CN100352930C

CN100352930C - 疫苗、免疫治疗剂及其应用方法

Info

Publication number: CN100352930C
Application number: CNB998031828A
Authority: CN
Inventors: D·B·韦纳; J·J·基姆; 辛正任
Original assignee: University of Pennsylvania Penn
Current assignee: University of Pennsylvania Penn
Priority date: 1998-02-27
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2007-12-05
Anticipated expiration: 2019-02-26
Also published as: IL220133A0; CA2322160A1; IL138075A; US20120195852A1; BR9908267A; JP5485601B2; JP2002504380A; AU3313099A; CA2322160C; JP2009263396A; ATE512231T1; IL138075A0; US20130045180A9; KR20070039615A; KR100743894B1; US8119395B1; EP1078093A4; CN1291235A; CA2792479A1; EP1078093B1

Abstract

本发明公开了改良的疫苗，它包括与调控元件操作性相连的编码免疫调节蛋白的核苷酸序列。改良疫苗包括用来输送外源抗原的DNA疫苗、重组疫苗和减毒活疫苗。公开了免疫个体的方法。公开了用来治疗自身免疫疾病个体的组合物和方法。

Description

疫苗、免疫治疗剂及其应用方法

发明领域

本发明涉及改进的疫苗、预防性和/或治疗性免疫个体以抵抗免疫原的改进的方法，以及改进的免疫治疗性组合物和改进的免疫治疗方法。

发明背景

本申请要求了1998年2月27日提交的题目为“改进的疫苗”的美国临时申请60/076,207的优先权，该专利纳入本文作参考。免疫治疗指调节人的免疫应答以赋予所需的治疗效果。免疫治疗剂指那样一些组合物，当将它们给予个体时，它们调节个体的免疫足以减少不希望的免疫应答所引起的症状和症状原因，或通过增加所希望的免疫应答来缓解症状或消除/减少症状原因。在一些情况下，免疫治疗是疫苗接种程序的一部分，在该程序中，给予个体一种疫苗，结果导致个体接触免疫原。在这种情况下，免疫治疗剂增加了免疫应答和/或选择性地增强了部分免疫应答，这是治疗或预防特定病情、感染或疾病所需的。在一些情况下，给予的免疫治疗剂不含免疫原。在这些情况下，提供免疫治疗剂是用来通过减少或抑制免疫应答、增强或增加免疫应答、减少或抑制部分免疫系统、增强或增加部分免疫系统、减少或抑制免疫应答、增强或增加免疫应答来调节免疫系统。在一些情况下，免疫治疗剂包括抗体，当抗体在体内给予时，它与参与调节免疫应答的蛋白结合。抗体与这种蛋白之间的相互作用导致免疫应答发生改变。如果该蛋白参与自身免疫疾病，则该抗体能抑制其在该作用中的活性，并减少或消除症状或疾病。

疫苗可用于免疫个体以抵抗靶抗原，例如变应原、病原性抗原或与参与人类疾病细胞相关的抗原。与参与人类疾病细胞相关的抗原包括癌相关性肿瘤抗原和参与自身免疫疾病的细胞相关抗原。

在设计这些疫苗中已经认识到，能在接种个体的细胞内产生靶抗原的疫苗能有效地诱导免疫系统的细胞免疫枝(cellular arm)。具体地说，减毒活疫苗、采用无毒力载体的重组疫苗和DNA疫苗都能在被接种个体的细胞内产生抗原，由此诱导免疫系统的细胞免疫。另一方面，只包含蛋白的亚单位疫苗和死的或灭活的疫苗，诱导了体液应答反应，却不能诱导良好的细胞免疫应答反应。

为了提供抵抗病原感染的保护作用，为治疗病原感染、癌症或自身免疫疾病而提供有效的免疫介导的治疗，常常需要有细胞免疫应答反应。因此，较佳的是能够在免疫接种个体的细胞内产生靶抗原的疫苗，例如减毒活疫苗、采用无毒力载体的重组疫苗和DNA疫苗。

虽然这些疫苗通过预防性或治疗性免疫接种个体，常能有效地抵抗病原感染或人体疾病，但仍然需要改进的疫苗，仍然需要产生增强性免疫应答反应的组合物和方法。

发明概述

本发明涉及包含免疫调节蛋白或编码该蛋白的核酸分子的增强和/或调节免疫应答的组合物，以及应用这些蛋白和核酸分子的方法。免疫调节蛋白的输送可用于免疫治疗，并可结合疫苗输送结合增强或定向调节免疫应答。免疫调节蛋白可以是：趋化因子，包括MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8和RANTES；粘附分子，包括选择蛋白，如L-选择蛋白、P-选择蛋白和E-选择蛋白，粘蛋白样分子，如CD34、GlyCAM-1和MadCAM-1，整联蛋白家族的成员，如LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95，免疫球蛋白超家族的成员，如PECAM、ICAM类(如ICAM-1、ICAM-2和ICAM-3)、CD2和LFA-3；细胞因子，包括M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变型；共同刺激分子，如CD40和CD40L；生长因子，包括血管生长因子、IL-7、神经生长因子和血管内皮生长因子；受体分子，包括Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6；其它，包括蛋白酶类(Caspase(ICE))。

本发明涉及一种质粒，该质粒包含编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与其在真核细胞中表达所需的调控元件操作性相连，该质粒还包含编码一种免疫原的核苷酸序列，该序列与其在真核细胞中表达所需的调控元件操作性相连。该免疫原宜为一种病原抗原、癌症相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞关联的抗原。

本发明涉及一种诱导个体内产生抵抗免疫原的免疫应答的方法，该方法包括给予该个体一种质粒的步骤，该质粒包含编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与其在个体细胞中表达所需的调控元件操作性相连，该质粒还包含编码一种免疫原的核苷酸序列，该序列与其在个体细胞中表达所需的调控元件操作性相连。

本发明涉及一种免疫个体以抵抗病原体、癌症或自身免疫疾病的方法，该方法包括给予该个体一种质粒的步骤，该质粒包含编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与其在个体细胞中表达所需的调控元件操作性相连，该质粒还包含编码一种免疫原的核苷酸序列，该序列与其在个体细胞中表达所需的调控元件操作性相连，其中该免疫原是病原抗原、癌症相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞关联的抗原。

本发明涉及一种组合物，该组合物包含第一质粒和第二质粒，第一质粒包含编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与其在真核细胞中表达所需的调控元件操作性相连，第二质粒包含编码一种免疫原的核苷酸序列，该序列与其在真核细胞中表达所需的调控元件操作性相连。在一些较佳的实施方案中，免疫原是病原抗原、癌症相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞关联的抗原。

本发明涉及一种免疫个体抵抗病原体、癌症或自身免疫疾病的方法，该方法包括给予该个体一种组合物的步骤，该组合物包含第一质粒和第二质粒，第一质粒包含编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与其在个体细胞中表达所需的调控元件操作性相连，第二质粒包含编码一种免疫原的核苷酸序列，该序列与其在个体细胞中表达所需的调控元件操作性相连，其中该免疫原是病原抗原、癌症相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞关联的抗原。

本发明涉及一种诱导抵抗免疫原的免疫应答的方法，该方法包括给予该个体一种组合物的步骤，该组合物包含第一质粒和第二质粒，第一质粒包含编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与其在个体细胞中表达所需的调控元件操作性相连，第二质粒包含编码一种免疫原的核苷酸序列，该序列与其在个体细胞中表达所需的调控元件操作性相连。

本发明涉及一种改进的重组疫苗载体，它包含编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与其在真核细胞中表达所需的调控元件操作性相连，它还包含编码一种靶抗原的核苷酸序列，该序列与其在真核细胞中表达所需的调控元件操作性相连。在较佳的实施方案中，该靶抗原是病原抗原、癌症相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞关联的抗原。

本发明涉及一种免疫个体抵抗病原体、癌症或自身免疫疾病的方法，该方法包括给予该个体一种重组疫苗载体的步骤，该载体包含编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与其在个体细胞中表达所需的调控元件操作性相连，它还包含编码一种靶抗原的核苷酸序列，该序列与其在个体细胞中表达所需的调控元件操作性相连，其中该靶抗原是病原抗原、癌症相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞关联的抗原。

本发明涉及一种诱导抵抗靶抗原的免疫应答的方法，该方法包括给予该个体一种重组疫苗载体的步骤，该载体包含编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与其在个体细胞中表达所需的调控元件操作性相连，它还包含编码一种靶抗原的核苷酸序列，该序列与其在个体细胞中表达所需的调控元件操作性相连。

本发明涉及一种改进的减毒活疫苗，它包含编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与其在真核细胞中表达所需的调控元件操作性相连。

本发明涉及一种免疫个体抵抗病原体、癌症或自身免疫疾病的方法，该方法包括给予该个体一种减毒疫苗的步骤，该疫苗包含编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与其在个体细胞中表达所需的调控元件操作性相连。

本发明涉及一种诱导个体内产生抵抗免疫原的免疫应答的方法，该方法包括给予该个体一种减毒疫苗的步骤，该疫苗包含编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与其在个体细胞中表达所需的调控元件操作性相连。

本发明涉及用来调节个体免疫系统的组合物和方法。本发明的方法包括将一种免疫调节蛋白给予该个体，其方法是给予免疫调节蛋白，或给予编码免疫调节蛋白的核苷酸序列，作为表达载体的一部分或能将核苷酸序列以可表达形式输送给个体的其它载体的一部分。

本发明涉及用来治疗患自身免疫疾病个体的组合物和方法。本发明的方法包括给予这些个体一种组合物，该组合物包含与包括MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8和RANTES在内的趋化因子特异性结合的抗体。

附图简述

图1A和1B显示了实施例2中讨论的预加工的和成熟的IL-18。

图2显示了将ICAM-1(pCICAM-1)、LFA-3(pCLFA-3)、和VCAM-1(pCVACM-1)的基因克隆到pCDNA3表达载体中。

较佳实施方案详述

本发明得自特定蛋白能增强和/或调节免疫应答的发现。因此，这些蛋白可以作为免疫治疗剂或疫苗组分来输送。

本文所用的术语“免疫调节蛋白”指本发明的增强和/或调节免疫应答的蛋白和核酸分子表达产物。因此，免疫调节蛋白可作为免疫治疗剂或疫苗组分来输送。

免疫调节蛋白包括趋化因子、粘附分子、细胞因子、共同刺激分子、生长因子和受体分子。

作为免疫调节蛋白的趋化因子包括MIP-1α、MIP-1β、RANTES、IL-8和MCP-1。

作为免疫调节蛋白的粘附分子包括选择蛋白家族成员、粘蛋白样分子、整联蛋白家族成员以及免疫球蛋白超家族成员。

作为免疫调节蛋白的选择蛋白家族成员包括：L-选择蛋白、P-选择蛋白和E-选择蛋白。

粘蛋白样分子是选择蛋白家族成员的配体。作为免疫调节蛋白的粘蛋白样分子包括CD34、GlyCAM-1和MAdCAM-1。

作为免疫调节蛋白的整联蛋白家族成员包括LFA-1、VLA-1、Mac-1和p150.95。

作为免疫调节蛋白的免疫球蛋白超家族成员包括PECAM、ICAM类、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2和LFA-3。

作为免疫调节蛋白的细胞因子包括M-CSF、GM-CSF、G-CSF、CSF、IL-4和IL-18的突变型，该突变型缺失了原型蛋白而不是成熟型蛋白上的开头大约35个氨基酸残基。

作为免疫调节蛋白的共同刺激分子包括CD40和CD40配体(CD40L)。

作为免疫调节蛋白的生长因子包括血管生长因子、IL-7、神经生长因子和血管内皮生长因子。

作为免疫调节蛋白的受体分子包括Fas″死亡基因″表达产物、肿瘤坏死因子TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6；其它，包括蛋白酶类(ICE)。

其它分子包括蛋白酶类-1(ICE)。

根据本发明的一些实施方案，免疫调节蛋白的输送是通过给予核酸分子来实现的，该核酸分子在被细胞吸收后受表达产生了该免疫调节蛋白。根据本发明的一些实施方案，免疫调节蛋白的输送是通过给予蛋白本身来实现的。根据本发明的一些实施方案，免疫调节蛋白的输送是通过给予核酸分子或蛋白来实现的。根据本发明的一些实施方案，免疫调节蛋白的输送是通过同时给予该核酸分子和该蛋白来实现的。

根据本发明的一些实施方案，给予免疫调节蛋白(无论是蛋白还是编码该蛋白的核酸分子)作为疫苗组合物的一个组分或与疫苗组合物联合使用的一种补充物。疫苗可以是亚单位疫苗、死的疫苗、减毒活疫苗、细胞疫苗、重组疫苗或核酸或DNA疫苗。在减毒活疫苗、细胞疫苗、重组疫苗或核酸或DNA疫苗的情况下，免疫调节蛋白可以由这些疫苗的核酸分子编码。

免疫调节蛋白可用来诱导并增强细胞毒性T细胞(CTL)应答，和/或诱导并增强抗体应答，和/或诱导和增强T细胞增殖反应。

诱导并增强CTL应答的免疫调节蛋白在与抵抗胞内病原、或自身免疫疾病或癌症相关细胞的疫苗联合或作为其一部分给药时特别有用。能诱导并增强CTL应答的免疫调节蛋白在与减毒活疫苗、细胞疫苗、重组疫苗和核酸/DNA疫苗联合给药时特别有用。或者，能诱导并增强CTL应答的免疫调节蛋白可用作免疫治疗剂，将其给予患有癌症或胞内感染的患者。能诱导并增强CTL应答的免疫调节蛋白可用来给予无免疫应答的患者。

在与抵抗细菌、其它胞外病原体、或引起保护性抗体应答的那些病毒(如乙型肝炎病毒)的疫苗联合或作为其一部分给药时，能诱导并增强抗体应答的免疫调节蛋白是特别有用的。能诱导并增强抗体应答的免疫调节蛋白在与亚单位疫苗联合给药时是特别有用的。另外，能诱导并增强抗体应答的免疫调节蛋白可用作免疫治疗剂，来给予患不希望的CTL免疫应答的患者。患者免疫系统的这些变迁减少了CTL应答引起的病理学损害。诱导并增强抗体应答的免疫调节蛋白在给予无免疫应答患者时是有用的。

能诱导并增强T细胞增殖反应的免疫调节蛋白在与疫苗联合或作为其一部分给药时是特别有用的。另外，能诱导并增强T细胞增殖反应的免疫调节蛋白可用作免疫治疗剂。诱导并增强T细胞增殖反应的免疫调节蛋白在给予无免疫应答患者时是有用的。

趋化因子：

给予趋化因子或编码该趋化因子的核酸分子将导致趋化因子的细胞表达增加。

MCP-1可特别用于诱导并增强CD8+CTL。

MIP-1α可特别用于诱导产生抗体。

IL-8可特别用于诱导产生抗体，并且是T辅助细胞应答的强诱导物。

RANTES诱导TH1以及CTL应答。

还可采用MIP-1β，如已经克隆到pCDNA3中产生pCDNA3-MIP-1β的构建物。

粘附分子：

选择蛋白家族的成员

L-选择蛋白

P-选择蛋白

E-选择蛋白。

粘蛋白样分子

CD34

GlyCAM-1，例如已经克隆到pCDNA3中产生pCDNA3-GlyCAM-1的构建物

MadCAM-1

整联蛋白家族的成员

LFA-1

VLA-1

Mac-1

p150.95

免疫球蛋白超家族的成员

PECAM

ICAM类

ICMA-1

ICAM-2

ICAM-3

CD2

LFA-3。

在以核酸分子给药时，粘附分子最有用。

在以核酸分子的形式、与疫苗(尤其是减毒活疫苗、细胞疫苗、重组疫苗和核酸/DNA疫苗)联合或作为其一部分给予时，粘附分子是最有用的。

粘附分子可作为核酸分子用于输送到肿瘤内或病灶内。

较佳的粘附分子包括ICAM-1、LFA-3和E-选择蛋白。

ICAM-1对于CTL和增殖反应而言是最佳的。

细胞因子

M-CSF

G-CSF

CSF IL-4

IL-18的突变型

共同刺激分子

CD40，例如可以采用将编码CD40的cDNA克隆到pCDNA3中产生pCDNA3-CD40的构建物

CD40L

生长因子

血管生长因子，例如可以采用将编码血管生长因子的cDNA克隆到pCDNA3中产生pCDNA3-VGF的构建物

IL-7

神经生长因子

血管内皮生长因子

受体分子

Fas″死亡基因″表达产物

TNF受体

Flt

Apo-1

p55

WSL-1

DR3

TRAMP

Apo-3

AIR

LARD

NGRF

DR4

DR5

KILLER

TRAIL-R2

TRICK2

DR6

其它

蛋白酶类(ICE)

表1中列出了上述每一个免疫调节蛋白以及CD86(B7.2)的核苷酸和氨基酸序列的GENBANK登录号和引用的杂志。

DNA疫苗在PCT/US90/01515、PCT/US93/02338、PCT/US93/048131、PCT/US94/00899以及其中引用的优先权申请中有所描述，这些申请的每一个均纳入本文作参考。除了这些申请中描述的输送方法外，美国专利4,945,050和5,036,006中还描述了输送DNA的其它方法，这些专利也都纳入本文作参考。

本发明的一些方面涉及将遗传物质导入个体的细胞中以便诱导针对该遗传物质编码的蛋白和肽的免疫应答的方法。该方法包括将将以下物质给予所述个体的组织的步骤：单个核酸分子，它包含了编码所需肽和蛋白的核苷酸序列以及编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列；或是具有两个核酸分子的组合物，一个核酸分子包含编码所需肽或蛋白的核苷酸序列，另一个核酸分子包含编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列。该核酸分子可以质粒DNA的形式、重组载体的核酸分子形式、或作为减毒疫苗或细胞疫苗中提供的遗传物质之一部分的形式提供。另外，在一些实施方案中，免疫调节蛋白可以蛋白形式输送。

根据一些实施方案，可将两种或多种免疫调节蛋白的组合给予个体。在一些实施方案中，作为疫苗接种程序的一部分，可将编码两种或多种免疫调节蛋白之组合的基因与编码免疫原和/或免疫原性蛋白的基因一起给予个体。在一些实施方案中，作为疫苗接种程序的一部分，可将免疫调节蛋白和编码免疫调节蛋白的基因的组合与编码免疫原和/或免疫原性蛋白的基因一起给予个体。在一些实施方案中，作为疫苗接种程序的一部分，可将两种或多种蛋白的组合与编码免疫原和/或免疫原性蛋白的基因一起给予个体。

根据一些实施方案，将免疫调节蛋白共同刺激分子CD86(B7.2)联合给予个体。在一些实施方案中，作为疫苗接种程序的一部分，可将编码CD86以及一种或多种免疫调节蛋白的组合的基因与编码免疫原和/或免疫原性蛋白的基因一起给予个体。在一些实施方案中，可将CD86蛋白和编码免疫调节蛋白的基因的组合与编码免疫原和/或免疫原性蛋白的基因一起给予个体，作为疫苗接种程序的一部分。在一些实施方案中，可将免疫调节蛋白和编码CD86蛋白的基因的组合与编码免疫原和/或免疫原性蛋白的基因一起给予个体，作为疫苗接种程序的一部分。在一些实施方案中，将CD86和一种或多种免疫调节蛋白的组合与编码免疫原和/或免疫原性蛋白的基因一起给予个体，作为疫苗接种程序的一部分。在一些实施方案中，将编码CD86和一种或多种趋化因子和/或粘附分子的组合的基因与编码免疫原和/或免疫原性蛋白的基因一起给予个体，作为疫苗接种程序的一部分。在一些实施方案中，将编码CD86和ICAM-1的组合的基因与编码免疫原和/或免疫原性蛋白的基因给予个体，作为疫苗接种程序的一部分。

本发明的一些方面提供了用于预防性和/或治疗性免疫个体以抵抗病原体、异常的疾病相关细胞的组合物和方法。遗传物质编码的肽或蛋白具有待靶向的细胞或病原体上所见的免疫原性蛋白的至少一个相同的表位，以及该遗传物质编码一种免疫调节蛋白。或者，在一些实施方案中，免疫调节蛋白可作为蛋白来输送。

遗传物质由个体细胞所表达，并作为引发免疫应答的免疫原性靶标。导致的免疫应答有广泛的基础：除了体液免疫应答外，还引起了细胞免疫应答两枝(arm)。本发明的方法可用来提供预防性和治疗性免疫力。因此，免疫方法包括抵抗免疫原从而(例如)保护个体以抵抗病原攻击、或特异性细胞发生增殖的方法，以及治疗患有病原感染、过度增殖疾病或自身免疫疾病的个体的方法。

本文所用的术语“靶蛋白”指由本发明基因构建物编码的肽和蛋白，它们起着免疫应答反应的靶蛋白的作用。“靶蛋白”和“免疫原”可互换，指能够引发针对它的免疫反应的蛋白。靶蛋白是免疫原性蛋白，它与病原或不良细胞类型(例如癌细胞或与自身免疫疾病有关的需要对其免疫的细胞)的蛋白至少具有一个相同表位。针对靶蛋白的免疫反应将保护和治疗个体以抵御与靶蛋白有关的特定感染或疾病。

本发明可用于引发针对某靶蛋白(即与病原体、变应原或个体自身的“异常”细胞特异性相关的蛋白)的广泛的免疫应答。本发明可用于免疫个体以抵抗病原性物质和生物，由此，针对某病原蛋白的免疫应答提供了抵抗该病原的保护性免疫力。本发明可用于抵抗过度增殖性疾病和紊乱(例如癌症)，即引发针对与过度增殖细胞特异性相关的靶蛋白的免疫应答。本发明可通过引发针对与参与自身免疫疾病的细胞特异性相关的靶蛋白的免疫应答来抵抗自身免疫疾病和紊乱。

