MXPA00008352A

MXPA00008352A - Vacunas, composiciones inmunoterapeuticas y metodos para usar las mismas.

Info

Publication number: MXPA00008352A
Application number: MXPA00008352A
Authority: MX
Inventors: David B Weiner
Original assignee: Univ Pennsylvania
Priority date: 1998-02-27
Filing date: 1999-02-26
Publication date: 2002-10-17
Also published as: IL220133A0; CA2322160A1; IL138075A; US20120195852A1; BR9908267A; JP5485601B2; JP2002504380A; AU3313099A; CA2322160C; JP2009263396A; ATE512231T1; IL138075A0; US20130045180A9; KR20070039615A; KR100743894B1; CN100352930C; US8119395B1; EP1078093A4; CN1291235A; CA2792479A1

Abstract

Se describen vacunas mejoradas que incluyen una secuencia nucleotida que codifica la proteina inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores. Las vacunas mejoradas incluyen vacunas de ADN, vacunas recombinantes para la liberacion de vacunas de antigeno y atenuadas activas. Se describen los metodos para inmunizar a los individuos. Se describen composiciones y metodos para tratar a individuos con enfermedades autoinmunes.

Description

VACUNAS, INMUNOTERAPEÜTICOS Y MÉTODOS PARA USAR LOS MISMOS CAMPO DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a vacunas mejoradas, métodos mejorados para inmunizar profiláctica y/o terapéuticamente individuos contra inmunógenos, y a composiciones inmunoterapéut icas mejoradas y métodos de inmunoterapia mejorados.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN Esta solicitud reivindica la prioridad a la Solicitud Provisional U.S. 60/076,207 presentada el 27 de febrero de 1998 y titulada "Vacunas Mejoradas", que se incorpora aquí por referencia. La inmunoterapia se refiere a la modulación de personas a la respuesta inmune para impartir un efecto terapéutico deseado. Los inmunoterapéuticos se refieren a las composiciones que, cuando se administran a un individuo, modulan la inmunidad del individuo, suficiente para disminuir los síntomas y causas de los síntomas llevados por las respuestas inmunes indeseables o para aliviar los síntomas, o eliminar /reducir las causas de los síntomas aumentado las respuestas inmunes REF.: 121992 deseables. En algunos casos, la inmunoterapia es parte de un protocolo de vacunación en el cual al individuo se administra una vacuna que resulta en la exposición del individuo a un inmunógeno. En tales casos, el inmunoterapéut ico aumenta la respuesta inmune y/o mejora selectivamente una porción de la respuesta inmune que es deseable para tratar o prevenir la condición, infección o enfermedad particular. En algunos casos, los inmunoterapéuticos se liberan sin inmunógenos. En tales casos, los inmunoterapéuticos se proporcionan para modular el sistema inmune ya sea disminuyendo o suprimiendo las respuestas inmunes, mejorando o aumentando las respuestas inmunes, disminuyendo o suprimiendo una porción del sistema inmune, mejorando o aumentando una porción del sistema inmune o disminuyendo o suprimiendo las respuestas inmunes, mejorando o aumentando las respuestas inmunes. En algunos casos, los inmunoterapéuticos incluyen anticuerpos que cuando se administran i n vi vo , se enlazan a proteínas involucradas en la modulación de las respuestas inmunes. La interacción entre los anticuerpos y tales proteínas resulta en la alteración de las respuestas inmunes. Si la proteína está involucrada en la enfermedad autoinmune, los anticuerpos pueden inhibir su actividad en tal papel y reducir o eliminar los síntomas o la enfermedad.

Las vacunas son útiles para inmunizar a los individuos contra antígenos blanco tal como, alérgenos, antígenos patógenos o antígenos asociados con células involucradas en las enfermedades en el humano. Los antígenos asociados con las células involucradas en las enfermedades en el humano incluyen antígenos de tumores asociados con cáncer y antígenos asociados con células involucradas en enfermedades autoinmunes.

En el diseño de tales vacunas, se ha reconocido que las vacunas que producen el antígeno blanco en la célula del individuo vacunado, son efectivas para inducir el brazo celular en el sistema inmune. Específicamente, las vacunas atenuadas activas, las vacunas recombinantes que usan vectores avirulentos y vacunas de ADN, todas llevan a la producción de antígenos en la célula del individuo vacunado que resulta en la inducción del brazo celular del sistema inmune. Por otro lado, las vacunas de sub-unidades que comprenden sólo proteínas y vacunas asesinas o inactivadas, que no inducen una respuesta humoral, no inducen buenas respuestas inmunes celulares.

Una respuesta inmune celular a menudo es necesaria para proporcionar protección contra la infección por patógeno y para proporcionar la terapia mediada inmune efectiva para el tratamiento de la infección por patógenos, cáncer o enfermedades autoinmunes. Por lo tanto, se prefieren vacunas que producen el antígeno blanco en la célula del individuo vacunado, tal como las vacunas atenuadas activas, vacunas recombinantes que usan vectores avirulentos y vacunas de ADN.

Mientras que tales vacunas frecuentemente son efectivas para inmunizar individuos profiláctica o terapéuticamente contra infección patógena o enfermedades del humano, existe una necesidad para las vacunas mejoradas. Existe una necesidad para las composiciones y métodos que producen una respuesta inmune mejorada.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención se refiere a composiciones que comprenden proteínas inmunomoduladoras o moléculas de ácidos nucleicos que codifican las mismas, que mejoran y/o modulan la respuesta inmune, así como a los métodos para usar tales proteínas y moléculas de ácidos nucleicos. La liberación de las proteínas inmunomoduladoras es útil para la inmunoterapia, así como para mejorar o de otra manera adaptar las respuestas inmunes en conjunto con la liberación de la vacuna. Una proteína inmunomoduladora podría ser una quimiocina que incluye MCP-1, MlP-la, MIP-lß, IL-d y RANTES; una molécula de adhesión que incluye una selectina tal como L-selectina, P-selectina y E-selectina, una molécula similar a muctina tal como CD34, GlyCAM-1 y MadCAM-1, un miembro de la familia de integrina tal como LFA-1, VLA-1, Mac-1 y pl50.95, un miembro de la superfamilia inmunoglobulina, tal como PECAM, ICAMs e.g. ICAM-2 e ICAM-3, CD2 y LFA-3; citocinas que incluyen M-CSF, G-CSF, GSF, IL-4, formas mutantes de IL-18; moléculas co-estímulantes tal como CD40 y CD40L; factores de crecimiento que incluyen factor de crecimiento vascular, IL-7, factor de crecimiento y factor de crecimiento endotelial vascular; moléculas receptores que incluyen Fas, receptor TNF, Fit, Apo-1, p55, SL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6; otros incluyen Caspasa (ICE) .

La presente invención se refiere a un. plásmido que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a los ele.mentos reguladores necesarios para la expresión en células eucarióticas, y .una secuencia nucleótida que codifica un inmunógeno enlazado operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células eucarióticas. El inmunógeno es preferentemente un antígeno patógeno, un antígeno asociado con cáncer o un antígeno enlazado a células asociadas con enfermedades autoinmunes.

La presente invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmune en un individuo contra un inmunógeno que comprende la etapa de administrar a un individuo, un plásmido que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteina inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo, y a una secuencia nucleótida que codifica un inmunógeno enlazado operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo.

La presente invención se refiere a un método para inmunizar un individuo contra un patógeno, cáncer o una enfermedad autoinmune, que comprende la etapa de administrar a un individuo, un plásmido que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo, y a una secuencia nucleótida que codifica un inmunógeno enlazado operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo, en donde el inmunógeno es un antígeno patógeno, un antígeno asociado con cáncer o un antígeno enlazado a células asociado con enfermedades autoinmunes.

La presente invención se refiere a una composición que comprende un primer plásmido que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células eucarióticas y un segundo plásmido que comprende una secuencia nucleótida que codifica un inmunógeno enlazado operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células eucarióticas. En algunas modalidades preferidas, el inmunógeno en un antígeno patógeno, un antígeno asociado con cáncer o un antígeno enlazado a células asociado con enfermedades autoinmunes.

La presente invención se refiere a un método para inmunizar a un individuo contra un patógeno, cáncer o una enfermedad autoinmune, que comprende la etapa de administrar a un individuo, una composición que comprende un primer plásmido que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo, y un segundo plásmido que comprende una secuencia nucleótida que codifica un inmunógeno enlazado operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo, en donde el inmunógeno es un antígeno patógeno, un antígeno asociado con cáncer o un antígeno enlazado a células asociadas con enfermedades autoinmunes.

La presente invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmune contra un inmunógeno que comprende la etapa de administrar a un individuo, una composición que comprende un primer plásmido que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo, y un segundo plásmido que comprende una secuencia nucleótida que codifica un inmunógeno enlazado operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo.

La presente invención se refiere a un vector de vacuna recombinante mejorado, que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteina inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células eucarióticas, y una secuencia nucleótida que codifica un antígeno blanco enlazado operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células eucarióticas. En las modalidades preferidas, el antígeno blanco es un antígeno patógeno, un antígeno asociado con cáncer o un antígeno enlazado a células asociadas con enfermedades autoinmunes.

•La presente invención se refiere a un método para inmunizar a un individuo contra un patógeno, cáncer o enfermedad autoinmune, que comprende la etapa de administrar a un individuo, una vacuna recombinante que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo, y una secuencia nucleótida que codifica un antígeno blanco enlazado operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo, en donde el antígeno blanco es un antígeno patógeno, un antígeno asociado con cáncer o un antígeno enlazado a células asociadas con enfermedades autoinmunes .

La presente invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmune contra un antígeno blanco, que comprende la etapa de administrar a un individuo, un vector de vacuna recombinante que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo, y una secuencia nucleótida que codifica un antígeno blanco enlazado operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo.

La presente invención se refiere a una vacuna activa, atenuada que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células eucarióticas.

La presente invención se refiere a un método para inmunizar a un individuo contra un patógeno, cáncer o una enfermedad autoinmune, que comprende la etapa de administrar a un individuo, una vacuna atenuada que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo.

La presente invención se refiere a un método para inducir una respuesta inmune en un individuo contra un inmunógeno, que comprende la etapa de administrar a un individuo, una vacuna atenuada que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora .enlazada operablemente a elementos reguladores necesarios para la expresión en células del individuo.

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para modular un sistema inmune del individuo. Los métodos de la invención comprenden liberar una proteína inmunomoduladora a un individuo, ya sea por administración de la proteína o administración de una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora como parte de un vector de expresión u otro vehículo capaz de liberar una secuencia nucleótida a un individuo en forma expresable .

