒活疫苗。
进一步的方案，本发明的禽4型腺病毒减毒活疫苗还可以包括药学上可以接受的辅料。
本发明的第四目的是提供一种如上任意一种方案或者组合方案所述的禽4型腺病毒载体，或所述的禽4型腺病毒减毒活疫苗在制备预防由禽流感病毒、新城疫病毒、传染性法氏囊病毒、鸡传染性支气管炎病毒感染引起的疾病的药物中的应用。
本发明的第五目的是提供一种如上任意一种方案或者组合方案所述的禽4型腺病毒载体，或所述的禽4型腺病毒减毒活疫苗在制备预防由禽腺病毒感染引起的疾病的药物中的应用；
优选的，所述的疾病由禽4型腺病毒感染引起；
优选的，所述的疾病包括禽心包积液-包涵体肝炎综合征、包涵体肝炎、肌胃糜烂。
采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果：
本发明从野生型FAdV-4基因组DNA出发，利用反向遗传学技术，删除了ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A基因及GAM-1基因的至少部分读码框，使前述基因的蛋白不能表达，构建了重组腺病毒质粒pkFAdV4-CXGA。Pme I线性化重组腺病毒质粒后转染LMH细胞，拯救出重组腺病毒FAdV4-CXGA。致病性实验结果显示，相对于FAdV-4的100％的致死率，重组腺病毒FAdV4-CXGA对SPF鸡不再具备致病性；免疫保护实验结果证明，接种FAdV4-CXGA的SPF鸡可以完全抵抗FAdV-4强毒株的攻毒感染，表明FAdV4-CXGA具有很好的免疫原性。因此，本发明构建的禽4型腺病毒减毒活疫苗安全性高、免疫效果好，为禽腺病毒减毒活疫苗及其它禽病疫苗的研发奠定了坚实基础。
下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的描述。
附图说明
附图作为本发明的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：
图1是中间质粒pAMS9002的构建示意图。以MauB I与Spe I双酶切FAdV-4基因组，电泳后使用试剂盒回收8953bp片段；设计引物，以质粒载体pMD18-T(购自日本TAKARA公司)为模板，以1907AMS9002f和1907AMS9002r为引物扩增得到2326bp的ORI-AMP片段，该片段两端各有约30bp与上述回收的8953bp片段两端序列相同。将电泳回收的ORI-AMP与8953bp片段混合，体外进行DNA组装(DNA assembly)反应；反应产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB琼脂平板，提取质粒，获得中间质粒pAMS9002。
图2是中间质粒pAMS-XGAM1的构建示意图。使用BsiW I/Eag I双酶切pAMS9002质粒，电泳回收10014bp片段；以pAMS9002质粒为模板，以2010XGAM1f与2010XGAM1r为引物，PCR扩增705bp的XGAM-1片段，该片段两端各有约30bp与上述回收的10014bp片段两端序列相同；将回收的XGAM-1片段与10014bp片段在体外进行DNA组装反应；反应产物转化E.coliTOP10感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB琼脂平板，提取质粒，得到中间质粒pAMS-XGAM1。
图3是重组腺病毒质粒pkFAV4-CXGA的构建示意图。Pac I酶切pAMS-XGAM1质粒，电泳回收8385bp的大片段；MauB I/Spe I双酶切pKFAV4-CX19A质粒，使用试剂盒回收34575bp的大片段，将回收的8385bp片段与34575bp片段在体外进行DNA组装反应；反应产物转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB琼脂平板，提取质粒，得到重组腺病毒质粒pkFAV4-CXGA。
图4显示FAV4-CXGA在LMH细胞中的拯救。使用Pme I酶切质粒pkFAV4-CXGA后转染LMH细胞，培养5天后，在荧光显微镜下观察。结果观察到细胞上出现红色荧光聚集，说明FAV4-CXGA病毒拯救成功。
图5显示FAV4-CXGA病毒形态。收获感染FAV4-CXGA的LMH细胞，冻融裂解3次后取上清进行磷钨酸负染，于透射电子显微镜下观察，可见典型的腺病毒正二十面体形态，说明FAV4-CXGA重组腺病毒拯救成功。