根据本发明的某些方面，编码靶蛋白和免疫调节蛋白的DNA或RNA导入个体的组织细胞中，在其中表达，由此产生靶蛋白。编码靶蛋白和免疫调节蛋白的DNA或RNA序列与其在个体细胞内表达所需的调控元件相连接。DNA表达所需的调控元件包括启动子和聚腺苷酸化信号。此外，此基因构建物中还可包含诸如Kozak区之类的其它元件。

本文所用的术语“基因构建物”指DNA或RNA分子，它包含一种核苷酸序列(该序列编码靶蛋白，并包括与调控元件操作性相连的起始和终止信号(包括能指导接种疫苗个体细胞表达的启动子和聚腺苷酸化信号))和/或一个核苷酸序列(该序列编码了一种免疫调节蛋白，并包括与调控元件操作性相连的起始和终止信号(包括能指导接种疫苗个体细胞表达的启动子和聚腺苷酸化信号))。在一些实施方案中，发现编码靶蛋白的可表达形式序列与编码免疫调节蛋白的可表达形式序列在输送给个体的同一核酸分子中。在一些实施方案中，编码靶蛋白的可表达形式序列和编码免疫调节蛋白的可表达形式序列在不同的核酸分子中。在这些情况下，将两种分子均输送给该个体。

本文所用的术语“可表达形式”，指这样的基因构建物，它包含与靶蛋白或免疫调节蛋白编码序列操作性相连的必需的调控元件，从而能够在个体的细胞内表达编码序列。

本文所用的术语“有一个相同的表位”指蛋白含有至少一个表位与另一蛋白的表位完全相同或基本相似。

本文所用的术语“基本相似的表位”指该表位所具有的结构与某蛋白的表位不相同，但是能够引发与该蛋白发生交叉反应的细胞或体液免疫应答。

基因构建物包含一个编码靶蛋白和/或免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与基因表达所需的调控元件操作性相连。本发明还提供基因构建物的组合，其中一个包含可表达形式的编码靶蛋白的核苷酸序列，另一构建物包含可表达形式的编码免疫调节蛋白的核苷酸序列。将包含基因构建物组合的DNA或RNA分子引入活细胞，使DNA或RNA表达并产生靶蛋白和免疫调节蛋白。结果增强了针对靶蛋白的免疫应答。

当遗传构建物被细胞摄取时，它们可留在细胞内作为功能性的染色体外分子，和/或整合到细胞的染色体DNA中。可以将DNA以质粒形式作为分离的遗传物质引入细胞。或者，可将能够与染色体整合的线性DNA引入细胞。在将DNA引入细胞后，可以加入促进DNA整合到染色体中的试剂。也可以在DNA分子内包含促进整合的DNA序列。或者，可以将RNA引入细胞。也可以考虑提供一种线性小染色体形式的遗传构建物，它具有着丝粒、端粒和复制起点。基因构建物可以作为部分遗传物质留在生活于细胞内的减毒活微生物或重组微生物载体内。基因构建物可以是重组病毒疫苗的基因组部分，此时，遗传物质或者整合到细胞染色体内，或者留存在染色体外。

遗传构建物包括核酸分子基因表达所需的调控元件。这些元件包括：启动子、起始密码子、终止密码子和聚腺苷酸化信号。此外，为了编码靶蛋白或免疫调节蛋白的序列的基因表达，常需要增强子。这些元件必须与编码所需蛋白的序列操作性相连，而且这些调控元件必须在所给予的个体内可操作。

起始密码子和终止密码子一般认为是编码所需蛋白的核苷酸序列的一部分。但是，这些元件在给予基因构建物的个体内必须是有功能的。起始密码子和终止密码子必须与编码序列在同一读码框内。

所用的启动子和聚腺苷酸化信号在个体的细胞内必须是有功能的。

用于实施本发明，尤其是用于产生人用基因疫苗的启动子例子包括但不限于猿病毒40(SV40)的启动子、小鼠乳腺瘤病毒(MMTV)的启动子、人免疫缺陷病毒(HIV)的启动子如HIV长末端重复序列(LTR)的启动子、Moloney病毒启动子、ALV启动子、巨细胞病毒(CMV)的启动子例如CMV立即早期启动子、EB病毒的启动子、Rous肉瘤病毒(RSV)的启动子和例如人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸、人金属硫蛋白等人基因的启动子。

用于实施本发明，尤其是用于生产人用基因疫苗的聚腺苷酸化信号的例子包括但不限于牛生长激素聚腺苷酸化信号、SV40聚腺苷酸化信号和LTR聚腺苷酸化信号。特别是，本发明使用的是位于pCEP4质粒(Invitrogen，San Diego CA)内的SV40聚腺苷酸化信号，文中称为SV40聚腺苷酸化信号。

除了DNA表达必需的调控元件外，DNA分子内还可以包含其它元件。这些附加的元件包括增强子。增强子可以选自但不限于：人肌动蛋白、人肌球蛋白、人血红蛋白、人肌酸和诸如CMV、RSV和EBV等病毒的增强子。

为了使构建物保留在染色体外并在细胞内产生构建物的多个拷贝，可以提供具有哺乳动物复制起点的遗传构建物。Invitrogen(San Diego CA)的质粒pCEP4和pREP4含有EB病毒复制起点和编码核抗原EBNA-1的区域，它们产生高拷贝游离复制产物而不整合。在一些实施方案中，将编码免疫调节蛋白的cDNA插入pCDNA3中。

在有关免疫接种应用的较佳实施方案中，输送的核酸分子包括编码靶蛋白、免疫调节蛋白和进一步加强针对这些靶蛋白的免疫应答的蛋白的基因的核苷酸序列。这些基因的例子是编码其它细胞因子和淋巴因子的基因，例如编码α干扰素、γ干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNF、上皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10和IL-12的基因。在一些实施方案中，用于免疫接种组合物的遗传构建物中宜包含GM-CSF的基因。

如果出于某种原因需要消除接受该遗传构建物的细胞，可以加入作为细胞自毁靶子的其它元件。可以在遗传构建物中加入可表达形式的疱疹胸苷激酶(tk)基因。可以给予个体药物甘克洛福(gangcyclovir)，该药将选择性地杀灭所有产生tk的细胞，从而提供了选择性破坏具有该遗传构建物的细胞的方法。

为了尽可能扩大蛋白的生产，可以选择调控序列使得它们很好地适合于在给予构建物的细胞内表达基因。而且，可以选择在细胞内最有效转录的密码子。本领域普通技术人员能够制造在细胞内具有功能的DNA构建物。

给药途径包括，但不局限于，肌内、鼻内、腹膜内、真皮内、皮下、静脉内、动脉内、眼内和口服，以及外用、透皮、通过吸入或栓剂或至粘膜组织，例如灌洗阴道、直肠、尿道、口腔颊部和舌下组织。较佳的给药途径包括粘膜组织、肌内、腹膜内、真皮内和皮下注射给药。遗传构建物的给药手段包括但不局限于，传统的注射器、无针注射装置或“微粒轰击基因枪”。

本发明的药物组合物含有大约1毫微克至2000微克DNA。在一些较佳的实施方案中，本发明的药物组合物含有大约5毫微克至1000微克DNA。在一些较佳的实施方案中，该药物组合物含有大约10毫微克至800微克DNA。在一些较佳的实施方案中，该药物组合物含有大约0.1至500微克DNA。在一些较佳的实施方案中，该药物组合物含有大约1至350微克DNA。在一些较佳的实施方案中，该药物组合物含有大约25至250微克DNA。在一些较佳的实施方案中，该药物组合物含有大约100至200微克DNA。

本发明的药物组合物可根据所用的给药方式来配制。当药物组合物是可注射的药物组合物时，它们是无菌、无热原和无颗粒的。宜采用等渗的制剂。通常，等渗性添加剂可包括氯化钠、葡萄糖、甘露糖、山梨糖和乳糖。在一些情况下，等渗溶液如磷酸缓冲盐溶液是较佳的。稳定剂包括明胶和白蛋白。在一些实施方案中，在制剂中加入血管收缩剂。

在有些实施方案中，将核酸分子与多核苷酸功能增强剂或遗传疫苗促进剂一起输送给细胞。多核苷酸功能增强剂在1993年1月26日提交的美国专利申请08/008,342，1993年3月11日提交的美国专利申请08/029,336，1993年9月21日提交的美国专利申请08/125,012以及1994年1月26日提交的国际专利申请PCT/US94/00899中有所描述，以上申请均被纳入本文作为参考。遗传疫苗促进剂在1994年4月1日提交的美国专利申请08/221,579中有所描述，该文也被纳入本文作参考。与核酸分子联合给予的辅助剂可以与核酸分子混合给予，或者在给予核酸分子的同时、之前或之后分开给予。此外，具有转染剂和/或复制剂和/或促炎剂功能并能和GVF一同给予的其它物质包括生长因子、细胞因子和淋巴因子，例如α干扰素、γ干扰素、血小板衍生生长因子(PDGF)、TNF、上皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12以及成纤维细胞生长因子，表面活性剂(如免疫刺激性复合物(ISCOMS))，弗氏不完全佐剂，LPS类似物(包括单磷酸脂A(MPL))，胞壁酰肽，醌类似物和诸如角鲨烯和角鲨烯之类的泡囊，和透明质酸，它们可以和遗传构建物联合给予。在一些实施方案中，免疫调节蛋白可用作GVF。

输送给本发明的细胞的核酸分子可作为起预防性和/或治疗性免疫剂作用的蛋白的遗传模板。在较佳的实施方案中，核酸分子包含有该编码区在动物细胞内转录和翻译所需的调控序列。

本发明可用来免疫个体以抵抗所有病原体，例如病毒、原核生物以及病原性真核生物(如单细胞病原性生物和多细胞病原性寄生虫)。本发明可特别用来免疫个体以抵抗能感染细胞且没有荚膜的那些病原体，例如病毒、原核生物(如淋病菌、李斯特菌和志贺氏菌)。另外，本发明还可用来免疫个体以抵抗原生动物病原体，它们在原生动物生命周期中的一个阶段是胞内病原体。本文所用的术语“细胞内病原体”指这样的病毒或病原性生物，它的至少一部分繁殖或生命周期存在于宿主细胞内，并在其中产生或导致产生病原体蛋白。表2提供了可制得本发明的疫苗的一些病毒家族和病毒属的清单。在疫苗中可采用这样的DNA构建物，该构建物包含的DNA序列所编码的肽包含至少一个与病原体抗原(如表中列出的那些抗原)上展示的表位相同或基本相似的表位。另外，本发明还可用来免疫个体以抵抗其它病原体，它们包括例如表3中列出的原核生物和真核原生动物病原体以及多细胞寄生生物。

为了生产提供抗病原感染保护作用的基因疫苗，必需在基因构建物中包括编码免疫原性蛋白的基因编码序列作为靶蛋白的编码序列，所述的免疫原性蛋白能够引起针对它的保护性免疫应答。不论病原是胞内感染(对此，本发明尤其适用)还是胞外感染，不可能所有的病原性抗原都引发保护性应答。因为DNA和RNA都较小，而且较容易生产，本发明还提供了多价病原性抗原免疫接种的额外优点。用于基因疫苗的基因构建物可以包括编码多种病原性抗原的基因物质。例如，可将数个病毒基因包括在一个构建物中，由此提供了多种靶标。

表2和表3列出了一些病原性因子和生物的名单，可以制备针对它们的基因疫苗以保护个体避免被它们感染。在某些优选的实施方案中，免疫个体抵抗病原的方法所针对的是HIV、HTLV或HBV。

本发明的另一方面提供了一种给予基础广泛的保护性免疫应答来抵抗以过度增殖性疾病为特征的过度增殖性细胞的方法，还涉及治疗过度增殖性疾病患者的方法。本文所用的术语“过度增殖性疾病”指以细胞的过度增殖为特征的疾病或紊乱。过度增殖性疾病的例子包括所有形式的癌症和牛皮癣。

已经发现，将包含编码免疫原性“过度增殖细胞”相关蛋白的核苷酸序列的基因构建物引入个体细胞，导致在个体的受接种细胞内产生了这些蛋白。本文所用的术语“过度增殖性相关蛋白”指与过度增殖性疾病相关的蛋白。为了免疫接种以抵抗过度增殖性疾病，需给予个体包含编码过度增殖性疾病相关蛋白的核苷酸序列的基因构建物。

为了使过度增殖相关蛋白成为有效的免疫原性靶标，该蛋白必需只在过度增殖细胞内产生，或在过度增殖细胞内的产生水平高于正常细胞。靶抗原包括这样的蛋白、其片段和肽，它们至少包含上述蛋白中的一个表位。有时，过度增殖相关蛋白是编码某蛋白的基团发生突变的产物。突变基因编码的蛋白与正常蛋白几乎相同，仅因细微的氨基酸序列差异产生了一个正常蛋白上没有的不同表位。这样的靶蛋白包括由诸如myb，myc，fyn之类的致癌基因和转位基因bcr/abl，ras，src，P53，neu，trk编码的蛋白和EGRF。除了作为靶抗原的致癌基因产物之外，用于抗癌治疗和保护性治疗的靶蛋白还包括B细胞淋巴瘤产生的抗体的可变区和T细胞淋巴瘤的T细胞受体的可变区，在一些实施方案中，它们也可用作自身免疫疾病的靶抗原。还可以用其它肿瘤相关蛋白作为靶蛋白，例如在肿瘤细胞内含量较高的蛋白，包括单克隆抗体17-1A识别的蛋白和叶酸结合蛋白。

虽然本发明可用于免疫个体以抵抗一种或多种形式的癌症，但本发明尤其适用于对个体进行预防性免疫接种，所述个体具有发生某种癌症的倾向或曾经患有癌症因而易复发。遗传学和基因技术以及流行病学的发展使得确定个体发生癌症的可能性和进行这方面的风险评估成为可能。用遗传筛选和/或家族健康史，有可能预测特定个体发生数种癌症中任何一种的可能性。

类似的，那些已经患癌症的个体和已接受治疗去除癌症的或处于缓解期的个体尤其易复发。作为治疗方法的一部分，为了战胜复发，可以针对已确诊的癌症对个体进行免疫接种。这样，一旦得知某个体曾患有某种癌症并有复发的危险，就可对他们进行免疫接种，使其免疫系统作好准备以抵抗任何将出现的癌症。

本发明提供了一种治疗过度增殖性疾病患者的方法。在这些方法中，引入的基因构建物起免疫治疗剂的作用，引导和促进个体的免疫系统战胜产生靶蛋白的过度增殖细胞。

本发明提供了治疗患自身免疫疾病和紊乱的个体的方法，方法是赋予基础广泛的保护性免疫应答以抵抗与自身免疫相关的靶抗原，包括细胞受体和产生针对“自身”的(self-derected)抗体的细胞。

T细胞介导的自身免疫疾病包括类风湿关节炎(RA)，多发性硬化(MS)，Sjogren综合征，肉样瘤病，胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)，自身免疫甲状腺炎，反应性关节炎，僵硬性脊椎炎，硬皮病，多肌炎，皮肌炎，牛皮癣，脉管炎，韦格纳氏肉芽肿病，Crohun疾病和溃疡性结肠炎。上述疾病的特征均在于T细胞受体结合内源性抗原，由此引发与自身免疫疾病有关的炎性级联反应。针对T细胞可变区的疫苗接种将引发包括CTL在内的免疫应答，以消除那些T细胞。

在RA中，已经特征性地描述了参与该疾病的T细胞受体(TCR)的数个特异性可变区。这些TCR包括Vβ-3，Vβ-14，Vβ-17和Vα-17。这样，用编码这些蛋白至少之一的DNA构建物作疫苗接种，将引发针对参与RA的T细胞的免疫应答。参见：Howell，M.D.等，1991 Proc.Natl.Acad.Sci.USA 88：10921-10925；Paliard，X.等，1991Science 253，325-329；Williams.W.C.等1992.J.Clin.Invest.90：326-333；以上均被纳入本文作参考。

在MS中，已经特征性地描述了参与该疾病的TCR的数种特异性可变区。这些TCR包括Vβ-7和Vα-10。这样，用编码这些蛋白至少之一的DNA构建物作疫苗接种，将引发针对参与MS的T细胞的免疫应答。参见：Wucherpfennig，K.W.等，1990Science 248：1016-1019；Oksenberg，J.R.等，1990 Nature 345：344-346；以上均被纳入本文作参考。

在硬皮病中，已经特征性地描述了参与该疾病的TCR的数种特异性可变区。这些TCR包括Vβ-6，Vβ-8，Vβ-14和Vα-16，Vα-3C，Vα-7，Vα-14，Vα-15，Vα-16，Vα-28和Vα-12。这样，用编码这些蛋白至少之一的DNA构建物接种，将引发针对参与硬皮病的T细胞的免疫应答。

为了治疗T细胞介导的自身免疫疾病患者，尤其是TCR可变区尚待特性分析的疾病患者，可以进行滑液活检。可以提取含有T细胞的样品，用标准技术鉴定那些TCR的可变区。利用以上信息就可以制备基因疫苗。

B细胞介导的自身免疫疾病包括狼疮(SLE)，格雷夫斯病，重症肌无力，自身免疫溶血性贫血，自身免疫血小板减少症，哮喘，冷球蛋白血症、原发性胆管硬化和恶性贫血。这些疾病的特征均在于抗体结合内源抗原，并引发与自身免疫疾病相关的炎性级联反应。用针对这些抗体可变区的疫苗接种，将引发包括CTL在内的免疫应答，从而消灭产生这些抗体的B细胞。

为了治疗B细胞介导的自身免疫疾病患者，必须鉴定出参与自身免疫活动的那些抗体的可变区。可以进行活检，取炎症部位的抗体样品。用标准技术鉴定那些抗体的可变区。利用这一信息就可以制备出基因疫苗。

在SLE情况下，一个抗原被认为是DNA。这样，可以在待接受抗SLE免疫的患者中筛选其血清抗DAN抗体，然后制备出包括编码血清中抗DNA抗体可变区的DNA构建物的疫苗。

TCR和抗体的可变区的共同结构特征是众所周知的。通常可用下列熟知的方法来找到编码特定TCR或抗体的DNA序列，这些方法例如在Kabat等，1987，“免疫学感兴趣的蛋白的序列”U.S.Department of Health and Human Services，Bethesda MD中有所描述，本文将其纳入作为参考。此外，克隆克隆功能性可变区的常用方法可在Chaudhary，V.K.等，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87：1066中找到，本文将其纳为参考。

除了用可表达形式的免疫调节蛋白编码序列来改进基因疫苗外，本发明还涉及改进的减毒活疫苗和利用重组载体输送编码抗原的外源基因的改良疫苗。减毒活疫苗和利用重组载体输送外源抗原的疫苗的实例可参见美国专利：4,722,848；5,017,487；5,077,044；5,110,587；5,112,749；5,174,993；5,223,424；5,225,336；5,240,703；5,242,829；5,294,441；5,294,548；5,310,668；5,387,744；5,389,368；5,424,065；5,451,499；5,453,364；5,462,734；5,470,734和5,482,713，以上这些专利均纳入本文作参考。本发明提供的基因构建物包括编码免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与可在受接种者体内有效实现表达功能的调控序列操作性相连。将基因构建物掺入减毒活疫苗和重组疫苗中，产生本发明的改良疫苗。

本发明提供了一种免疫接种个体的改进方法，它包括将基因构建物作为疫苗组合物的一部分输送给个体细胞的步骤，该疫苗组合物包括DNA疫苗，减毒活疫苗和重组疫苗。基因构建物包括编码免疫调节蛋白的核苷酸序列，该序列与能在受免疫者体内有效实现表达功能的调控序列操作性相连。此改良疫苗可产生加强的细胞免疫应答。

本发明的另一方面涉及GM-CSF或编码GM-CSF的核酸分子或两种与一DNA疫苗之组合的应用，针对所述DNA疫苗的强抗体应答或辅助性T细胞应答是特别希望的。这种疫苗的一个例子是针对乙型肝炎病毒的疫苗。其它例子包括胞外病原体和变应原。GM-CSF、编码GM-CSF的核酸分子或两者与一种DNA疫苗组合的给药也适用于鉴定为无免疫应答的个体的疫苗接种。

本发明的另一个实施方案涉及抗趋化因子抗体治疗自身免疫疾病患者的应用。自身免疫疾病如上所述。抗趋化因子抗体包括对MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8或RANTES有特异性的抗体。可以给予怀疑患这些疾病的患者治疗有效量的抗趋化因子抗体，以减少或缓解症状。

治疗自身免疫疾病的药物组合物包括对趋化因子有特异性的抗体以及药学上可接受的载体。根据较佳的实施方案，组合物是可注射的。无菌的、无热原的无颗粒的可注射组合物包括一种或多种对趋化因子有特异性的抗体以药学上可接受的载体或注射载体。

抗体用制备单抗的常规方法制得。载体可选自本领域普通技术人员熟知的那些载体。载体的一个例子是无菌盐水。

本领域普通技术人员能用标准技术和容易获得的原料来生产特异性结合MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8或RANTES的单克隆抗体。生产单克隆抗体的技术在Harlow，E.和D.Lane，(1988)《抗体：实验手册》，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor NY中有所描述，该文被纳入本文作参考，其中提供了关于生产特异性结合靶蛋白的杂交瘤和单克隆抗体的详细指导。

简言之，将趋化因子注射入小鼠中。取出小鼠的脾脏，分离脾细胞并与无限增殖的小鼠细胞融合。培养杂交的细胞或杂交瘤，选出分泌抗体的那些细胞。分析抗体，如果发现与感兴趣蛋白特异性结合，则培养产生它们的杂交瘤，以产生持续供应的抗原特异性抗体。