La presente invención se refiere a composiciones y métodos para tratar individuos que tienen enfermedades autoinmunes . Los métodos de la invención comprenden administrar a tales individuos, una composición que comprende anticuerpos que se enlazan específicamente a quimiocinas que incluyen MCP-1, MlP-la, MlP-lß, IL-8 y RANTES .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las Figuras ÍA y IB representan IL-8 pre-procesadas y maduras como se discute en el Ejemplo 2.

La Figura 2 muestra genes para ICAM-1 (pCICAM-1 ) , LFA-3(pCLFA-3) y VCAM- 1 (pCVCAM- 1 ) clonados en el vector de expresión pCDNA3.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LAS MODALIDADES PREFERIDAS La invención surge del descubrimiento de que proteínas particulares mejoran y/o modulan la respuesta inmune. Por lo. tanto, tales proteínas podrían liberarse como -inmunoterapéuticos o como compuestos en una vacuna.

Como se usa aquí, el término "proteínas inmunomoduladoras" significa que se refiere a proteínas y productos de expresión de moléculas de ácidos nucleicos de acuerdo con la presente invención, que mejoran y/o modulan la respuesta inmune. Por lo tanto, l s proteínas inmunomoduladoras podrían liberarse como inmunoterapéuticos o como componentes en una vacuna.

Las proteínas inmunomoduladoras incluyen quimiocinas, moléculas de adhesión, citocinas, moléculas coestimulantes, factores de crecimiento y molécula receptoras .

Las quimiocinas que son proteínas inmunomoduladoras incluyen MlP-la, MlP-lß, RANTES, IL-8 y MCP-1.

Las moléculas de adhesión que son proteínas inmunomoduladoras incluyen miembros de la familia de selectina, moléculas similares a mucina, miembros de la familia de integrina, y miembros de la superfamilia de inmunoglobulina .

Los miembros de la familia de selectina que son proteínas inmunomoduladoras incluyen L-selectina, P-selectina y E-selectina.

Las moléculas similares a mucina son ligandos a miembros de la familia de selectina. Las moléculas similares a mucina que son proteínas inmunomoduladoras incluyen CD34, GlyCAM-1 y MadCAM-1.

Los miembros de la familia de integrina que son proteínas inmunomoduladoras incluyen LFA-1, VLA-1, Mac-1 y pl50.95.

Los miembros de la superfamilia de inmunoglobulina que son proteínas inmunomoduladoras incluyen PECAM, ICAMs, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2 y LFA-3.

Las citocinas que son proteínas inmunomoduladoras incluyen M-CSF, GM-CSF, G-CSF, CSF, IL-4 y las formas mutantes de IL-18 que incluyen una eliminación de los primeros aproximadamente 35 residuos de aminoácidos presentes en la forma pro de la proteína, pero no la forma madura .

Las moléculas co-estimulantes que son proteínas inmunomoduladoras incluyen CD40 y el ligando CD40 (CD40L) .

Los factores de crecimiento que son proteínas inmunomoduladoras incluyen el factor de crecimiento vascular, IL-7, factor de crecimiento nervioso y factor de crecimiento endotelial vascular.

Las moléculas receptoras que son proteínas inmunomoduladoras incluyen el producto de expresión del "gen muerto" Fas, receptor TNF del factor de necrosis tumoral, Fit, Apo-1, ?55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6; otros incluyen Caspasa (ICE) .

Otras moléculas incluyen Caspasa-1 (ICE) De acuerdo a algunas modalidades de la invención, una proteína inmunomoduladora se libera administrando una molécula de ácido nucleico que, cuando se toma por una célula, se expresa para producir la proteína inmunomoduladora. De acuerdo a algunas modalidades de la invención, la proteína inmunomoduladora se libera administrando la proteína misma. De acuerdo a algunas modalidades de la invención, la proteína inmunomoduladora se libera administrando ya sea moléculas de ácidos nucleicos o proteínas. De acuerdo a algunas modalidades de la invención, la proteína inmunomoduladora se libera administrando ambas moléculas de ácidos nucleicos y proteínas simultáneamente.

De acuerdo a algunas modalidades de la invención, la proteína inmunomoduladora, ya sea como proteína o una molécula de ácido nucleico que codifica la proteína, se administra como un componente de o de otra manera como un suplemento en conjunto con una composición de vacuna. La vacuna podría ser una vacuna subunitaria, una vacuna asesina, una vacuna atenuada activa, una vacuna celular, una vacuna recombinante o una vacuna de ácido nucleico o ADN. En el caso de una vacuna atenuada activa, una vacuna celular, una vacuna recombinante o una vacuna de ácido nucleico o ADN, la proteína inmunomoduladora podría codificarse por las moléculas de ácido nucleico de estas vacunas Las proteínas inmunomoduladoras se usan para inducir y mejorar las respuestas celulares citotóxicas T (CTL), e/o inducir y mejorar las respuestas de anticuerpos, e/o inducir y mejorar las respuestas de proliferación de células T.

Las proteínas inmunomoduladoras que inducen y mejoran las respuestas CTL son particularmente útiles cuando se administran en conjunto o como parte de una vacuna contra un patógeno intracelular, o contra células asociadas con enfermedad o cáncer autoinmune. Las proteínas inmunomoduladoras que inducen y mejoran las respuestas CTL son particularmente útiles cuando se administran en conjunto con las vacunas atenuadas activas, las vacunas celulares, vacunas recombinantes y vacunas de ácido nucleico/ADN . Alternativamente, las Las proteínas inmunomoduladoras que inducen y mejoran las respuestas CTL, son útiles como inmunoterapéuticos que se administran a pacientes que sufren de cáncer o infección intracelular. Las proteínas inmunomoduladoras que inducen y mejoran las respuestas CTL son útiles cuando se administran a pacientes inmunocomprometidos.

Las proteínas inmunomoduladoras que inducen o mejoran las respuestas de anticuerpos, son particularmente útiles cuando se administran en conjunto o como parte de una vacuna contra bacterias, otros patógenos extracelulares, o los virus para los cuales las respuestas de anticuerpos son protectoras, tal como el virus de hepatitis B. Las proteínas inmunomoduladoras que inducen y mejoran las respuestas de anticuerpos son particularmente útiles cuando se administran en conjunto con vacunas s ubun i t a r i a s . Alternati amente, las proteínas inmunomoduladoras que inducen y mejoran las respuestas de anticuerpos son útiles como inmunoterapéuticos que se administran a pacientes que sufren de respuestas inmunes CTL indeseables. Tal cambio del sistema inmune del paciente reduce la patología causada por la respuesta CTL. Las proteínas inmunomoduladoras que inducen y mejoran las respuestas de anticuerpos son útiles cuando se administran a pacientes inmunocomprometidos.

Las proteínas inmunomoduladoras que inducen y mejoran las respuestas de proliferación de células T, son particularmente útiles cuando se administran en conjunto o como parte de las vacunas. Alternativamente, las proteínas inmunomoduladoras que inducen y mejoran las respuestas de proliferación de células T son útiles como inmunoterapéuticos. Las proteínas inmunomoduladoras que inducen y mejoran las respuestas de proliferación de células T son útiles cuando se administran a pacientes inmunocomprometidos .

Quimiocinas : La administración de quimiocinas o moléculas de ácidos nucleicos que codifican las quimiocinas resulta en una expresión aumentada de quimiocinas por las células.

MCP-1 es particularmente útil para inducir y mejorar CD8+CTLs .

MlP-la es particularmente útil en la inducción de anticuerpos .

IL-8 es particularmente útil en la inducción de anticuerpos, y es un fuerte inductor de las respuestas auxiliares T.

RANTES induce TH1 así como las respuestas CTL.

También podría usarse la MlP-lß, tal como la construcción que se clona en pCDNA3 para generar pCDNA3-MlP-lß Moléculas de adhesión: Miembros de la familia de selectina L-select ina P-select ina E-select ina Moléculas similares s mucina .CD34 GlyCAM-1 tal como la construcción que se ha clonado en pCDNA3 para generar pCDNA3-GlyCAM-l . MadCAM-1 Miembros de la familia de integrina LFA-1 VLA-1 Mac-1 pl50.95 Miembros de la superfamilia de inmunoglobulina PECAM ICAMs ICAM-1 ICAM-2 ICAM-3 CD2 LFA-3.

Las moléculas de adhesión son más útiles cuando se administran como moléculas de ácidos nucleicos.

Las moléculas de adhesión son más útiles cuando se administran como moléculas de ácidos nucleicos como párate de o en conjunto con vacunas, particularmente vacunas atenuadas, vacunas celulares, vacunas recombinantes y vacunas de ácido nucleico/ADN.

Las moléculas de adhesión útiles cuando se liberan como moléculas de ácidos nucleicos int rat umorales o antralesión.

Las moléculas de adhesión preferidas incluyen ICAM-1, LFA-3 y E-selectina.

ICAM-1 es la mejor para CTL y proliferación.

Citocinas M-CSF G-CSF CSF IL-4 formas mutantes de 11-18 Moléculas co-estimulantes Podría usarse CD40 tal como la construcción en la que el ADNc que codifica CD40 se clona en pCDNA3..para generar pCDNA3-CD40 CD40L Factores de crecimiento podría usarse el factor de crecimiento vascular tal como la construcción en la que ADNc que codifica el factor de crecimiento se clona en pCDNA3 para generar pCDNA3-VGF ! IL-7 factor de crecimiento nervioso factor de crecimiento endotelial vascular Moléculas receptoras producto de expresión del "gen muerto" Fas receptor TNF Fit Apo-1 p55 SL-1 DR3 TRAMP Apo-3 AIR LARD NGRF DR4 DR5 KILLER TRAIL-R2 TRICK2 DR6 Otro Caspasa (ICE) La Tabla 1 lista los números de acceso GENBANK y las citaciones de revistas para las secuencias de ácidos nucleicos y nucleótidas para cada una de las proteínas inmunomoduladoras anteriores y para CD86 (B7.2) .

Las vacunas de ADN se describen en PCT/US 90 /01515 , PCT/US93/02338, PCT/US 93/0 8131 y PCT/US 94 /O 0899 , y las solicitudes de prioridad citadas aquí, que se incorporan cada una por referencia. Además de los protocolos de liberación descritos en las solicitudes, los métodos alternativos para liberar el ADN se describen en las Pats. U.S. Nos. 4,945,050 y 5,036,006, que se incorporan ambas aquí por referencia.

