KR0179994B1 - 칠면조의 재조합 포진바이러스 및 이로부터 유도된 생존상태의 벡터 백신 - Google Patents

칠면조의 재조합 포진바이러스 및 이로부터 유도된 생존상태의 벡터 백신 Download PDF

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Abstract

본 발명은 칠면조의 재조합 포진성 바이러스(HVT)에 관한 것으로서, HVT 게놈의 삽입부위로 결합된 이종 유전자를 포함한다
또한 본 발명은 이종의 항원성 폴리펩타이드를 형질 발현하며 적당한 숙주 동물의 감염시 적당한 면역반응을 유도하는 재조합 HVT를 포함한 벡터 백신에 관한 것이다.

Description

칠면조의 재조합 포진바이러스 및 이로부터 유도된 생존 상태의 벡터 백신
제1도는 HVT 게놈의 Us 영역에 본질적으로 대응하는 DNA 단편의 제한 효소 지도이다.
제2도는 pMD 07 gal (A) pMD 12 gal(B)의 제한 효소 지도이다.
제3도는 pMD 40 (A) 와 pMD 44 gal(B)의 제한 효소 지도이다.
제4도는 pVEC04의 제한 효소 지도이다.
제5도는 pIB18의 제한 효소 지도이다.
제6도는 pNDVO4(A) 및 pNDVO5(B)의 제한 효소 지도이다.
본 발명은 HVT 게놈의 특정 삽입부위에 이종 핵산 서열이 도입된 칠면조의 재조합 포진바이러스(Herpesvirus of Turkey : HVT), HVT 게놈의 상기 삽입부위에서 유래된 DNA 서열이 양쪽에 연결된 이종 유전자를 함유하는 핵산 서열, 상기 핵산 서열을 함유하는 플라즈미드, 재조합 HVT 를 제조하는 방법, 재조합 HVT 로 감염시킨 세포 배양물, 재조합 HVT 를 함유하는 백신 및 이 백신의 제조 방법, 및 재조합 HVT 에 대한 항체를 함유하는 항혈청에 관한 것이다.
머레크 질환(Marek's disease) (MD)은 T-세포 임파종 및 말초신경 수초 탈락증을 일으키는 닭의 임파증식성 암으로서 양계업에 큰 경제적 손실을 가져온다.
머레크 질환 바이러스(MDV)는 MD 의 병인으로 확인되었다. 원형 MD 백신은 처음에는 칠면조로부터 분리된 혈청형 3 MD 바이러스인 칠면조의 포진바이러스(HVT)로 구성된다. 병원성, 발암성의 결핍, 생체내 및 시험관내에서의 양호한 복제 능력, 세포-제거 및 세포-연관 제제로서의 이용가능성 및 높은 보호 효능 때문에, HVT는 양계업에서 MD 를 효과적으로 구제하기 위한 매우 성공적이고 광범위하게 사용되는 안전한 백신으로서 확립되었다.
현재로서는, 일반적으로 생백신(live vaccine) 또는 불활성 백신(inactivated vaccine)이나, 해당 병원체의 서브 유니트로부터 유도되는 백신에 의하여 병원성 미생물의 감염으로부터 동물을 보호할 수 있다.
그러나, 상기 백신들은 많은 단점을 지닌다. 감독(減毒)된(attenuated) 생바이러스 백신의 경우, 부적절하게 감독된 병원성 미생물로 동물을 접종할 위험이 항상 존재한다. 또한, 감독된 바이러스는 병원성 상태(virulent state)로 복귀되어, 접종된 동물에 질병을 일으키고 다른 동물에 병원체를 전파시킬 가능성이 있다.
일반적으로, 불활성 백신은 낮은 정도의 면역성만을 유도하여 추가 면역화가 필요하다. 또한, 바이러스의 중화-유도 항원성 결정인자(antigenic determinant)가 불활성화 처리에 의해 변화되어 백신의 보호 효능을 감소시킬 수 있다.
또한, 조합된 생바이러스 백신의 문제점은 항원 성분이 상호 영향을 미치게 되어 하나 이상의 구성 성분의 효능을 감소시킨다는 것이다.
재조합 방법에 의하여 또는 자연 발생적으로 유도된 서브 유니트 백신도 또한 많은 단점을 나타내고 있다.
첫째, 면역 시스템에 비-복제 구조로 제공되는 폴리펩타이드 서브 유니트는 흔히 장기간 지속되는 면역성을 유도하지 못하여 보조제의 존재를 필요로 한다. 두번째는, 복제-구조로 제공된 것은 서브 유니트 구조로 제공된 것보다 더 효율적으로 면역성을 유도할 수 있다.
본 발명의 목적은 MD 에 대한 백신 제제 뿐만 아니라 가금류의 다른 면역 질환에 대하여 사용할 수 있는 재조합 HVT를 제공하는 것으로, 이것은 감독된 살아있는 병원체를 백신으로 사용하는 경우에 유발될 수 있는 어떤 잠재적 위험성을 제거하며, 보조제를 사용하지 않고 강력하게 체액성(humoral) 및 세포성 면역 시스템을 자극하며, 다른 항원 성분의 유해한 상호 간섭의 위험성 없이 다가 백신(multivalent vaccine)의 가능성을 제공한다.
본 발명에 따르면, 상기 재조합 HVT 는 HVT 에 이종인 폴리펩타이드를 코오딩하는 이종 핵산 서열을 함유함을 특징으로 하는데, 상기 핵산 서열은 제1도에서와 같이 ORF-1 의 말단에서부터 ORF-5 까지의 게놈 영역에 상응하는 HVT 게놈의 삽입부위에 도입되고, 본질적으로 제1도에 의하여 정의된 제한 효소 지도를 갖는 HVT 게놈의 DNA 단편내에 위치한다.
본 발명의 재조합 HVT는 예컨대, PB-THV1(Intervet International 에서 시판함) 또는 균주 FC126과 같은 어떤 HVT균주로부터도 유도될 수 있다.
본원에서 사용되고 있는 용어 재조합 HVT는 HVT에서 자연적으로 존재하는 유전자의 핵산 서열과 일치하지 않는 유전자 또는 그것의 일부를 코오드하는 이종 핵산서열(즉, DNA)을 바이러스 게놈내로 도입함으로써 유전적으로 변화된 감염성 바이러스를 의미한다.
재조합 HVT로 세포를 감염시키면, 재조합 HVT는 이종 폴리펩타이드 형태로 이종 유전자를 발현한다.
폴리펩타이드란 생물학적 활성을 갖는 아미노산의 분자쇄를 의미하는 것으로서, 특정 길이의 생성물을 의미하지는 않고, 필요에 따라 생체내에서 또는 시험관내에서, 예를 들면, 글리코실화, 아미드화, 카르복실화 또는 포스포릴화 등에 의해 변형될 수 있으며, 따라서, 펩타이드, 올리고펩타이드, 및 단백질은 폴리펩타이드의 정의내에 포함된다.
유용한 재조합 HVT의 필요조건은 게놈 HVT서열의 허용부위 또는 위치, 즉, 감염이나 복제에 필요한 HVT의 필수적인 기능을 파괴하지 않으면서, 이종 서열을 도입하는데 사용할 수 있는 부위 또는 위치에 이종 핵산 서열이 도입되어야 한다는 점이다. 이러한 부위를 삽입 부위라고 한다.
본 발명에서 말하는 삽입부위는 HVT의 필수적인 기능을 파괴하지 않으면서 이종 DNA를 도입시키는 것으로서 종래에는 기술되어 있지 않았다. 또한 본 명세서에서 개시된 이종 DNA서열을 도입하는데 사용되는 HVT 의 게놈부위의 제한 효소 지도에 대해서는 어떠한 정보도 제시되어 있지 않았다.
본 발명의 재조합 HVT를 제조하기 위하여 이종 DNA 서열을 도입하는데 사용되는 삽입 부위는 17.5kb 제한 단편내에 위치하며, 상기 제한 단편은 게놈 HVT DNA를 효소 Sau3A로 부분 절단함으로써 생성된다.
상기 단편은 제한 효소 매핑(mapping) (제1도)에 의해 상세히 분석되었으며, 상기 단편은 본질적으로 HVT 게놈의 Us 부위에 상응하며, 이것은 아마도 IRs 과 TRs 구조의 플랭킹 부분(flanking part)을 포함한다. HVT 게놈내의 Us 부위와 IRs 및 TRs 구조의 상대적인 위치는 이가라시등(Igarashi et al) (1987)에 의해 밝혀진바 있다.