图6是对质粒pkFAV4-CXGA和病毒FAV4-CXGA基因组PCR鉴定的结果。分别以质粒pkFAV4-CXGA或FAV4-CXGA病毒基因组为模板，以2011XGAMf和2011XGAMr为引物，PCR扩增可见531bp的条带，与预期大小相符，表明FAV4-CXGA病毒基因组中GAM-1基因成功缺失。图中M：DL2000 DNA marker；1-4：以质粒pKFAV4-CXGA为模板扩增5,10,15,20个循环结果；5-8：以病毒FAV4-CXGA基因组为模板扩增5,10,15,20个循环结果。
图7是对GAM-1蛋白表达鉴定结果。收获接种FAV4-CXGA及FAdV-4病毒的LMH细胞后，经Western blot检测，可见FAdV-4病毒感染的LMH细胞中出现30kD左右(GAM-1蛋白)的目的条带，而FAV4-CXGA感染的LMH细胞以及未接种病毒的LMH细胞中未见该条带，表明FAV4-CXGA病毒中GAM-1蛋白已不再表达。1：LMH细胞；2：感染野生型FAdV-4的LMH细胞；3：感染FAV4-CXGA的LMH细胞。
图8是对病毒FAV4-CXGA在鸡胚中安全性评价结果。野生型FAdV-4接种鸡胚后，在第3日开始出现死亡，至第6日全部死亡；FAV4-CXGA病毒接种鸡胚后，培养至13天试验结束仍全部存活，结果表明FAV4-CXGA病毒毒力明显下降。
图9是对病毒FAV4-CXGA对SPF鸡毒力评价结果。FAdV-4病毒接种SPF鸡后，在第3日出现死亡，至第5日全部死亡；而FAV4-CXGA和PBS接种的SPF鸡培养至第21天仍然全部存活，表明FAV4-CXGA病毒毒力明显下降。
图10是SPF鸡经FAV4-CXGA病毒免疫及攻毒后的存活情况。结果显示，经FAV4-CXGA病毒免疫的SPF鸡，使用野生型FAdV-4攻毒后7天均存活，而对照组(PBS免疫)的SPF鸡在第3天开始出现死亡，至第4天全部死亡。
图11是中和抗体水平检测结果，表明SPF鸡经FAV4-CXGA病毒免疫后均产生了较高水平的中和抗体。
需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1、中间质粒pAMS9002的构建
中间质粒pAMS9002的构建示意图如图1所示，具体构建步骤包括：
(1)以MauBI与SpeI双酶切FAdV-4基因组(FAdV-4基因组的核苷酸序列参见Genbank accession number:MG547384)，电泳后使用试剂盒(Zymoclean Large FragmentDNA Recovery Kit,Cat.D4045,Zymo Research公司)回收8953bp片段，该片段包含FAdV-4基因组右侧的ORF16,ORF17,GAM-1,ORF29,0RF28,ORF43,ORF42,ORF20,ORF20A和ORF22等基因的开放读码框；
(2)在标准的聚合酶链式反应(PCR)条件下，以质粒载体pMD18-T为模板，利用如下表1中所示引物(下述引物由华大基因合成)扩增得到2326bp的ORI-AMP片段，含有PBR322质粒的复制起点(ORI)和氨苄青霉素的抗性基因(AMP)，该片段两端各有约30bp与上述回收的8953bp片段两端序列相同。
表1
Figure BDA0003141246190000071
(3)将电泳回收的ORI-AMP片段(2326bp)与回收的8953bp片段混合，再加入等体积DNA组装试剂母液(NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix,Cat.E2623S,New EnglandBiolabs)，50℃反应1h，组装得到中间质粒pAMS9002。
(4)取反应产物(中间质粒pAMS9002)直接转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB琼脂平板，阳性菌落使用LB液体培养基扩大培养，保存并对组装位点及PCR区域测序，得到测序正确的中间质粒pAMS9002。
pAMS9002质粒中的6个单酶切位点(Hind III、EcoR V、Xba I、BsiW I、Eag I与SpeI)将FAdV-4病毒基因组的右端分为5个小片段，可经分子生物学方法对此5个片段进行删减，构建FAdV-4的不同基因缺失/突变毒株。
实施例2、中间质粒pAMS-XGAM1的构建
中间质粒pAMS-XGAM1的构建示意图如图2所示，具体构建步骤包括：