Algunos aspectos de la presente invención se refieren a métodos para introducir material genético en las células de un individuo, para inducir las respuestas inmunes contra proteínas y péptidos que se codifican por el material genético. Los métodos comprenden las etapas de administrar al tejido del individuo, ya sea una molécula de ácido nucleico simple que comprende una secuencia nucleótida que codifica un péptido o proteína deseada y una ' secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora, o una composición que tiene dos moléculas de ácido nucleico, una que comprende una secuencia nucleótida que codifica un péptido o proteína deseada y una que comprende una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora. La molécula de ácido nucleico podría proporcionarse como ADN de plásmido, las moléculas de ácido nucleico de los vectores recombinantes o como parte del material genético proporcionado en una vacuna atenuada o vacuna celular. Alternativamente, en algunas modalidades, la proteína inmunomoduladora podría liberarse como una proteína.

De acuerdo a algunas modalidades, las combinaciones de dos o más proteínas inmunomoduladoras se administran a un individuo. En algunas modalidades, los genes que codifican una combinación de dos o más proteínas inmunomoduladoras se administran a un individuo junto con un gen que codifica un inmunógeno y/o una proteína inmunogénica como parte de un protocolo de vacuna. En algunas modalidades, una combinación de una proteína inmunomoduladora y un gen que codifica una proteína inmunomoduladora, se administra a un individuo junto con un gen que codifica un inmunógeno y/o una proteína inmunogénica como parte de un protocolo de vacuna. En algunas modalidades, una combinación de dos o más proteínas inmunomoduladoras se administra a un individuo junto con un gen que codifica un inmunógeno y/o una proteína inmunogénica como parte de un protocolo de vacuna .

De acuerdo a algunas modalidades, las proteínas inmunomoduladoras se administran a un individuo en combinación con la molécula co-estimulante CD86 (B7.2) . En algunas modalidades, los genes que codifican una combinación de CD86 y una o más proteínas inmunomoduladoras se administran a un individuo junto con un gen que codifica un inmunógeno y/o una proteína inmunogénica como parte de un protocolo de vacuna. En algunas modalidades, una combinación de la proteína CD86 y un gen que codifica una proteína inmunomoduladora se administra a un individuo junto con un gen que codifica un inmunógeno y/o una proteína inmunogénica como parte de un protocolo de vacuna. En algunas modalidades, una combinación de la proteína inmunomoduladora y un gen que codifica la proteína CD86 se administra a un individuo junto con un gen que codifica un inmunógeno y/o una proteína inmunogénica como parte de un protocolo de vacuna. En algunas modalidades, una combinación de CD86 y una o más proteínas inmunomoduladoras se administra a un individuo junto con un gen que codifica un inmunógeno y/o una proteína inmunogénica como parte de un protocolo de vacuna. En algunas modalidades, los genes que codifican una combinación de CD86 y una o más quimiocinas y/o moléculas de adhesión se administran a un individuo junto con un gen que codifica un inmunógeno y/o una proteína inmunogénica como parte de un protocolo de vacuna. En algunas modalidades, los genes que codifican una combinación de CD86 e ICAM-1 se administran a un individuo junto con un gen que codifica un inmunógeno y/o una proteína inmunogénica como parte de un protocolo de vacuna .

De acuerdo a algunos aspectos de la presente invención, se proporcionan las composiciones y métodos que inmunizan profiláctica y/o terapéuticamente a un individuo contra un patógeno o una célula relacionada con enfermedad, anormal. El material genético que codifica un péptido o proteína que comparte al menos un epítope con una proteína inmunogénica encontrada en el patógeno o células que son el blanco, y el material genético que codifica una proteína inmunomoduladora. Alternativamente, en algunas modalidades, la proteína inmunomoduladora podría liberarse como una proteína.

El material genético se expresa por las células del individuo y sirve como un blanco inmunogénico contra el cual se obtiene una respuesta inmune. La respuesta inmune resultante se basa ampliamente: además de una respuesta inmune tumoral, se obtienen ambos brazos de la respuesta inmune celular. Los métodos de la presente invención son útiles para conferir la actividad profiláctica y terapéutica. De esta manera, un método para inmunizar incluye ambos métodos de inmunización contra inmunógenos y de esta manera, por ejemplo, proteger un individuo de la estimulación del patógeno, o la presencia o la proliferación de células específicas, así como los métodos para tratar a un individuo que sufre de infección patógena, enfermedad hiperproliferativa o enfermedad autoinmune .

Como se usa aquí, el término "proteína blanco" significa que se refiere a péptidos y proteínas codificados por construcciones de genes de la presente invención que actúan como proteínas blanco para una respuesta inmune. El término "proteína blanco" e "inmunógeno" se usan intercambiablemente y .se refieren a una proteína contra la cual puede obtenerse una respuesta inmune. La proteína blanco es una proteína inmunogénica que comparte al menos un epítope con una proteína del patógeno o tipo celular indeseable, tai-como una célula de cáncer o una célula involucrada en la enfermedad autoinmune contra la cual se requiere la inmunización. La respuesta inmune dirigida contra la proteína blanco protegerá al individuo contra y tratará al individuo para la infección o enfermedad específica con la cual se asocia la proteína blanco.

La presente invención es útil para obtener amplias respuestas inmunes contra una proteína blanco, i.e. proteínas asociadas específicamente con patógenos, alérgenos o las células "anormales" propias del individuo. La presente invención es útil para inmunizar al individuo contra agentes y organismos patogénicos, de modo que una respuesta inmune contra una proteína patógena proporciona la inmunidad protectora contra el patógeno. La presente invención es útil para combatir las enfermedades y padecimientos hiperproliferativos, tal como cáncer proporcionando una respuesta inmune contra una proteína blanco que se asocia específicamente con las células hiperproliferativas. La presente invención es útil para combatir las enfermedades y padecimientos autoinmunes proporcionando una respuesta inmune contra una proteína blanco que se asocia específicamente con las células involucradas en la condición autoinmune.

De acuerdo a algunos aspectos de la presente invención, el ADN o ARN que codifica una proteína blanco y una proteína inmunomoduladora se introduce en las células del tejido de un individuo en donde se expresa, de esta manera, se produce la proteína blanco. Las secuencias de ADN o ARN que codifican la proteína blanco y la proteína inmunomoduladora se enlazan a elementos reguladores necesarios para la expresión en las células del individuo. Los elementos reguladores para la expresión de ADN incluyen un promotor y una señal de poliadenilación. Además, otros elementos, tal como una región Kozak, también podrían incluirse en la construcción genética .

Como se usa aquí, el término "construcción genética" se refiere a las moléculas de ADN o ARN que comprenden una secuencia nucleótida que codifica la proteína blanco y que incluyen las señales de iniciación o terminación enlazadas operablemente a elementos reguladores, que incluyen un promotor y la señal de poliadenilación capaz de dirigir la expresión en las células del individuo vacunado y/o una secuencia nucleótida que codifica la proteína inmunomoduladora y que incluyen las señales de iniciación y . terminación, enlazadas operablemente a elementos reguladores que incluyen un promotor y señal de poliadenilación capaz de dirigir la expresión en las células del individuo vacunado. En algunas modalidades, las secuencias de las formas expresadas que codifican la proteína blanco y las secuencias de las formas expresadas que codifican una proteína inmunomoduladora se encuentran en la misma molécula de ácido nucleico que se libera al individuo. En algunas modalidades, las secuencias de las formas expresadas que codifican la proteína blanco se presentan en la misma molécula de ácido nucleico de las moléculas de ácido nucleico que contienen las secuencias de las formas expresadas que codifican una proteína inmunomoduladora. En tales casos, ambas moléculas se liberan al individuo.

Como se usa aquí, el término "forma expresada" se refiere a construcciones de genes que contienen los elementos reguladores necesarios enlazados operablemente a una secuencia de codificación que codifica una proteína blanco o a una proteína inmunomoduladora, de modo que cuando está presente en la célula de un individuo, se expresará la secuencia de codificación.

Como se usa aquí, el término "compartir un epítope" se refiere a proteínas que comprenden al menos un epítope que es idéntico a o sustancialmente similar a un epítope de otra proteína.

Como se usa aquí, el término "sustancialmente similar a epítope" significa que se refiere a un epítope que tiene una estructura que no es idéntica a un epítope de -una proteína, pero sin embargo, recurre a una respuesta celular o humoral que reacciona en forma cruzada a tal proteína.

Las construcciones genéticas comprenden una secuencia nucleótida que codifica una proteína blanco o una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores necesitados para la expresión del gen. De acuerdo a la invención, se proporcionan las combinaciones de las construcciones del gen que incluyen una que comprende una forma expresada de la secuencia nucleótida, que codifica una proteína blanco y una que incluye una forma expresada de la secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora. La incorporación en una célula activa de las moléculas de ADN o ARN que incluyen la combinación de las construcciones del gen, resulta en la expresión del ADN o ARN y la producción de la proteína blanco y la proteína inmunomoduladora. Resulta una respuesta inmune mejorada contra la proteína blanco.

Cuando se toma por una célula, la construcción o construcciones genéticas podrían permanecer presentes en la célula como una molécula extracromosomal funcional y/o integrarse en el ADN cromosomal de la célula. El ADN podría introducirse en las células en donde permanece como material genético separado en la forma de un plásmido o plásmidos. Alternativamente, el ADN lineal que puede integrarse en el cromosoma, podría introducirse en la célula. Cuando se introduce el ADN en a célula, podrían adicionarse los reactivos que promueven la integración de ADN en los cromosomas. Las secuencias de ADN que son útiles para promover la integración también podrían incluirse en la molécula de ADN. Alternativamente, el ARN podría administrarse a la célula. También se contempla para proporcionar la construcción genética como un minicromosoma lineal que incluye un centrómero, telómeros y un origen de replicación. Las construcciones del gen podrían mantener parte del material genético en microorganismos vivos o vectores microbianos recombinantes que viven en las células. Las construcciones de genes podrían ser parte de genomas de vacunas virales recombinantes en donde el material genético se integra en el cromosoma de la célula o permanece extracromosomal.

Las construcciones genéticas incluyen elementos reguladores necesarios para la expresión del gen de una molécula de ácido nucleico. Los elementos incluyen: un promotor, un codón de iniciación, un codón de paro y una señal de poliadenilación. Además, los mejoradores frecuentemente se requieren para la expresión del gen de la secuencia que codifica la proteína blanco o la proteína inmunomoduladora. Es necesario que estos elementos sean enlazados operablemente a la secuencia que codifica las proteínas deseadas y que los elementos reguladores estén operablemente en el individuo al cual se administran.

Los codones de iniciación y el codón de paro en general, se consideran que son parte de una secuencia nucleótida que codifica la proteína deseada. Sin embargo, es necesario que estos elementos sean funcionales .en el individuo a quién la construcción del gen se administra. Los codones de iniciación y de terminación deben estar en el marco con la secuencia de codificación.