根据本发明，可用对MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8或RANTES的特异性抗体来治疗自身免疫疾病。因此，用CMP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8或RANTES来产生杂交瘤。编码这些蛋白的基因是众所周知的，本领域普通技术人员很容易获得。因此，本领域普通技术人员能够制备用来实施本发明的抗体。除了啮齿类抗体外，本发明还涉及人抗体、人化抗体、Fab和嵌合抗体以及与MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8或RANTES结合的Fab，它们可由本领域普通技术人员用常规方法来生产。

本领域普通技术人员能容易地确定患有或易患自身免疫疾病的个体。

组合物可包括额外的组分来使它们更有效。例如，本发明的组合物可包含多种抗趋化因子抗体，包括对不同趋化因子有特异性的抗体以及对同一趋化因子的不同表位有特异性的抗体。

可以给予约5微克至5000毫克的抗体。在一些较佳的实施方案中，可以给予50微克至500毫克。在其它较佳的实施方案中，可以给予500微克至50毫克。在一个较佳的实施方案中，可以给予5毫克抗体。

可通过合适的途径给予该组合物，例如口服、鼻内、肌内、腹膜内或皮下给药。在一些实施方案中，静脉内给药是较佳的。

在初次给药后，可以再次给药来强化个体。在一些较佳的实施方案中，进行多次给药。

实施例

实施例1

引言

为了从分子上仔细研究趋化因子在免疫应答中的具体作用，我们将编码α-趋化因子IL-8的cDNA以及编码β-趋化因子MIP-1α、RANTES和MCP-1的cDNA各个克隆到表达载体中，将它们与编码HIV-1包膜蛋白或gag/pol蛋白的DNA免疫原一起共同免疫接种。用这些DNA疫苗构建物作为模型抗原，我们通过分析这样免疫后诱导的抗原特异性体液和细胞介导的免疫应答来检查趋化因子基因表达在免疫应答发展中的具体作用。我们发现趋化因子在激活和调节抗原特异性免疫应答中有具体的可鉴定的作用。

结果

DNA疫苗接种诱导趋化因子

用50微克pCDNA3(对照)、pCEnv或pCGag/pol免疫小鼠。两周后，处死小鼠，收获它们的脾脏，分离获得它们的淋巴细胞。通过抗原-特异性刺激(用固定的重组牛痘感染的刺激细胞)在体外刺激这些细胞5天。我们从效应细胞中收集培养上清液，测试它们释放趋化因子MIP1-α、MIP1-β和RANTES的情况。我们发现，用pCEnv或pCGag/pol的DNA免疫所诱导的β-趋化因子MIP1-α、MIP1-β和RANTES的表达水平明显高于对照载体。该增加早在第一次免疫后两周就已出现，提示β-趋化因子可能调节体内免疫应答。为了确定趋化因子对于抗原特异性应答的影响，然后我们研究了它们对于DNA疫苗诱导的免疫应答的影响。

趋化因子表达盒的构建

用Kim，J.J.，D.B.Weiner(1997)Spring Sem Immunopathol 19 174-195；Kim，J.J.等人，(1997)Nature Biot.15，641-645；和Kim，J.J.，等人(1997)J.Immunol.158，816-826中描述的方法(这些内容均纳入本文作参考)，将趋化因子IL-8、MIP1-α、MCP-1和RANTES的基因分别克隆到pCDNA3质粒表达载体中。通过对完整插入物(包括5′和3′侧接序列)进行序列分析，验证这些趋化因子表达盒。另外，将这些趋化因子构建物体外转染入RD细胞，通过采用有关抗体的免疫沉淀或通过趋化因子ELISA验证这些构建物的表达。IL-8、MIP1-α、MCP-1和RANTES的表达构建物也用作疫苗来免疫接种到小鼠体内。经材料和方法中描述的体内表达技术确定，这些构建物在小鼠肌肉组织体内表达了它们所编码的趋化因子。

IL-8是一种T辅助细胞应答的强诱导物

单独分析各种趋化因子对于疫苗诱导的应答的影响。收集pCEnv和pCEnv+IL-8免疫小鼠的抗血清，用ELISA分析针对HIV-1 gp120蛋白的特异性抗体应答。测定在DNA免疫后0、2、4和6周收集的血清的gp120-特异性抗体滴度。在1∶128稀释度下，pCEnv+IL-8免疫组的血清显示出针对gp120的抗体应答比单用pCEnv的免疫组高。用pCGag/pol免疫的组观察到了相似的结果。另外，测定和IL-8共同给予所诱导的gp120-特异性IgG的亚类。IgG1型的产生由Th2型细胞因子诱导，而IgG2a型的产生由Th1型细胞因子诱导。测定IgG1与IgG2a(Th2与Th1)的相对比值。pCEnv免疫组的IgG1与IgG2的比值为1.3。另一方面，pCEnv+IL-8的共注射将该相对比值减少至0.9，这表明向Th1型应答移动。因此，IL-8影响抗原特异性应答的质和量。

还检查IL-8表达对T辅助细胞增殖反应的影响。IL-8与HIV-1免疫原(pCEnv或pCGag/pol)的共表达产生了水平明显的抗原特异性T辅助细胞增殖反应。增殖的增加在4至6倍之间，抗原特异性应答的这种增加是显著的。另外，还调查了IL-8共表达对所诱导的CTL应答的影响。在对照动物中发现了本底水平的特异性杀伤作用，而单用pCEnv免疫的动物显示出小而恒定水平的CTL应答。IL-8的共给予对于抗原特异性CTL应答没有任何增强作用。从pCGag/pol+IL-8的共免疫观察到了相似的CTL结果。

在免疫应答期间，细胞因子在指引和靶向免疫细胞中起关键作用。例如，IFN-γ复杂地参与调节T细胞介导的细胞毒性免疫应答，而IL-4在B细胞介导的免疫应答中起主要作用。TNF-α由激活的巨噬细胞和单核细胞、中性粒细胞、激活的淋巴细胞和NK细胞产生，已有人提出TNF-α在调节其它促炎性细胞因子合成中起关键作用。我们分析了用于CTL试验的体外刺激的效应细胞的上清液，并测试它们释放细胞因子IFN-γ、IL-4和TNF-α的情况。我们发现，IL-8的表达只稍稍增加了TNF-γ的水平，但它没有影响细胞因子IL-4和TNF-α的水平。这多少有点令人惊奇，因为IL-8的共输送对于体液应答的显著作用可能预计对IL-4有显著的作用。然而，并没有观察到这种情况。

MIP1-α是抗体应答的强诱导物

MIP1-α的共表达在诱导抗原特异性体液应答中显示出比IL-8更显著的影响。PCEnv+MIP1-α的共免疫导致包膜特异性抗体应答显著增加。用pCGag/pol免疫的组也看到了相似的结果。测定共给予pCEnv+MIP1-α后IgG1与IgG2a的相对比值。pCEnv免疫组的IgG1与IgG2a比值为1.3。另一方面，pCEnv+MIP1-α的共注射使该相对比值减少至1.7，这表明向Th2-型应答移动。MIP1-α与HIV-1免疫原(pCEnv或PCGag/pol)的共表达导致抗原特异性T辅助细胞增殖反应增强。相反，MIP1-α的免疫接种对抗原特异性CTL应答或细胞因子的诱导的作用很小。同样，如分析IL-8对于细胞因子产生的影响中所观察到的那样，注意到对IL-4水平没有影响。

RANTES诱导Th1和CTL应答

然后，我们检查了RANTES的共输送对疫苗诱导的免疫应答的影响。与IL-8或MIP1-α不同，RANTES与pCEnv的共表达没有增强HIV-1包膜特异性抗体应答。另外，pCEnv-RANTES的共免疫对于IgG1-IgG2a比值(与单用pCEnv免疫的组相比)没有影响。与抗体应答相反，RANTES与HIV-1免疫原(pCEnv或pCGag/pol)共同疫苗接种导致抗原特异性T辅助细胞增殖反应显著增加。另外，在pCEnv和RANTES共给予的组中注意到Th1细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达水平高出两倍。与pCEnv+IL-8或pCEnv-MIP-1α的共注射导致对CTL活性的影响很小所不同的是，在用pCEnv+RANTES共注射后，注意到对感染表达HIV-1包膜的牛痘(vMN462)的靶细胞的特异性杀伤作用有更为显著的增加。在效靶(E∶T)之比为50∶1时，共注射pCEnv和RANTES后，注意到靶细胞有36％以上特异性裂解。同样，用pCGag/pol+RANTES免疫小鼠，结果导致感染表达HIV-1 gag/pol的牛痘(vVK1)的靶细胞的抗原特异性CTL裂解明显增强。RANTES的共输送看来使所得应答向Th1型表型移动，因为再次发现对IL-4无影响。

MCP-1诱导CTL应答

下面观察MCP-1 cDNA的佐剂性能。MCP-1看来对pCEnv免疫所诱导的特异性抗体结合的影响很小。另外，MCP-1与HIV-1免疫原(pCEnv或pCGag/pol)的共表达对于抗原特异性T辅助细胞增殖反应有正的增强作用，但该增强作用较小(两倍)。测定共给予pCEnv+MCP-1后IgG 1与IgG 2a的相对比值。pCEnv免疫组的IgG1与IgG2a比值为1.3。另一方面，pCEnv+MCP-1的共注射使该相对比值减少至1.0，这表明向Th1-型应答移动。在用pCEnv+MCP-1共注射后，注意到特异性杀伤作用有更显著的增加。在效靶(E∶T)之比为50∶1时，共注射pCEnv和MCP-1后，观察到靶细胞有36％以上的特异性裂解。同样，用pCGag/pol+MCP-1免疫小鼠，结果导致表达HIV-1 gag/pol的靶细胞的抗原特异性CTL裂解明显增加。pCEnv+MCP-1免疫的小鼠释放的IFN-γ水平明显高于pCEnv免疫组或对照组。同样，所有组释放的IL-4的水平是相似的。而且，pCEnv+MCP-1免疫组释放的TNF-α水平明显高于pCEnv免疫组或对照组。这些细胞因子释放数据支持了我们的CTL结果，即说明了MCP-1在激活CD8⁺CTL中的作用。

CTL应答中CD8局限性的确定

为了确定靠MCP-1和RANTES的共表达所增加的CTL应答是否局限于CD8⁺T细胞，用HIV-1包膜肽(RIHIGPGRAFYTTKN)进行CTL试验，该肽已证明是balb/c小鼠的MHC I型限制性CTL的特异性表位。让小鼠接受相隔两周的两次各50微克DNA构建物的免疫接种，在第二次免疫后1周收获它们的脾脏。在用包膜特异性肽体外刺激后，对分离的脾细胞进行CTL试验。我们观察到，在E∶T比为50∶1时，MCP-1以及RANTES共注射后的CTL应答均有明显增强，特异性杀伤作用分别为35％和26％。我们验证了该观察结果，方法是在通过补体溶解从效应细胞群中除去CD8⁺T细胞后测定CTL活性。CD8⁺T细胞的除去导致与MCP-1以及与RANTES共注射后所见的抗原特异性CTL增强被抑制。这些结果表明，溶细胞活性的增强是抗原特异性的，I类限制性的，并且依赖于CD8⁺T细胞。

趋化因子表达的增强

重要的是要确定那些特异性趋化因子辅助的免疫原对于趋化因子产生本身的影响(如果有的话)。我们检查了从受免疫动物收集得到的受刺激细胞的趋化因子MIP1-α、MIP1-β、RANTES和MCP-1的表达。趋化因子的共注射以趋化因子特异性方式调节了趋化因子的产生。我们作了几个重要的观察。另外，我们发现，与趋化因子基因的共免疫导致受刺激细胞的趋化因子表达增加。例如，我们发现，通过用pCEnv+MIP1-α共免疫，MIP1-α表达可显著增加超过单用pCEnv免疫时的表达水平。另外，我们发现pCEnv+MCP-1和pCEnv+RANTES(两种CTL应答最明显的诱导物)的免疫大大增加了MIP1-β的表达。另外，pCEnv+MIP1-α、pCEnv+MCP-1以及pCEnv+RANTES的共免疫导致受刺激细胞的RANTES表达显著增强。最后，用pCEnv+MIP1-α和pCEnv+MCP-1共免疫获得的MCP-1表达最高。

讨论

炎性反应的免疫启动是一个复杂的过程，它涉及细胞粘附分子、细胞因子和趋化因子的密切协调的表达。在白细胞从血管移动到宿主防御机制外周部位的分子调节中，趋化因子是尤其重要的。趋化因子超家族由20个以上的相关蛋白组成。根据保守的半胱氨酸残基的存在和位置，趋化因子可广泛地分为三个家族：C-X-C(α)、C-C(β)和C(γ)。在α家族的成员中，前两个半胱氨酸被另一个氨基酸隔开，而β家族的前两个半胱氨酸是彼此毗邻的。目前只鉴定出γ家族中的两个成员，它们的N端均含有一个而不是两个半胱氨酸。

每个亚家族的成员具有独特的以及重叠的活性。尽管确切的生理和病理性功能还未清楚确定，但是从文献中可以找到某些简化的概括。总之，已经报道说，C-X-C家族的成员是多形核白细胞(包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细胞)的化学引诱物和激活剂。相反，C-C家族的成员起单个核细胞(如单核细胞和淋巴细胞)的趋化因子作用。另一方面，据报道C-X-C趋化因子IL-8和IP-10对T淋巴细胞有趋化性，而C-C趋化因子MCP-1、MPC-3、RANTES和MIP-1α对嗜碱性粒细胞也有趋化性。总之趋化因子的功能看来是在炎性部位募集和激活白细胞。

除了它们在炎性反应和免疫应答中的功能外，一些趋化因子在导致AIDS的HIV1型和2型病毒的传播和进展中起关键作用。早在10年前，就已经预计到HIV包膜糖蛋白gp120与CD4的结合不足以导致病毒融合和进入，这提示HIV感染还需要附加的细胞表面协同因子。最近研究鉴定出亲T细胞性和亲巨噬细胞性病毒与它们的靶细胞的融合所需要的协同受体分别是CXCR-4和CCR-5。

CXCR-4，也称为融合(fusion)或LESTR，最初被发现是结构与趋化因子受体相似的孤儿受体。随后，鉴定出CXCR-4是亲T细胞性HIV病毒进入CD4⁺细胞所必需的辅因子。β-趋化因子SDF-1是CXCR-4的配体，它是一种亲T细胞型HIV-1病毒株感染的强效抑制剂。类似地，β趋化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES是CCR-5的天然配体，它们是CD8⁺T细胞产生的针对亲巨噬细胞性、而不是亲T细胞性HIV分离株的主要HIV抑制性因子。

在这些研究中，在注射DNA免疫原后观察到了水平显著的趋化因子表达。这些结果暗示了它们作为免疫应答的重要激活剂和调节剂的潜在作用。为了阐明这些趋化因子在免疫诱导和调节中的具体作用，我们利用趋化因子DNA表达盒的共输送作为抗原输送模型。DNA共免疫是研究趋化因子体内功能的合适模型，因为DNA疫苗通过MHC I类和II类通道诱导了体液和细胞免疫应答。另外，我们和其它人已经证明，对于DNA疫苗的抗原特异性免疫应答可以通过共注射协同刺激分子和细胞因子基因与DNA免疫原盒来调节。因此，我们克隆了趋化因子表达载体，并与HIV-1DNA免疫原一起共免疫，并检查趋化因子表达对于免疫激活的作用。我们观察到，α-趋化因子IL-8和β-趋化因子MIP-1α、RANTES和MCP-1对抗原特异性免疫应答的激活有特异性的可鉴定的作用。

例如，IL-8是中性粒细胞的趋化因子，它诱导中性粒细胞离开血流迁移进入周围组织。我们发现IL-8是CD4⁺T细胞的强诱导物(通过强的T辅助细胞增殖反应以及抗体应答来表明)。IgG1与IgG2a的比值减少以及IFN-γ的表达增强表明，IL-8的共表达还调节免疫应答向Th1型移动。另一方面，IL-8的共给予对CD8⁺T细胞没有显著的影响，因为它不增强对CTL应答。

MIP-1α能化学引诱嗜酸性粒细胞并使其脱颗粒。MIP-1α还诱导嗜碱性粒细胞和肥大细胞释放组胺，并且是嗜碱性粒细胞和B细胞的趋化因子。这些报道支持了我们的观察结果，即MIP-1α对抗体应答具有最大的影响。另外，MIP-1α还是CD4⁺T细胞的强诱导物，具有良好的T辅助细胞增殖反应。MIP-1α共表达还调节免疫应答向Th2型移动(通过IgG 1与IgG 2a的比值增加表明)。相反，MIP1-α的共免疫对CD8⁺T细胞应答的影响很小。

与IL-8和MIP-1α的作用不同，RANTES的共免疫对抗体应答的影响很小。RANTES是单核细胞的化学引诱物。另外，RANTES能化学引诱未受刺激的CD4⁺/CD45RO⁺记忆T细胞以及受刺激的CD4⁺和CD8⁺T细胞。我们发现，RANTES能将CD4⁺和CD8⁺T细胞化学吸引到DNA免疫部位，在诱导T辅助细胞增殖反应和CTL应答中起重要作用。Th1细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达增加支持了Th1应答激活的加强。已经确定RANTES表达所诱导的高水平的CTL应答是I类限制性的和依赖于CD8⁺T细胞。

作为单核细胞的一种强效趋化因子，认为MCP-1是慢性炎性疾病的最重要的趋化因子之一。MCP-1诱导单核细胞从血流中迁移出来，变成组织巨噬细胞。发现MCP-1化学吸引激活的记忆亚组的T淋巴细胞。在所有检测的趋化因子中，MCP-1是CD8⁺CTL的最强效的激活剂。MCP-1表达所诱导的CTL应答的增强经确定是I类限制性的，并且依赖于CD8⁺T细胞。增强的CTL结果得到Th1细胞因子IFN-γ和TNF-α的表达增加以及IgG 1与IgG 2a比值减少的支持。与RANTES不同的是，MCP-1对T辅助细胞增殖反应具有明确的、但适中的影响。和RANTES一样，MCP-1的共给予对抗体应答的影响很小。这种比较强调了体液应答、T辅助细胞应答和T细胞毒性应答的诱导可被相互独立地调节。

除了它们对免疫应答的直接作用外，趋化因子基因的共表达以自分泌方式导致表达增加。例如，我们发现，pCEnv和MIP1-α的共免疫可以使MIP1-α表达大幅增加超过单用pCEnv免疫时的表达水平。从RANTES的共输送发现RANTES有类似的增加，且MCP-1增加。

另外，趋化因子的共表达还导致其它趋化因子的表达增强。这些结果暗示，这些趋化因子不仅具有直接调节免疫应答的作用，而且还具有控制其它趋化因子产生的作用。

一个重要的发现是趋化因子RANTES和MCP-1在诱导TNF-α表达中所起的作用。TNF-α由激活的巨噬细胞和单核细胞、中性粒细胞、激活的淋巴细胞和NK细胞产生，而TNF-β由淋巴细胞产生。TNF-α还涉及注射革兰阴性菌后的脓毒性休克和类风湿性关节炎。另外，TNF-α在调节其它促炎性细胞因子合成中起关键作用。由于TNF-α在各种疾病中起着关键作用，因此作了许多努力来减少体内TNF-α的水平作为治疗病情(如类风湿性关节炎)的潜在方法。在我们的试验中，我们发现RANTES或MCP-1的共表达导致TNF-α的表达增加。这些结果暗示，抑制RANTES和MCP-1可能作为抑制体内TNF-α表达的一种相关策略。

感兴趣的是Th1对Th2表型看来独立于其它免疫功能而分开。IL-8加强了体液应答，但将这些应答向Th1表型移动，使IgG 1/IgG 2a值减半。而MIP-1α(可能是最强的血清学驱动物)使IgG1/IgG2a比值向Th2应答方向显著移动。显然，这种控制作用能使主要的抗原特异性免疫应答的诱导向所需的表型以及免疫球蛋白同种型相互独立地移动。另外，细胞应答的诱导相对于较高的体液应答的诱导看来是相对极化的免疫功能。对体液应答最有显著影响的那些趋化因子(IL-8和MIP-1α)表现出对CTL应答的影响很小，而介导对CTL应答最显著作用的那些趋化因子(RANTES和MCP-1)对血清学的影响很小。相同的CTL驱动性趋化因子RANTES和MCP-1均刺激产生IFN-γ和TNF-α，而体液应答物对免疫激活的这些细胞因子制造者的影响很小。

实施例2

当将编码IL-18的核苷酸序列作为疫苗或免疫治疗剂的一部分输送给某些细胞时，其效果较低，因为它在全长形式下是无活性的，只有被加工成成熟形式后才变得有活性。如图1A所示，IL-18的开头35个氨基酸被蛋白酶类-1(ICE)断裂。构建突变型IL-18核苷酸序列，它被翻译成图1B所示的突变体IL-18。该IL-18突变型作为本发明有效的免疫调节蛋白运作。编码突变体IL-18的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致T辅助细胞应答增强。编码该突变型的核苷酸序列可以插入pCDNA3中。

实施例3

编码CD40的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致CTL应答增强。

编码CD40的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。

编码CD40L的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致CTL应答增强。

编码Fas的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致CTL应答增强。

编码ICAM-1的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致CTL应答增强。

编码ICAM-1的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。

编码LFA-3的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致CTL应答增强。

编码LFA-3的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。

编码VCAM-1的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。

编码PECAM-1的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。

编码E-选择蛋白的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。

编码M-CSF的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致CTL应答增强。

编码G-CSF的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致CTL应答增强。

编码M-CSF的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。

编码G-CSF的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。

编码IL-4的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。

编码IL-7的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致CTL应答增强。

编码NGF的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致CTL应答增强。

编码VEGF的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致CTL应答增强。

编码IL-7的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。

编码NGF的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。

编码VEGF的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。

编码MCP-1的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致CTL应答增强。

编码RANTES的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致CTL应答增强。

编码MCP-1的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。编码RANTES的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。