(1)使用BsiW I/Eag I双酶切pAMS9002质粒，电泳回收10014bp片段；(2)以pAMS9002质粒为模板，以下述表2中的引物(下述引物由华大基因合成)进行PCR扩增，得到705bp的XGAM-1片段(SEQ ID NO:3)并经电泳回收，片段两端各有约30bp与上述回收的10014bp片段两端序列相同；
表2
Figure BDA0003141246190000081
注：由于采用DNA组装技术，2010XGAM1f引物中可以不含BsiW I酶切位点，2010XGAM1r引物中恰巧含有Eag I酶切位点。
(3)将回收的XGAM-1片段与10014bp片段混合，再加入等体积DNA组装试剂母液，50℃反应1h，组装得到中间质粒pAMS-XGAM1。
(4)取反应产物(中间质粒pAMS-XGAM1)直接转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布含氨苄青霉素的LB琼脂平板，阳性菌落使用LB液体培养基扩大培养，保存并对组装位点及PCR区域测序，得到测序正确的中间质粒pAMS-XGAM1。
中间质粒pAMS-XGAM1的Hind III与Spe I酶切位点之间的序列如SEQ ID NO:6所示。
实施例3、重组腺病毒质粒pkFAV4-CXGA的构建
重组腺病毒质粒pkFAV4-CXGA的构建示意图如图3所示，具体构建步骤包括：
(1)使用Pac I酶切pAMS-XGAM1质粒，电泳后回收8385bp的大片段；8385bp的大片段中不含有ORI-AMP片段。
(2)使用MauB I/Spe I双酶切pKFAV4-CX19A质粒。
需要说明的是，pKFAV4-CX19A质粒为现有技术中已经公开的质粒，构建方法记载在YAN Bingyu，ZOU xiaohui et al.User-Friendly Reverse Genetics System forModification of the Right End of Fowl Adenovirus 4Genome.Viruses 2020,12(3),301中。
具体的，pKFAV4-CX19A质粒包含PBR322质粒的复制起点、卡那霉素的抗性基因以及FAdV-4基因组(FAdV-4基因组的核苷酸序列参见Genbank accession number:MG547384)，并且FAdV-4基因组中，ORF1，ORF1B，ORF2和ORF19A基因至少部分缺失，同时，CMV启动子、mCherry基因和SV40 polyA加尾信号核酸序列被克隆在原ORF1-ORF1B-ORF2的位点处。
使用试剂盒(Genomic DNA Clean Concentrator,Cat.D4010,Zymo Research公司)回收34575bp的大片段，将回收的8385bp片段与34575bp片段混合，再加入等体积DNA组装试剂母液，50℃反应1h，组装得到重组腺病毒质粒pkFAV4-CXGA。
(3)取反应产物直接转化E.coli TOP10感受态细胞，涂布含卡那霉素的LB琼脂平板，阳性菌落使用LB液体培养基扩大培养，酶切鉴定并对组装位点进行测序后保存，得到重组腺病毒质粒pkFAV4-CXGA。
实施例4、重组腺病毒FAV4-CXGA的拯救与扩增纯化
Pme I酶切实施例3得到的质粒pkFAV4-CXGA，乙醇沉淀回收DNA，使用jetPRIMETransfection Reagent(Reference number:114-15,Polyplus公司)转染LMH细胞，37℃培养3-7天。第5天可见细胞出现病变(Cytopathic effect,CPE)，在荧光显微镜下可见红色荧光(mCherry)聚集(如图4所示)；收获感染FAV4-CXGA的LMH细胞，冻融裂解3次后取上清进行磷钨酸负染，于透射电子显微镜下观察，可见典型的腺病毒正二十面体形态(约80nm)(如图5所示)。上述结果均说明重组腺病毒FAV4-CXGA拯救成功。
收获的FAV4-CXGA病毒再次感染LMH细胞，多次扩增后使用氯化铯(使用0.1M柠檬酸配制)进行密度梯度离心纯化，并分别测定病毒感染滴度和颗粒数(Viral particle，vp)滴度。需要说明的是，密度梯度离心纯化、病毒感染滴度和颗粒数滴度的测定方法均采用现有技术中的方法。
实施例5、重组腺病毒FAV4-CXGA的鉴定
1.基因组的PCR鉴定。