Los promotores y las señales de poliadenilación usados deben ser funcionales dentro de las células del individuo .

Ejemplos de promotores útiles para la práctica de la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para humanos, incluyen, pero no se limitan a promotores de Virus 40 de simio (SV40), promotor de virus de tumor mamario de ratón (MMTV), virus de inmunodeficiencia humano (VIH) tal como el promotor de repetición terminal largo del VIH (LRT) , virus Maloney, ALV, citomegalovirus (CMV) tal como el promotor tardío inmediato de CMV, virus de Epstein Barr (EBV) , virus de sarcoma Rous (RSV) , así como los promotores de genes humanos, tal como actina de humano, miosina de humano, hemoglobina de humano, creatina de músculo de humano y metalotioneina de humano.

Ejemplos de las señales de poliadenilación útiles para la práctica de la presente invención, especialmente en la producción de una vacuna genética para humanos, incluyen pero no se limitan a la señal de poliadenilación de la hormona de crecimiento de bovino, señales de poliadenilación SV40 y señales de poliadenilación LTR. En particular, se usa la señal de poliadenilación SV40 que es un plásmido pCEP4 (Invitrogen, San Diego CA) , referida como la señal de poliadenilación SV40.

Además de los elementos reguladores requeridos para la expresión de ADN, también podrían incluirse otros elementos en la molécula de ADN. Tales elementos adicionales incluyen mejoradores. El mejorador podría seleccionarse del grupo que incluye, pero no se limita a actina de humano, miosina de humano, hemoglobina de humano, creatina de músculo de humano y mejoradores virales, tal como los de CMV, RSV y EBV.

Las construcciones genéticas pueden proporcionarse con origen de replicación mamífero, para mantener la construcción ext racromosómicamente y producir múltiples copias de la construcción en la célula. Los plásmidos pCEP4 y pREP4 de Invitrogen (San Diego, CA) , contienen el origen de replicación del virus de Epstein Barr y en antígeno nuclear EBNA-1 que codifica la región que produce la replicación episomal de copia alta sin integración. En algunas modalidades, el ADNc que codifica la proteína inmunomoduladora se inserta en el pCDNA3.

En algunas modalidades preferidas relacionadas con las aplicaciones de inmunización, se liberan moléculas de ácido nucleico, que incluyen las secuencias nucleótidas que codifican una proteína blanco, la proteína inmunomoduladora y, adicionalmente, los genes para las proteínas que mejoran adicionalmente la respuesta inmune contra tales proteínas blanco. Ejemplos de tales genes son los que codifican otras citocinas y linfocinas, tal como a-interferón, gama-interferón, factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12. En algunas modalidades, se prefiere que el gen para GM-CSF se incluya en las construcciones genéticas usadas en las composiciones de inmunización.

Un elemento adicional podría adicionarse, el cual sirve como un blanco para la destrucción celular si es deseable para eliminar las células que reciben la construcción genética por cualquier razón. Un gen de timidina cinasa (tk) de herpes en una forma expresable puede incluirse en la construcción genética. El fármaco ganciclovir puede administrarse al individuo y tal fármaco causará la muerte selectiva de cualquier célula que produce tk, de esta manera, se proporciona el medio para la destrucción selectiva de células con la construcción genética Para maximizar la producción de proteínas, las secuencias reguladoras podrían seleccionarse, las cuales son muy apropiadas para la expresión del gen en las que la construcción se administra en las células. Además, los codones podrían seleccionarse, los cuales se transcriben más eficientemente en la célula. Una vez que se tienen, el experto en el arte puede producir construcciones de ADN que son funcionales en las células.

Las rutas de administración incluyen, pero no se limitan a, intramuscular, i n t r a n a s a 1 me n-t e , intraperitoneal, intradérmica, subcutánea, intravenosa, int raarterialmente, intraocularmente y oral, así como tópicamente, transdérmicamente , por inhalación o supositorio o al tejido mucosal tal como por lavado vaginal, rectal, uretral, bucal o tejido sublingual. Las rutas de administración preferidas incluyen al tejido mucosal, inyección intramuscular, intraperitoneal, intradérmica y subcutánea. Las construcciones genéticas podrían administrarse por medio de, incluyendo, pero no se limitan a, jeringas tradicionales, dispositivos de inyección sin agujas, o "pistolas de gen de bombardeo de microproyectil" .

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la presente invención comprenden aproximadamente 1 nanogramo a aproximadamente 2000 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la presente invención comprenden aproximadamente 5 nanogramos a aproximadamente 1000 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 10 nanogramos a aproximadamente 800 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 0.1 a aproximadamente 500 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 1 a aproximadamente 350 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 25 a aproximadamente 250 microgramos de ADN. En algunas modalidades preferidas, las composiciones farmacéuticas contienen aproximadamente 100 a aproximadamente 200 microgramos de ADN.

Las composiciones farmacéuticas de acuerdo a la presente invención se formulan de acuerdo a la forma de administración que va a usarse. En los casos en donde las composiciones farmacéuticas son composiciones farmacéuticas inyectables, estas son estériles, libres de pirógeno y libres de particulados. Una formulación isotónica se usa preferentemente. En general, los aditivos para isotonicidad pueden incluir cloruro de sodio, dextrosa, manitol, sorbitol y lactosa. En algunos casos, se prefieren soluciones isotónicas tal como solución salina amortiguada con fosfato. Los estabilizadores incluyen gelatina y albúmina. En algunas modalidades, se adiciona a la formulación un agente de vaso-constricción.

En algunas modalidades, la molécula de ácido nucleico se libera a las células en conjunto con la administració de un mejorador de función polinucleótida o un agente facilitador de vacuna genético. Los mejoradores de función polinucleótida se describen en el Número de Serie U.S. 08/008,342 presentado el 26 de enero de 1993, Número de Serie U.S. 08/029,336 presentado el 11 de marzo de 1993, Número de Serie U.S. 08/125,012 presentado el 21 de septiembre de 1993 y el Número de Serie de la Solicitud Internacional PCT/US 94 /00899 presentado el 26 de enero de 1994, que se incorporan cada una aquí por referencia. Los agentes facilitadores de vacuna genéticos se describen en el Número de Serie U.S. 08/221,579, presentado el 1 de abril de 1994, que se incorpora aquí por referencia. Los co-agentes que se administran en conjunto con las moléculas de ácido nucleico podrían administrarse como una mezcla con la molécula de ácido nucleico o administrarse separadamente simultáneamente, antes o después de la administración de las moléculas de ácido nucleico. Además, otros agentes que podrían funcionar como agentes de transfección y/o agentes de replicación y/o agentes inflamatorios y que podrían co-administrarse con un GVF incluyen factores de crecimiento, citocinas y linfocinas tal como a-interferón, gama-interferón, factor de crecimiento derivados de plaquetas (PDGF), TNF, factor de crecimiento epidérmico (EGF), IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-10 e IL-12, así como factor de crecimiento de fibroblasto, agentes activos superficiales tal como complejos de estimulación inmunes (ISCOMS), adyuvante incompleto de Freund, análogo LPS que incluye Lípido A de monofosforilo (MPL) , péptidos de muramilo, análogos de quinona y vesículas tal como espinaceno y espinaceno y también podría usarse ácido hialurónico, administrarse en conjunto con la construcción genética. En algunas modalidades, podría usarse como un GVF una proteína inmunomoduladora .

Las moléculas de ácido nucleico que se liberan a las células de acuerdo a la invención, podrían servir como moldes genéticos para las proteínas que funcionan como agentes profilácticos e/o inmunizantes terapéuticos. En las modalidades preferidas, el ácido nucleico y las moléculas de ácido nucleico comprenden las secuencias reguladoras necesarias para la transcripción y translación de la región codificante en las células del animal.

La presente invención podría usarse para inmunizar individuos contra todos los patógenos, tal como virus, organismos procarióticos y eucarióticos patogénicos tal como organismos patogénicos unicelulares y parásitos multicelulares. La presente invención es útil particularmente para inmunizar un individuo contra los patógenos que afectan las células y que no se encapsulan, tal como virus y procariotas, tal como gonorrea, listeria y shigella. Además, la presente invención también es útil para inmunizar un individuo contra patógenos protozoarios que incluyen una etapa en el ciclo de vida, en donde son patógenos intracelulares. Como se usa aquí, el término "patógeno intracelular" significa que se refiere a un virus u organismo patogénico que, al menos en parte de su ciclo reproductivo o de vida, existe dentro de una célula huésped y en donde se producen o causa que se produzcan, proteínas patógenas. La Tabla 2 proporciona una lista de algunas de las familias y géneros virales para los cuales pueden usarse las vacunas de acuerdo con la presente invención. Las construcciones de ADN que comprenden las secuencias de ADN que codifican los péptidos que comprenden al menos un epítope idéntico o sustancialmente similar a un epítope expresado en un antígeno patógeno, tal como los antígenos listados en las tablas, son útiles en vacunas. Además, la presente invención también es útil para inmunizar un individuo contra otros patógenos que incluyen protozoarios procariotas y eucariotas, así como parásitos multicelulares tal como los listados en la Tabla 3.

Para producir una vacuna genética para proteger contra la infección patógena, el material genético que codifica las proteínas inmunogénicas contra el cual puede montarse una respuesta inmune protectora, debe incluirse en una construcción genética como la secuencia de codificación para el blanco. Si el patógeno infecta int racelularment e, para el que la presente invención es particularmente útil, o ext raceluiarmente, es improbable que todos los antígenos patógenos obtendrán una respuesta protectora. Debido a que el ADN y ARN son relativamente pequeños y pueden producirse relativamente fácilmente, la presente invención proporciona la ventaja adicional de permitir la vacunación con múltiples antígenos patógenos. La construcción genética usada en la vacuna genética puede incluir el material genético que codifica muchos antígenos patógenos. Por ejemplo, varios genes virales podrían incluirse en una sola construcción, por lo que se proporcionan múltiples blancos.

Las Tablas 2 y 3 incluyen listas de algunos agentes y organismos patogénicos para los cuales pueden prepararse las vacunas genéticas para proteger un individuo de la infección por estos. En algunas modalidades preferidas, los métodos para inmunizar un individuo contra un patógeno se dirigen contra VIH, HTLV o VHB.

Otro aspecto de la presente invención proporciona un método para conferir una respuesta inmune protectora basada ampliamente contra células hiperproliferativas que son características en las enfermedades hiperproliferativas y a un método para tratar individuos que sufren de enfermedades hiperproliferativas. Como se usa aquí, el término "enfermedades hiperproliferativas" significa que se refiere a las enfermedades y padecimientos caracterizados por la hiperproliferación de células. Ejemplos de enfermedades hiperproliferativas incluye todas las formas de cáncer y psoriasis.