본 명세서에 개시된 삽입부위는 각각 약 1.2kb, 3.5kb 및 2.8kb 의 인접한 3개의 XhoI 단편내에 위치하며, 1.2kb XhoI 단편의 왼쪽의 HVT 게놈내의 한 위치에서 시작하는 오픈 리딩 프레임(ORF-1)의 말단에서 시작된다(제1도). 약 5Kb 의 상기 삽입 부위는 비-코오딩 서열을 사이에 함유하고 있는 ORF 2, 3, 4 및 5를 지나서 계속된다. 상기에서 요약한 삽입 부위에 상응하는 DNA 서열은 바이러스의 필수적인 기능을 파괴하지 않고 HVT 게놈내로 유전자를 삽입하는데 사용할 수 있다.
특히, ORF-2 와 ORF-3은 외래 유전자의 도입에 사용할 수 있다.
ORF-2 와 ORF-3 내에서 외부 유전자의 바람직한 삽입 위치는 제1도에서 제시된 특정한 Bg1 II 제한 부위이다.
ORF-2 와 ORF-3 중 어느 하나의 특정한 Bg1 II 제한 부위에 β-갈락토시다제 유전자가 삽입된 재조합 바이러스는, 생존능력이 있고, 안정되고, 조직 배양에서 복제가 가능하고, 그것이 유도된 HVT 바이러스에 필적하는 정도로 닭을 감염시킨다. 플라즈미드 pMDO7gal 또는 pMD12gal(제2도)로 형질전환된 이. 콜리(E. coli)는 제1도에서 제시한 각 XhoI 단편을 수반하는 pMDO7 과 pMD12의 특정한 Bg1 II 위치로 β-gal 유전자를 삽입시킴으로써 제조된다. 상기 미생물, 즉, E. coli/BMDO7gal[기탁기관 : 프랑스 파리의 파스퇴르 연구소의 C.N.C.M.(Collection Nationals De Cultures De Microorganismes), 기탁일: 1989 년 11월 30일, 수탁번호 : I-914] 및 E. coli/pMD12gal[기탁기관 : C.N.C.M., 기탁일 : 1989년 11월 30일, 수탁번호 : 1-915] 로 기탁되어 있다.
다른 실시예에서는, ORF-4 와 ORF-5의 상당 부분을 HVT 게놈으로부터 제거하고 β-갈락토시다제 마커 유전자로 대체하여, ORF-2 또는 ORF-3 에 마커 유전자가 삽입된 재조합 HVT 바이러스와 유사한 재조합 바이러스를 제조하였다.
당업자라면 HVT 게놈의 DNA 서열의 경우, 각 HVT 바이러스 사이에 자연적인 변이가 존재할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 이러한 변이는 하나 이상의 뉴클레오티드가 결실, 치환, 삽입, 역위 또는 첨가됨으로써 발생되며, 이것은 가능하게는 하나 이상의 제한 우위 위치에 영향을 미칠 수 있고, 따라서, 제1도에 제시된 제한 효소 지도에 영향을 줄 수 있다.
또한, 유전 공학 기술을 사용하여 상술한 변이를 유도하는 것도 가능하며, 그결과 제1도에 제시된 지도와 관련된 제한 효소 지도를 갖는 DNA 서열을 생성한다. 이와 같이 연관된 제한 효소 지도의 특징을 갖는 HVT 게놈 부위내에 존재하는 삽입 부위에 삽입된 이종 유전자를 함유한 재조합 HVT도 또한 본 발명의 범위내에 포함되는 것은 명백하다. 또한 본 발명에 따라 확인된 삽입 부위는 필수적인 기능을 나타내지 않기 때문에, 상기 부위는 그 일부 또는 전부가 결실될 수 있으며, 그후 이종 유전자가 상기 결실 부위에 삽입될 수 있다. 본 발명의 삽입부위에 상응하는 HVT 게놈의 부위에 삽입되고 여기서 특정화된 이종 유전자를 함유하는 재조합 HVT도 본 발명의 일부를 형성한다.
요약하면, 본질적으로 상기에서 정의된 삽입부위는 이종 핵산 서열을 도입시키는데 사용할 수 있는 HVT 게놈내 부위의 위치임을 특징으로 한다.
본 발명의 바람직한 목적은 이종핵산 서열을 함유하는 재조합 HVT 를 제공하는 것으로서, 상기 핵산 서열은 본질적으로 4개의 ORF를 함유하는 SEQ ID NO:1에 제시된 HVT DNA 서열을 특징으로 하는 삽입부위에 도입된다. 209 개의 아미노산(SEQ ID NO : 2)의 작은 오픈 리딩 프레임 ORF-2는 뉴클레오티드 위치 316 번과 945번 사이에 위치하며, HVT 게놈내로 유전자를 삽입시키는데 사용되는 pMDO7의 Bg1 II 제한 부위를 포함하는데(제1도, SEQ ID NO : 1), 이로써 ORF-2 에 의해 코오드되는 가상의 폴리펩타이드는 생체내 또는 시험관내에서 바이러스의 존속에 필수적인 기능을 갖지 않는다는 것을 알 수 있다. 또한, 이것은 346 개의 아미노산(SEQ ID NO : 3)을 포함하는 ORF-3에도 적용되는데, 뉴클레오티드 위치 1084번과 2124 번(상보성)사이에서 역방향으로 번역되며, HVT 게놈내로 유전자를 삽입하기 위해 pMD 12 에 사용되는 Bgl II 제한 부위를 포함한다(제1도, SEQ ID NO : 1). ORF-4 는 뉴클레오티드 위치 2322 번과 3170 번(상보성, 제1도, SEQ ID NO : 1) 사이에서 IRs 방향으로 전사되는 반면, ORF-5 는 뉴클레오티드 위치 3320 번에서 시작하여 뉴클레오티드 위치 4504 번까지 계속되어(제1도, SEQ ID NO : 1), 394 개의 아미노산의 폴리펩타이드(SEQ ID NO : 5)를 코오딩한다.
본 발명에 의하면, 뉴클레오티드 위치 82번에서 ORF-1 의 말단 이후부터 시작되는 약 5kb 의 HVT 게놈의 연속적인 DNA 가닥은 SEQ ID NO:1 에 제시된 DNA 서열을 본질적으로 특징으로 하고, 4개의 오픈리딩 프레임과 그 사이의 비-코오딩 서열을 포함하는데, 이것을 바이러스의 필수적인 기능을 파괴하지 않고 HVT 게놈내로 이종 유전자를 삽입시키는데 적용할 수 있다.
특히, SEQ ID NO:1 에 제시된 뉴클레오티드 위치 316-945, 1084-2124, 2322-3170 과 3320-4504 사이의 DNA 서열이 외래 유전자의 삽입에 있어서 정의되어 있는데, 특정한 Bg1 II 제한 부위가 삽입에 가장 적당한 부위이다.
본 발명에 의한 삽입 부위를 특정하는 SEQ ID NO:1 에 제시된 DNA 서열의 경우, HVT 바이러스 사이에 자연발생 변이가 존재하여, 하나 이상의 뉴클레오티드의 결실, 치환, 삽입, 역위 등을 일으키는 것은 명백하다. 상기 변이는 또한 유전공학적 방법으로 생성할 수도 있다. 상기와 같이 특정화된 삽입부위와 동일하지는 않지만 그와 연관된 HVT 게놈의 부위에 도입된 이종 유전자를 함유하는 재조합 HVT도 또한 본 발명의 범위내에 포함된다. 예를 들면, SEQ ID NO:1 에 제시된 HVT 게놈의 핵산 서열에서 발생한 결실부에 이종 유전자를 도입시킬 수 있다.
SEQ ID NO:1 에 제시된 DNA 서열에 의해 여기서 정의되는 HVT 삽입 부위는 이종 핵산 서열을 도입하는데 사용할 수 있는 HVT 게놈내의 한 부위인 것을 특징으로 한다.
본 발명의 HVT 게놈내로 도입되는 이종 핵산 서열은 바이러스, 원핵세포, 진핵세포 또는 합성체 등 어떠한 공급원으로부터도 추출할 수 있다. 상기 핵산 서열은 병원체, 바람직하게는 조류의 병원체에서 추출될 수 있는 바, HVT 게놈내로의 삽입후 질환에 대해 면역성을 유도해 내기 위해 적용될 수 있다. 감염성 기관지염 바이러스(IBV), 머레크 질환 바이러스(MDV), 뉴우캣슬 질환 바이러스(NDV), 감염성 점액낭 질환 바이러스(IBDV), 닭의 빈혈 작용제(chicken Aneamia Agent:CAA), 레오 바이러스, 조류의 레트로 바이러스, 가금류 아데노 바이러스, 칠면조의 비강기관지염 바이러스, 에이메리아 종, 살모넬라 종, 이. 콜리(E. coli) 및 미코플라즈마 겔리셉티컴(Mycoplasma gallisepticum)을 HVT 게놈의 삽입부위내로 도입하는데 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 약리용 또는 진단용의 폴리펩타이드, 특히 림포카인, 인터페론 또는 사이토카인과 같은 면역 조절제를 코오딩하는 핵산 서열을 상기 삽입 부위내로 도입할 수 있다.