取50μl FAV4-CXGA种子病毒(接种体积比为1:100)接种培养在T25培养瓶中的LMH细胞，感染2h后，去除病毒液，更换含2％胎牛血清(FBS)的新鲜DMEM培养基，继续培养2天。
Hirt法提取病毒基因组(参考现有技术中的文献方法)，使用引物2011XGAMf:tcttcaatcaaactcccaccccc和2011XGAMr:gcatagtgacgtaggcccattgg对基因组进行PCR鉴定。
PCR结果可见，产物长度与预期大小(531bp)相符(如图6所示)，表明拯救的病毒确为GAM-1基因部分删除成功的重组腺病毒FAV4-CXGA。若GAM-1未删除，使用上述引物扩增得到的产物长度应为1154bp。将PCR扩增产物(531bp)切胶回收后送北京六合华大基因科技有限公司测序，测序结果与原始质粒pKFAV4-CX19A序列进行比对，结果表明GAM-1基因已成功部分缺失。
2.GAM-1蛋白表达检测。
以500vp/cell纯化的FAV4-CXGA及FAdV-4病毒分别接种六孔板培养的LMH细胞，感染2h后，去除病毒液，更换含2％胎牛血清(FBS)的新鲜DMEM培养基，继续培养。30h后，加入100μl RIPA裂解液(上海碧云天生物技术有限公司，Cat No.P0013B)裂解病毒感染的细胞，经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(Sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide gelelectrophoresis,SDS-PAGE)并转移至硝酸纤维素膜上后，5％脱脂奶封闭2h，加入一抗(兔抗FAdV4-GAM1抗血清，经5％脱脂奶稀释100倍)孵育2h，PBST漂洗3次，加入二抗(山羊抗兔IgG/辣根酶标记，使用5％脱脂奶稀释20000倍)，室温下孵育2h，PBST漂洗3次，使用K3000mini型化学发光成像系统进行拍照。GAM-1蛋白为30.89kDa，Western blot结果显示GAM-1蛋白在FAdV-4感染的LMH细胞中表达，但在重组病毒FAV4-CXGA感染的LMH细胞中不表达(如图7所示)。
实施例6、重组病毒FAV4-CXGA的安全性评价
SPF鸡胚分成3组，每组10个。将纯化的FAV4-CXGA病毒稀释至1×109vp/ml，在SPF鸡胚6日龄时进行接种，每个鸡胚接种0.1ml，以野生型FAdV-4接种为阳性对照(1×108vp/个)，PBS接种为阴性对照。接种结束后将SPF鸡胚全部转入37℃培养箱培养，逐日观察鸡胚状态并记录鸡胚死亡情况，培养至13天试验结束。
结果可见，接种野生型FAdV-4的鸡胚在第3日出现死亡，至第6日全部死亡，而接种FAV4-CXGA和PBS的鸡胚直至实验结束(第13天)均存活(如图8所示)，表明FAV4-CXGA的毒力明显下降，安全性较好。
实施例7、重组病毒FAV4-CXGA的免疫保护实验
SPF鸡分成3组，每组10只。将纯化的FAV4-CXGA病毒稀释至2.5×109vp/ml，在SPF鸡1日龄时进行颈部皮下注射免疫，每只SPF鸡接种0.2ml，以野生型FAdV-4接种为阳性对照(5×108vp/只)，PBS接种为阴性对照。逐日观察SPF鸡状态并记录死亡情况，培养至第21天，对于存活的SPF鸡，采血检测中和抗体情况。
结果可见，野生型FAdV-4接种的SPF鸡在第3日出现死亡，至第5日全部死亡；FAV4-CXGA和PBS接种的SPF鸡全部存活(如图9所示)。
对于仍然存活的SPF鸡，使用野生型FAdV-4进行颈部皮下注射攻毒，每只接种4×108vp，继续培养，逐日观察攻毒后的SPF鸡状态并记录死亡情况，直至第7天实验结束。
结果可见，PBS免疫组的SPF鸡攻毒后第3天开始出现死亡，至第4天全部死亡，而FAV4-CXGA免疫组SPF鸡攻毒后7天全部存活，表明重组病毒FAV4-CXGA减毒成功，并具有免疫保护作用(如图10所示)。
图11是SPF鸡经FAV4-CXGA病毒免疫后中和抗体产生情况。SPF鸡经FAV4-CXGA病毒免疫后28天，鸡翅静脉取血测定中和抗体，以PBS接种的SPF鸡作为对照。结果可见，经FAV4-CXGA免疫的SPF鸡的中和抗体效价均在2000以上，而PBS接种的SPF鸡血清中和抗体检测结果均为阴性。
以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。
Figure IDA0003141246250000011
Figure IDA0003141246250000021