.Se ha descubierto que la introducción de una construcción genética que incluye una secuencia nucleótida que codifica una "célula de hiperprol i feración" inmunogénica, asociada a la proteína en las células de un individuo, resulta en la producción de las proteínas en las células vacunadas de un individuo. Como se usa aquí, el término "proteína asociada hiperproliferativa" significa que se refiere a proteínas que se asocian con una enfermedad hiperproliferativa. Para inmunizar contra las enfermedades hiperproliferativas, una construcción genética que incluye una secuencia nucleótida que codifica una proteína que se asocia con una enfermedad hiperproliferativa se administra a un individuo.

Para que la proteína asociada hiperproliferativa sea un blanco inmunogénico efectivo, debe ser una proteína que se produzca exclusivamente o a altos niveles en las células hiperproliferativas comparado con las células normales. Los antígenos blanco incluyen tales proteínas, fragmentos de las mismas y péptidos que comprenden al menos un epítope encontrado en tales proteínas. En algunos casos, una proteína asociada hiperproliferativa es el producto de una mutación de un gen que codifica una proteína. El gen mutado codifica una proteína que es casi idéntica a la proteína normal, excepto que tiene una secuencia aminoácido ligeramente diferente que resulta en un epítope diferente no encontrado en la proteína normal. Tales proteínas blanco incluyen las que son proteínas codificadas por oncogenes tal como myb , myc , fyn , y el gen de t ranslocalización bcr/abl , ra s , src , P53, n e u , trk y EGRF. Además de los productos de oncogenes como antígenos blanco, las proteínas blanco para los tratamientos anticáncer y los regímenes protectores incluyen regiones variables de anticuerpos hechas por linfomas de células B y regiones variables de receptores de células T de linfomas de células T que, en algunas modalidades, también se usan antígenos blanco para la enfermedad autoinmune. Otras proteínas asociadas con tumores pueden usarse como proteínas blanco tal como proteínas que se encuentran a niveles superiores en células tumorales, que incluyen l proteína reconocida por el anticuerpo monoclonal 17-1A las proteínas de enlazamiento de folato.

Mientras que la presente invención podria usarse para inmunizar a un individuo contra una o más de varias formas de cáncer, la presente invención es particularmente útil para inmunizar profilácticamente un individuo que está predispuesto a desarrollar un cáncer particular y que ha tenido cáncer y es por lo tanto, susceptible a una recaída. Los desarrollos en la genética y la tecnología, así como epidemiología, permiten la determinación e la verificación de probabilidad y riesgo para el desarrollo de cáncer en el individuo. Usando el cribado genético y/o la historia de muerte familiar, es posible predecir la probabilidad de que un individuo particular tenga desarrollado cualquiera de los tipos de cáncer.

Similarmente, los individuos que ya han desarrollado cáncer y que se han tratado para retirar el cáncer o están de otra manera, en remisión, son particularmente susceptibles a recaída y re-ocurrencia-. Como parte de un régimen de tratamiento, tales individuos pueden inmunizarse contra el cáncer que se les ha sido diagnosticado para combatir una reaparición. De esta manera, una vez que se conoce que un individuo ha tenido un tipo de cáncer y está en riego de una recaída, puede inmunizarse para preparar a su sistema inmune para combatir cualquier aparición futura del cáncer.

La presente invención proporciona un método para tratar a individuos que sufren de enfermedades hiperproliferativas. En tales métodos, la introducción de las construcciones genéticas sirve como un inmunot erapéut ico directamente y promueve al sistema inmune del individuo a combatir las células hiperproliferativas que producen la proteína blanco.

La presente invención proporciona un método para tratar a individuos que sufren de enfermedades y padecimientos autoinmunes confiriendo una respuesta inmune protectora basa ampliamente contra blancos que se asocian con la autoinmunidad incluyendo receptores celulares y células que producen anticuerpos "auto"-dirigidos .

Las enfermedades autoinmunes mediadas por células T incluyen artritis reumatoide (AR) , esclerosis múltiple (EM) , síndrome de Sjogren, sarcoidosis, diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM), tiroiditis autoinmune, específicas de TCRs que se involucran en la enfermedad. Estos TCRs incluyen Vß-7 y Va-10. De esta manera, la vacunación con una construcción de ADN que codifica al menos una de estas proteínas obtendrá una respuesta inmune que formará el blanco con las células T involucradas en EM. Ver: Wucherpfennig, K. ., et a l . , 1990 Sci en ce '248:1016-1019; Oksenberg, J.R., et a l . r 1990 Na t ure 345:344-346; cada una de las cuales se incorpora aquí por referencia .

En escleroderma, se han caracterizado varias regiones específicas de TCRs que se involucran en las enfermedades. Estos TCRs incluyen Vß-6, Vß-8, Vß-14 y Va-16, Va-3C, Va- 7, Va-14, Va-15, Va-16, Va-28 y Va-12. De esta manera, la vacunación con una construcción de ADN que codifica al menos una de estas proteínas obtendrá una respuesta inmune que formará el blanco con las células T involucradas en escleroderma .

Para tratar a pacientes que sufren de una enfermedad, autoinmune mediada por células T, particularmente para las que la región variable del TCR ya sea ha caracterizado, puede realizarse una biopsia sinovial. Las muestras de las células T presentes, pueden tomarse y la región variable de estos TCRs se identifica usando las técnicas estándares. Las vacunas genéticas pueden prepararse usando esta información.

Las enfermedades autoinmunes mediadas por células B incluyen lupus (SLE), enfermedad de Grave, miastenia gravis, anemia hemolítica autoinmune, trombocitopenia autoinmune, asma, crioglobulinemia , esclerosis biliar primaria y anemia perniciosa. Cada una de estas enfermedades se caracteriza por anticuerpos que se enlazan a antígenos endógenos e inician la cascada inflamatoria asociada con enfermedades autoinmunes. La vacunación contra la región variable de anticuerpos producirá una respuesta inmune que incluye CTLs para eliminar las células B que producen el anticuerpo.

Para tratar a pacientes que sufren de una enfermedad autoinmune mediada por células B, debe identificarse la región variable de los anticuerpos involucrados en la actividad autoinmune. Puede realizarse una biopsia y pueden tomarse las muestras de los anticuerpos presentes en el sitio de inflamación. La región variable de los anticuerpos puede identificarse usando las técnicas estándares. Las vacunas genéticas pueden prepararse usando esta información.

En el caso de SSL, un antígeno se cree que es ADN. De esta manera, en pacientes que se inmunizan contra SSL, su suero puede cribarse para los anticuerpos anti-ADN y puede prepararse una vacuna que incluye construcciones de ADN que codifican la región variable de tales anticuerpos anti-ADN encontrados en el suero.

Son bien conocidas las características estructurales comunes entre las regiones variables de ambos TCRs y los anticuerpos. La secuencia de ADN que codifica un TCR particular o anticuerpo, puede encontrarse en general siguiendo los métodos bien conocidos, tal como los descritos en Kabat, et a l . , 1987 Sequ en ce of Pro t eins of Immu.n o l og i ca l In t eras t U.S. Department of Health and Human Services, Bethesda MD, que se incorpora aquí por referencia. Además, un método general para la clonación de regiones variables de anticuerpos puede encontrarse en Chaudhary, V.K., et a l . , 1990 Pro c . Na t l . Aca d . Sci . USA 87:1066, que se incorpora aquí por referencia.

Además del uso de las formas expresadas de la secuencia que codifica la proteína inmunomoduladora para mejorar las vacunas genéticas, la presente invención se refiere a vacunas activas atenuadas mejoradas y vacunas mejoradas que usan vectores recombinantes para liberar los genes extraños que codifican los antígenos. Ejemplos de vacunas activas atenuadas y las que usan vectores recombinantes para liberar los antígenos extraños se describen en las Patentes U.S. Nos. 4,722,848; 5,017,487 5, 077, 044 5,110,587; 5,112,749; 5,174,993; 5,223,424 5, 225, 336 5,240,703; 5,242,829; 5,294,441; 5,294,548 5, 310, 668 5,387,744; 5,389,368; 5,424,065; 5,451,499 5, 453, 634 5,462,734; 5,470,734 y 5,482,713, que se incorporan cada una por referencia. Las construcciones del gen se proporcionan, las cuales incluyen la secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora se enlaza operablemente a las secuencias reguladoras que pueden funcionar en la vacuna para efectuar la expresión. Las construcciones del gen se incorporan en las vacunas activas atenuadas y las vacunas recombinantes . para producir vacunas mejoradas de acuerdo a la invención.

La presente invención proporciona un método mejorado para inmunizar a individuos que comprende la etapa de liberar las construcciones del gen a las células de los individuos, como parte de las composiciones de vacuna que incluyen vacunas de ADN, vacunas activas atenuadas y vacunas recombinantes. Las construcciones del gen comprenden una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora y que se enlaza operablemente a las secuencias reguladoras que pueden funcionar en la vacuna para efectuar a expresión. Las vacunas mejoradas resultan en una respuesta inmune celular mejorada.

Otro aspecto de la presente invención se refiere al uso de GM-CSF o una molécula de ácido nucleico que codifica GM-CSF o ambas en combinación con una vacuna de ADN para la cual es particularmente deseable una respuesta de anticuerpo fuerte o respuesta de célula T auxiliar. Un ejemplo de tal vacuna es una vacuna contra hepatitis B. Otros ejemplos incluyen patógenos y alérgenos extracelulares. La administración de GM-CSF o una molécula de ácido nucleico que codifica GM-CSF o ambas en combinación una vacuna de ADN, también es útil para los individuos vacunados identificados que son inmunocomprometidos .

Otra modalidad de la presente invención se refiere al uso de anticuerpos de ant i-quimiocina para tratar pacientes que tienen enfermedades autoinmunes. Las enfermedades autoinmunes se expusieron anteriormente. Los anticuerpos de anti-quimiocina incluyen anticuerpos específicos para MCP-1, MlP-la, MlP-lß, IL-8 o RANTES. Los anticuerpos de anti-quimiocina podrían administrarse a pacientes que se sospecha o que sufren de algunas enfermedades en cantidades terapéuticamente efectivas para reducir o aliviar los síntomas.

Las composiciones farmacéuticas para tratar la enfermedad autoinmune comprenden un anticuerpo específico .para una quimiocina y un vehículo farmacéuticamente aceptable. De acuerdo a las modalidades preferidas, las composiciones son inyectables. Las composiciones inyectables libres de particulados, libres de pirógeno, estériles, comprenden uno o más anticuerpos específicos para una quimiocina y un vehículo o vehículo de inyección farmacéuticamente aceptable.