재조합 HVT 내의 이종 핵산 서열을 발현시키기 위한 필수적인 요건은 이종 핵산 서열에 작동가능하게 연결된 적당한 프로모터이다.
재조합 HVT 에 의하여 감염된 세포내에서 유전자 전사를 지시할 수 있는 프로모터라면 어떠한 진핵, 원핵 또는 바이러스성 프로모터라도 사용가능하며, 에컨대, 레트로바이러스의 긴 말단 반복부(long terminal repeat), SV40 에서 유도된 프로모터 또는 HVT 내에 존재하는 프로모터 등이 사용가능한 바, 이러한 것은 당업자들에게 명백하다.
생체내(in vivo) 상동성 (homologous) 재조합 기술은 이종 핵산 서열을 HVT 게놈내로 도입하는데 사용될 수 있다. 이것은 먼저 HVT와 재조합시키기 위한 재조합 DNA 분자를 제조함으로써 수행된다. 상기 분자는 적당한 플라즈미드, 코스미드(cosmid) 또는 파지로부터 유도될 수 있는데, 플라즈미드가 가장 바람직하며, 상기 분자는 이종 핵산 서열을 포함하며, 필요하다면 프로모터에 작동가능하게 연결된다.
상기 핵산 서열과 프로모터는 상기와 같이 재조합 DNA 분자에 서브클로닝된 삽입부위 서열을 함유하는 게놈 HVT DNA 단편내로 도입된다. 이종 핵산 서열의 측면에 위치한 삽입부위 서열은 바이러스 HVT 게놈과의 생체내 상동성 재조합이 일어나도록 하기 위해서는 적당한 길이이어야 한다. 원한다면, 본 명세서에서 정의된 HVT 의 삽입 부위 서열의 측면에 위치한,.예컨대, 동일하거나 상이한 병원체로부터 유도된 둘 이상의 상이한 이종 핵산 서열을 포함하는 구조체를 제조할 수 있다. 이러한 재조합 DNA 분자를 사용하여, 2 개 이상의 상이한 항원성 폴리펩타이드를 발현시켜서 다가의 백신을 제공하는 재조합 HVT를 생성할 수 있다. 두번째로, 적당한 HVT 서열이 측면위치한 이종의 핵산 서열을 함유하는 재조합 DNA 분자의 존재하에서, 세포, 예를 들면 닭의 배(embryo) 섬유아세포(CEF)를 HVT DNA 로 형질감염시킬 수 있는데, HVT 내의 삽입부위 서열과 재조합 DNA 분자내의 삽입부위 서열 사이에서 재조합이 일어난다. 또한, 재조합 DNA 분자서열 없이, 적당한 측면위치 삽입부위 서열이 측면위치한 이종 핵산 서열을 포함하는 핵산서열로 감염된 세포를 형질감염시켜서 재조합을 일으킬 수도 있다. 그 후, 재조합 바이러스의 자손을 세포 배양물에서 생성하고, 이들은 예컨대 하이브리드화(hybridization)에 의해, 이종 핵산 서열과 함께 통합된 유전자에 의해 코오드되는 효소 활성을 검출하거나, 또는 재조합 HVT에 의해 발현되는 항원성 이종 폴리펩타이드를 면역학적으로 검출함으로써, 유전형 또는 표현형에 의해 선별할 수 있다. 선별된 재조합 HVT는 세포 배양물내에서 다량으로 배양할 수 있으며, 그후 HVT에 의해 발현된 이종 폴리펩타이드 또는 재조합 HVT 함유물질을 배양액으로부터 회수할 수 있다.
본 발명에 따르면, 특정 병원체의 하나 이상의 다른 이종 폴리펩타이드를 발현하는 생존상태의 재조합 HVT는 이들 병원체에 감염되기 쉬운 동물, 특히 닭, 칠면조, 메추라기 비둘기(quails Pigeons) 및 호로호로새(guinea fowl) 등의 조류종을 면역화시키는데 사용할 수 있다. 이러한 생 벡터 백신으로 백신접종을 하면, 바람직하게는, 접종된 숙주내에서 재조합 HVT가, 복제되고, HVT 폴리펩타이드와 함께 이종의 폴리펩타이드가 생체내에서 발현된다. 그 다음에는 이종 면역원성 폴리펩타이드가 HVT 그 자체뿐만 아니라 상기 폴리펩타이드와의 면역학적 반응을 유발하게 될 것이다. 특정 병원체로부터 유도된 이종 폴리펩타이드가 보호 면역반응을 자극할 수 있다면, 본 발명의 재조합 HVT로 접종된 동물은 MDV에 의한 감염 뿐만 아니라 상기 병원체에 의한 추후 감염에 대해서도 면역성을 갖게 될 것이다. 따라서, 본 발명의 HVT게놈의 삽입부위로 도입된 이종의 핵산 서열은 생체내에서 계속적으로 발현되어, 병원체에 대해서 확실하고, 안전하고, 장기간 지속되는 면역성을 제공할 수 있다.
하나 이상의 다른 이종 폴리펩타이드를 함유하고 이를 발현하는 본 발명의 재조합 HVT는 단가(monovalent) 또는 다가(multivalent) 백신으로 제공될 수 있다.
본 발명의 재조합 HVT는 불활성 백신(inactivated vaccine)을 제조하는 데 사용될 수도 있다.
동물에 투여하는 경우, 본 발명의 재조합 HVT는 특히 에어로졸, 음료수 형태로 주어질 수 있고, 또는 경구적으로, 또는, 알을 통해서 접종될 수 있고, 또는 피내(intradermally), 피하내 또는 근육내 투여할 수도 있다.
본 발명의 또 다른 목적은, 본 발명에 따른 재조합 HVT에 의하여 발현되는 이종 폴리펩타이드를 함유하는 서브유니트 백신, 약학 제제 및 진단용 제제를 제조하는 것이다. 이것은 이종 폴리펩타이드의 발현을 촉진하는 조건하에서 상기 재조합 HVT로 형질 감염시킨 세포를 배양함으로써 이루어질 수 있다. 그후 이종 폴리펩타이드는 목적하는 용도에 따라 통상적인 기법으로 정제되고, 면역, 치료 또는 진단활성을 갖는 제제로 더욱 처리된다.
상술한 바와 같은, 특정 병원체에 대한 활성 면역화(active immunization)는 건강한 동물의 보호 처리로서 적용될 것이다. 특정 병원체로 이미 감염된 동물은, 항원성 폴리펩타이드를 코오딩하는 특정 병원체로부터 유도된 이종 유전자를 함유하는 본 발명의 재조합 HVT에 의해 유발된 항체를 함유하는 항혈청으로 치료할 수 있다. 본 발명의 재조합 HVT에 대한 항 혈청은 적당한 면역 반응을 유발하도록 유효량의 상기 재조합 HVT로 동물(예, 가금류)을 면역화시킴으로써 제조될 수 있다. 그후 상기 동물의 피를 채혈하여 항혈청을 제조할 수 있다.