编码MIP1-α的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。编码IL-8的核苷酸序列与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致辅助T细胞应答增强。

MCP-1、RANTES、MIP-1α和IL-8中的任一个与编码免疫原的核苷酸序列的联合输送导致抗体应答增强。

MCP-1或RANTES之任一个的输送导致TNF-α的产生增强。

MCP-1、RANTES、MIP-1α和IL-8之任一个与编码免疫原的核苷酸序列的输送导致IFN-γ的产生增强。

实施例4

我们检查了在M-CSF(巨噬细胞-集落刺激因子)、G-CSF(粒细胞-CSF)和GM-CSF(粒细胞/单核细胞-CSF)的基因表达盒与HIV-1 DNA免疫原构建物共输送后对于抗原特异性免疫应答的影响。将这些细胞因子的基因单独克隆到表达载体中处于巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下。然后将基因质粒表达盒与HIV-1免疫原的DNA疫苗盒一起注射到小鼠体内。我们分析了用这些基因佐剂表达盒的共注射对于抗原特异性免疫应答的方向和数量的免疫学影响；将这些结果与我们用原型预防性Th1和Th2型细胞因子(分别为IL-12和IL-4)的基因共输送后观察到的结果比较。用这些DNA疫苗构建物作为模型抗原，我们发现CSF基因能清楚明显地调节体内的抗原特异性免疫应答，并以疫苗特异性方式推动β-趋化因子的产生。

材料和方法

DNA质粒

如Boyer，J.D.等人(1997)Nature Med.3，526-532所述的那样(该内容纳入本文作参考)，制备表达HIV-1包膜蛋白和gag/pol蛋白的DNA疫苗构建物pCEnv和pCGag/pol。如Kim，J.J.等人(1998)Eur.J.Immunol.28，1089-1103和Kim，J.J.，等人(1998)J.Clin.Invest.102，1112-1124所述的那样(这些内容纳入本文作参考)，将人G-CSG和M-CSF以及小鼠GM-CSF的基因克隆到pCDNA3表达载体(Invitrogen，Inc.，San Diego，CA)中。已报道人G-CSF和M-CSF在小鼠细胞中有活性。用Qiagen MaxiPrep试剂盒(Qiagen，Santa Clara，CA)在细菌内生产质粒DNA并纯化。

试剂和细胞系

小鼠肥大细胞瘤p815细胞系获自ATCC(Rockville，MD)。表达HIV-1包膜、gag/pol和半乳糖苷酶的的重组痘苗vMN462、vVK1和vSC8获自NIH AIDS Researchand Reference Reagent Program。重组gp120或p24蛋白购自ImmunoDiagnostics，Inc.(Bedford，MA)。

小鼠DNA接种

在6至8周龄雌性BALB/c小鼠(Harlan Sprague Dawley，Inc.，Indianapolis，IN)的股四头肌部位注射50μg各种感兴趣的DNA构建物，这些构建物配制在磷酸盐缓冲液(PBS)和0.25％布吡卡因-HCl(Sigma，St.Louis，MO)中。各种基因表达盒的共同给予包括将所选质粒混合，然后注射。对照小鼠用50微克pCDNA3载体免疫。每组研究进行三次，提供一组典型的结果。小鼠接受的两次DNA免疫(各50毫克)相隔两周。在加强注射后一周，处死小鼠，取出脾脏，分离淋巴细胞，测试细胞(Th或CTL)应答。所有动物饲养在宾西法尼亚大学的温度控制、光照循环的设备中，并按国立卫生研究院和宾西法尼亚大学指导护理。

ELISA

p24或gp120蛋白稀释在0.1M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.5)中至浓度为2毫克/毫升，取50微升4℃过夜吸附到微量滴定板的孔上。该板用PBS-0.05％吐温-20洗涤，在37℃用3％BSA(PBS配)和0.05％吐温-20封闭1小时。用0.05％吐温-20稀释小鼠抗血清，并37℃培育1小时，然后与HRP-偶联的山羊抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO)一起培育。用3′3′5′5′TMB(Sigma)缓冲液洗涤板并显影。为了测定gp120-特异性IgG亚类的相对水平，用HRP偶联的抗鼠IgG 1和IgG 2a(Zymed，San Francisco，CA)代替抗鼠IgG-HRP。然后加入ABTS底物溶液(Chemicon，Temecula，CA)。在每一步骤中，用洗涤缓冲液(PBS+0.05％吐温-X)洗涤3次。在Dynatech MR5000测试板读数仪上读取诸板在450nm处的光密度值。

T辅助细胞增殖试验

从脾脏收获淋巴细胞，去除红细胞并用新鲜培养液洗涤数次制备效应细胞。将分离细胞重悬至浓度为5×10⁶细胞/毫升。取含5×10⁵细胞的100微升等份立即加入96孔平底微量滴定板各孔内。在孔中加入重组p24或gp120蛋白至最终浓度分别为5μg/ml和1μg/ml，一式三份。这些细胞在5％CO₂中37℃培养3天。在各孔中加入1mCi氚化胸苷，37℃培养细胞12至18小时。收获测试板，在β测试板读数仪(Wallac，Turku，Finland)上测定掺入的氚化胸苷量。用以下公式计算刺激指数：

刺激指数(SI)＝(试验计数/自发计数)

自发计数的测试孔内包括作为非相关蛋白对照的10％胎牛血清。

细胞毒性T淋巴细胞试验

用牛痘感染的靶细胞进行5小时的⁵¹铬释放CTL试验。用体外效应物刺激进行试验，用相关牛痘(包膜为vMN462和gag/pol为vVK1)感染的细胞刺激效应细胞，该感染细胞用0.1％戊二醛在CTL培养基中以5×10⁶细胞/毫升下固定5天。用CTL培养基非特异性地刺激效应细胞两天，该CTL培养基由RPMI 1640(Gibco-BRL，GrandIsland，NY)、10％胎牛血清(Gibco-BRL)和10％不含Con A的RAT-T-STIM(BectonDickinson Labware，Bedford，MA)组成。在37℃以10至20的感染复数(MOI)对3×10⁶个P815细胞进行5至12小时的感染，制备牛痘感染的靶细胞。进行标准铬释放试验，用100μCi/ml Na₂ ⁵¹CrO₂标记靶细胞60至120分钟，用于和受刺激的效应脾细胞一起37℃培育4至6小时。在效∶靶(E∶T)比50∶1至12.5∶1下测定CTL裂解。收获上清液，在LKB CliniGammaγ计数仪上计数。用以下公式测定特异性裂解百分比：

100×(试验释放量-自发释放量)÷(最大释放量-自发释放量)

最大释放量以含1％Triton X-100的培养基裂解靶细胞来测定。如果“自发释放”计数值超过“最大释放”计数的20％，则该试验视为无效。

CD8+T细胞的补体溶解

通过α-CD8单克隆抗体(Pharmingen，San Diego，CA)处理，然后与家兔补体(Sigma)一起37℃培育45分钟，将CD8⁺T细胞从脾细胞中除去。

细胞因子/趋化因子表达分析

在第6天收集用于CTL试验的受刺激效应细胞的上清液，用检测IFN-γ和IL-4(Biosource International，Inc.，Camarillo，CA)和MIP-1α(R&D Systems，Minneapolis，MN)、MIP-1β和RANTES(Intergen，Pace，NY)的ELSIA试剂盒测定各上清液的细胞因子和趋化因子分布图。

结果

细胞因子表达盒的构建

将细胞因子基因分别克隆到pCDNA3质粒表达载体内。为了测试细胞因子构建物是否表达了其相关蛋白，我们将它们转染到RD肌细胞系中，用细胞因子ELISA分析这些构建物的表达。结果证实每个表达盒均产生特异性的细胞因子(G-CSF～40-60pg/ml；GM-CSF＞70pg/ml；M-CSF～60-70-pg/ml)。

G-CSF诱导T辅助细胞应答增强

G-CSF是由巨噬细胞、成纤维细胞、内皮细胞和骨髓基质细胞产生的一种生长因子。G-CSF激活中性粒细胞、内皮细胞和血小板，但是认为它对抗原呈递细胞的直接影响很少。我们检查了G-CSF共表达对于抗原特异性抗体应答的作用。从pCEnv和pCEnv+G-CSF免疫的小鼠收集抗血清，并用ELISA分析针对HIV-1 gp120蛋白的特异性抗体应答。测定DNA免疫6周后收集的血清的gp120-特异性抗体滴度。G-CSF的共免疫对gp120-特异性抗体应答的水平没有显著影响。用pCGag/pol免疫的组观察到类似的结果。另外，测定G-CSF基因共给予所诱导的gp120-特异性IgG的亚类。已有报道说，IgG 1型的产生由Th2型细胞因子诱导，而IgG 2a型的产生由Th1型细胞因子诱导。测定IgG 2a与IgG 1(Th1和Th2)的相对比值。pCEnv免疫组的IgG 2a与IgG 1比值为0.8。另一方面，原型Th1细胞因子IL-12基因的共免疫使该比值增加至1.28，而与Th2细胞因子IL-4基因的共注射导致该比值减少至0.68。G-CSF的共给予使该相对比值增加至1.1，这表明向Th1型应答移动。

还测定了G-CSF的共表达对T辅助细胞增殖反应的影响。T辅助淋巴细胞在通过B细胞诱导体液免疫应答和通过CD8⁺细胞毒性T细胞诱导细胞免疫应答中起关键的作用。IL-12基因的共免疫显著增加了抗原特异性Th增殖反应的水平。相反，与IL-4基因的共注射对于Th增殖反应的影响很小。G-CSF与HIV-1免疫原的共表达导致抗原特异性T辅助细胞增殖反应明确增强。

另外，还调查了细胞因子共表达对CTL应答的影响。从对照动物观察到有本底水平的特异性杀伤作用，而用pCEnv或pCGag/pol免疫的动物显示出抗原特异性CTL应答低的但明确的水平。用IL-12基因的共注射显著增加了该抗原特异性CTL应答的水平。相反，用IL-4基因共免疫对于该应答的影响却很小。类似的，G-CSF的共给予对抗原特异性CTL应答没有任何增强作用。

在免疫应答期间，细胞因子在指引和靶向免疫细胞中起关键作用。例如，IFN-γ复杂地参与调节T细胞介导的细胞毒性免疫应答，而IL-4在B细胞介导的免疫应答中起主要作用。我们分析了用于CTL试验的体外刺激的效应细胞的上清液，并测试其细胞因子IFN-γ和IL-4的释放情况。我们发现，G-CSF的表达增加了IFN-g的水平(2倍)，但是它没有影响IL-4的产生水平。

GM-CSF是抗体应答和T辅助细胞应答的强诱导物

GM-CSF激活并分化粒细胞，并起着内皮细胞、类红细胞、巨核细胞和T辅助细胞生长因子的作用。尚不清楚GM-CSF是否对杀伤性T细胞有影响。与G-CSF共表达相反，GM-CSF的共表达在诱导抗原特异性体液应答中具有显著的增强作用(在所有组中最高)。与IL-4共注射类似，GM-CSF的共免疫导致最高水平的包膜特异性抗体应答。用pCGag/pol免疫的组看到了类似的结果。另一方面，与单用pCEnv免疫的组相比，pCEnv+GM-CSF的共免疫对于IgG 2a/IgG 1比值没有任何影响。另外，和IL-12的共免疫一样，GM-SF和HIV-1免疫原(pCEnv或pCGag/pol)的共表达产生了最高水平的抗原特异性T辅助细胞增殖反应。我们还发现GM-CSF表达增加了FIN-γ的水平(2倍)，但是它不影响IL-4的产生水平。相反，GM-CSF的共免疫对抗原特异性CTL应答只稍有影响。

M-CSF是CTL应答的强诱导物

M-CSF是巨噬细胞以及巨噬细胞先祖细胞的强激活剂。M-CSF受体具有受限制的表达方式，同样局限于巨噬细胞。因此可以评价M-CSF的共输送对于此APC群的直接作用。与GM-CSF不同，M-CSF和pCEnv的共表达对HIV-1包膜特异性抗体应答具有明确的增强作用(但低于IL-4或GM-CSF)。测定了共给予pCEnv和M-CSF后IgG 2a与IgG 1的相对比值。pCEnv免疫组的IgG 2a与IgG 1比值为0.8。另一方面，pCEnv和M-CSF的共注射使该相对比值增加至1.2，这表明向Th1型应答明显移动。另外，M-CSF和HIV-1免疫原(pCEnv或pCGag/pol)的共表达导致抗原特异性T辅助细胞增殖反应明显增加。与导致对CTL活性影响很小的pCEnv+G-CSF或pCEnv+GM-CSF的共注射不同，在共注射了pCEnv和M-CSF后，观察到感染了表达HIV-1包膜的牛痘(vMN642)的靶细胞的特异性杀伤作用有更为显著的增加。在效靶(E∶T)之比为50∶1时，共注射pCEnv和M-CSF后，观察到靶细胞有几乎40％的特异性裂解。同样，用pCGag/pol和M-CSF免疫小鼠，结果导致感染了表达HIV-1gag/pol的牛痘(vVK1)的靶细胞的抗原特异性CTL裂解明显增强。用pCEnv和M-CSF免疫的小鼠的IFN-γ的释放水平明显高于pCEnv免疫组或对照组的水平。另一方面，这些组的IL-4水平是相似的。

M-CSF共免疫对CTL应答的增强作用局限于CD8 T细胞

为了确定M-CSF共表达而增强的CTL应答是否局限于CD8⁺T细胞，用HIV-1包膜肽(RIHIGPGRAFYTTKN)进行CTL试验，该肽已经证明是balb/c小鼠的MHC I类限制性CTL的特异性表位。让小鼠接受相隔两周的两次各50微克DNA构建物的免疫接种，在第二次免疫后1周收获它们的脾脏。在用所述的包膜特异性肽体外刺激后的分离的脾细胞上进行CTL试验。我们观察到，在E∶T比为50∶1时，与M-CSF共注射后CTL应答均有明显增强，特异性杀伤作用为40％。我们验证了该观察结果，方法是在通过补体溶解从效应细胞群中除去CD8⁺T细胞后测定CTL活性。CD8⁺T细胞的除去导致M-CSF共注射后所见的抗原特异性CTL增强作用被抑制。这些结果表明，溶细胞活性的增强是抗原特异性的，I类限制性的，并且依赖于CD8⁺T细胞。

M-CSF基因的共输送调节受刺激T细胞产生β趋化因子

我们检查了受刺激T细胞的β-趋化因子(MIP-1α、MIP-1β和RANTES)的表达情况。这些β-趋化因子是由CD8⁺T细胞针对亲巨噬细胞性病毒而非亲T细胞性病毒而产生的主要HIV抑制因子。另外，这些CD8⁺T细胞产生的趋化因子已经证明在外周的细胞免疫扩张(immune expansion)起关键作用。具体地说，我们发现用pCEnv的DNA免疫诱导出β-趋化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES。另外，我们发现，与造血细胞因子基因的共免疫导致受刺激T细胞的趋化因子表达增加。例如，我们发现通过pCEnv和G-CSF的共免疫可使MIP-1α表达明显增加超过单用pCEnv免疫所表达的水平。另外，我们发现，pCEnv和M-CSF的共免疫显著增加了MIP-1β的表达。另一方面，pCEnv和M-CSF、pCEnv和G-CSF以及pCEnv和GM-CSF的共免疫却没有使受刺激效应细胞的RANTES表达明显增加超过单用DNA疫苗盒所诱导出的水平。然而，感兴趣的是，M-CSF看来下调了MIP-1α的水平，甚至低于基因免疫本身所诱导的水平。该信息提示，MIP-1α不直接参与推动CTL应答，实际上可能干扰了其诱导。

讨论

局部免疫环境(可能在注射部位的局部淋巴结外周或肌肉中)的控制可能影响免疫应答的程度和方向。我们研究了作为DNA疫苗分子佐剂的G-CSF、GM-CSF和M-CSF的基因共输送所产生的免疫效果。

我们发现G-CSF、GM-CSF和M-CSF cDNA构建物均以独特的方式调节了DNA疫苗的免疫效果。G-CSF是一种多效细胞因子，最为人知的是其对中性粒细胞谱系的造血细胞的增殖、分化和激活的特异性作用。它主要由单核细胞和巨噬细胞在受各种刺激(包括内毒素、IL-1、TNF-α和IFN-γ)激活后而产生。它调节中性粒细胞前体的增殖和成熟，并直接作用于成熟的中性粒细胞以增强吞噬作用、ADCC、超氧化物的产生、趋化性和细胞-表面粘附分子的表达。G-CSF的体外给予能刺激骨髓造血先祖细胞形成嗜中性集落。在临床上，最通常的是给予G-CSF来治疗化疗和放疗诱导产生的中性粒细胞减少。我们发现G-CSF的共免疫总体上对抗体应答的影响很小。IgG 2a/IgG 1比值增加和IFN-γ的表达增加表明，G-CSF的共表达调节免疫应答向Th1型移动。另外，G-CSF的共表达导致T辅助细胞增殖反应有适度增加。总体上，G-CSF对抗原特异性免疫应答最多有适中的影响(不应直接影响抗原呈递)。

GM-CSF是一种能刺激各种造血细胞增殖、成熟和发挥功能的多效细胞因子。首先认识到GM-CSF能刺激中性粒细胞、单核细胞/巨噬细胞以及嗜酸性粒细胞集落形成。它由各种类型的细胞(包括T细胞、B细胞、巨噬细胞、肥大细胞、内皮细胞和成纤维细胞)对细胞因子或免疫和炎性刺激反应中产生的。我们发现，强的T辅助细胞增殖反应以及抗体应答的加强表明GM-CSF是CD4+Th细胞的强诱导物。另一方面，pCEnv和GM-CSF的共免疫对IgG 2a/IgG 1比值没有任何影响。另外，GM-CSF的共给予似乎对CD8⁺T细胞没有显著的效果，其表现为对抗原特异性的CTL应答的诱导缺乏影响。因此，该细胞因子产生的疫苗辅佐作用全部集中在T辅助细胞上。这些结果支持并扩大了以前关于GM-CSF cDNA构建物作为分子佐剂的应用研究。已经报道，表达狂犬病毒糖蛋白的质粒和编码小鼠GM-CSF的质粒肌内共接种增强了B细胞和T辅助细胞的活性。类似的，我们报道说，GM-CSF cDNA和DNA疫苗构建物的共免疫增加了抗原特异性抗体和Th-细胞增殖反应。相反，在这些研究中，没有发现GM-CSF的基因对CTL诱导有任何影响。用GM-CSF与编码流感核蛋白(NP)的DNA免疫原共输送报道了相似的发现。我们还将GM-CSF cDNA构建物与编码HSV-2 gD蛋白的DNA表达构建物一起共输送。然后，我们分析了HSV致死性攻击后疫苗对所得免疫表型以及受免疫动物的死亡率和发病率的调节作用。我们发现，GM-CSF基因的共给予不仅提高了存活率，而且还减少了HSV阴道内攻击后疱疹性病损的频率和严重程度。

已经显示，M-CSF是单核吞噬细胞的生长、分化和发挥功能的调剂物。它还增加了粘附分子和Fc受体的表达，增加了杀肿瘤活性，增强了包括IL-1、TNF-α和IFN-γ在内的细胞因子的次级释放。M-CSF最初发现于血清、尿液和其它生物体液中作为能刺激骨髓造血先祖细胞形成巨噬细胞集落的一种因子。M-CSF可以由多种细胞产生，这些细胞包括成纤维细胞、子宫内膜分泌性上皮细胞、骨髓基质细胞、脑星形胶质细胞、成骨细胞、肾血管系膜细胞、角质细胞和LPS或细胞因子激活的巨噬细胞、B细胞、T细胞和内皮细胞。在研究的CSF类物质中，M-CSF是CD8⁺CTL的最强效激活剂。M-CSF表达诱导的CTL应答增强既为MHC I类限制性，又依赖于CD8⁺T细胞。此种增强的CTL结果得到IFN-γ产生的增加以及IgG 2a/IgG 1比值增加的支持。与GM-CSF的作用不同，M-CSF的共免疫对抗体应答的影响微弱。与GM-CSF的作用类似，M-CSF和HIV-1免疫原的共表达导致抗原特异性T辅助细胞增殖反应增强，但是程度较低。看来该细胞因子为CTL通道特别提供了益处。

感兴趣的是比较了Th1/Th2型细胞因子与CSF基因的免疫调节作用。例如，GM-CSF的共注射类似于IL-4共免疫那样明确调节了抗体应答的水平。另一方面，IL-4共免疫导致更呈Th2型的应答(从IgG 2a/IgG 1比值显著减少看出)。另外，GM-CSF共注射对Th增殖反应的显著增强作用只与IL-12共给予相匹配。另一方面，M-CSF(不是G-CSF或GM-CSF)基因的共输送导致CD8⁺T细胞限制性的CTL应答明显增强。这些结果表明在免疫激活部位产生这些生长因子能调节体内DNA疫苗诱导的免疫应答的水平。另外，这些结果暗示这些生长因子能在调节免疫应答级联反应中起着更活跃的作用，这在以前被认为是在传统的Th1和Th2型细胞因子的范围内。