Los anticuerpos se hacen de acuerdo a los métodos convencionales para producir anticuerpos monoclonales. El vehículo se selecciona de los bien conocidos para los expertos en el arte. Un ejemplo de un vehículo es una solución salina estéril.

Los expertos en el arte pueden producir anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente a MCP-1, MIP-la, MlP-lß, IL-8 o RANTES usando las técnicas estándares y los materiales iniciadores fácilmente disponibles. Las técnicas para producir anticuerpos monoclonales se exponen en Harlow, E. and D. Lañe, (1988) ANTIBODIES : A Labora t ory Ma n ua l , Cold Spring Harbor Laboratory NY, que se incorpora aquí por referencia, proporcionan la guía detallada para la producción de hibridomas y anticuerpos monoclonales que se enlazan específicamente a proteínas blanco.

Brevemente, la quimiocina se inyecta en los ratones. El bazo del ratón se retira, las células del bazo se aislan y fusionan con células de ratón inmortalizadas. Las células híbridas o hibridomas, se cultivan y se seleccionan las células que secretan anticuerpos. Los anticuerpos se analizan y, si se encuentran que se enlazan especí icamente a la proteína de interés, el hibridoma que los produce se cultiva para producir un suministro continuo de anticuerpos específicos de antígeno.

De acuerdo a la presente invención, los anticuerpos específicos para MCP-1, MlP-la, MlP-lß, IL-8 o RANTES podría usarse para tratar una enfermedad autoinmune. Por lo tanto, MCP-1, MlP-la, MlP-lß, IL-8 o RANTES se usan para generar hibridomas. Los genes que codifican estas proteínas son ampliamente conocidos y fácilmente disponibles para los expertos en el arte. Así, un experto en el arte puede hacer anticuerpos útiles para la práctica de la presente invención. Además de anticuerpos de roedores, la presente invención se refiere a anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos Fabs y quiméricos y Fabs que se enlazan a MCP-1, MlP-la, MlP-lß, IL-8 o RANTES, que podrían producirse rutinariamente por los expertos en el arte.

Los expertos en el arte pueden identificar fácilmente a individuos que sufren de o son susceptibles a -una enfermedad autoinmune.

La composición podría incluir componentes adicionales para hacerlos más efectivos. Por ejemplo, una composición de la invención podría comprender múltiples anticuerpos de anti-quimiocina que incluyen anticuerpos específicos para diferentes quimiocinas y anticuerpos específicos para diferentes epítopes de la misma quimiocina.

Aproximadamente, podrían administrarse 5 µg a 5000 mg del anticuerpo. En algunas modalidades preferidas, podrían administrarse 50 µg a 500 mg del anticuerpo. En otras modalidades preferidas, podrían administrarse 500 µg a 50 mg del anticuerpo. En una modalidad preferida, se administra 5 mg del anticuerpo.

Las composiciones podrían administrarse por una ruta apropiada tal como, por ejemplo, administración oral, íntranasal, intramuscular, intraperitoneal o subcutánea.

En algunas modalidades, se prefiere la administración intravenosa .

Subsecuente la administración inicial los individuos podrían estimularse por re-administración. En algunas modalidades, se realizan administraciones múltiples .

EJEMPLOS E emplo 1 Introducción Para examinar molecularmente los papeles específicos de las quimiocinas en la respuesta inmune, se clonó ADNsc que codifican la a-quimiocina IL-8 así como ADNsc que codifican las ß -quimiocinas MlP-la, RANTES y MCP-1 individualmente en los vectores de expresión y se co-inmunizan junto con inmunógenos de ADN que codifica la cubierta VIH-1 y proteínas gag/pol. Usando estas construcciones de vacunas de ADN como modelos de antígeno, se examinaron los papeles específicos de la expresión de los genes de quimiocina que juegan en el desarrollo de las respuestas inmunes a través del análisis de las respuestas inmunes mediadas celulares y humoral específico de antígeno inducidas después de tal inmunización. Se observó que las quimiocinas tuvieron papeles específicos identificables en la activación y la modulación de las respuestas inmunes específicas de antígeno.

Resultados Inducci ón de quimi ocina s por va cuna ci ón de ADN Los ratones se inmunizaron con 50 µg de pCDNA3 (control), pCEnv o PCGag/pol. Después de dos semanas, los ratones se sacrificaron, sus bazos se cosecharon y se aislaron sus linfocitos. Estas células se estimularon in vi tro por estimulación específica de antígeno (usando vacunas recombinantes fijas infectadas por células estimuladoras) durante 5 días. Se colectó el sobrenadante del cultivo de las células efectoras y se probaron para la liberación de las quimiocinas MlPl-a, MlPl-ß y RANTES. Se observó que la inmunización de ADN con pCEnv o pCGag/pol indujo los niveles superiores significativos de expresión de las ß -quimiocinas MlPl-a, MlPl-ß y RANTES sobre los del vector de control. El cambio estuvo presente tan cerca como 2 semanas después de la primera inmunización, sugiriendo que las ß quimiocinas podrían ser respuestas inmunes moduladoras i n vi vo . Para determinar los efectos de las quimiocinas sobre las respuestas específicas de antígeno, posteriormente se investigó sus efectos en las respuestas inmunes inducidas por la vacuna de ADN.

Cons tru cci ón de l os ca se tes de expresi ón de quimi ocina Los genes para las quimiocinas IL-8, MlPl-a, MCP-1 y RANTES se clonaron individualmente en los vectores de expresión del plásmido pCDNA3 usando los métodos descritos en Kim, J.J., D.B. Weiner (1997) Springer Sem Immunopathol 19 174-195; Kim, J.J., et al. (1997) Na t ure Biot. 1 5 , 641-645; and Kim, J.J., et al. (1997) J. Immunol . 1 58 , 816-826, que se incorporan cada una aquí por referencia. Estos casetes de expresión de quimiocina se verificaron por análisis de secuenciación de la inserción completa (incluyendo las secuencias de flanqueo 5' y 3') . Además, estas construcciones de quimiocina se transfirieron in vi t ro en células RD y la expresión de estas construcciones se verificaron por inmunoprecipitación usando los anticuerpos relevantes o por ELISA de quimiocina. Las construcciones de expresión para IL-8, MlPl-a, MCP-1 y RANTES, también se usaron como vacunas y se inmunizaron en ratones. Se determinó por la técnica de expresión i n vi vo descrita en materiales y métodos, que estas construcciones expresaron sus quimiocinas codificadas in vi vo en el tejido muscular en el ratón.

IL-8 es un inductor fuerte de la respues ta a uxi l iar Los efectos de las varias quimiocinas sobre las respuestas • inducidas por vacunas se analizaron individualmente. Los ratones inmunizados con el antisuero de pCEnv y pCEnv + IL-8 se colectaron y analizaron para las respuestas de anticuerpos específicas contra la proteína VIH-1 gpl20 por ELISA. Se midió la titulación del anticuerpo específico gpl20 del suero colectado a las semanas 0, 2, 4 y 6 de la inmunización post-ADN. A la dilución 1:28, el suero de los grupos inmunizados, con pCEnv+IL-8 mostró la respuesta del anticuerpo contra la proteína gpl20 que fue mayor que el del grupo inmunizado con pCEnv sola. Un resultado similar se observó con los grupos inmunizados con pCGag/pol. Además, se determinaron las sub-clases de IgGs específicas gpl20 inducidas por la co-administración con los genes IL-8. La producción del tipo IgGl se induce por las citocinas de tipo Th2, mientras que la producción del tipo IgG2a se induce por las citocinas de tipo Thl. Se midieron las relaciones relativas de IgGl a IgG2a (Th2 a Thl) . El grupo inmunizado pCEnv tuvo una relación IgGl a IgG2a de 1.3. Por otro lado, la co-inyección con pCEnv+IL-8 disminuyó la relación relativa a 0.9, indicando un cambio en la respuesta de tipo Thl. IL-8 por lo tanto, influencia la calidad y la cantidad de la respuesta específica del antígeno.

También se examina el efecto de la expresión IL-8 en la respuesta proliferativa de la célula auxiliar T. La coexpresión IL-8 con los inmunógenos VIH-1 (pCEnv o pCGag/pol) resultó en un nivel dramático de las respuestas proliferativas de células T auxiliares específicas de antígeno. El aumento en la proliferación fue entre 4 y 6 veces, un cambio significativo en las respuestas específicas de antígeno. Además, también se investigó el 'efecto de la co-expresión de IL-8 en la respuesta CTL inducida. Un nivel de origen de muerte específica se observó de los animales de control, mientras que los animales inmunizados sólo con pCEnv mostraron un nivel pequeño, pero consiste de la respuesta CTL. La coadministración IL-8 no tuvo ningún efecto mejorador sobre las respuesta CTL específica de antígeno. Los resultados CTL similares se observaron en la co-inmunización pCGag/pol + IL-8.

Las citocinas juegan un papel clave en la dirección y blanco de células inmunes durante la respuesta inmune. Por ejemplo, IFN-? se involucra intrínsecamente en la regulación de las respuestas inmunes citotóxicas mediadas por células T, mientras que 11-4 juega un papel dominante en las respuestas inmunes mediadas por células B. TNF-a se produce por los macrofagos y monocitos activados, neutrófilos, linfocitos activados y células NK y se ha sugerido que juegan un papel pivotal en la regulación de la síntesis de otras citocinas proinflamatorias. Se analiza el sobrenadante de las células efectoras estimuladas i n vi t ro para la prueba CTL y se prueban para la liberación de las citocinas IFN-?, IL-4 y TNF-a. Se encuentra que la expresión de IL-8 aumentó el nivel de IFN-? sólo ligeramente, pero no afectó los niveles de las citocinas IL-4 y TNF-a. Esto es bastante sorprendente conforme el efecto dramático de la co-liberación de IL-8 en que las respuestas humorales podrían haberse esperado que tienen un efecto notorio sobre la IL-4. Sin embargo, esto no se observó.