[실시예 1]
1. HVT 게놈의 Us부위로부터 서브단편물(subfragment)의 분리
HVT 백신 균주 PB-THV1의 바이러스(네덜란드의 Intervet International 에서 시판됨)로 닭의 배 섬유아체포(CEF)를 감염시키고, 배양물이 90% 세포변성 효과(cytopathic effect) (CPE)에 도달할 때까지 로울러 병내에서 48시간 동안 배양했다. 세포를 수거하고, 인산염 완충 염수(PBS)로 세척하고, 1㎖ 당 1 내지 5×108세포의 농도가 되도록 20mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM EDTA중에 재현탁시켰다. SDS를 가하여 최종농도가 0.5%가 되도록 하고, 프로테인아제 K(Boehringer)를 가하여 200㎍/㎖가 되도록 하였다. 37℃에서 2시간 동안 배양한 후, 100㎍/㎖ 프로테인아제 K를 더 첨가하고, 1시간 동안 배양을 계속하였다 페놀/클로로포름(1:1) 혼합물로 2회 추출하고 에탄올로 핵산을 침전시켰다. 감염세포로부터 수득한 전체 DNA를 TE(10mM Tris-HCl, pH 7.5, 1mM EDTA)중에 용해시켜 0.5mg/㎖의 농도가 되도록 했다. 10㎍의 DNA를 효소 공급체에서 추천하는 조건에 따라 100㎕ 반응 부피로 37℃에서 10분 동안 0.5유니트의 Sau 3A(promega)와 반응시켰다. 반응 생성물을 0.8% 아가로즈 겔상에서 분리하고 16 내지 20kb 크기의 분획을 분리하였다. 100ng의 상기 DNA 단편을 4℃에서 30mM Tris-HCl(pH 7.5), 10mM MgCl2, 10mM DTT, 0.1mM ATP의 10㎕중의 Bam HI/EcoRI으로 절단된 λEMBL3 DNA(프로메가) 1㎍과 1U의 T4 DNA 리가제(베링거)를 첨가하여 하룻밤 동안 결찰시켰다. 결찰후, 반응 혼합물의 1/10을 10㎕ 부피에서 Bam HI으로 절단하고, 시험관내에서 시판용 추출물(프로메가)을 사용하여 DNA를 패키징하였다. 재조합 파지를 LE 392나 K802와 같은 적당한 이.콜리 숙주 균주상에 약 100 pfu/n플레이트의 밀도로 접종하였다. 벤톤 앤드 데이비스(Benton Davis)의 방법(1978)으로 니트로셀룰로즈 필터를 사용하여 디쉬(dish)의 레플리카(replica)를 이중으로 제조하였다. 첫번째 셋트는 비감염된 CEF의32P-표지된 DNA와 하이브리드 시키고, 두번째 셋트는 HVT 감염 세포의32P-표지된 DNA와 하이브리드시켰다(Maniatis 등, 1982). 세척하고 X-선 필름에 노출시킨 후, 이중 필터의 상을 정방향으로 포개놓고 감염세포로부터 제조된 프로브와 특이적으로 시그날을 나타내는 몇개의 플라크를 분리하고 그것으로부터의 파지를 증폭시켰다. 상기 파지중 하나(λHVTO4로 명명됨)는 17.5kb의 삽입물의 제한 효소 지도로 상세히 분석되었다(제1도). 이 단편에 존재하는 서열은 반복 구조물(이가라시 등, 1987)의 플랭킹 부위를 포함하여 HVT게놈의 Us부위에 거의 대응하였다.
2. Us부위의 서브단편을 사용한 HVT게놈내로의 β-갈락토시다제 유전자의 삽입.
생체내에서 완전한 바이러스 게놈 DNA와의 재조합이 일어나도록 하기 위해서 λHVTO4의 삽입체에 존재하는 2개의 XhoI 단편은 적당한 위치에 특정한 Bgℓ II 제한 부위를 포함하였다. 상기의 2개 단편은 XhoI절단 및 SalI으로 절단한 플라즈미드 벡터 pGEM3Z(프로메가)와의 결찰에 의하여 λHVTO4로부터 서브클로닝되었다. 수득한 플라즈미드 구조체 pMDO7과 pMD 12은 제1도에 제시된 XhoI 단편을 포함 하는데, 이것은 특정한 Bgℓ II 제한 부위에 의하여 선형화되고, 4.0kb 발현 카세트와 결찰되었는데, 이 카세트는 BamHI 부위에 의해 플랭킹되고 SV40의 초기 프로모터에 의해 조절된 이.콜리의 β-갈락토시다제 유전자를 포함하였다. 이 발현 카세트는 Pharmacia에서 시판되는 플라스미드 pCH110로부터 유도되었는데, 하기 구조를 갖는 이중 나선의 합성 올리고뉴클레오티드에 의해 pCH110에 존재하는 것과 같은 SV40 복제 기점에 인접한 72bp Sph I 단편을 대체함으로써 유도되었다.
5'- GGATCCGTCGACCATG -3'
3'- GTACCCTAGGCAGCTG-5'
pCH110의 2개 SphI 제한 부위 사이에 링커를 삽입하면 각 부위에 SphI에 대한 인지 서열을 회복하지 않으면서 SV40 초기 프로모터의 상류의 BamHI 및 SalI 부위를 생성하게 된다. 그후 BamHI로 상기 구조체를 절단하여 pMD 07과 pMD 12의 Bal II 부위에 삽입시켜서 제2도의 제한 효소 지도를 갖는 플라즈미드 pMD 07gal과 pMD 12 gal을 생성하기 위한 4.0kb 발현 카세트를 생성하였다. 플라즈미드 pMD07gal과 pMD12gal의 선형 DNA를_ HVT 감염세포로부터 제조한 전체 DNA와 함께 Graham 및 v.d. Eb(1973)에 의한 인산 칼슘 DNA 침전에 기초한 방법으로 CEF에 삽입시켰다. HVT 상동성 서열에 의해 플랭킹된 β-갈락토시다제 유전자를 함유하는 구조체로부터 2㎍의 플라즈미드 DNA를, HVT 감염세포의 DNA 15㎍과 최종부피 560㎕ H2O에서 혼합하고 750㎕의 HBSP(20mM KCl, 560mM NaCl, 24mM 글루코스, 3mM Na2HPO4, 100mM HEPES, pH 7.0)에 첨가했다. 1M CaCl2용액 190㎕ 를 서서히 첨가하고 30분 동안 실온에서 혼합물을 배양하여 침전물을 형성시켰다. 한편, 2%의 송아지 태아 혈청으로 보충한 이글(Eagle) 최소 필수 배지의 글래스고우(Glasgow) 변형에 기초한 조성을 갖는 배지 6/B8 중의 10일된 태아의 제2CEF 현탁액 15㎖를 5×105세포/㎖의 밀도로 지름 10cm 디쉬에 접종했다. 인산칼슘 침전시킨 DNA를 세포 현탁액에 서서히 첨가하고, 상기 디쉬를 공기중 5% CO2를 함유하는 습윤 배양기내에서 37℃로 항온배양했다. 5시간 후, 배지를 제거하고 동일한 체적의 HBSP와 30% 글리세롤을 함유한 용액 10㎖를 세포상에 부었다.
1 내지 2분간의 배양 후, 용액을 제거하고 세포를 배지 6/B8으로 세척하며, 바이러스 CPE가 나타날 때까지 3 내지 5일 동안 신선한 배지로 상기 디쉬를 항온처리했다. β-갈락토시다제 활성을 나타내는 재조합 HVT 바이러스를 포함한 플라크를, Bluogal(Gibco-BRL) 기질, 5-브로모-4-클로로-3-인돌릴-β-D-갈락토시드의 화학적 유도체를 청색의 반응 생성물로 전환시킬 수 있는 능력에 의하여 확인했다. 디메틸설폭사이드 중에 새로 용해된 Bluogal 0.2mg/㎖로 플라크를 염색시키고 청색의 플라크가 검출될 때까지 항온처리하였다. pMD07과 pMD12의 β-갈락토시다제 유도체로 형질감염시키면 상당한 퍼센트(5)의 청색 플라크를 생성하였다. pMD07과 pMD12로 형질감염된 일련의 포지티브 플라크를 현미경으로 선별하고 새로운 CEF와 함께 혼합하여 바이러스를 증폭시켰다. CPE가 관찰될 때 세포를 수거하고, 1% BSA(소 혈청 알부민)을 함유하는 캘스탭-완충액(calstab-buffer) (74.35g 슈크로즈, 0.52g KH2PO4, 2.58g Na2HPO4.2H2O 및 0.92g 소듐 글루타미네이트/1ℓ의 H2O)중에서, 3분 동안 15℃에서 바이브라셀(Vibracell) 300 컵 호온 장치 내에 추출물을 함유한 플라스틱 튜브를 초음파 처리 함으로써 세포를 분해시켰다. 역가 측정을 위하여, 세포-비함유 바이러스를 새로운 CEF상에 접종하고, 청색-염색된 재조합 HVT 바이러스를 함유하는 플라크를 검출하고, 상술한 바와 같이 증폭시켰다. Bluogal로 배양물을 염색할 때 포지티브로 나타나는 바이러스 플라크가 95% 이상이 될 때까지 상기 사이클을 반복했다. 특히 pMD07로부터 유도된 A4-1/A10-4와 pMD12에서 유도된 E1/E2로 명명된 4개의 클론을 닭의 백신 접종 실험을 실시하는 바이러스 원료 제제로 선별했다. 또한, 원료의 일부를 사용하여 감염된 CEF로부터 전체 DNA를 제조하였다. XhoI 으로 절단한 DNA를 아가로즈 겔에 전개시키고, 메니아티스 등(Maniatis et al.)의 방법(1982)에 의해 니트로셀룰로즈 시트로 이동시켰다. 프로브로서 비차단성(non-disrupted) XhoI 단편을 사용하는, 비-재조합 HVT 바이러스의 XhoI 절단 DNA와 비교한 A4-1/A10-4 및 E1/E2 샘플의 하이브리드화는, pMD07과 pMD12의 원래의 단편 크기보다 증가된 것으로 나타났으며, 이것은 β-갈락토시다제 카셋트의 삽입에 기인한다.