除了分析细胞为基础的应答外，我们还检查了CSF基因共表达导致的对趋化因子产生的调节作用。趋化因子是免疫和炎性应答的重要调节剂。在白细胞从血管移动到宿主防御机制外周部位的分子调节中，趋化因子是尤其重要的。另外，一些趋化因子已证明在调节外周的免疫扩张(expansion)中起关键作用。我们发现CD8⁺效应T细胞在引发免疫应答时增加了趋化因子表达水平，这表明这些期末的效应细胞在抗原特异性免疫应答的扩张期起调节作用。除了它们在炎性和免疫应答中的功能外，一些趋化因子可能在AIDS的传播和进展中起关键作用。早在10年前，就已经预计到HIV包膜糖蛋白gp120与CD4的结合不足以导致病毒融合和进入，这提示HIV感染还需要额外的细胞-表面辅因子。最近的研究已经确定，亲T细胞性和亲巨噬细胞性HIV病毒株与其靶细胞融合所需的协同受体分别是CXCR-4和CCR-5。β-趋化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES是CCR-5的天然配体，它们是CD8⁺T细胞针产生的对亲巨噬细胞性、而不是亲T细胞性HIV分离株的主要HIV抑制性因子。

我们研究了体内受疫苗刺激细胞的MIP-1α、MIP-1β和RANTES的表达，发现与CSF基因共免疫导致受抗原刺激的T细胞的趋化因子表达增加。我们发现，通过pCEnv和G-CSF的共免疫，MIP-1α的产生可明显增加超过单用pCEnv免疫所产生的水平。特别是，我们发现pCEnv和M-CSF共免疫显著增加了MIP-1β表达。相反，没有一种共注射策略导致受刺激效应细胞的RANTES表达显著增加。发现的另一个新作用是RANTES和MIP-1β的显著增加以及同时MIP-1α的降低。实际上，M-CSF诱导的MIP-1α水平低于对照水平。该数据提示MIP-1α信号传导通过CCR1、CCR4和CCR5产生了一个信号，该信号与RANTES或MIP-1β通过CCR3或CCD9输送产生的信号不同。

这些数据表明，生长因子cDNA构建物的共输送调节了体液免疫应答和细胞(包括产生趋化因子)免疫应答。特别是，与M-CSF的共注射对于抗原特异性CTL诱导和趋化因子产生最具调节作用。

实施例5：ICAM-1提供了T细胞共同刺激和趋化因子产生

我们研究检查了由趋化因子密切调节的三种特异性粘附分子的免疫调节作用。我们利用DNA疫苗技术来研究ICAM-1、LFA-3和VCAM-1在体内免疫激活中所起的作用。具体地说，我们将ICAM-1、LFA-3和VCAM-1的基因分别克隆到表达载体中处于巨细胞病毒(CMV)启动子的控制下。然后将这些构建物与编码HIV-1包膜或gag/pol抗原的DNA免疫原一起共免疫。我们分析了与这些粘附分子表达盒的共注射对抗原特异性免疫应答水平的免疫学效果。

我们发现，DNA免疫原和粘附分子ICAM-1和LFA-3的共表达能增强抗原特异性T细胞应答。然而，ICAM-1和LFA-3看来在抗原特异性体液应答的表达中没有作用。相反，它们看来特异性地影响T细胞应答。LFA-3增强CD4⁺T细胞应答并显示出对CD8⁺T细胞功能有更次要的影响。更重要的是，ICAM-1共给予显著增加了CD4⁺和CD8⁺T细胞应答。ICAM-1共表达还显著增加了抗原特异性β-趋化因子的产生，提示LFA-1的连接在外周T细胞扩张中起重要作用。这些分子的激活表型看来与原型CD80/CD86共同刺激分子不同。这些结果支持了这样一个观点，即细胞因子、趋化因子和粘附分子的外周网络协同调节了效应物功能部位的效应T细胞应答。

材料和方法

DNA质粒

如Kim，J.J.，等人Nature Biot.15：641-645所述的那样(该内容纳入本文作参考)，制备表达HIV-1包膜蛋白和gag/pol蛋白的DNA疫苗构建物pCEnv和pCGag/pol。将ICAM-1、LFA-3和VCAM-1的基因克隆到pCDNA3表达载体(Invitrogen，Inc.，San Diego，CA)中，如Kim，J.J.，等人Eur.J.Immunol.28：1089-1103所述的那样产生了纯净的质粒DNA。

试剂和细胞系

人横纹肌肉瘤(RD)和小鼠肥大细胞瘤P815细胞系获自ATCC(Rockville，MD)。表达HIV-1包膜、gag/pol和半乳糖苷酶的的重组疫苗vMN462、vVK1和vSC8获自NIH AIDS Research and Reference Reagent Program。重组gp120或p24蛋白购自ImmunoDiagnostics，Inc.(Bedford，MA)。

粘附分子表达构建物的表达

将ICAM-1、LFA-3、VCAM-1构建物转染到RD细胞中，分析这些构建物的表达。转染72小时后收获细胞，用异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的抗ICAM-1、LFA-3、VCAM-1的单克隆抗体(Pharmingen，San Diego，CA)进行FACS分析，测试表达情况。

小鼠DNA接种

在6至8周龄雌性BALB/c小鼠(Harlan Sprague Dawley，Inc.，Indianapolis，IN)的股四头肌部位注射50μg各种感兴趣的DNA构建物，这些构建物配制在磷酸盐缓冲液(PBS)和0.25％布吡卡因-HCl(Sigma，St.Louis，MO)中。各种基因表达盒的共给予包括将所选质粒混合，然后注射。对照小鼠用50微克pCDNA3载体免疫。每组研究进行三次，提供一组典型的结果。小鼠接受的两次DNA免疫(各50微克)相隔两周。在加强注射后一周，处死小鼠，取出脾脏，分离淋巴细胞，测试细胞(Th或CTL(细胞毒性T淋巴细胞))应答。

ELISA

p24或gp120蛋白稀释在0.1M碳酸盐-碳酸氢盐缓冲液(pH9.5)中至浓度为2微克/毫升，取50微升4℃过夜吸附到微量滴定板的孔上。该板用PBS-0.05％吐温-20洗涤，在37℃用3％BSA(PBS配)和0.05％吐温-20封闭1小时。用0.05％吐温-20稀释小鼠抗血清，并37℃培育1小时，然后与HRP-偶联的山羊抗小鼠IgG(Sigma，St.Louis，MO)一起培育。用3′3′5′5′TMB(Sigma)缓冲液洗涤测试板并显影。在DynatechMR5000测试板读数仪上读取板在450nm处的光密度值。

T辅助细胞增殖试验

从脾脏收获淋巴细胞，去除红细胞并用新鲜培养液洗涤数次制成效应细胞。将分离的细胞悬液重悬至浓度为5×10⁶细胞/毫升。取含5×10⁵细胞的100毫升等份立即加入96孔平底微量滴定板各孔内。在孔中加入重组p24或gp120蛋白至最终浓度分别为5μg/ml和1μg/ml，一式三份。这些细胞在5％CO₂中37℃培养3天。在各孔中加入1mCi氚化胸苷，37℃培养细胞12至18小时。收获测试板，在β测试板读数仪(Wallac，Turku，Finland)上测定掺入的氚化胸苷量。用以下公式计算刺激指数：

刺激指数(SI)＝(试验计数/自发计数)

自发计数的测试孔内包括作为非相关蛋白对照的10％胎牛血清。此外，pCEnv或对照免疫的动物一般对Pr55蛋白的SI为1。类似地，pCGag/pol或对照一般对gp120蛋白的SI为1。为了确保细胞健康，将PHA或con A(Sigma)用作多克隆刺激剂阳性对照。PHA或con A对照样品的SI为20至40。

细胞毒性T淋巴细胞试验

用牛痘感染的靶细胞进行5小时的⁵¹铬释放CTL试验。用体外效应物刺激进行试验，其中用相关的牛痘感染的细胞(包膜为vMN462和gag/pol为vVK1)刺激效应细胞，此种感染细胞用0.1％戊二醛在CTL培养基中以5×10⁶细胞/毫升下固定5天。用CTL培养基非特异性地刺激效应细胞两天，该CTL培养基由RPMI 1640(Gibco-BRL，Grand Island，NY)、10％胎牛血清(Gibco-BRL)和10％不含Con A的RAT-T-STIM(Becton Dickinson Labware，Bedford，MA)组成。在37℃以10至20的感染复数(MOI)对3×10⁶个P815细胞进行5至12小时的感染，制备牛痘感染的靶细胞。进行标准铬释放试验，用100μCi/ml Na₂ ⁵¹CrO₄对靶细胞标记60至120分钟，并用来和受刺激的效应脾细胞一起37℃培育4至6小时。在效∶靶(E∶T)之比从50∶1至12.5∶1下测定CTL裂解。收获上清液，在LKB CliniGammaγ计数仪上计数。用以下公式测定特异性裂解百分比：

100×(试验释放量-自发释放量)÷(最大释放量-自发释放量)

最大释放量由含1％Triton X-100培养基中靶细胞的裂解来测定。如果“自发释放”计数超过“最大释放”计数的20％，则该试验视为无效。

CD8+T细胞的补体溶解

细胞因子/趋化因子表达分析

在第6天收集用于CTL试验的受刺激效应细胞的上清液，用针对IFN-γ和IL-4以及MIP-1α、MIP-1β和RANTES的ELSIA试剂盒(Biosource Camarillo，CA；R&DSystems，Minneapolis，MN；Intergen，Purchase，NY)测试表达。

结果

ICAM-1、LFA-3和VCAM-1可以由转染的细胞表达

将ICAM-1、LFA-3和VCAM-1的基因pCICAM-1、pCLFA-3和pCVCAM-1分别克隆到pCDNA3表达载体中(图2)。为了测试pCICAM-1、pCLFA-3和pCVCAM-1构建物是否能表达其相关的蛋白，我们将它们体内转染到人横纹肌肉瘤(RD)细胞中。利用FACS分析，我们发现CICAM-1、pCLFA-3和pCVCAM-1表达盒的转染分别导致ICAM-1、LFA-3和VCAM-1的特异性表达。我们还发现，两个DNA表达盒的肌内共免疫导致体内同一肌细胞共表达两种编码的蛋白。

粘附分子的共表达不影响Ag特异性的体液免疫应答

然后，我们调查了粘附分子的共表达对抗原特异性免疫应答诱导作用的影响。对于所有实验，在第0周和第2周将50微克各种DNA表达构建物肌内注射入BALB/c小鼠。第一个测定的免疫参数是抗原特异性体液应答。在第0、2和6周收集受免疫小鼠的抗血清，用ELISA分析针对HIV-1 gp120蛋白的特异性抗体应答。ICAM-1、LFA-3或VCAM-1的共表达看来对pCEnv免疫诱导的特异性抗体结合分布图有最小的影响。用与pCGag/pol共免疫的组看到了类似的结果。

ICAM-1或LFA-3的共表达增强了Ag-特异性的Th增殖反应

还研究了粘附分子共表达对细胞免疫应答程度的影响。CD4⁺T辅助细胞增殖反应的诱导是很重要的，因为Th细胞在通过B细胞诱导体液免疫应答和通过CD8⁺T细胞诱导CTL应答中起关键作用。测定了用pCGag/pol免疫的小鼠以及与pCICAM-1、pCLFA-3或pCVCAM-1共免疫的小鼠的Th增殖反应。将重组gp120 HIV-1包膜蛋白(5微克/毫升和1微克/毫升)接种到各孔中，以便特异性刺激T细胞增殖。我们还用非相关蛋白分析了这些组中T细胞的非特异性刺激，发现非特异性抗原不诱导体外T细胞增殖反应。用对照载体免疫的对照组中只有本底水平的增殖，在单用pCEnv免疫的组中发现有中等水平的增殖。相反，在与PCICAM-3或pCLFA-3免疫的组中有明显较高水平的增殖反应。另一方面，用VCAM-1基因共免疫的组未显示抗原特异性Th应答有任何增强。用pCGag/pol共免疫的组观察到相似的结果。在用两免疫原之一的重复实验中，与pCICAM-1或pCLFA-3共输送导致抗原特异性增殖反应增加3至4倍。

ICAM-1或LFA-3的共表达增强了Ag-特异性CTL应答

为了进一步研究细胞免疫力的增强情况，我们用经pCEnv和pCGag/pol共免疫的小鼠的脾细胞进行CTL试验。试验的进行是体外刺激效应脾细胞，然后测定特异性以及非特异性牛痘感染的或肽处理的靶细胞的铬释放。为了计算靶细胞的特异性溶解，从特异性靶细胞溶解百分比中减去不相关靶细胞的溶解百分比。从经pCDNA3、pCICAM-1、pCLFA-3或pCVCAM-1免疫的对照动物中观察到本底水平的特异性杀伤作用，而经pCEnv免疫的动物显示出低水平的CTL应答。另一方面，pCEnv和pCICAM-1的共免疫导致CTL活性显著增加。在效靶(E∶T)比为50∶1下，在pCEnv和pCICAM-1共免疫后发现HIV-1包膜牛痘(vMN462)感染的靶细胞的特异性杀伤高于40％。在E∶T比为12.5∶1下，CTL活性滴度为20％特异性溶解。相反，pCEnv和pCLFA-3的共免疫导致CTL活性有较中等程度的增加。pCGag/pol和pCICAM-1以及pCGag/pol和pCLFA-3的共免疫后观察到相似的CTL结果。

为了确定与pCICAM-1以及与pCLFA-3共表达后CTL应答的增加是否局限于CD8⁺T细胞，进行CTL试验，方法是在补体溶解除去效应细胞群中的CD8⁺T细胞以及不除去该细胞的情况下，测定CTL活性。CD8⁺T细胞的除去导致与pCICAM-1和pCLFA-3共注射后所见的抗原特异性CTL增强作用受到抑制。这些结果表明，溶细胞活性的增强是抗原特异性的，并且依赖于CD8⁺T细胞。

ICAM-1或LFA-3的共表达增加了受刺激T细胞产生IFN-γ

对免疫动物中受刺激CTL的细胞因子产生的分析，支持了所观察到的CTL结果。在免疫应答发展期间，细胞因子在指引和靶向免疫细胞中起关键作用。例如，IFN-γ复杂地参与调节T细胞介导的细胞毒性免疫应答，而IL-4在B细胞介导的免疫应答中起主要作用。我们分析了用于CTL试验的体外刺激的效应细胞的上清液，并测试它们释放细胞因子IFN-γ和IL-4的情况。我们发现，与pCICAM-1的共注射显著增加了IFM-γ的水平。与pCLFA-3的共免疫导致IFN-γ的产生较适中的增加。另一方面，所有动物组释放IL-4的水平相似。

ICAM-1的共表达显著增加了受刺激T细胞的β-趋化因子产生

最近我们报道了CD8⁺效应T细胞通过在感染部位周围产生特异性趋化因子而扩展了体内的抗原特异性应答。因此，我们分析受刺激CTL产生β-趋化因子的情况。我们分析了用于CTL试验的体外刺激的效应细胞的上清液，并测试了它们释放β-趋化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES的情况。如我们以前所注意到的那样，我们发现pCEnv的DNA免疫诱使MIP-1α、MIP-1β和RANTES的表达水平明显高于对照载体。另外，我们注意到pCEnv和pCLFA-3的共注射使β-趋化因子生产水平高于pCEnv免疫组的水平。还要显著的是，pCEnv与pCICAM-1的共免疫导致MIP-1α、MIP-1β和RANTES的产生比pCEnv免疫组有大幅度增加(2至4倍)。相反，pCVCAM-1的共给予没有增强趋化因子的表达水平。这些结果支持了这样一个结论，即ICAM-1和LFA-2提供了直接的T细胞共同刺激作用。

ICAM-1和CD86的共表达协同增强Ag-特异性CTL应答

认为B7(CD80和CD86)通道是输送关键的第二信号引导和扩展T细胞应答的主要共刺激通道。已经在作为调节剂的DNA疫苗意义上检测了这些分子。在此意义上，看来当CD86分子作为疫苗佐剂输送时，它在CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞的抗原特异性诱导中起着显著的作用。CD86 cDNA与DNA免疫原的共给予显著增加了抗原特异性CD8⁺CTL应答。ICAM-1以及LFA-3的效应可能依赖于B7-CD28信号，或它们可能代表另一个推动体内CTL诱导的协同通道。因此，我们进一步研究了ICAM-1和LFA-3分子在与CD86分子共表达时是否能协同增强CTL诱导水平。我们发现ICAM-1和CD86分子的共表达能协同增强抗原特异性CTL应答。另一方面，LFA-3和CD86分子的共表达没有提高CTL应答的水平。这些结果表明ICAM-1/LFA-1通道提供了独立于CD86/CD28通道的T细胞共同刺激信号，它们能协同作用来扩展体内T细胞应答。

受刺激CTL产生IFN-γ以及β-趋化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES的水平进一步支持了这些结果，表明ICAM-1/LFA-1信号独立于CD86/CD28信号起作用，并协调地扩展了T细胞应答。当我们用上述方法分析效应T细胞的上清液时，我们注意到LFA-3和CD86基因的共给予导致IFN-γ、MIP-1α、MIP-1β和RANTES的水平明显较高。这些结果进一步暗示ICAM-1和CD86在T细胞激活中的协同性质。

讨论

在免疫或炎性应答期间，淋巴细胞移动至接触抗原的部位。淋巴细胞和内皮细胞上的粘附分子在提供直接细胞接触以及指引白细胞迁移中起着重要的作用。另外，粘附分子在T淋巴细胞与APC结合时起着重要作用。ICAM-1(CD54)是90-114kD的分子，它表达在内皮细胞、巨噬细胞和树突细胞上，并与LFA-1和Mac-1结合。在所有的白细胞(包括T淋巴细胞)中均表达LFA-1，而Mac-1表达更局限于单核细胞、巨噬细胞和粒细胞。LFA-3(CD58)是55-70kD的表面分子，它由包括APCs的各种类型细胞表达(Springer，T.A.，等人，1987 Ann.Rev.Immunol.5：223-252，纳入本文作参考)。血管细胞粘附分子-1(VCAM-1)是一种110kD的表面分子，它表达在激活的内皮细胞和平滑肌细胞上(Osbom，L.等人，1989.Cell.59：1203-1211，纳入本文作参考)。VCAM-1识别并结合极迟(very late)抗原-4(VLA-4)，该抗原组成型表达在大多数单核白细胞(包括嗜酸性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞和嗜碱性粒细胞)上，但在中性粒细胞上没有(Elices，M.J.，等人1990 Cell.60：577-584，纳入本文作参考)。VCAM-1/VLA-4相互作用在白细胞迁移和血细胞渗出中起重要作用。

在此研究中，我们利用一种DNA免疫原模型来研究这些细胞表面粘附分子在提供T细胞激活和扩展所需刺激信号中的作用。在一个双信号T细胞激活模型中，第一激活信号通过抗原性肽-MHC复合物与T细胞受体连接而介导。第二共刺激信号通过CD80/CD86共同刺激分子与存在于T细胞上的其受体(CD28/CTLA-4)连接来提供。尽管该双信号模型在概念上是易懂的，且得到实验结果的很好支持，但是T细胞激活过程中提供的共同刺激信号可能不仅仅局限于B7(CD80/CD86)分子。其它细胞表面分子如APC上的粘附分子也可能具有提供共同刺激作用的重要功能，它们在向CD4⁺和CD8⁺T细胞提供直接的信号中所起的作用有待研究。

粘附分子在白细胞移动、炎性细胞募集以及免疫监视中很重要。最近已经提出粘附分子在T细胞激活中有作用。我们用均能与T细胞配体结合的一个粘附分子亚组研究了该作用。我们选出三个相关的分子ICAM01(CD54)、LFA-3(CD58)和VCAM-1(CD106)。利用编码ICAM-1、LFA-3和VCAM-1的DNA表达盒与我们的DNA免疫原，我们尝试鉴定了这些粘附分子与抗原共表达的特异性作用。我们注意到，DNA免疫原和粘附分子ICAM-1以及LFA-3的共表达可以增强抗原特异性T细胞(CD4⁺和CD8⁺T细胞)应答。ICAM-1或LFA-3分子与DNA免疫原的共表达导致Th细胞增殖反应明显增强。另外，与pCICAM-1的共免疫导致局限于CD8的CTL应答显著增加(与pCLFA-3的共免疫较为适中)。这些观察进一步支持了这样一个发现，即与LFA-3的共注射增加了受刺激CD8⁺T细胞产生IFN-γ以及β-趋化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES的水平。更令人印象深刻的是，与ICAM-1的共免疫导致IFN-γ和β-趋化因子的增加幅度更大。重要的是注意到单单增加细胞接触或细胞并置不足以增强抗原特异性T细胞-介导的应答。即使ICAM-1和VCAM-1具有相似的分子大小，但和VCAM-1的共注射对T细胞应答却没有可测得的影响。另一方面，ICAM-1共表达显著增加了CD4⁺和CD8⁺T细胞应答的水平。这些结果暗示，T细胞刺激作用并不是它们的粘附性质或分子大小所固有的。令人感兴趣的是，增强CTL的CTL推动型粘附分子(ICAM-1和LFA-3)均在各种APC上表达。实际上，最佳的CTL诱导型粘附分子ICAM-1在树突细胞上表达可能是很重要的。

我们还比较了增强的CTL诱导与靠CD86表达而增强的CTL诱导。我们发现CD86分子与ICAM-1(不是LFA-3)表达的组合能增强抗原特异性CTL应答。在外周的免疫激活中起重要作用的IFN-γ以及β-趋化因子MIP-1α、MIP-1β和RANTES的产生显著增加进一步支持了这些结果。尽管阐述这些分子的生物学意义需要进一步的研究，但是最近的一份研究发现了趋化因子MIP-1β和RANTES与CTL应答之间的关系。虽然附加的研究能更深入地了解这些分子的共同刺激作用，但这些结果表面ICAM-1分子能通过独立于CD86的通道提供T细胞共同刺激信号，并且它们能协同作用以增加提供给T细胞的共同刺激信号总水平。总之，这些结果支持粘附分子ICAM-1和LFA-3可能提供重要的共同刺激信号，这表明简单的T细胞激活双信号模型尽管在概念上是有用的，但可能不完整，应进一步考虑和研究具有多个共同刺激来源的更新的模型。这些结果表明，以采用其它细胞表面分子的T细胞共同刺激功能为目标的进一步研究是有理由的。