MlPl -a es un fuerte indu c tor de l a respues ta del an ti cuerpo La co-expresión de MIP1 exhibió un efecto más drástico que IL-8 en la inducción de la respuesta humoral específica de antígeno. La co-inmunización de PCEnv+MIPl resultó en un mejoramiento dramático de la respuesta del anticuerpo de cubierta específica. Un resultado similar se observó con los grupos inmunizados con PCGag/pol. Se determinaron las relaciones relativas de IgGl a IgG2a después de la co-administración con pCEnv+MIPl-a. El grupo pCEnv inmunizado tuvo una relación IgGl a IgG2a de 1.3. Por otro lado, la co-inyección con pCEnv+MIPl-a disminuyó la relación relativa a 1.7, indicando un cambio en la respuesta de tipo Th2. La co-expresión MlPl-a con inmunógenos VIH-1 (pCEnv o pCGag/pol) resultó en el mejoramiento de las respuestas proliferativas de células T auxiliares específicas de antígeno. Por el contrario, la inmunización con MlPl-a tuvo efecto mínimo sobre las respuestas CTL específicas de antígeno o la inducción de citocinas. Nuevamente, como se observó en el análisis de IL-8, los efectos sobre la producción de citocina, no se observó efecto en los niveles IL-4.

RANTES induce Thl a sí como l a s respues ta s CTL Después se examinaron los efectos de la co-liberación de RANTES en las respuestas inmunes inducidas por la vacuna. A diferencia de IL-8 o MlPl-a, la co-expresión de RANTES con pCEnv no mejoró la respuesta de anticuerpo de cubierta específica VIH-1. Además, la co-inmunización pCEnv-RANTES no tuvo ningún efecto sobre la relación IgGl-IgG2a cuando se compara con el grupo inmunizado con pCEnv sólo. En contraste con las respuestas del anticuerpo, la co-vacunación de RANTES con los inmunógenos VIH-1 (pCEnv o pCGag/pol) resultó en el cambio significativo de las respuestas proliferativas de células auxiliares T específicas de antígeno. Además, se observaron expresiones de nivel dos veces superiores de las citocinas Thl IFN-? y TNF-a del grupo co-administrado con pCEnv+RANTES . A diferencia de la co-inyección con pCEnv+IL-8 o pCEnv-MIP-la que resultó en un efecto mínimo en la actividad CTL, un cambio más drástico en la muerte específica de los blancos afectados con la vacuna (vMN462) que expresa la cubierta VIH-1, se observó después de la co-inyección con pCEnv+RANTES . Se observó más de 36% de lisis específica de las células blanco después de la co-inyección con pCEnv+RANTES a una relación de efector a blanco (E:T) de 50 : 1. Similarmente, los ratones inmunizados con pCGag/pol+RANTES resultaron en un mejoramiento significativo de la lisis CTL específica de antígeno de los blancos afectados con la vacuna (vVKl) que expresa VIH-1 gag/pol. La co-liberación de RANTES pareció polarizar las respuestas resultantes contra un fenotipo de tipo Thl como no se observó nuevamente el efecto sobre IL-4.

MCP-1 induce la s respues ta s CTL Después se observaron las propiedades adyuvantes MCP-1 ADNc. MCP-1 pareció que tenía un efecto mínimo sobre el perfil de enlazamiento de anticuerpo específico inducido por la inmunización pCEnv. Además, la co-expresión MCP-1 con inmunógenos de VIH-1 (pCEnv o pCGag/pol) tuvo mejoramiento positivo, pero relativamente menor (dos veces) de las respuestas proliferativas de células auxiliares T específicas de antígeno. Se determinaron las relaciones relativas de IgGl a IgG2a después de la coadministración con pCEnv+MCP-1. El grupo inmunizado pCEnv tuvo una relación de IgGl a IgG2a de 1.3. Por otro lado, la co-inyección con pCEnv+MCP-1 disminuyó la relación relativa a 1.0, indicando un cambio a la respuesta de tipo Thl. Un aumento más drástico en la muerte específica se observó después de la co-inyección con pCEnv+MCP-1. Más de 36% de lisis específica de las células blanco se observó después de la co-inyección con pCEnv+MCP-1 a una relación de 50:1 de efector a blanco (E:T) . Similarmente, los ratones inmunizados con pCGag/pol-MCP-1 resultó en un mejoramiento significativo de la lisis CTL específica de antígeno de blancos de expresión VIH-1 gag/pol. El nivel de liberación de IFN-? por los ratones inmunizados con pCEnv+MCP-1 fue significativamente mayor los de los grupos pCEnv inmunizados o de control. Nuevamente, el nivel de .IL-4 liberado de todos los grupos fue similar. Además, el nivel de liberación de TNF-a por el grupo inmunizado pCEnv+MCP-1 fue significativamente mayor que los de los grupos pCEnv inmunizados o de control. Estos resultados de liberación de citocinas soportan los resultados CTL que elucidan los papeles de la MCP-1 en la activación de CD8+CTL.

De t ermina ci ón de l a res tri cci ón CD8 en l a respues ta CTL , Para determinar si el aumento en la respuesta CTL por vía de la co-expresión en MCP-1 y RANTES se restringió a las células T CD8+, las pruebas CTL se realizaron usando un péptido de cubierta VIH-1 ( RIHIGPGRAFYTTKN) que ha mostrado que es un epítope específico para la CTL restringida 1 de clase MHC para ratones balb/c. Los ratones recibieron dos inmunizaciones de 50 µg de cada construcción de ADN separadas por dos semanas y sus bazos se cosecharon una semana después de la segunda inmunización. La prueba CTL se realizó sobre los esplénocitos después de .la estimulación in vi t ro con péptidos de cubierta específica. Se observó un mejoramiento significativo de la respuesta CTL después de la co-inyección con MCP-1 y RANTES a 35% y 26% de muerte específica a una relación E:T de 50:1, respectivamente. Se verificó esta observación midiendo la actividad CTL después de la remoción de las células T CD8+ de la población de células efectoras por lisis complementaria. La remoción de células T CD8+ resultó en la supresión del mejoramiento de la CTL específica de antígeno observada después de co-inyecciones con MCP-1 y RANTES. Estos resultados indican que el mejoramiento de la actividad cítotóxica fue dependiente de células T CD8+ y restringidas de clase 1.

Mej orami en to de la expresi ón de quimi ocina Fue importante determinar los efectos, si los hubo, de los inmunógenos adyuvantes que quimiocina específicos sobre la producción de quimiocina misma. Se examinó la expresión de quimiocinas MlPl-a, MlPl-ß, RANTES y MCP-1 por las células estimuladas colectadas de los animales inmunizados. La co-inyección de quimiocina se moduló por la producción de quimiocina en patrones específicos de quimiocina. Se hicieron varias observaciones importantes.

Además, se observó que la co-inmunización con genes de quimiocina resultó en la expresión aumentada de quimiocinas por las células estimuladas. Por ejemplo, se observó que la expresión MlPl-a podría mejorarse dramáticamente por la co-inmunización con pCEnv+MIPl-a sobre el nivel expresado por la inmunización pCEnv sola. Además, se encontró que la expresión MlPl-ß se mejoró dramáticamente por la inmunización pCEnv+MCP-1 y PCEnv+RANTES, los dos inductores más significativos de las respuestas CTL. Además, las co-inmunizaciones pCEnv+MCP-1, PCEnv+MCP-1 y pCEnv+RANTES resultaron en el mejoramiento significativo de la expresión RANTES por las células estimuladas. Finalmente, la expresión de MCP-1 fue la más alta con las co-inmunizaciones pCEnv+MIPl-a y pCEnv+MCP-1.

Discusión La iniciación de la inmunidad de las reacciones inflamatorias es un proceso complejo que involucra una expresión fuertemente coordinada de las moléculas de adhesión celular, citocinas y quimiocinas. Las quimiocinas son especialmente importantes en la regulación molecular del tránsito de leucocitos de los vasos a los sitios periféricos de la defensa del huésped. La superfamilia de las quimiocinas consiste de cualquier arreglo de aproximadamente 20 proteínas relacionadas. Las quimiocinas se dividen ampliamente en tres familias, C-X-C(a), C-C(ß) y C(?), con base en la presencia y posición de los residuos de cisteína conservados. En los miembros de la familia a, las primeras dos cisteínas se separan por otro aminoácido, mientras que las de la familia ß se colocan próximas una con otra. Sólo dos miembros de la familia ? se han identificado hasta ahora, y ambos de estos contienen una en lugar de dos cisteínas en su término N.

Los miembros de cada subfamilia tienen actividades únicas, así como de trans lapación . Mientras que las funciones fisiológicas y patológicas exactas no se han identificado claramente hasta ahora, ciertas generalidades simplificat ivas pueden hacerse de la literatura. Se ha reportado que, en general, los miembros de la familia C-X-C son quimioatrayentes y activadores para los leucocitos polimorfonucleares que incluyen neutrófilos, eosinófilos y basofilos. Por el contrario, los quimiocinas C-X-C, IL-8 e IP-10, que son qimiot áct icas reporteros a linfocitos T y quimiocinas C-C, MCP-1, MPC-3, RANTES y MlP-la w que también son quimiotácticas a los basofilos. En general, la función de las quimiocinas parece que es recuperar y activar los leucocitos en el sitio de inflamación.

Además de ;us funciones en las respuestas inflamatorias e inmunes, algunas quimiocinas juegan un papel crítico en la transmisión y progresión de virus VIH-1 y 2 responsables para el SIDA. Se ha anticipado durante una década que el enlazamiento de la glicoproteína de cubierta de VIH gpl20 a CD4 no es suficiente para la fusión viral y la entrada, que sugiere el requerimiento de un cofactor de superficie celular adicional para la infección por VIH. Los estudios recientes han identificado que los co-receptores requeridos para la fusión de la célula T trópica y los virus trópicos de macrofagos con sus células blanco son CXCR-4 y CCR-5, respectivamente.

CXCR-4, también se conoce como fusión o LESTR, se descubrió originalmente como un receptor orfano con similaridad estructural para los receptores de quimiocina. CXCR-4 se identificó subsecuentemente como un cofactor necesario para la entrada de los virus VIH trópicos de células T en células CD4+. La ß-quimiocina SDF-1 es un ligando para CXCR-4 y un fuerte inhibidor de la infección por cepas de VIH-1 trópicas de células T. Similarmente, las ß-quimiocinas MlP-la, MlP-lß y RANTES son ligandos naturales para CCR-5 y son los principales factores supresores de VIH producidos por células T CD8+ para aislados de VIH, trópicos de macrofagos, pero no para trópicos de células T.