β-갈락토시다제 마커 유전자를 사용하여, ORF-4 과 ORF-5 도 또한 삽입부위로서 사용될 수 있음을 보였다. 이러한 목적을 위하여, ORF-4의 뉴클레오티드 2311번과 ORF-5의 3428번 위치 사이에 존재하는 pMDl2의 1117bp Spel 단편을 16-염기의 합성 이중나선 올리고머로 대체시켜, pMD12에 새로운 특징적인 Sal I 부위를 생성시킴으로써, ORF-4 와 ORF-5의 상당 부분을 결실시켰다. 상기 플라즈미드(pMD40)의 제한효소지도는 제3a도에 나타나 있다. 특정한 Bam HI 부위를 Sal I으로 대체하고, 그후 상술한 바와 같이 72-bp Sph I 단편을 Bam HI과 Sal I 제한부위 둘다를 함유하는 이중나선 합성 링커로 대체시킴으로써, 삽입에 사용되는 β-갈락토시다제 마커 유전자를 pCH110(파마시아)로부터 유도하였다.
β-갈락토시다제 마커 유전자는 Sal I 부위와 인접하는 4.0kb DNA 단편에 존재하며, pMD40에 새로운 Sal I 부위를 생성할 수 있도록 전달되어 플라즈미드 pMD44를 생성할 수 있다(제3b도 참조).
pMD44의 선형 DNA를 HVT 감염 세포의 DNA와 함께 상술한 바와 같이 2차 CEF에 형질감염시켰다. CPE가 나타날 때까지 플레이트를 항온처리한다. Bluogal로 배양 디쉬를 염색한 결과, β-갈락토시다제 활성을 나타내는 HVT 플라크가 상당 비율로 확인되었다.
이러한 결과는 ORF-2 와 ORF-3의 마커 유전자의 삽입후 행해진 초기 관찰 결과와 비교할만하다.
[실시예 2]
β-갈락토시다제 활성을 나타내는 재조합 HVT로의 닭의 백신접종
생후 수일된 백색 레그호온(leghorn) 닭에 바이러스 A4-1 및 E1를 50 또는 1000 pfu로 근육내 투여하였다. 모(母) HVT 백신 균주 PB-THVI의 동량을 대조군 동물에 투여했다. 8일 및 15일경에 혈액을 채혈하고 백혈구 세포를 Ficoll/MyPaque 구배로 분리했다. 백혈구 세포를 2차 CEF에 접종하고, 접종한 세포수에 대한 플라크수를 측정했다. 상기의 적정 결과는 표 1에 나타냈으며, pMD07과 pMD12 각각에 존재하는 각 Xho I서브단편내의 특정한 Bal II 제한 부위에 삽입된 β-갈락토시다제 유전자를 포함하는 재조합 HVT 바이러스는, 비-재조합 PB-THVI 백신 균주에 비해 비교될만한 농도 및 횟수로 닭의 바이러스 혈중을 유도할 수 있는 것으로 나타났다. CEF상에 일부 백혈구 세포를 Bluogal로 염색하면, 감염된 조류에서 회수한 바이러스 90% 이상이 β-갈락토시다제 유전자를 여전히 발현하는 것을 보였다. 또한, β-갈락토시다제에 대한 상당한 ELISA 항체 역가는 접종 35일 후 각 동물의 혈청 샘플내에서 관찰되었다. 따라서, pMD07과 pMD12에 존재하는 인접 서열에 의해 정의되는 HVT 게놈의 Us의 특정 부위는, 감염 및 복제에 필요한 HVT 바이러스의 필수적인 기능에 영향을 미치지 않고 외부 유전자의 안정한 결합에 사용될 수 있다. 또한, 상기 부위에 삽입된 외부 유전자는 감염 동물의 혈청내에 높은 수준의 항체 역가를 유도할 수 있는 기능적 단백질을 발현한다.
* CEF 플레이트 상의 WBC 접종후 5일째에 계측. 다른 것은 접종후 3일째에 계측.
[실시예 3]
HVT의 Us 영역의 서열분석
제1도에 제시된 HVT 게놈의 각 Xho I 제한 단편에 대응하는 플라즈미드 pMD07 과 pMD12 의 삽입체는, 생거 등(Sanger et al.) (1977)에 의한 디데옥시 사슬 종결 반응에서 이중 가닥 DNA 제제를 사용하여 뉴클레오티드 서열 분석되었다. 반응의 프라이밍(Priming)은 각 HVT 게놈 단편에 플랭킹된 pGEM3Z 플라즈미드 벡터의 SP6 과 T7 프로모터 부위내로부터 행해졌다. 각 단편에 들어가는 순차적인 결실을 한 방향으로만 도입함으로써 분석을 완료했다. 이러한 연속적 결실은 효소 엑소뉴클레아제-III 을 사용하여 도입되는데, 이 효소는 이중 가닥 DNA 를 인지하여 3'→5' 방향으로 이중 나선의 한가닥을 가수분해하는 단일 가닥 엑소뉴클레아제이다. 엑소뉴클레아제 III 에 의해 분해되는 플라즈미드 벡터의 프라이머 개시부위 SP6 또는 T7 를 보호하는 3' 단일 가닥 말단을 생성하는 제2의 제한 효소와 조합 하여, 분석할 단편의 말단 근처에 있는 블런트 말단이나 5'-돌출부를 생성하는 제한 부위를 선별하는 것은, 효소가 pMD07 이나 pMDl2 에 존재하는 삽입된 DNA 단편의 한쪽 가닥을 제거하도록 한다. 30초 간격으로 반응 혼합물로부터 샘플을 취하고, 헤니코프(Henikoff) (1984)에 의한 방법으로 처리하여, 적당한 이. 콜리 숙주 균주에 형질전환시키는 다시 원형화된 DNA 분자를 생성하였다. 각 콜로니의 플라즈미드 DNA 미니제제(minipreparations)는 pMD07 과 pMDl2 각각의 본래의 1.2 및 3.5kb 단편물속에 도입되는 결실체의 크기에 대한 제한 효소 매핑에 의하여 분석했다. 한방향으로 단편에 들어가는 연속적 결실부를 함유하는 일련의 시료들을 사슬 종결 반응에서 미니제제의 이중가닥 DNA 를 사용하는 뉴클레오티드 시퀸싱법으로 분석했다. 반응 생성물을 변성 아크릴아미드겔 상에서 분리하고 방사선 사진에 의해 x-선 필름으로 가시화시켰다. 디지타이저(digitizer)를 사용하여 밴드의 양상을 해독하고 데이타를 종합하여, 숏트-건 조절기(shot-gun handler)와 진-메스터 워크스테이숀(Gene-Master workstation) (Bio-Rad)의 다른 소프트 웨어를 사용하여 분석했다.
pMD12 에 존재하는 XhoI 단편에 인접한 XhoI 제한 단편을 λHVT04(제1도)로부터 pMD36에 서브클로닝시키고, 상술한 것과 동일한 방법에 따라 부분서열 결정하였다.
[실시예 4]
유전자 삽입물의 HVT 게놈내의 부위를 확인하고 상세히 분석한 후, β-갈락토시다제를 코오딩하는 부위 이외의 다른 유전자를 갖는 재조합 HVT 바이러스를 제조할 수 있다. 그러나, 특히, 연관된 및 비-연관된 조류 병원체로부터의 적당한 항원을 코오드하는 유전자들이 관심을 끄는 것들이다.
상기의 실례에 대해서는 후술할 것이다. 관심있는 유전자는 감염성 기관지염 바이러스(IBV)의 페플로머(peplomer) 단백질에 대한 157kd 의 전구체 분자를 코오드하며, 상기 바이러스는 닭의 전염성이 강한 코로나바이러스이다. 이 글리코실화 단백질은 스파이크(spike)로도 알려져 있는 전형적인 표면 구조체의 주성분으로서 IBV 를 포함한 모든 코로나바이러스에 존재한다. 상기 유전자의 cDNA 복제물은 메사츄세츠 혈청형에 속하는 균주인 IBV 균주 M4l 로부터 분리하고, RSV(Rous Sarcoma Virus)의 긴-말단 반복서열(LTR)로부터 유도되는 프로모터 요소의 뒷쪽에 배치되었다. 프로모터를 함유한 유전자를 β-갈락토시다제 발현 카세트의 삽입을 위해 전술한 바와 동일하게 pMD07 의 특정한 Bgl II 제한부위로 전이시키고, HVT 의 바이러스 게놈에 재조합시켰다. 바이러스의 재조합체 자손을 스파이크 유전자의 발현여부에 대해 스크리닝하고, 포지티브 재조합체를 분리하고, 제한 희석액으로 한번이상의 플레이팅에 의해 클로닝하였다. 재조합 IB/HVT 바이러스의 균질 원료액을 생성하고, 생체내 및 시험관내에서 특성을 규명하는데 사용했다.