关于这些研究的一个重要问题是具有增强细胞免疫应答功能的这些分子确切地在那里。最近研究报道，注射质粒DNA能低效率地转染驻留的APC(包括巨噬细胞和树突细胞)。用骨髓嵌合体的研究进一步支持了这些结果，该研究描述了骨髓衍生的细胞引发DNA免疫应答的需求。与文献相符的是在我们的研究中发现的一些共同刺激可能通过转染以及驻留的专职APC增强的T细胞引发而发生。

和以前的报道一样，这些结果支持了ICAM-1和LFA-3在T细胞共同刺激中的作用。看来LFA-3对II类应答有特别的作用，而通常ICAM-1是CTL诱导以及CD8⁺效应功能的非常强的推动物(通过β-趋化因子产生的增强而证明)。这些结果也支持了关于T效应细胞在外周募集和扩展的协调性假设。最近，我们报道说，除了它们的化学引诱功能外，趋化因子还调节了外周部位的抗原特异性免疫应答的调节和扩增。我们注意到CD8+T效应细胞在引发免疫应答时控制着趋化因子的表达水平。因此，在趋化作用中，趋化因子通过浓度梯度调节淋巴细胞的移动。另外，粘附分子表达的相应的重新分布在指引淋巴细胞至外周中提供了直接的细胞-细胞接触。另外，粘附分子的表达受各种炎性细胞因子和趋化因子调节。例如，IFN-γ和TNF-α已证明能上调内皮细胞和肌细胞的ICAM-1表达。

因此，CD8⁺T效应细胞合成了募集更多APC和T细胞至炎性部位的趋化因子。这些T细胞将受β趋化因子产生的刺激而增强粘附分子的表达，而粘附分子的作用是推动IFN-γ的产生，并使T细胞受到共刺激。因此，一旦处于炎性部位，这些效应CTL可能通过特异性趋化因子以及能扩展效应细胞功能水平的粘附分子的表达而受到进一步调节。这些结果进一步支持了这样一个观点，即在抗原特异性免疫应答的扩展期中、期末T效应细胞能通过这些分子的协同表达和释放来指导它们的命运。

实施例6：粘附分子和共同刺激分子诱导不同抗原特异性免疫应答并增强体内抵抗单纯疱疹病毒2型的保护性免疫力

CD40配体和T细胞上的白细胞功能相关蛋白(LFA)分别与CD40和APC上的胞间粘附分子(ICAM)相互作用。我们用共同刺激分子CD40和CD40配体，以及粘附分子LAF-3和ICAM-1进行共免疫，然后分析对gD质粒疫苗以及抵抗HSV-2致死性攻击的保护力的免疫调节作用。我们发现，与LFA-3的共注射明显增加了全身性gD-特异性IgG的产生。然而，与CD40、CD40配体和ICAM-1的共注射却几乎未发现IgG产生有所改变。另外，Th1型细胞应答由CD40配体推动，而Th1和Th2型免疫应答由LFA-3推动。与CD40配体以及LFA-3的共输送还增强了致死性HSV-2攻击后的存活率。这些研究证实共同刺激分子和粘附分子具有不同的共同刺激通道，它们能在产生抗原特异性保护性免疫力中起重要作用。

测试了共同刺激分子和粘附分子在诱导抗原特异性免疫应答中的具体作用，以及用共同刺激分子和粘附分子作为质粒一部分的疫苗效果，其中在小鼠HSV-2攻击模型系统中输送该质粒来推动DNA疫苗诱导的保护性免疫力。我们发现共同刺激分子和粘附分子差异性地调节了抗原特异性免疫应答。具体地说，与共同刺激分子CD40配体以及与粘附分子LFA-3的共输送以依赖于抗原的方式诱导出明显的CD4⁺T细胞活性，并增强了HSV-2致死性攻击后的存活。

材料和方法

小鼠—雌性4至6周龄BALB/c小鼠购自Harlan Sprague-Dawley(Indianapolis，Ind.)。按照国立卫生研究院(Bethesda，Md.)和宾西法尼亚大学1ACUC(Philadelphia，Pa.)的指导进行护理。

试剂—HSV-2病毒株186(Philadelphia，Pa.宾西法尼亚大学的Schaffer教授慷慨赠与)繁殖在Vero细胞系中(美国典型培养物保藏中心，Rockville，Md.)。在这些研究中，用重组HSV-2 gD蛋白作为重组抗原。人横纹肌肉瘤(RD)细胞系获自ATCC(Rockville，Md.)。

质粒和DNA制备—如Pachuk，等人.1998 Current topics Microbiol.Immunol.226，79中所述的那样(该文纳入本文作参考)，制备编码HSV-2 gD蛋白的DNA疫苗pAPL-gD2。将CD40、CD40配体、LFA-3和ICAM-1的cDNA克隆到表达载体pCDNA3中，分别产生pCDNA3-CD40、pCDNA3-CD40配体、pCDNA3-LFA和pCDNA3-ICAM-1。质粒DNA在细菌中产生，用双条带CsCl制备法纯化。

CD40和CD40配体基因构建物的体外表达—将CD40、CD40配体、LFA-3和ICAM-1构建物转染到RD细胞中，分析它们的表达。转染72小时后收获细胞，用异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的针对LFA-3、ICAM-1、CD40和CD40配体的单克隆抗体(Pharmingen，San Diego，CA)进行FACS分析，测试表达情况。

小鼠DNA接种—通过28号针头(Becton Dickinson，Franklin Lakes，N.J.)向BALB/c小鼠的四头肌注射以100微升磷酸盐缓冲液和0.25％布吡卡因-HCl(Sigma，St.Louis，MO)配制的gD DNA构建物。将各种趋化因子和细胞因子基因表达盒样品与pgD质粒溶液混合，然后注射。

ELISA—用HRP偶联的抗鼠IgG 1和IgG 2a(Zymed，San Francisco，CA)进行酶联免疫吸附试验(ELISA)，以测定gD-特异性的IgG亚类的相对水平。ELISA滴度确定为显示出光密度与原初小鼠血清相同的最高血清稀释度的倒数。

趋化因子、Th1和Th2型细胞因子—在24孔测试板的孔中加入含有6×10⁶脾细胞的1毫升等份。然后，在各孔中加入1微克HSV-2 gD蛋白/毫升。在5％CO₂中37℃培育2天后，获得细胞上清液，然后用市售的细胞因子试剂盒(Biosource，Intl.，Camarillo，Ca.和R&D Systems，Minneapolis，Md.)检测上清液中IL-2、IL-10、IFN-γ、RANTES、MCP-1、和MIP-1α的水平，方法是将胞外液体加入细胞因子或趋化因子特异性的ELISA测试版中。

HSV-2阴道内攻击—在接种病毒前，用曾浸泡在0.1M NaOH溶液中的带棉花塞头的涂药器(Hardwood Products Company，Guiford，ME)拭抹阴道内区域，然后用干的棉花涂药器清洁。然后每日检查小鼠以评价存活率。

统计学分析—用配对的斯图登特t测试和ANOVA进行统计学分析。比较不同免疫组之间的数值。p值小于0.05视为有意义。

结果

CD40、CD40配体、LFA-3和ICAM-1能由转染的细胞表达—将CD40、CD40配体、LFA-3和ICAM-1的基因个别克隆到pCDNA3表达载体中。为了测试CD40、CD40配体、LFA-3和ICAM-1构建物是否能表达其相关蛋白，我们将它们体外转染到人RD细胞中。利用FACS分析，我们发现CD40、CD40配体、LFA-3和ICAM-1表达盒的转染分别导致CD40、CD40配体、LFA-3和ICAM-1的特异性表达。用pCDNA3(对照)、或表达CD40、CD40配体、LFA-3和ICAM-1的pCDNA3转染RD细胞。转染后3天，从测试版中取出细胞，用α-CD40、α-CD40配体、α-LFA-3、αICAM-1抗体通过FACS分析检测转染基因产物的表达。

LFA-3增强系统性IgG应答—为了确定gD基因疫苗与CD40、CD40配体、LFA-3和ICAM-1表达载体的共注射是否能影响抗gD的系统性IgG应答，以ELISA测试了DNA接种后稀释度为100的血清。每组小鼠(n＝8)用gD DNA疫苗(60微克)和共同刺激分子的基因(40微克)免疫两次。在第二次注射DNA后2周，取出小鼠的血液，然后将血清1∶100稀释，以便和gD反应。gD DNA疫苗(每只小鼠60微克)与CD40或CD40配体质粒DNA(每只小鼠40微克)的共注射对整体IgG水平没有显著影响。系列稀释每组等份合并的血清，以测定ELISA的滴度。还确定第二次免疫后2周等份合并的ELISA滴度为6400(CD40)、6400(CD40配体)和6400(单用gD DNA疫苗)。当我们对共注射gD DNA疫苗(每只小鼠10微克)加上这些共同刺激分子(每只小鼠40微克)一次后1个月时所得的血清进行测试时，也观察到类似的结果。

在第0和2周用gD DNA疫苗(60微克)加上LFA-3粘附分子基因(40微克)对小鼠组(n＝8)进行免疫。每两周对小鼠取血，然后将血清1∶100稀释来与gD反应。与LFA-3 cDNA的共注射使系统性IgG应答明显高于单用gD DNA疫苗时的应答，而与ICAM-1 cDNA的共注射发现几乎没有变化。系列稀释每组等份合并的血清，以测定ELISA滴度。在405nm测定光密度。数值和柱图代表平均值(n＝8)和标准偏差。ELISA滴度确定为显示出与原初小鼠血清的光密度相同的最高稀释度的倒数。第二次免疫两周后等份合并血清的ELISA滴度也确定为25600(LFA-3)、6400(ICAM-1)和6400(单用gD DNA疫苗)。

CD40配体和LFA-3影响IgG同种型方式。IgG亚类表明所诱导免疫应答的Th1对Th2的性质。我们分析了与CD40、CD40配体、LFA-3以及ICAM-1共注射而诱导产生的IgG亚类。测定DNA载体免疫的小鼠中gD特异性IgG同种型的水平。每组小鼠(n＝8)用gD DNA疫苗(60微克)加上共同刺激分子基因(40微克)或粘附分子基因(40微克)免疫两次。在第二次DNA注射后2周，对小鼠取血，然后将每组等份合并的血清1∶100稀释，以便与gD反应。在405nm下测定光密度。与CD40配体的共同注射使gD特异性的IgG 2a对IgG 1的相对产量增加，而与CD40基因的共注射显示出IgG同种型方式与单用gD DNA疫苗相似。IgG产生的这种偏移说明只有与CD40配体cDNA共同注射才诱导了更偏向Th1型的应答。然而，与LFA-3共同注射使IgG 1和IgG 2a同种型均明显高于单用gD DNA疫苗或ICAM-1共注射。这种增加表明LFA-3 cDNA的共注射诱导了Th1型以及Th2型应答。

CD40配体和LFA-3增强了Th细胞增殖反应—T辅助细胞分别在通过Ag刺激的B细胞扩展以及CD8⁺T细胞扩展而引发体液免疫应答和细胞免疫应答中起重要作用。作为CD4⁺激活的特异性指标，测定T细胞增殖。重要的是在与细胞因子基因共免疫后当用特异性抗原体外刺激时测定所得的T细胞增殖水平。用gD-2蛋白(1和5微克/毫升)作为特异性刺激T细胞的抗原。对于阳性对照，用5微克/毫升PHA作为多克隆刺激物。在阴性对照中发现低本底水平的Th细胞增殖。然而，gD DNA疫苗接种诱导的Th细胞增殖反应比阴性对照高得多。当与CD40配体和LFA-3 cDNA共同注射时，Th细胞增殖水平得到进一步加强。然而，在共注射了CD40和ICAM-1 cDNA的动物中几乎未检测到Th细胞应答增加。注意到这种趋势存在于测试的两种不同的gD抗原浓度，反映出该作用是由CD40配体和LFA-3介导的。gD质粒疫苗接种不产生CTL应答，因为在Balb/c本底中缺少CTL表位。然而，为了更详细地评价细胞效应，下面我们测定细胞因子产生的情况。

CD40配体和LFA-3影响Th1和Th2型细胞因子的产生。Th1细胞因子(IL-2和IFN-γ)和Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)是我们了解免疫应答极化现象的主要依据。认为Th1型免疫应答推动细胞免疫力的诱导产生，而Th2型免疫应答优先推动体液免疫力。因此，我们研究了有和没有共同刺激分子的gD DNA疫苗接种是否诱导Th1或Th2型免疫应答。测定与共同刺激分子或粘附分子共免疫的小鼠的脾细胞中IL-2、IL-10、IFN-γ、RANTES、MIP-1α和MCP-1的产生水平。在第0和2周，用gD DNA疫苗(60微克)加上共同刺激分子基因或粘附分子基因(40微克)对每组小鼠(n＝2)进行免疫。在最后一次注射DNA后两周，处死两只小鼠，合并脾细胞。用1微克/毫升gD-2蛋白刺激脾细胞2天。与CD40配体cDNA的共同注射显著增加了IL-2和IFN-γ的产生，而此共注射同时减少了IL-10的产生。然而，在该试验中，CD40加gD基因的共注射有稍稍增加IFN-γ的作用。但是，与LFA-3 cDNA共注射使IL-2、IL-10以及IFN-γ的产生均明显超过gD DNA疫苗，而ICAM-1加gD基因的共注射在该试验中只有稍稍增加的作用。这证实，CD40配体推动免疫应答向Th1表型移动，而LFA-3则影响到体内Th1和Th2两种免疫表型。

CD40配体和LFA3影响β趋化因子的产生—β趋化因子(CC型)包括RANTES(活化后可调节的、正常T细胞表达和分泌的)、MIP(巨噬细胞炎性蛋白)-1α和MCP(单核细胞趋化蛋白)。MCP-1特别是化学引诱单核性吞噬细胞，并激活T细胞、嗜碱性粒细胞、嗜酸性粒细胞和单核吞噬细胞以及各种其它可溶性免疫调节物。与MCP-1相比，也有报告RANTES和MIP-1α是主要的HIV抑制因子。认为这些分子在调节炎性免疫应答中是重要的。然而，它们在感染性疾病中的直接作用正在研究。CD40、CD40配体、LFA-3和ICAM-1分子作为疫苗佐剂与体内趋化因子产生的关系仍不清楚。我们研究了gD DNA疫苗与CD40配体、CD40、LFA-3和ICAM-1 cDNA共注射所诱导产生的趋化因子(RANTES，MCP-1和MIP-1α)水平。单用gD DNA疫苗以抗原特异性方式增强了RANTES、MCP-1和MIP-1α的产生。另外，与CD40配体cDNA的共注射使RANTES和MIP-1α的生产明显高于单用gD DNA疫苗。相反，MCP-1的产生则不受CD40配体共注射的影响。然而，与CD40分子的共注射显示只稍稍增加了β趋化因子的产生。数据表明，与LFA-3 cDNA共注射使RANTES和MIP-1α的产生明显高于单用gD DNA疫苗。类似的，ICAM-1共注射增加了RANTES和MIP-1α的产生。相反，MCP-1的产生被ICAM-1共注射所抑制。这种调节作用表明，共同刺激分子和粘附分子可能对β趋化因子家族个别成员的产生有特异性的作用。

CD40配体和LFA-3增强了抵抗HSV阴道内(i.vag.)攻击的保护作用。前面已测定了HSV-2(186)的致死剂量(LD)₅₀。为了确定在gD基因疫苗接种中用CD40、CD40配体、LFA-3和ICAM-1 cDNA作为分子佐剂是否能影响抵抗HSV-2攻击的保护作用，用DNA疫苗和各个共同刺激分子以及粘附分子的cDNA免疫，然后用4 LD₅₀的HSV-2作阴道内攻击。选择阴道内感染途径是因为HSV-2通过粘膜皮肤感染并引起泌尿道感染。测定用gD DNA疫苗以及共同刺激分子或粘附分子基因免疫两次的小鼠的存活率。每组小鼠(n＝10)用gD DNA疫苗(10微克)加共同刺激分子或粘附分子基因(40微克)免疫一次。DNA免疫4周后，用4 LD₅₀的HSV-2病毒株186(1.4×10⁴pfu)阴道内攻击小鼠。当用gD DNA疫苗免疫小鼠后，注意到有60％存活，但是在病毒攻击后13天内原初小鼠全部死亡。然而，与CD40配体的共注射使存活率增加至100％(保护比例增加40％)，而与CD40 cDNA的共注射显示出与单用gD DNA疫苗相比只有很小的保护作用。另外，与LFA-3 cDNA共同注射使小鼠存活率增加至90％。然而，与ICAM-1 cDNA的共注射显示出对于抵抗HSV-2感染的保护作用只有稍微好些的作用。

讨论

在抗原呈递期间，APC的共同刺激分子对于T细胞应答的启动和分化是重要的。具体地说，CD40L-CD40的相互作用诱导APC表达出B7和IL-12。IL-12也增强T细胞表达CD40配体，而IFN-γ抑制CD40配体的表达，这表明T细胞上诱导CD40配体可能有一个自身调节的机制。另外，细胞因子、IL-2和IL-4也增强抗-CD3刺激的T细胞上CD40配体的表达，这表明在介导体内免疫应答时，共同刺激分子和细胞因子之间有一种协同调节。另外，CD40-CD40配体的相互作用增加了Th细胞依赖型抗体应答和促炎性细胞因子的产生，并且是巨噬细胞杀肿瘤和杀微生物活性所需的。具体地说，休眠T细胞并不表达CD40配体，而是由CD3-TCR触发过程诱导的。CD40(45-50kDa糖蛋白)是TNF受体超家族的成员，它表达在B细胞、单核细胞和树突细胞上。然而，其配体CD40配体(gp39)是一种II型跨膜蛋白，它与TNF-α有序列同源性，并瞬时表达于激活的T细胞上。然而，T细胞上的粘附分子LFA-3与APC上的ICAM-1的相互作用受到对ICAM-1有高亲和力和亲合力的LFA-3的构型变化的高度调控。已经知道，LFA-3与CD3单克隆抗体或II类加上抗原的共同刺激导致T细胞增殖，且T细胞产生各种细胞因子的水平更高。另外，LFA-3和ICAM-1的相互作用触发了信号传导通道。与共同刺激CD40/CD40配体分子相比，这些粘附分子与抗CD3或抗TCR抗体共同定位在表面上是将适当信号传导给T细胞所需的。

APC刺激性或吸引性分子与DNA疫苗共注射导致免疫力两分枝的诱导更为有效。在肌内(i.m.)注射时，DNA被摄取到肌纤维内，随后内源性表达，使天然形式的抗原呈递给免疫系统。分泌的抗原被吞噬细胞摄取，然后由巨噬细胞以肽-MHC II复合物的形式呈递，它能提供刺激原初T细胞所需的第一激活信号、共同刺激配体和细胞因子。最近的证据还支持在肌内或皮肤输送DNA疫苗后体内直接转染APC。DNA疫苗与共同刺激分子(如B7.1和B7.2)的共注射明显增强了抗原特异性细胞免疫应答，如Th细胞增殖反应和细胞毒性T细胞活性。类似的，与GM-CSF基因的共注射在病毒性DNA疫苗模型中增强了抗体应答和细胞免疫应答。pLcaZ和CD40配体cDNA的共注射以依赖于抗原的方式增强了体液和细胞免疫应答、尤其是CTL应答。然而，还没有通过共输送共同刺激分子和粘附分子的HSV攻击研究。比较诱导抗原特异性免疫应答和抵抗HSV-2的保护性免疫力的过程中这两种不同的通道也是令人感兴趣的。

我们注意到，通过用CD40和CD40配体基因调节疫苗，gD特异性IgG的产生没有显著增加。然而，这与以前的发现(即，与CD40配体的共注射增强了针对和DNA载体一起输送的某抗原(β-半乳糖苷酶)的抗体产生)不一致。这种差异可能是由于受测试抗原的性质所致。然而，有一个相似的发现，即与CD40配体的共注射诱导出相似的IgG同种型产生方式。在我们的研究中，和CD40配体一同输送诱导的IgG 2a产生(认为它由Th1型免疫应答介导)与IgG1同种型相比显著增加。这暗示，通过共注射推动CD40配体表达的质粒载体，可以实现gD特异性免疫应答向Th1型极化。相反，发现与LFA-3共注射后的gD-特异性IgG的产生与单用gD DNA疫苗或ICAM-1共注射相比有明显增加。这表明LFA-3能增强体内抗体应答。我们还注意到，LFA-3共注射使得Th1和Th2同种型的产生均有所增加(表现为IgG1和IgG2a同种型的产生有所增加)，暗示LFA-3能推动体内的Th1和Th2免疫应答。

Th细胞增殖的增加可通过共注射编码CD40配体的质粒DNA来实现。这再次与以前在其它模型中的发现一致，即CD40配体分子增加了抗原特异性Th细胞增殖和IFN-γ产生以及CTL应答。这种方式与我们发现的细胞因子产生水平符合，因为与CD40配体cDNA的共注射增强了IL-2和IFN-γ的分泌，但抑制了IL-10的产生。因此，在gD DNA疫苗接种中采用CD40配体cDNA可有效地使免疫应答向Th1表型极化，增加细胞介导的免疫力。然而，与LFA-3的共注射增强了IL-2、IL-10和IFN-γ的产生，而与ICAM-1的共注射稍稍增加了细胞因子的产生。这支持了LFA-3推动免疫应答向Th1和Th2表型转化的IgG同种型方式。