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Figure IDA0003141246250000051

Claims (13)

1.一种禽4型腺病毒载体，其特征在于，禽4型腺病毒载体包括pBR322质粒的复制起点核酸序列、卡那霉素抗性基因核酸序列和禽4型腺病毒的基因组序列；所述禽4型腺病毒的基因组序列中，ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因均失活。
2.根据权利要求1所述的一种禽4型腺病毒载体，其特征在于，所述失活为ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因的核酸序列均至少部分缺失。
3.根据权利要求2所述的一种禽4型腺病毒载体，其特征在于，ORF2，ORF19A和GAM-1基因的核酸序列部分缺失，ORF1和ORF1B基因的核酸序列均全部缺失。
4.根据权利要求1所述的一种禽4型腺病毒载体，其特征在于，所述禽4型腺病毒的全基因组序列的GenBank号为MG547384。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的一种禽4型腺病毒载体，其特征在于，所述禽4型腺病毒的基因组序列中，ORF1-ORF1B-ORF2的编码区替换为外源目的基因的核酸序列。
6.根据权利要求5所述的一种禽4型腺病毒载体，其特征在于，所述的ORF1-ORF1B-ORF2的编码区由人巨细胞病毒启动子CMVp、mCherry基因和SV40 polyA加尾信号的核酸序列替代。
7.一种如权利要求1-6任意一项所述的禽4型腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括：
（1）以禽4型腺病毒的完整的基因组为骨架，构建含有pBR322质粒的复制起点核酸序列、卡那霉素抗性核酸序列的载体；
（2）构建多个中间质粒，以获得ORF1和/或ORF1B和/或ORF2和/或ORF19A和/或GAM-1基因失活的禽4型腺病毒基因组的多个人工改造片段；
（3）利用（2）中获得的人工改造片段，替换（1）的载体中的禽4型腺病毒基因组的相应片段，最终获得ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因均失活的禽4型腺病毒载体。
8.根据权利要求7所述的禽4型腺病毒载体的构建方法，其特征在于，包括：
（1）以pKFAV4-CX19A载体为基础，所述pKFAV4-CX19A载体包含PBR322质粒的复制起点、卡那霉素的抗性基因以及禽4型腺病毒的基因组；并且禽4型腺病毒的基因组中，ORF19A基因缺失，同时ORF1，ORF1B和ORF2基因的编码区由人巨细胞病毒启动子CMVp、mCherry基因和SV40 polyA加尾信号核酸序列替代；
（2）构建中间质粒，获得GAM-1基因部分缺失的人工改造片段；
（3）利用（2）中获得的人工改造片段，替换pKFAV4-CX19A载体中的相应片段，获得ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因至少部分缺失的禽4型腺病毒载体。
9.一种禽4型腺病毒减毒活疫苗，其特征在于，包括禽4型腺病毒，所述禽4型腺病毒的全基因组序列的GenBank号为MG547384；同时，所述禽4型腺病毒的基因组序列中，ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因均失活。
10.根据权利要求9所述的禽4型腺病毒减毒活疫苗，其特征在于， ORF1，ORF1B，ORF2，ORF19A以及GAM-1基因的核酸序列均至少部分缺失。
11.根据权利要求9所述的禽4型腺病毒减毒活疫苗，其特征在于，将如权利要求4或5所述的禽4型腺病毒载体线性化后转染细胞，利用重组病毒拯救技术，得到禽4型腺病毒减毒活疫苗。
12.如权利要求1-6任意一项所述的禽4型腺病毒载体、或权利要求9-11任意一项所述的禽4型腺病毒减毒活疫苗在制备预防由禽4型腺病毒感染引起的疾病的药物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于所述的疾病包括禽心包积液-包涵体肝炎综合征、包涵体肝炎、肌胃糜烂。
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