1. IBV균주 M4l 의 스파이크 유전자의 분리
IBV 균주 M 41로부터 분리한 바이러스를 에그(egg) 1 개당 10 중기(median) 에그 감염량으로 요막강(allentoic cavity)에 접종함으로써 10일된 배를 가진 에그에서 증식시켰다. 37℃에서 24시간 동안 배양한 후, 에그를 4℃에서 하룻밤 동안 냉각시켰다. 요막액을 수거하고 얼음에서 조심스럽게 냉각상태로 유지하였다. 적혈구 세포와 찌꺼기를 4℃에서 6000×g 로 30분간 원심분리하여 제거하고, 상층액을 4℃에서 4시간동안 베크만(Beckmann) 타입 19 로터로 54000×g 에서 원심분리하여 바이러스를 펠렛화시켰다. 이것을 주사기 바늘로 반복 통과시킴으로써 냉각 TNE(10mM Tris-HCl, 100mM NaCl, 1mM EDTA, pH 7.5)중에 재현탁시키고 TNE 중의 20-60% 슈크로즈의 선형 구배 32㎖위에 층지게 하였다. 4℃에서 SW28 로터로 24000rpm 에서 하룻밤동안 원심분리한 후, 주사기로 튜브에 구멍을 뚫어서 돌출된 측벽을 통해 바이러스 밴드를 회수했다. 2배 부피의 TNE 로 희석한 후, 바이러스를 SW28 로터에서 18000rpm으로 90분 동안(4℃) 원심분리하여 펠렛화한 후 TNE 소량에 재현탁시키고 SDS(황산도데실나트륨)를 첨가하여 최종 농도 0.5% 가 되도록 하였다. 2시간동안(37℃) 200㎍/㎖ 의 프로테인아제 K(베링거)로 상기 제제를 분해시키고, 페놀/클로로포름(1:1) 혼합물로 2 회 추출했다. 수층의 바이러스 RNA 를 0.1M 소듐 아세테이트(pH 6.0) 존재하에 -20℃에서 2 배 부피의 에탄올로 침전시켰다. 원심분리하고 에탄올로 상기 튜브를 헹군 다음, 진공하에서 펠렛을 건조시키고, 멸균수에 용해시켜 0.5mg/㎖ 농도의 RNA 를 얻었다. 아가로즈 겔 전기 영동으로 확인했을 때 상기 제제는 90% 이상의 IBV 게놈 RNA 를 함유하였으며, 이것을 -20℃ 에서 보관했다. 제1가닥의 cDNA 합성은 75㎕ 반응 부피중 5㎍의 바이러스 RNA 를 사용하여 AMV 역전사효소 존재하에서 올리고(dT)로 프라이밍되었다. 44℃에서 30분간 항온처리한 후, DNA/RNA 하이브리드를 3 분간 100℃에서 가열하여 변성시킨 후, 20℃에서 2시간 동안 반응물을 항온처리하여 이.콜리 DNA 폴리머라제 I 의 큰 단편의 존재하에서 제2가닥을 합성했다. 에탄올로 cDNA 를 침전시키고 37℃에서 30분동안 200㎕ 반응부피 중의 S-뉴클레아제 10 유니트로 절단시켰다. 반응 생성물을 10mM Tris-HCl, 5mM EDTA, 500mM NaCl, pH 7.5 중의 5-20% 슈크로즈 구배 3.2㎖l 위에 층지게 하고, 15℃에서 16시간동안 SW65 로터에서 30000 rpm으로 원심분리했다. 500 내지 5000 bp 크기의 침강 물질을 회수하고 에탄올로 침전시켰으며, 0.1 SSC(15mM NaCl, 1.5mM 시트르산 나트륨) 20㎕ 중에 용해시켰다. 효소 공급체에서 추천하는 조건에 따라 30㎕ 반응부피 중에서 15 유니트 터미날 트랜스퍼라제(Gibco-BRL)로 37℃에서 2분간 항온처리함으로써, 이중 가닥 cDNA 의 말단을 10 내지 15 dG 잔기로 연장시켰다. 5mM EDTA로 반응을 중단시켰다. l0ng 의 말단 cDNA 를 최종부피 10㎕ TEN 중에 포스포릴화 합성 올리고머 5'-dAATTCCCCCCCCCCC-3' 25몰 초과량과 함께 65℃에서 2분동안 가열했으며 50℃에서 하룻밤동안 항온처리함으로써 함께 어닐링했다. EcoRI 절단된 λgt10 DNA(Huynh et al., 1985) 10㎍로의 결찰은, 30mM Tris-HCl, pH 7.5, 10mM MgCl, 10mM DTT, 0.1mM ATP의 20㎕ 중에서, T4 DNA 리가제 1 유니트를 첨가하고 4℃에서 하룻밤동안 항온처리함으로써 수행되었다. DNA 를 시험관내 패키징하여 반응 혼합물(프로메가)에 첨가하고 IBV 균주 M41 의 cDNA 라이브러리를 이. 콜리의 hf1A 균주상에 플레이팅한 후 재조합 파지에 대해 선별함으로써 확립하였다.
상기 라이브러리를 이.콜리가 깔린 페트리 디쉬내에 100 내지 200 pfu 를 플레이팅함으로써 스파이크(spike) 단백질 단편을 코오딩한 cDNA클론에 대해 스크리닝했다. 니트로셀룰로즈의 복제 필터를 제조하고(벤톤 및 데이비스,1978), 42℃에서 하룻밤동안 10mM Tris-HCℓ, pH 7.5, 1M NaCl 0.1% SDS 및 4x 덴하르트 용액을 함유하는 하이브리드화 용액(메니아티스 등, 1982) 중에서 P-표지된 함성 올리고머와 함께 항온 처리하였다.
상기 하이브리드화에서 프로브로 사용된 3개의 합성 올리고머는 다음의 뉴클레오티드 서열구조를 포함했다 :
상기의 프로브중 하나 또는 바람직하게는 두개를 갖는 시그날을 제공하는 재조합 파지를 선별하고, 표준방법(매니아티스 등, 1982)에 의해 플라크를 정제했다. λ 파지 재조합물의 cDNA 단편에 EcoRI 제한 부위를 측면연결시키고 플라즈미드 클로닝 벡터 pGEM3Z(프로메가)의 EcoRI 부위에 그대로 이동시켰다. 2개의 후보에 대한 제한 효소 분석 및 부분적 시퀸싱은 하나는 스파이크 유전자의 완전한 S1을 코오드 하고 다른 하나는 S2부위를 코오드한다는 것을 보였다. 상기 2 개의 DNA 단편 서열은 부분적으로 서로 중복되며 특히 S1/S2연결부 근처의 특정한 MIuI-제한 부위가 중복되었다. 그후 이 부위는 상술한 바와 같이 2 개 단편을 결합시키는데 사용할 수 있으며, 그 결과 3.7kb 의 BamHI삽입물을 갖는 플라즈미드 구조체가 형성되며, 이것은 IBV 균주 M4l 로부터 단백질 페플로머(peplomer)의 전구체를 코오딩한 완전한 유전자를 수반했다.