最近已经报道，趋化因子以类似于细胞因子的方式在免疫和炎性应答中起重要作用。通过局部给予Th2型细胞因子蛋白(IL-10)，HSV感染介导的眼部炎性疾病被抑制。这种应用导致趋化因子产生受到抑制。该疾病(眼部炎症)还可通过注射抗MIP-1α(而不是MCP-1)来改善，这再次表明MIP-1α是Th1型趋化因子。然而，趋化因子对感染状况的作用正在研究。在本研究中，共输送CD40配体使得RANTES和MIP-1α的产生增加超过共输送CD40，提示CD40配体分子在调节T细胞产生β趋化因子中起重要作用。LFA-3和ICAM-1均增加了MIP-1α和RANTES的产生。相反，MCP-1的产生不受LFA-3的影响，或被ICAM-1抑制，表明该粘附分子也能调节体内的β趋化因子的产生。

已有报道说体液免疫应答、细胞免疫应答或这两者可能承担了抵抗HSV感染的保护性免疫力。用HSV-特异性单克隆抗体的被动免疫导致抵抗致死性HSV感染的保护作用。在病毒感染期间，中和抗体能灭活游离的病毒颗粒，但是不能抑制胞内HSV感染。看来依赖于抗体的、补体介导的以及依赖于抗体的细胞介导的细胞毒性(ADCC)不足以控制HSV感染。因此，有人提出HSV-特异性细胞介导免疫力可能起着根除HSV-感染细胞并控制HSV感染的主要效应功能。CD4⁺和/或CD8⁺T细胞介导的细胞免疫应答在控制HSV感染上的重要性已详细记载于文献中。

我们发现与CD40配体分子的共注射诱导了抵抗HSV-2感染引起的死亡率的保护作用明显增强。这提示保护性免疫力与Th1型细胞免疫力之间成正相关，共注射CD40配体分子后Th细胞增殖反应以及IFN-γ产生水平的增加支持了这点。我们的观察结果与以前的发现是一致的，即与CD40配体的共注射增强了抵抗主要利什曼原虫(Leishmania major)或转移性肿瘤表达抗原攻击的保护性免疫力。我们还发现LFA-3诱导了抵抗HSV-2感染引起的死亡率的保护作用明显增强。LFA-3增强细胞和/或体液免疫力似乎导致该系统中HSV-2引起的死亡率减少。还可能是CD40配体或LFA-3所诱导的IFN-γ部分承担了体内抗HSV-2活性。因此，CD40配体和LFA-3推动的细胞或体液介导的免疫力看来与抵抗HSV感染的保护力有关。

总之，这里显示的数据提示共同刺激分子和粘附分子在诱导抗原特异性免疫应答中具有不同的共同刺激通道。具体地说，CD40配体推动免疫应答向Th1型转化，而LFA-3对Th1和Th2免疫类型均是有利的。这些活性在以前只与细胞因子有关。这些数据表明，共同刺激分子和细胞因子一样在诱导抗原特异性免疫力中起主要作用。另外，CD40配体和LFA-3在gD DNA疫苗接种中使抵抗HSV-2致死性攻击的保护作用增强。该发现拓宽了我们对付感染性疾病的武器。

实施例7

我们分析了趋化因子(IL-8、IP-10、RANTES、MCP-1、MIP-1α)对免疫表型以及抵抗HSV-2致死性攻击的保护力的调节作用。我们发现IL-8和RANTES的共注射显著增强了抗原特异性免疫应答以及抵抗HSV-2致死性攻击的保护作用。然而，MCP-1以及IP-10的共注射增加了受攻击小鼠的死亡率。这些研究证实趋化因子能以类似于细胞因子的方式控制并推动免疫应答，在产生抗原特异性保护性免疫力中起重要作用。

免疫或炎性反应的启动是一个复杂的过程，它涉及共同刺激分子、粘附分子、细胞因子和趋化因子的协同表达。具体地说，趋化因子在免疫细胞移动至宿主防御机制外周部位的分子调节中很重要。根据两个半胱氨酸残基中存在(α家族)或不存在(β家族)一个氨基酸序列，该趋化因子超家族可分为两个亚家族。已经证明α和β趋化因子能诱导各种类型的免疫细胞(包括中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和单核细胞)的直接迁移。最近，α趋化因子家族(CXC型，白细胞介素(IL)-8和干扰素-γ可诱导的蛋白(IP)-10)和β趋化因子家族(CC型，RANTES(活化后可调节的、正常T细胞表达和分泌的因子)、单核细胞趋化蛋白(MCP)-1以及巨噬细胞炎性蛋白(MIP)-1α)已经显示能化学引诱T淋巴细胞。具体地说，IL-8和IP-10表现为化学引诱中性粒细胞，诱导它们离开血流迁移进入周围组织中。类似的，RANTES化学引诱单核细胞、未受刺激的CD4⁺/CD45RO⁺记忆性T细胞以及受刺激的CD4⁺和CD8⁺T细胞。MIP-1α已知能化学引诱嗜酸性粒细胞并使其脱粒。MIP-1α还诱导嗜碱性粒细胞和肥大细胞释放组胺，并化学引诱嗜碱性粒细胞和B细胞。MCP-1是慢性炎性疾病中的一种重要的趋化因子。MCP-1诱导单核细胞从血流中迁移出来并变成组织巨噬细胞。MCP-1还化学引诱激活的记忆亚组的T淋巴细胞。最近的研究表明，趋化因子受体标记T细胞亚组和趋化因子可能涉及抗原特异性免疫应答的产生。

为了研究免疫应答和保护性免疫力的调节，我们将编码HSV-2gD蛋白的DNA表达构建物与编码趋化因子(IL-8、IP-10、RANTES、MCP-1、MIP-1α)的质粒一同输送。然后，我们分析了它们在抗原特异性免疫诱导和抵抗攻击的保护力中的调节作用。首先，我们研究了所选趋化因子对抗原特异性免疫应答诱导的体内影响。我们用gD疫苗和2种促炎性细胞因子TNF家族基因(TNF-α和TNF-β)免疫动物作为对照。研究这些促炎细胞因子，因为认为它们以相似的方式参与早期免疫应答，应视作正对照。用ELISA测定经DNA载体免疫的Balb/c小鼠系统性gD-特异性IgG的水平。每组小鼠(n＝10)在第0和2周用gD DNA疫苗(每只小鼠60微克)加趋化因子基因(每只小鼠40微克)或TNF基因(每只小鼠40微克)免疫。表达gD抗原和趋化因子的DNA构建物以前已被克隆(Pachuk，等人，1988 Current topics Microbiol.Immunol.226，79；Kim，等人1988 J.Clin.Invest.102，1112；和Kim等人，1998 Eur.J.Immunol.28，1089)。第二次免疫后2周取小鼠血液，然后系列稀释每组等份合并的血清与gD反应。ELISA滴度确定为显示与原初小鼠血清光密度相同的最高血清稀释度的倒数。测定405nm下的吸收值(O.D.)。第二次免疫后两周收集的等份合并血清的ELISA滴度确定为12800(IL-8)、6400(IP-10)、6400(RANTES)、6400(MCP-1)、12800(MIP-1α)、25600(TNF-α)、6400(TNF-β)以及6400(单用gD DNA疫苗)。这表明与IL-8和MIP-1α基因的共注射导致gD特异性IgG抗体有适中但不显著的增加。相反，IP-10、RANTES或MCP-1显示出抗体应答水平与单用pgD疫苗接种的水平相似。TNF-α cDNA对照导致系统性IgG水平明显高于单用gD DNA疫苗的水平。

已经报道说，IgG1同种型由Th2型细胞因子诱导产生，而IgG2a同种型的产生则受Th1型细胞因子的影响和体内推动。这已被用作确定免疫应答是否在Th1或Th2细胞因子控制下的指标。我们分析了共注射所诱导的IgG亚类。测定每个免疫组诱导的IgG同种型。每组小鼠(n＝10)在第0和2周用gD DNA疫苗(每只小鼠60微克)加趋化因子基因(每只小鼠40微克)或TNF基因(每只小鼠40微克)免疫。在最后一次免疫后2周对小鼠取血，然后1∶100稀释血清用于和gD反应。为了确定gD特异性IgG亚类的相对水平，用偶联HRP(Zymed，San Francisco，CA)的抗鼠IgG1、IgG2a、IgG2b或IgG3代替抗鼠IgG-HRP。测定405nm下吸收值(O.D.)。相对光密度计算成每种IgG亚类的光密度/总光密度。柱条图代表每种小鼠IgG亚类的相对光密度的平均值(n＝10)。测定IgG2a与IgG1(Th1与Th2)的相对比值。pgD免疫组的IgG2a与IgG1比值为0.62。与IL-8、RANTES或TNF-α基因共注射使gD特异性IgG 2a与IgG 1的相对比值增加至0.8。另一方面，与IP-10和MIP-1α的共注射使IgG 2a与IgG 1的相对比值降低至0.3和0.4，而与MCP-1或TNF-β基因的共免疫导致IgG亚型方式与单用pgD疫苗接种相似。此分析表明，IL-8和RANTES以类似于IFN-γ型细胞因子的方式推动体内免疫应答向Th1表型移动。因此，这些结果延伸了以前在HIV模型中的发现，即体液免疫应答向Th1或Th2移动可受趋化因子调节，这再次提示趋化因子能调节体内的细胞因子产生。

细胞增殖是用来评价细胞介导免疫力效果的一个标准参数。我们测定了与细胞因子基因共免疫后用gD蛋白体外刺激免疫的脾细胞后的Th细胞增殖反应。测定用α-趋化因子cDNA、β-趋化因子cDNA和TNF对照共免疫的Balb/c小鼠经体外gD刺激后的脾细胞的Th细胞增殖水平。每组小鼠(n＝2)在第0和2周用gD DNA疫苗(每只小鼠60微克)加趋化因子基因(每只小鼠40微克)或TNF基因(每只小鼠40微克)进行免疫。最后一次注射DNA的2周后，处死两只小鼠，合并脾细胞进行增殖试验。用每毫升1微克和5微克的gD-2蛋白刺激脾细胞，用每毫升5微克的PHA作为阳性对照。刺激3天后，收获细胞，计数cpm。样品试验一式三份。PHA对照样品显示的刺激指数为单用pgD DNA疫苗接种导致gD特异性的Th细胞增殖反应的40-50。我们还发现与IL-8、RANTES以及TNF-αcDNA共注射后Th细胞增殖反应的增加明显超过单用gD DNA疫苗时的增加。我们还注意到与TNF-β基因共注射使增殖稍有增加。相反，与IP-10、MCP-1和MIP-1α基因的共免疫看来对Th细胞增殖反应只有极小的影响。然而，共注射显示对于PHA诱导的非特异性Th细胞增殖反应(S.I.范围为40至50)没有影响。由于Balb/c本底中缺少CTL表位，因此gD质粒疫苗接种不产生CTL应答。然而，为了更详细地评价细胞免疫，下面我们检查细胞因子的产生情况。

Th1细胞因子(IL-2和IFN-γ)和Th2细胞因子(IL-4、IL-5和IL-10)已经成为我们了解免疫应答极化现象的主要依据。认为Th1型免疫应答推动细胞免疫力的诱导产生，而Th2型免疫应答优先推动体液免疫力。因此，根据IgG表型结果，我们通过分析细胞因子的直接释放来进一步评价Th1对Th2的问题。如表4所示，与IL-8 cDNA共同注射可使IL-2的产生大幅度增加几乎7倍。与TNF-α cDNA的共注射以及与MIP-1α表达盒的共注射也诱导了IL-2。具体地说，RANTES以及IL-8的共输送使IFN-γ的产生有最显著的增加(分别为20倍和6倍)，这进一步支持了同种型的结果，并证实IL-8和RANTES以依赖于抗原的方式介导Th1型细胞免疫应答。RANTES、IL-8、TNF-α和TNF-β共注射还使IL-10的产生明显高于单用pgD疫苗时的水平。这说明IL-8和RANTES对Th1型T细胞的推动优于对Th2型T细胞。

为了确定趋化因子共注射是否能以依赖于抗原的方式诱导β趋化因子产生，我们作共免疫，然后分析用重组gD抗原或对照抗原体外刺激后脾细胞释放β趋化因子的水平。如表5所示，与IL-8 cDNA的共注射显著增加了MCP-1的产生水平，但是与RANTES以及与MIP-1α表达盒的共注射却使MCP-1的产生水平降低。具体地说，RANTES和IL-8的共输送使MIP-1α产生的增加最为显著。就RANTES而言，IL-8和RANTES共注射使RANTES的产生增加超过了单用pgD疫苗时的水平。这表明，在HSV模型中，RANTES调节抗原特异性免疫应答的方式与IL-8不同。这还支持了趋化因子调节其自身产生的观点。

HSV是各种人疾病，例如唇疱疹、眼部感染、脑炎和生殖道感染的病原体。HSV能建立病毒潜伏性感染，伴有在宿主中频繁复发。在病毒感染期间，中和抗体灭活病毒颗粒，但是不能控制胞内HSV感染。相反，细胞介导的免疫力起着根除HSV感染细胞和HSV体内传播的主要效应功能。针对HSV产生的细胞毒性T淋巴细胞(CTL)的过继转移在动物体内产生了抵抗HSV致死性攻击的完全保护力。而且，有几篇报道说Th1型CD4⁺T细胞在抵抗HSV-2攻击的保护作用中起着更为重要的作用。当体内的CD4⁺T细胞缺失时，就丧失了抵抗HSV的保护性免疫力。另外，Th1型CD4⁺T细胞产生了大量IFN-γ。IFN-γ上调了HSV感染的细胞上的I类和II类表达，使其更好地被细胞毒性CD4⁺T细胞和CD8+CTL识别，并具有直接的抗HSV作用。Th1型细胞因子cDNA的共输送增强了HSV-2致死性攻击后的存活率，而Th2型细胞因子cDNA的共输送却恶化了该疾病状况。类似的，在HSV攻击模型中，原型Th1型细胞因子IL-12 cDNA共输送所增强的保护作用由Th1型CD4⁺T细胞介导，从而强调了Th1型T细胞介导的抵抗HSV感染的保护性免疫力的重要性。

抗原特异性免疫调节影响病原体复制是重要的。测定经gD DNA疫苗加上α趋化因子cDNA、β趋化因子cDNA以及TNF对照免疫的Balb/c小鼠的存活率。每组小鼠在第0和2周用gD DNA疫苗(每只小鼠60微克)加趋化因子基因(每只小鼠40微克)或TNF基因(每只小鼠40微克)进行免疫。在第二次免疫后3周，用200 LD₅₀的HSV-2病毒株186(7×10⁵PFU)阴道内攻击小鼠。在接种病毒前，用曾浸泡在0.1MNaOH溶液中的带棉花塞头的涂药器(Hardwood Products Company，Guiford，ME)拭抹阴道内区域，然后用干的棉花涂药器清洁。每日检查小鼠以评价存活率。在病毒攻击后61天计数存活的小鼠。重复该方法一次，获得预计的结果。我们分析趋化因子共注射在鼠疱疹攻击模型中的保护效率。在第0和2周对小鼠作DNA载体肌内共免疫，然后在第二次免疫后3周用HSV-2攻击。选择阴道内攻击途径是因为HSV-2通过粘膜皮肤感染。单用gD DNA疫苗免疫小鼠后，经200LD₅₀的HSV-2阴道内攻击的小鼠有63％存活。与IL-8以及RANTES cDNA的共注射使得该存活率增加至88％(保护率增加几乎30％)，而与MCP-1以及IP-10的共注射使该存活率降低至25％(较单用gD疫苗时的总存活减少超过50％)。类似的，MIP-1α的共注射也反面地影响了疫苗接种动物的存活率。如果考虑每个趋化因子组中测试的动物总数的话，这些观察结果是明显的(单用gD的存活率，18只中有11只，61％；IL-8的存活率，18只中有17只，94％；IP-10的存活率，18只中有5只，28％；RANTES的存活率，18只中有17只，94％；MCP-1的存活率，18只中有6只，33％；MIP-1α的存活率，18只中有8只，44％)。这表明，与IL-8以及RANTES趋化因子基因的共注射增强了抵抗HSV致死性攻击的保护作用，而与IP-10和MCP-1以及MIP-1α(程度较低)的共注射尽管诱导了免疫应答，却使得动物更易受病毒感染。这支持了IL-8和RANTES通过抗原特异性免疫调节作用增强抵抗HSV-2感染的保护力的观点。这些研究表明趋化因子能以类似于细胞因子的方式(Th1对Th2)起作用和调节重要的免疫应答和疾病进展。通过使用共输送的趋化因子cDNA，不仅影响免疫应答还影响对疾病的保护力，可以实现显著的免疫调节。另外，在制备针对HSV的更有效的疫苗或免疫治疗中，采用输送趋化因子基因的佐剂(尤其是IL-8和RANTES)将是重要的。我们在前文报道说，与Th1型细胞因子基因共注射增加了抵抗HSV致死性攻击的保护率，而与Th2型细胞因子共注射则增加了动物对病毒感染的易感性。在发病机理的研究中，已报道了Th1样细胞因子反应对于抵抗病原性感染的重要性。因此，Th1和/或Th2型免疫应答似乎可能由这些趋化因子推动，从而根据免疫应答的性质来影响抵抗HSV感染性攻击的保护力。

我们在疱疹攻击模型中比较了TNF家族共注射的保护效率。与TNF-α以及TNF-β基因的共同注射还使受攻击小鼠的存活率降低至25％(比单用gD疫苗时的总体存活减少50％以上)。尽管经TNF-α基因共注射的小鼠的gD特异性抗体和Th细胞增殖水平以及细胞因子产生水平(IL-2、IFN-γ、IL-10)比单用gD DNA疫苗时的水平要高得多，但是在那些动物中发现TNF细胞因子介导了对HSV-2感染的易感性。造成该现象的原因还不清楚，但是这强烈支持了这样一个结论，即应答性质对于控制病原性感染是非常重要的。

总之，本文提供的数据证明趋化因子能以依赖于抗原的方式调节Th1和/或Th2型免疫应答。以前认为这些活性只与细胞因子有关，这暗示趋化因子可以象细胞因子一样在诱导抗原特异性免疫力中起主要作用。趋化因子在调节免疫应答用于免疫治疗和疫苗接种中的应用值得进一步研究。

表1

MadCAM-1

登陆号：U80016

作者：Leung，E.，等人

杂志：Immunogenetics 46(2)，111-119(1997)

MadCAM-1

登陆号：U43628

作者：Shyjan，A.M.，等人

杂志：J.Immunol.156(8)，2851-2857(1996)

NGF

登陆号：M57399

作者：Kretschmer，P.J.，等人

杂志：Growth Factors 5，99-114(1991)

IL-7

登陆号：J04156

作者：Goodwin，R.G.，等人

杂志：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.86(1)，302-306(1989)

VEGF

登陆号：M32977

作者：Leung，D.W.，等人

杂志：Science 246，1306-1309(1989)

TNF-R

登陆号：M60275

作者：Gray，P.W.，等人

杂志：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.87，7380-7384(1990)

TNF-R

登陆号：M63121

作者：Himmler，A.，等人

杂志：DNA Cell Biol.9，705-715(1990)

Fas

登陆号：M67454

作者：Itoh，N.，等人

杂志：Cell 66(2)，233-243(1991)

CD40L

登陆号：L07414

作者：Gauchat，J.F.M.，等人

杂志：FEBS Lett.315，259-266(1992)

登陆号：M23442

作者：Arai，N.，等人

杂志：J.Immunol.142(1)，274-282(1989)

IL-4

登陆号：M13982

作者：Yokota，T.，等人

杂志：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83(16)，5894-5898(1986)

CSF

登陆号：M37435

作者：Wong，G.G.，等人

杂志：Science 235(4795)，1504-1508(1987)

G-CSF

登陆号：X03656

作者：Nagata，S.，等人

杂志：EMBO J.5(3)，575-581(1986)

G-CSF

登陆号：X03655

作者：Nagata，S.，等人

杂志：EMBO J.5(3)，575-581(1986)

GM-CSF

登陆号：M11220

作者：Lee，F.，等人

杂志：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82(13)，4360-4364(1985)

GM-CSF

登陆号：M10663

作者：Wong，G.G.，等人

杂志：Science 228(4701)，810-815(1985)

M-CSF

登陆号：M27087

作者：Takahashi，M.，等人

杂志：Biochem.Biophys.Res.Commun.161(2)，892-901(1989)

M-CSF

登陆号：M37435

作者：Wong，G.G.，等人

杂志：Science 235(4795)，1504-1508(1987)

LFA-3

登陆号：Y00636

作者：Wallner，B.P.，等人

杂志：J.Exp.Med.166(4)，923-932(1987)

ICAM-3

登陆号：X69819

作者：de Fougerolles，A.R.，等人

杂志：Unpublished

ICAM-2

登陆号：X15606

作者：Staunton，D.E.，等人

杂志：Nature 339(6219)，61-64(1989)

ICAM-1

登陆号：J03132

作者：Staunton，D.E.，等人

杂志：Cell 52(6)，925-933(1988)

PECAM

登陆号：M28526

作者：Newman，P.J.，等人

杂志：Science 247，1219-1222(1990)

p150.95

登陆号：Y00093

作者：Corbi，A.L.，等人

杂志：EMBO J.6(13)，4023-4028(1987)

Mac-1

登陆号：J03925

作者：Corbi，A.L.，等人

杂志：J.Biol.Chem.263(25)，12403-12411(1988)

LFA-1

登陆号：Y00796

作者：Larson.R.，等人

杂志：J.Cell Biol.108(2)，703-712(1989)

CD34

登陆号：M81104

作者：Simmons，D.L.，等人

杂志：J.Immunol.148，267-271(1992)

RANTES

登陆号：M21121

作者：Schall，T.J.，等人

杂志：J.Immunol.141，1018-1025(1988)

IL-8

登陆号：M28130

作者：Mukaida，N.，等人

杂志：j.IMMUNOL.143(4)，1366-1371(1989)

MIP-1α

登陆号：U72395

作者：Fridell，R.A.，等人

杂志：J.Cell.Sci.110(Pt 11)，1325-1331(1997)

E-selecton

登陆号：M24736

作者：Bevilacqua，M.P.，等人

杂志：Science 243(4895)，1160-1165(1989)

CD2

登陆号：M14362

作者：Sewell，W.A.，等人

杂志-1：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.83，8718-8722(1986)

杂志-2：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84，7256-7256(1987)

CD2

登陆号：M16336

作者：Sayre，P.H.，等人

杂志：Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84(9)，2941-2945(1987)

MCP-1

登陆号：S69738

作者：Li，Y.S.，等人

杂志：Mol.Cell.Biochem.126(1)，61-68(1993)

MCP-1

登陆号：S71513

作者：Yoshimura，T.，等人

杂志：Adv.Exp.Med.Biol.305，47-56(1991)

L-selection

登陆号：X16150

作者：Tedder，T.F.，等人

杂志：J.Exp.Med.170(1)，123-133(1989)

P-selection

登陆号：M25322

作者：Johnston，G.I.，等人

杂志：Cell 56，1033-1044(1989)

FLT

登陆号：X94263

作者：Mandriota，S.J.，等人

杂志：J.Biol.Chem.271(19)，11500-11505(1996)

FLT

登陆号：X51602

作者-1：Shibuya，M.等人

杂志-1：Oncogene 5(4)，519-524(1990)

作者-2：Han，H.J.，et al.

杂志-2：Hum.Mol.Genet.2(12)，2204(1993)

Apo-1

登陆号：X63717

作者：Oehm等人

杂志：J.Biol.Chem.，1992，267(15)，10709-15

Fas

登陆号：M67454

作者：Itoh等人

杂志：Cell，1991，66(2)，233-43

TNFR-1

登陆号：M67454

作者：Nophar等人

杂志：EMBO J.，1990，9(10)，3269-78

p55

登陆号：M58286

作者：Loetscher等人

杂志：Cell，1990，61，351-359

WSL-1

登陆号：Y09392

作者：Kitson等人

杂志：Nature，1996，384(6607)，372-5

DR3

登陆号：U72763

作者：Chinnaiyan等人

杂志：Science，1996，274(5829)，990-2

TRAMP

登陆号：U75381

作者：Bodmer等人

杂志：Immunity，1997，6(1)，79-88

Apo-3

登陆号：U74611

作者：Marsters等人

杂志：Curr.Biol.，1996，6(12)，1669-76；

AIR

登陆号：U78029

作者：Degli-Esposti等人

杂志：

LARD

登陆号：U94512

作者：Screaton等人

杂志：Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1997，94(9)，4615-19

NGRF

登陆号：M14764

作者：Johnson等人

杂志：Cell，1986，47(4)，545-554

DR4(TRAIL)

登陆号：U90875

作者：Pan等人

杂志：Science，1997，276(5309)，111-113

DR5

登陆号：AF012535

作者：Sheridan等人

杂志：Science，1997，277(5327)，818-821

KILLER

登陆号：

作者：Wu等人

杂志：Nature Genetics，印刷中

TRAIL-R2

登陆号：AF020501

作者：MacFarlane等人

杂志：J.Biol.Chem.，1997，印刷中

TRICK2

登陆号：AF018657

作者：Screaton等人

杂志：Curr.Biol.，1997，印刷中

DR6

登陆号：AF068868

作者：Pan等人

杂志：

ICE

登陆号：U13698

作者：Alnemri，E.S.，等人

杂志：J.Biol.Chem.270(9)，4312-4317(1995)

ICE

登陆号：U13697

作者：Alnemri，E.S.，等人

杂志：J.Biol.Chem.270(9)，4312-4317(1995)

ICE

登陆号：U13699

作者：Alnemri，E.S.，等人

杂志：J.Biol.Chem.270(9)，4312-4317(1995)

VLA-1

登陆号：X17033

作者：Takada.，等人

杂志：J.Biol.Chem.109(1)，397-407(1989)

CD86(B7.2)

登陆号：U04343

作者：Azuma，等人

杂志：Nature.366(6450)，76(1993)

表2

小RNA病毒科

属：鼻病毒属：(医用)造成50％普通感冒病例。

Etheroviruses：(医用)包括脊髓灰质炎病毒，柯萨奇病毒，埃可(ECHO)病毒，人肠道病毒例如甲肝病毒。

口疮病毒(Apthoviruses)：(兽医用)这些是足口腔疾病病毒。

靶抗原：VP1，VP2，VP3，VP4，VPG

杯状病毒科

属：Norwalk组病毒属：(医用)这些病毒是流行性胃肠炎的重要病原体。

披膜病毒科

属：α病毒属：(医用和兽医用)例子包括Senilis病毒、RossRiver病毒和东方和西方马脑炎病毒。

呼肠孤病毒属：(医用)风疹病毒。

黄病毒科

例子包括：(医用)登革热病毒、黄热病毒、日本脑炎病毒、圣路易斯脑膜炎病毒和虱传脑炎病毒。

丙肝病毒：(医用)这些病毒不属于任何科，但被认为或者是披膜病毒或者是黄病毒。大部分类似于披膜病毒科。

冠状病毒科：(医用和兽医用)

传染性支气管炎病毒(禽)

猪可传递性胃肠炎病毒(猪)

猪血凝脑脊髓炎病毒(猪)

猫传染性腹膜炎病毒(猫)

猫小肠冠状病毒(猫)

狗冠状病毒(狗)

人呼吸道冠状病毒引起约40例普通感冒。EX.224E，0C43。

注意—冠状病毒可能引起非甲型、非乙型和非丙型的肝炎。

靶抗原：

E1-又称M蛋白或基质蛋白

E2-又称S蛋白或刺突蛋白

E3-又称HE或血凝elterose糖蛋白(并不存在于所有的冠状病毒中)

N-核衣壳

弹状病毒科

属：Vesiliovirus

狂犬病病毒：(医用和兽医用)狂犬病

靶抗原：G蛋白

N蛋白

线状病毒科：(医用)

出血热病毒，例如Marburg病毒和埃博拉(Ebola)病毒

副粘病毒科：

属：副粘病毒属：(医用和兽医用)

腮腺炎病毒，新城疫病病毒(重要的鸡致病原)

麻疹病毒属：(医用和兽医用)

麻疹病毒、狗瘟热

肺病毒：(医用或兽医用)

呼吸道合胞病毒

正粘液病毒科(医用)

流感病毒

布尼亚病毒科(Bungavirus)

属：布尼亚病毒属：(医用)加利福尼亚脑炎，LA Crosse

白蛉热病毒属：(医用)Rift峡谷热

汉坦病毒属：Puremala是一种hemahagin热病毒

内罗毕病毒属：(兽医用)内罗毕绵羊病

还有许多未归类的布尼亚病毒属

沙粒病毒科(医用)

LCM，拉沙热病毒

呼肠孤病毒科

属：呼肠孤病毒属：可能是一种人病原

轮状病毒：儿童急性胃肠道炎

环状病毒属：(医用和兽医用)

科罗拉多虱传热病毒、Lebombo(人)、马脑炎病毒、蓝舌病毒

逆转录病毒科

亚科：

致癌病毒亚科：(兽医用和医用)猫白血病病毒、

HTLVI和HTLVII

慢病毒亚科：(医用和兽医用)HIV，猫免疫缺陷病毒、马传染病病毒、贫血病毒

泡沫病毒亚科

乳多空病毒科

亚科：

多瘤病毒亚科：(医用)BKU和JCU病毒

亚科：

乳头瘤病毒亚科：(医用)与癌症或乳头瘤的恶性发展有关的许多种病毒

腺病毒(医用)

EX AD7，ARD.，O.B.—引起呼吸道疾病—一些腺病毒，例如275，引起肠炎

细小病毒科(兽医用)

猫细小病毒：引起猫肠炎

猫瘟病毒

狗细小病毒

猪细小病毒

疱疹病毒科

亚科：α疱疹病毒亚科

属：单纯疱疹病毒属：(医用)

HSVI，HSVII

水痘病毒属：(医用和兽医用)假狂犬病-水痘-带状疱疹病毒

亚科—β疱疹病毒亚科

属：巨细胞病毒属：(医用)

HCMV

鼠巨细胞病毒(Muromegalovirus)

亚科：γ疱疹病毒亚科

属：淋巴隐病毒属(医用)

EBV-(Burkitts淋巴细胞)

Rhadino病毒

痘病毒科

亚科：带状痘病毒亚科(医用-兽医用)

属：天花病毒属

牛痘属

副痘病毒属-兽医用

山羊痘病毒属(Auipoxvirus)兽医用

兔痘病毒属

猪痘病毒属

亚科：Entemopoxviridue亚科

肝DNA病毒科

乙型肝炎病毒

未分类的

δ肝炎病毒

表3

细菌病原

革兰阳性病原球菌包括：肺炎球菌；葡萄球菌；和链球菌。革兰阴性病原球菌包括：脑膜炎球菌和淋球菌。

病原性革兰阴性肠道杆菌包括：肠杆菌、假单胞菌、不动细菌和艾肯氏菌、类鼻疽、沙门氏菌、志贺氏菌、嗜血杆菌、软性下疳、布鲁氏菌、土拉菌、耶尔森(巴斯德)菌、念珠状链杆菌和螺菌、单核细胞增生李斯特菌、猪红斑丹毒丝菌、白喉杆菌、霍乱杆菌、炭疽杆菌、杜诺万氏菌(性病性肉芽肿)和巴尔通氏体。

病原性厌氧菌包括：破伤风杆菌；肉毒菌和其它羧菌；结核菌；麻风杆菌和其它分枝杆菌。病原性螺旋体病包括：梅毒；密螺旋体病；热带肉芽肿；品它病和地方流行性梅毒；和钩端螺旋体病。

由较高级病原菌和病原性真菌引起的其它感染包括：放线菌病；诺卡菌病；隐球菌病，酵母病，组织胞浆菌病和球孢子菌病；念珠菌病，曲霉病，和毛霉菌病；孢子丝菌病，巴西芽生菌病，petriellidosis，球拟酵母菌属，足分枝菌病和着色芽生菌病；和皮肤真菌病。

立克次体感染包括立克次体的和立克次体病。

支原体和衣原体感染的病例包括：支原体肺炎；性病性淋巴肉芽肿；鹦鹉热；和产期衣原体感染。

真核细胞病原

由病原性原虫和蠕虫引起的感染包括：阿米巴病；疟疾；利什曼病；锥虫病；弓形体病；肺炎肺囊虫病；巴贝虫病；贾第鞭毛虫病；旋毛虫病；丝虫病；血吸虫病；线虫病；吸虫病；和绦虫感染。

表4体外gD刺激后脾细胞产生IL-2、IL-10和IFN-γ的水平^a

免疫组 IL-2 IFN-γ IL-10

(pg/ml) (pg/ml) (pg/ml)

原初 16.7±0.8 10.5±0.7 17.1±6.12

pgD+pCDNA3 134.7±3.5 22.4±2.4 57.1±4.4

pgD+IL-8 756.4±5.4 138.5±4.7 128±13

pgD+IP-10 143.5±3.9 31.5±2.5 69.9±1.9

pgD+RANTES 59.9±1.1 520±13 360±46.5

pgD+MCP-1 93.6±4.7 17.9±0.5 49.7±2.3

pgD+MIP-1α 345.4±18 55.4±1.8 22±2.1

pgD+TNF-α 403±13.3 77±6.3 86.8±6.2

pgD+TNF-β 288±5.6 20.8±1.5 78.3±3.6

^a在第0和2周用gD DNA疫苗(每只小鼠60微克)加趋化因子基因(每只小鼠40微克)或TNF cDNA(每只小鼠40微克)免疫每组Balb/c小鼠(n＝2)。在最后一次注射DNA后两周，处死两只小鼠，合并脾细胞。将含有6×10⁶脾细胞的1毫升等份加入24孔板的孔内。然后，在各孔中加入1微克HSV-2 gD蛋白/毫升。在5％CO₂中37℃培育2天后，获得细胞上清液，然后用市售的细胞因子试剂盒(Biosource，Intl.，Camarillo，Ca.)检测其中IL-2、IL-10和IFN-γ的水平，方法是将胞外液体加入细胞因子特异性的ELISA测试版中。样品试验一式三份，数值代表释放的细胞因子浓度平均值±标准偏差。这代表了三个分开的实验中显示预计结果的一个实验。

表5.体外gD刺激后脾细胞产生MCP-1、MIP-1α和RANTES的水平^a

免疫组 MCP-1 MIP-1α RANTES

(pg/ml) (pg/ml) (pg/ml)

原初 153.8±5.7 247±11 769±7

pgD+pCDNA3 234±5.3 747±39 817±55

pgD+IL-8 322±24 1411±113 1284±53

pgD+IP-10 246.3±2.7 1407±459 831±52

pgD+RANTES 189.7±0 2267±219 1077±32

pgD+MCP-1 209.2±6.4 725±501 646±45

pgD+MIP-1α 142.7±3.3 787±94 690±39

^a在第0和2周用gD DNA疫苗(每只小鼠60微克)加趋化因子基因(每只小鼠40微克)免疫每组Balb/c小鼠(n＝2)。在最后一次注射DNA后两周，处死两只小鼠，合并脾细胞。将含有6×10⁶脾细胞的1毫升等份加入24孔板的孔内。然后，在各孔中加入1微克HSV-2 gD蛋白/毫升。在5％CO₂中37℃培育2天后，获得细胞上清液，然后用市售的细胞因子试剂盒(R&D Systems，Minneapolis，Md.)检测其中RANTES、MCP-1和MIP-1α的水平，方法是将胞外液体加入细胞因子或趋化因子特异性的ELISA测试版中。样品试验一式三份，数值代表释放的趋化因子浓度平均值±标准偏差。这代表了三个分开的实验中显示预计结果的一个实验。

Claims

1.一种质粒，它包含与调控元件操作性相连的编码一种免疫原的核苷酸序列以及与调控元件操作性相连的编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，其中所述免疫调节蛋白选自：MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变型、CD40、CD40L、血管生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6和蛋白酶类ICE。

2.根据权利要求1所述的质粒，其中所述免疫原是编码病原体抗原、癌症相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞关联的抗原的靶蛋白。

3.根据权利要求1所述的质粒，其中所述免疫原是病原体抗原。

4.根据权利要求1所述的质粒，其中所述免疫原是HIV-1抗原。

5.根据权利要求1所述的质粒，其中所述免疫调节蛋白是ICAM-1，它还包含与调控元件操作性相连的编码CD86蛋白的核苷酸序列。

6.一种可注射的药物组合物，它包含权利要求1所述的质粒。

7.权利要求1所述的质粒在制备用于诱导个体内产生抵抗免疫原的免疫应答的药物中的用途。

8.一种质粒，它包含与调控元件操作性相连的编码单纯疱疹抗原的核苷酸序列以及与调控元件操作性相连的编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，其中所述免疫调节蛋白选自：IL-8、RANTES、LFA-3和CD40L。

9.根据权利要求8所述的质粒，其中所述单纯疱疹抗原是HSV2gD。

10.一种可注射的药物组合物，它包含权利要求8所述的质粒。

11.权利要求8所述的质粒在制备用于对个体进行免疫以抵抗单纯疱疹病毒感染的药物中的用途。

12.一种组合物，它包含两种质粒：

第一种质粒包含与调控元件操作性相连的编码一种免疫原的核苷酸序列；和

第二种质粒包含与调控元件操作性相连的编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，其中所述免疫调节蛋白选自：MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变型、CD40、CD40L、血管生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6和蛋白酶类ICE。

13.根据权利要求12所述的组合物，其中所述免疫原是编码病原体抗原、癌症相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞关联的抗原的靶蛋白。

14.根据权利要求12所述的组合物，其中所述免疫原是病原体抗原。

15.根据权利要求12所述的组合物，其中所述免疫原是HIV-1抗原。

16.根据权利要求12所述的组合物，其中所述免疫调节蛋白是ICAM-1，它还包含与调控元件操作性相连的编码CD86蛋白的核苷酸序列，其中所述第一质粒或所述第二质粒包含编码CD86蛋白的所述核苷酸序列。

17.根据权利要求12所述的组合物，其中所述免疫调节蛋白是ICAM-1，它还包含与调控元件操作性相连的编码CD86蛋白的核苷酸序列，其中所述组合物还包含第三质粒，所述第三质粒包含编码CD86蛋白的所述核苷酸序列。

18.权利要求12所述的组合物在制备用于诱导个体内产生抵抗免疫原的免疫应答的药物中的用途。

19.一种组合物，它包含两种质粒：

第一种质粒包含与调控元件操作性相连的编码单纯疱疹抗原的核苷酸序列；和第二种质粒包含编码IL-8、RANTES、LFA-3或CD40L的核苷酸序列。

20.根据权利要求19所述的组合物，其中所述单纯疱疹抗原是HSV2gD。

21.一种可注射的药物组合物，它包含权利要求19所述的组合物。

22.权利要求19所述的组合物在制备用于对个体进行免疫以抵抗单纯疱疹病毒感染的药物中的用途。

23.一种重组疫苗，它包含与调控元件操作性相连的编码一种免疫原的核苷酸序列以及与调控元件操作性相连的编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，其中所述免疫调节蛋白选自：MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、IL-18的突变型、CD40、CD40L、血管生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6和蛋白酶类ICE。

24.根据权利要求23所述的重组疫苗，其中所述免疫原是编码病原体抗原、癌症相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞关联的抗原的靶蛋白。

25.根据权利要求23所述的重组疫苗，其中所述免疫原是病原体抗原。

26.根据权利要求23所述的重组疫苗，其中所述免疫调节蛋白是ICAM-1，它还包含与调控元件操作性相连的编码CD86蛋白的核苷酸序列。

27.权利要求23所述的重组疫苗在制备诱导个体内产生抵抗免疫原的免疫应答的药物中的用途。

28.根据权利要求23所述的重组疫苗，其中所述重组疫苗是重组牛痘疫苗。

29.根据权利要求23所述的重组疫苗，其中所述免疫原是病原体抗原。

30.权利要求28所述的重组疫苗在制备诱导个体内产生抵抗免疫原的免疫应答的药物中的用途。

31.一种减毒活病原体，它包含与调控元件操作性相连的编码免疫调节蛋白的核苷酸序列，其中所述免疫调节蛋白选自：MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、IL-18的突变型、CD40、CD40L、血管生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6和蛋白酶类ICE。

32.权利要求31所述的减毒活病原体在制备对个体进行免疫以抵抗病原体的药物中的用途。

33.以下物质的组合在制备诱导个体内产生抵抗免疫原的免疫应答的药物中的用途：

所述免疫原和/或包含与调控元件操作性相连的编码所述免疫原的核苷酸序列的核酸分子；和

一种免疫调节蛋白和/或包含与调控元件操作性相连的编码所述免疫调节蛋白的核苷酸序列的核酸分子，其中所述免疫调节蛋白选自：MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、IL-18的突变型、CD40、CD40L、血管生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6和蛋白酶类ICE。

34.根据权利要求33所述的用途，其中所述免疫原是编码病原体抗原、癌症相关抗原或与自身免疫疾病相关细胞关联的抗原的靶蛋白。

35.根据权利要求33所述的用途，其中所述免疫原是病原体抗原。

36.根据权利要求33所述的用途，其中所述免疫原是HIV-1抗原。

37.以下物质的组合在制备诱导个体内产生抵抗免疫原的免疫应答的药物中的用途：

所述免疫原和/或包含与调控元件操作性相连的编码所述免疫原的核苷酸序列的核酸分子；

一种免疫调节蛋白和/或包含与调控元件操作性相连的编码所述免疫调节蛋白的核苷酸序列的核酸分子，所述免疫调节蛋白是ICAM-1；和

CD86蛋白或与调控元件操作性相连的编码CD86蛋白的核苷酸序列。

38.一种可注射的药物组合物，它包含治疗有效量的特异性结合一种免疫调节蛋白的抗体，所述免疫调节蛋白选自MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES。

39.权利要求38所述的可注射药物组合物在制备用于治疗自身免疫疾病个体的药物中的用途。

40.一种组合物，它包含至少一种质粒，其中所述质粒包含与调控元件操作性相连的编码一种免疫原的核苷酸序列，和与调控元件操作性相连的编码一种免疫调节蛋白的核苷酸序列，其中所述免疫调节蛋白选自：MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8、RANTES、L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变型、CD40、CD40L、血管生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6和蛋白酶类ICE。

41.根据权利要求40所述的组合物，其中所述免疫调节蛋白选自MCP-1、MIP-1α、MIP-1β、IL-8和RANTES。

42.根据权利要求40所述的组合物，其中所述免疫调节蛋白选自L-选择蛋白、P-选择蛋白、E-选择蛋白、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2和LFA-3。

43.根据权利要求40所述的组合物，其中所述免疫调节蛋白选自M-CSF、G-CSF、IL-4和IL-18的突变型。

44.根据权利要求40所述的组合物，其中所述免疫调节蛋白选自CD40和CD40L。

45.根据权利要求40所述的组合物，其中所述免疫调节蛋白选自血管生长因子、IL7、神经生长因子和血管内皮生长因子。

46.一种可注射的药物组合物，它包含权利要求40-45任一项所述的组合物。

47.权利要求40-46任一项所述的组合物在制备诱导个体内产生抵抗免疫原的免疫应答的药物中的用途。

48.一种重组疫苗，它包含权利要求40-46任一项所述的组合物。

49.一种可注射的药物组合物，它包含权利要求12所述的组合物。