2. LTR 프로모터에 의해 조절되는 M4l 의 스파이크 유전자를 코오딩하는 HVT 재조합 플라즈미드 pIB18의 제조
HVT 바이러스의 게놈으로 삽입한 이후, 외부 유전자의 형질 발현을 지시할 수 있는 강력한 프로모터를 RSV 의 LTR 서열로부터 선별했다. 이 프로모터는 pRSVcat(고르만, 등, 1982) 의 580bp NdeI/HindIII 제한 단편물상에 지도화되어 있으며, 이것을 단편의 양끝에 이중 가닥의 합성 링커를 이용하여 pGEM3Z(프로메가)의 HindIII 와 PstI 부위 사이에 삽입했다. 벡터 pGEM3Z 의 HindIII 부위와 LTR-프로모터를 수반한 RSV 단편의 NdeI 부위 사이의 연결은, 한끝은 HindIII 이고 다른 한끝은 NdeI 인 결합성 말단을 함유한 30bp 의 링커로 실시되었다. 그러나, 결찰한 후에, 두 제한 부위는 6bp 의 인지 서열의 외부 뉴클레오티드에서의 변형으로 인해 회복되지 않는다. 상기 두 부위가 제거된 것에 부가하여, 링커자체에 존재하는 새로운 제한부위(BamHI)가 상응하는 부위에서 생성되었다. 제2 의 20bp 링커는 LTR 단편의 HindIII 부위를 pGEM3Z 의 PstI 부위에 연결하여 합성되며, 이 경우 각 말단의 인지 서열을 파괴하지 않으며, 3개의 용이한 특정 제한 부위, BgIII, XhoI 및 EcoRV 가 pGEM3Z 의 폴리링커에 이미 존재했던 제한부위(예, PstI, SalI, XhoI 및 BamHI)에 첨가된다. 따라서 pGEM3Z 에서 생성된 유도체(pVECO1)는 650bp의 제한 단편을 포함하는데 이것은 LTR 프로모터 서열의 바로뒤에 외부 유전자의 삽입에 이용되는 7개의 제한 부위를 수반한다. 650bp 단편은 BamHI 제한부위의 한 말단에 플랭킹되며 이것은 pMD07 의 1.2kb HVT 삽입물에 존재하는 특정한 BgIII부위에 그대로 전달되었다. 상기 두 제한효소로 생성된 결합성 말단이 양립하지만 결찰물은 BgIII 나 BamHI 에 대한 본래의 인지 서열을 회복하지 못한다. TRs 쪽 배향으로 LTR 을 수반하는 구조물중 하나는 pVEC04 로 명명되며 제한효소 매핑으로 확인되었다(제4도). 일반적인 HVT 재조합 벡터의 구조는 LTR 프로모터의 바로 하류에 외부 유전자를 삽입하는 것이 가능하며, 그후 완전한 발현 카세트를 생체내 재조합에 의해 HVT 게놈속으로 통합시킬 수 있다. LTR 하류의 상이한 제한부위, 특히 BaIII, XhoI 및 EcoRV 의 위치는 복수개의 유전자 삽입물조차 관찰할 수 있는 방식으로 고안되었다. 상기 벡터의 첫번째 용도는 IBV 균주 M41 의 스파이크 유전자를 발현하는 재조합 HVT 바이러스를 제조하는 것이며, 이의 분리 방법은 전술한 바와 같다. M41의 스파이크 유전자를 수반하는 3.7kb BamHI 제한 단편물을 LTR 프로모터의 하류에 있는 pVEC04 의 특정한 BgIII 부위에 삽입했다. 또한 상기 조작은 결찰 이후에 제한 부위중 어느것도 회복시키지 않는다. LTR 프로모터에 비해 정방향으로 삽입된 유전자를 갖는 후보중 하나를 제한 효소매핑으로 분석하여, 제5도에 제시된 예상 구조를 확인하였다. 이 플라즈미드는 pIB18 이며 그후 닭의 태아 섬유아세포(CEF) 의 동시 형질감염에 사용되었다.
3. IBV의 스파이크 유전자의 HVT내로의 게놈삽입 및 페플로머 단백질의 발현
pIB18 의 선형 DNA 를 β-갈락토시다제 재조합물 제조에 대해 실시예 I 에서 기술했던 방법에 따라 HVT 감염된 닭 세포의 전체 DNA 와 함께 형질감염시켰다.
스파이크 단백질을 발현하는 HVT 재조합물의 검출은 IBV 에 대한 단가 또는 다가의 혈청을 사용하여 면역형광 염색법으로 실시되었다. 형질감염 이후 제1차 배양물을 신선한 CEF 상에 1 회 통과시키고 실시예 1 에서 기재한 바대로 배양한 후 초음파 처리를 했다. 무세포 용해물의 역가를 측정한 후, CEF 를 갖는 마이크로 타이터 플레이트를 웰 당 1 이하의 pfu 를 사용하여 제한 희석액으로 감염시키고, CPE 가 검출될 때까지 배양했다. 각 웰의 세포 현탁액을 신선한 CEF 와 함께 이중 마이크로타이터 플레이트에 나누고 2 일간 재배양했다. 플레이트 1 개를 고정하고, IBV 특이 혈청으로 염색하고, IBV-포지티브 염색을 나타내는 HVT 플라크의 대부분을 함유하는 웰을 현미경으로 면역-형광성에 대하여 관찰하면서 계수했다.
감염된 생존 세포를 이중 마이크로타이터 플레이트의 상응하는 웰로부터 회수하고, 신선한 CEF 로 1 또는 2 회 통과시킴으로써 증폭시켰다. 제한 희석액을 이용한 클로닝 방법을 여러차례 반복한 결과, 감염된 세포 배양물상에서 IBV 특이성 면역형광 분석에서 양성으로 모두 염색된 재조합 HV를 바이러스를 몇개 독립적으로 분리해냈다.
[실시예 5]
1. 뉴우캣슬병 바이러스(NDV)의 융합물(F) 및 헤마글루티닌(HN) 단백질을 코오딩하는 유전자의 분리
NDV 백신 균주 클론 30(네델란드, Intervet International)로부터 분리한 바이러스를 30시간동안 배아 상태의 에그 상에서 증식시키고, 4℃에서 하룻밤동안 항온 처리한 후 요막 유체(allantoic fluid)를 수거했다. 단일 슈크로즈 그레디언트로 바이러스를 정제하고, 게놈 RNA를 SDS 존재하에 프로테인아제 K로 절단하여 추출했다.
제1가닥 cDNA 합성은 반응을 프라이밍(priming)하기 위래 20㎍/㎖ 의 임의의 10-염기 올리고머를 사용하여 역전사 효소로 실시했다.
제2가닥 합성은 S1-처리 및 이후 λgt10 벡터에 삽입시키는 것을 포함하는 하기의 단계들은 실시예 4 의 섹션 1에서 전술한 바와 같이 실시했다.
F-유전자 특이 서열에 대한 라이브러리의 스크리닝은32P-표지화 올리고뉴클레오티드로의 플라크 하이브리드화에 의해 수행되었다.
상기 서열은 코오딩 부위의 5' 및 3' 말단을 각각 인지하였으며, HN-유전자 서열은 상기 올리고뉴클레오티드로 분석하였다.
상기 프로브의 서열은 NDV-균주 오스트랄리아-빅토리아(맥긴, 등, 1986), 이탈리앤(에스피온, 등, 1987 및 웨머스, 등,1987), 뷰데트(챔버스, 등, 1986 및 밀러, 등,1986) 및 D26(세이토, 등, 1987)상에 공표된 데이타를 비교함으로써 고안되었다.
적어도 2 개의 프로브를 갖는 시그날을 제공하는 포지티브 후보를 분리하고 제한 효소 매핑에 의해 특정화하였다. 이것들로부터 NDV 균주-클론 30의 F 및 HN 을 각각 갖는 2개를 선별했다.
상기 DNA 삽입물을 플라즈미드 벡터 pGEM4Z로 전달하고 F-유전자 및 HN-유전자의 실제 코오딩 부위의 상류 또는 하류의 초과 서열이나 중복서열을 제거하기 위해 엑소뉴클레아제 Bal 31로 처리했다.
이렇게 하여 BamHI 제한부위에 의해 플랭킹된 F 및 HN 각각을 코오딩한 완전한 유전자를 함유하는 플라즈미드 pNDV01 및 pNDVO3을 생성하였다.
2- NDV의 F-유전자 및 HN-유전자의 HVT내로의 게놈 삽입
F 와 HN 각각을 코오딩하는 유전자를 함유한 플라즈미드 pNDV01 과 pNDV03 의 BamHI 단편을 HVT 재조합 벡터 pVEC04의 Bg1II 에 삽입한 결과 pNDV04 와 pNDV05가 생성되었다.
LTR 프로모터에 대한 삽입 유전자의 정확한 방향은 제6도에 제시된 상기 구조체의 물리적인 지도에 근거한 제한효소 분석으로 확인되었다.
상기 플라즈미드의 DNA를 실시예 1의 섹션 2에 기재된 바와 같이 HVT 감염세포의 DNA 와 함께 CEF속에 형질감염시켰다.
형질감염된 배양물을 증폭시킨 후, 무세포 용해물을 확립하고 마이크로타이터 디쉬에 플레이팅하였다.
F 또는 HN 단백질을 발현하는 HVT 재조합물의 검출은 특이 NDV 항원에 대한 다가 NDV 혈청 또는 모노클로날 항체를 사용하여 면역형광 염색에 의해 실시했다. HVT 재조합 바이러스의 증폭은 실시예 4의 섹션 3에 기재되어 있는 바와 같이 제한 회석액법으로 수행했다.
단일 플라크를 분리하고 면역형광 염색법에 의해 감염된 CEF에서 F와 HN 각각의 발현 여부를 시험하여, 균질적인 재조합 바이러스 시료를 제조했다.
도면에 관하여 상세히 설명하면,
제1도는 HVT 게놈의 Us영역에 본질적으로 대응하는 DNA 단편의 제한효소지도이며, 4개의 오픈리딩 프레임과 그 사이의 비코오딩 서열로 구성된 삽입부위의 상대적인 위치가 나타나 있다.
제2(a)도는 플라즈미드 pMD07 gal의 제한효소지도이며, 이 플라스미드는 β-갈락토시다제 유전자를 HVT 게놈의 1.2kb XhoI 단편물에 존재하는 특정한 Bg1II 제한 부위에 삽입함으로써 pMD07에서 유도되었다. 제 2(b)도는 플라즈미드 pMD12gal의 제한효소지도이며, 이 플라스미드는 β 갈락토시다제 유전자를 HVT 게놈의 3.5kb XhoI 단편물에 존재하는 특정한 Bg1II 제한부위에 삽입함으로써 pMD12에서 유도되었다. 제3(a)도는 pMD40의 제한효소지도이며, pMD12에 존재하는 1117bp의 SpeI 단편이 SalI 부위를 포함하는 합성 올리고뉴클레오티드에 의해 대체되었다. 제3(b)도는 pMD44의 제한 효소 지도이며, SalI 부위에 의해 플랭킹된 4.0kb의 β-갈락토시다제 마커 유전자를 pMD40의 SalI부위에 삽입함으로써 pMD40 에서 유도되었다. 제4도는 pVEC04의 제한효소지도인데, 이것은 pMD07의 1.2kb XhoI HVT 단편의 특정한 Bg1II부위에 삽입된 LTR프로모터를 나타내고 있다.
제5도는 pIB18의 제한효소지도인데, 이것은 LTR 프로모터의 하류의 pVECO4의 Bg1II 부위에 삽입된 IBV 균주 M4l의 스파이크 유전자를 수반하는 3.7kb BamHI 단편을 나타내고 있다.
제6(a)도는 pNDVO4의 제한효소지도이며, 이 플라스미드는 pVECO4의 Bg1II 부위에 삽입된 BamHI 부위에 의해 플랭킹되는 NDV-F 유전자를 함유한다(제4도 참조). 제6(b)도는 pNDV05의 제한효소지도이며, 이 플라스미드는 pVECO4의 Bg1II부위에 삽입된 BamHI 부위에 의해 플랭킹되는 NDV-HN 유전자를 함유한다.
참고문헌
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2. 챔버스, 등 (1986), J.Gen. 67,2685.
3. 에스피은, 등 (1987), Arch. Virol. 95,79.
4. 고르만, C. et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6777.
5. 그라함, F. 및 v. d. Eb, A. (1973), Virology, 92, 456.
6. 헤니코프, S. (1984), Gene, 28, 351.
7. 훈, T.V., et at.(1985) in DNA cloning, Vol. I, ed. D. Glover, Pag. 49.
8. 이가리시, T., et al. (1987), Virology, 157, 351.
9. 메니아티스, T., et al. (1982) in Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory
10. 맥긴스, 등. (1986), Virus Res. 5, 343.
11. 밀러, 등 (1986), J. Gen. Virol. 67, 1917.
12. 생거, I., et al. (1977), Proc. Nat1 Acad Sci. USA, 74, 5463.
13. 세이토, 등. (1987), Virus Res. 7, 241.
14. 훼머스 등. (1987), Arch, Virol. 97, 101.
이하에서 서열리스트를 첨부했다.
(1) SEQ ID NO : 1 에 관한 정보
(i) 서열특성 :
(A)길이 : 4527bp
(B)유형 : 핵산
(C)가닥유형 : 이중나선
(D)형태 : 선형
(ii)분자유형 : DNA(게놈)
(vi)제공원 :
(A)유기체 : 칠면조의 포진바이러스(Herpesvirus)
(B)균주 : PB-THV1
(ix)특징 :
(A)명칭/KEY : CDS
(B)위치 : 1..81
(C)기타 정보 : /표지=ORF1의 말단
(ix)특징 :
(A)명칭/KEY : CDS
(B)위치 : 316..945
(D)기타 정보 : /표지=ORF2
(ix)특징:
(A)명칭/KEY : CDS
(B)위치 : 상보물(complement) (1084..2124)
(D)기타 정보 : /표지=ORF3
(ix)특징:
(A)명칭/KEY : CDS
(B)위치 : 상보물(2322..3170)
(D)기타정보 : /표지=ORF4
(ix)특징:
(A)명칭/KEY : CDS
(B)위치 : 3320..4504
(D)기타 정보 : /표지=ORF5
(xi)서열 : SEQ ID NO : 1 :
(2) SEQ ID NO:2에 관한 정보
(i) 서열특성 :
(A)길이 ' 209 아미노산
(B)유형 : 아미노산
(C)형태 : 선형
(ii)분자유형 : 단백질
(k)특징 : ORF-2
(xi)서열 : SEQ ID NO:2
(3) SEQ ID NO: 3에 관한 정보
(i) 서열특성 :
(A)길이 : 346 아미노산
(B)유형 : 아미노산
(C)형태 : 선형
(ii)분자유형 : 단백질
(Ix)특징 : ORF-3
(xi)서열 : SEQ ID NO:3:
(4) SEQ ID NO:4에 관한 정보
(i) 서열특성 :
(A)길이 : 282 아미노산
(B)유형 : 아미노산
(C)형태 : 선형
(ii)분자유형 : 단백질
(Ix)특징 : ORF-4
(xi)서열 : SEQ ID NO:4 :
(5) SEQ ID NO:5에 관한 정보:
(i) 서열특성 :
(A)길이 : 394 아미노산
(B)유형 : 아미노산
(C)형태 : 선형
(ii)분자유형 : 단백질
(Ix)특징 : ORF-5
(xi)서열 : SEQ ID NO:5:

Claims (17)

  1. 제1도의 제한효소지도로 정의되는 HVT 게놈의 DNA 단편내에 위치하는 ORF-2, ORF-3, ORF-4 및 ORF-5의 게놈영역에 상응하는 HVT 게놈의 삽입부위에, 조류병원체의 항원을 암호화하는 이종핵산서열이 도입된 재조합 HVT.
  2. 제1항에 있어서, HVT 게놈의 삽입부위가 서열분석표 제1번(SEQ ID NO:1)에 제시된 DNA 서열의 뉴클레오티드 제82번과 제4504번 사이의 DNA 서열에 상응하는 재조합 HVT.
  3. 제1항에있어서, 이종 핵산 서열이 ORF-2 또는 ORF-3의 Bg1 II 제한 효소 부위에 도입되는 재조합 HVT.
  4. 제1항에 있어서, 삽입부위내에서 HVT 핵산 서열의 적어도 일부분이 결실된 재조합 HVT.
  5. 제1항에 있어서, 이종 핵산 서열이 폴리펩타이드를 코오드하며, 상기 서열이 재조합 HVT로 감염된 세포내에서 상기 핵산서열의 발현을 제어하는 프로모터의 조절하에 있는 재조합 HVT.
  6. 제1항에 있어서, 항원이 머레크 질환 바이러스, 감염성 기관지염 바이러스, 뉴우캣슬 질환 바이러스 및 감염성 점액낭 질환 바이러스로 구성된 그룹에서 유도되는 재조합 HVT.
  7. ORF-2, ORF-3, ORF-4 및 ORF-5의 HVT 게놈 부위에 걸쳐있는 HVT 게놈의 삽입부위의 DNA서열에 의해 플랭킹(flanking)되고, 프로모터의 조절하에 있고, 조류 병원체의 항원을 암호화하는 HVT에 이종인 하나 이상의 유전자 또는 그것의 일부를 포함하는 핵산서열.
  8. 제7항의 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA분자.
  9. 제8항에 의한 재조합 DNA분자로 형질 전환된 숙주세포.
  10. 적당한 세포 배양물을 HVT DNA 및 제8항의 재조합 DNA 분자로 동시 형질감염시킴을 특징으로 하는 제1항의 재조합 HVT의 제조방법.
  11. 제1항의 재조합 HVT로 감염된 세포 배양물.
  12. 제1항의 재조합 HVT를 함유하는, 조류 병원체로부터 가금(Poultry)을 보호하기 위한 백신.
  13. 제1항의 재조합 HVT에 의해 발현된 폴리펩타이드를 함유하는, 조류병원체로부터 가금을 보호하기 위한 백신.
  14. HVT 함유물질을 제11항의 세포배양물로부터 회수하고 백신으로 가공함을 특징으로 하는 백신의 제조방법.
  15. 제1항의 재조합 HVT에 의해 발현된 폴리펩타이드가 면역화 활성을 갖는 제제로 가공됨을 특징으로 하는 백신의 제조방법.
  16. 제1항의 재조합 HVT에 대한 항체를 함유하는, 조류 병원체로부터 가금을 보호하기 위한 항혈청.
  17. 제12항의 백신을 동물에 투여함을 특징으로 하는, 조류 병원체로부터 가금을 보호하기 위하여 동물을 면역화시키는 방법.
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