En estos estudios, un nivel significativo de la expresión de quimiocina se observó después de la inyección con un inmunógeno de ADN. Estos resultados implican sus papeles potenciales como activadores y reguladores importantes de las respuestas inmunes. Para elucidar los papeles específicos de estas quimiocinas en la inducción y modulación inmune, se utilizaron los casetes de expresión de ADN de quimiocina y co-liberación como un modelo de liberación de antígeno. La co-inmunización de ADN es un modelo apropiado para investigar las funciones ín vi vo de las quimiocinas, debido a que las vacunas de ADN inducen las respuestas inmunes humorales y celulares por vía de las rutas MCH de clase I Y II. Además, se ha mostrado que las respuestas inmunes específicas de antígenos para vacunas de ADN pueden modularse por la co-inyeccíón de la molécula co-est imuladora y los genes de citocina con casetes de inmunógeno de ADN. Así, se clonó y la co-inmunización de los vectores de expresión de quimiocina con inmunógenos de ADN de VIH-1, y se examinaron los efectos de la expresión de quimiocina sobre la activación inmune. Se observó que la a-quimiocina IL-8 y las ß-quimiocinas MlP-la, RANTES y MCP-1 tuvieron papeles específicos, identificables en la activación de las respuestas inmunes específicas de antígenos.

Por e.jemplo, la IL-8 es un factor quimiotáctico para los neutrófilos, induciéndolos para salir de' la corriente sanguínea y emigrar en los tejidos circundantes. Se observó que IL-8 fue un fuerte inductor de las células T CD4+, indicado por las respuestas proliferativas de células auxiliares T fuertes, así como las respuestas de anticuerpos. La co-expresión IL-8 también moduló el cambio de las respuestas inmunes al tipo Thl, indicado por la reducción de loa relación de IgGl a IgG2a y la expresión mejorada de IFN-?. Por otro lado, la co-administración de IL-8 no tuvo efecto observable sobre las células T CD8+, dado que no tuvo ningún efecto de mejoramiento sobre la respuesta CTL.

La MlP-la puede ser quimioatrayente y desgranular los eosinófilos. La MlP-la también induce la liberación de histamina de los basofilos y los mastocitos, y es un factor quimiotáctico para los basofilos y las células B. Estos reportes soportan la observación de que la MlP-la tuvo el efecto más grande sobre las respuestas de anticuerpos. Además, la MlP-la también fue un fuerte inductor de las células T CD4+, con buenas respuestas proliferativas de células T auxiliares. La co-expresión de MlP-la también moduló el cambio de las respuestas inmunes al tipo Th2, indicado por el aumento de la relación de IgGl a IgG2a. Por el contrario, la co-inmunización de MlPl-a tuvo el mínimo efecto sobre la respuesta de las células T CD8+ .

A diferencia de los efectos de IL-8 y MlP-la, la coinmunización de RANTES tuvo el mínimo efecto sobre las respuestas de anticuerpos. RANTES es un monocito quimioatrayente . Además, RANTES puede quimioatraerse por las células T de memoria CD4+/CD45RO+ no estimuladas y las células T CD4+ y CD8+ estimuladas. Se observó la capacidad de RANTES para quimioatraer células T CD4+ y CD8+ al sitio "de inmunización de ADN que sirvió de un papel importante para inducir las respuestas de proliferación de auxiliares T y respuestas CTL. La activación mejorada de las respuestas Thl se soportó por la expresión aumentada de las citpcinas Thl IFN-? y TNF-a. El alto nivel de las respuestas CTL inducido por la expresión de RANTES, se determinó que era la célula T CD8+ y restringida de clase I dependiente.

Como un factor quimiotáctico potente para los monocitos, la MCP-1 se piensa que es una de las quimiocinas más importantes para las enfermedades inflamatorias crónicas. La MCP-1 induce que los monocitos emigren desde la corriente sanguínea hasta llegar estar en los macrofagos del tejido. La MCP-1 se encontró que quimioatraía a los linfocitos T del subgrupo de memo-ria activado. Entre todas las quimiocinas examinadas, la MCP-1 es el activador más potente de CD8+CTLs. El mejoramiento de las respuestas de CTL inducidas por la expresión de MCP-1 se determinó que era célula T CD8+ y restringida de clase 1 dependientes. Los resultados CTL mejorados se soportan mediante la expresión mejorada para las citocinas Thl IFN-? y TNF-a y la reducción de la relación IgGll a IgG2a. A diferencia de RANTES, MCP-1 tuvo efecto positivo, pero moderado en las respuestas proliferativas de células auxiliares T. Como RANTES, la co-administración de MCP-1 tuvo. efecto mínimo sobre las respuestas del anticuerpo. Esta comparación destaca que la inducción de las respuestas humorales, auxiliares T y citotóxicas T podrían modularse independientemente de uno con otro.

Además de sus efectos directos sobre las respuestas inmunes, la co-expresión de los genes de quimiocina resulta en la expresión aumentada de la manera autócrina. Por ejemplo, se observa que la expresión de MlPl-a podría mejorarse dramáticamente por la co-inmunización con pCEnv+MIPl-a sobre el nivel expresado por la inmunización pCEnv sola. Los aumentos similares en RANTES se observaron de la co-liberación de RANTES y MCP-1 disminuida.

Además, la co-expresión de la quimiocina también resultó en la expresión mejorada de otras quimiocinas . Estos resultados implican que estas quimiocinas no sólo tienen papel directo en las respuestas inmunes moduladoras, sino que actúan para controlar la producción de otras quimiocinas.

Una observación importante fueron los papeles de las quimiocinas RANTES y MCP-1 que juegan en la inducción de la expresión de TNF-a. TNF-a se produce por los macrofagos, monocitos, neutrófilos activados, linfocitos activados y células NK, mientras que la TNF-ß se produce por los linfocitos. La TNF-a también está implicada en el choque séptico después de la infección por bacterias Gram negativas y en artritis reumatoide. Además, TNF-a juega un papel primordial en la regulación de la síntesis de otras citocinas proinflamatorias. Dados los papeles críticos de las TNF-a en varios alimentos, existen esfuerzos principales en la reducción de los niveles de TNF-a in vi vo como el tratamiento potencial para las condiciones, tal como artritis reumatoide. En los experimentos, se observó que la co-expresión de RANTES o MCP-1 resultó en la expresión mejorada de TNF-a. Estos resultados implican que inhibiendo RANTES y MCP-1 podrían componer una estrategia relevante a la curva de expresión de TNF-a in VI VO .

Es de interés que el fenotipo Thl contra Th2 parece segregar independientemente otras funciones inmunes. IL-8 estimula las respuestas humorales, pero dirige estas respuestas hacia un fenotipo Thl, cortando la relación IgGl/IgG2a a la mitad. Mientras que MlP-la, quizá el accionador más prolífico de serología, que dobla la relación IgGl/IgG2a dramáticamente hacia una respuesta Th2. Es claro que esta manipulación puede permitir la inducción de las respuestas inmunes específicas de antígeno primarias que se doblan hacia un fenotipo deseado así como el isotipo de inmunoglobulina independentemente de uno con respecto a otro. Además, la inducción de las respuestas celulares contra las respuestas humorales superiores parece que polarizan relativamente las funciones inmunes. Estas quimiocinas con el efecto más dramático sobre las respuestas humorales, la IL-8 y MIP-la, exhiben poco efecto sobre las respuestas CTL, mientras que las que regulan los efectos más dramáticos sobre las respuestas CTL, RANTES y MCP-1 tuvieron efectos mínimos sobre la serología. La misma CTL dirig-e las quimiocinas RANTES y MCP-1 ambas IFN-? y TNF-a estimuladas, mientras que las respuestas humorales tuvieron mínimo efecto sobre los marcadores de citocinas de la activación inmune.

Ejemplo 2 Cuando la secuencia nucleótida que codifica IL-18 se libera a ciertas células como parte de una vacuna o inmunoterapéutico , es menos el efecto debido a que inactiva en la forma de longitud total y sólo llega a ser activa cuando se procesa en la forma madura. Como se muestra en las Figura ÍA, los primeros 35 aminoácidos se cortan por la caspasa-1 (ICE) . Se construyó una secuencia nucleótida IL-18 mutante, la cual se translada en IL-18 mutante mostrada en la Figura IB. Esta forma mutante de IL-18 opera como una proteína inmunomoduladora efectiva de acuerdo a la invención. La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican la IL-18 mutante en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el ínmunógeno, resultan en una respuesta celular T auxiliar mejorada. La secuencia nucleótida que codifica la forma mutante podría insertarse en pCDNA3.

Ejemplo 3 La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican CD40 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta CTL mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican CD40 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta celular T auxiliar mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican CD40L en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta CTL mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican Fas en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta CTL mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican ICAM-1 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta CTL mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican ICAM-1 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta celular T auxiliar mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican LFA-3 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta CTL mejorada." La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican LFA-3 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de células T auxiliares mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican VCAM-1 en combinación con las secuencias nucleótidas qué codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de células T auxiliares mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican PECAM-1 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de células T auxiliares mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican E-selectina en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de células T auxiliares mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican MC-SF en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta CTL mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican GC-SF en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta CTL mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican M-CSF en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de células T auxiliares mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican G-CSF en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de células T auxiliares mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican IL-4 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de células T auxiliares mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican IL-7 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta CTL mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican NGF en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta CTL mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican VEGF en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta CTL mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican IL-7 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de células T auxiliares mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican NGF en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de células T auxiliares mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican VEGF en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de células T auxiliares mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican MCP-1 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta CTL mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican RANTES en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta CTL mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican MCP-1 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de células T auxiliares mejorada. La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican RANTES en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de células T auxiliares mejorada.

La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican MIP-1 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de células T auxiliares mejorada. La liberación de las secuencias nucleótidas que codifican IL-8 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de células T auxiliares mejorada.

La liberación de cualquiera de MCP-1, RANTES, MIP-lcc e IL-8 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en una respuesta de anticuerpo mejorada.

La liberación de cualquiera de MCP-1 o RANTES resulta en la producción mejorada de TNF-a.

La liberación de cualquiera de MCP-1, RANTES, MlP-la e IL-8 en combinación con las secuencias nucleótidas que codifican y el inmunógeno, resultan en la producción mejorada de IFN-?.

Ejemplo Se examinaron los efectos sobre las respuestas inmunes específicas de antígeno después de la co-liberación ' de los casetes de expresión del gen para M-CSF (factor de estimulación de la colonia de macrofago), G-CSF (granulocito-CSF) y GM-CSF ( granuloci t o/monoci t o-CSF) junto con construcciones de inmunógeno ADN de VIH-1. Los genes para estas citocinas se clonaron individualmente en los vectores de expresión bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV) . Los casetes de expresión del plásmido del gen después se inyectaron en ratones junto con los casetes de vacunas de ADN para los inmunógenos de VIH-1. Se analizaron los efectos inmunológicos de la co-inyección con estos casetes adyuvantes genéticos sobre la dirección y la magnitud de las respuestas inmunes específicas de antígenos; estos resultados se compararon con los resultados observados con la co-liberación de genes para las citocinas de tipo Thl y Th2 prototípicas (IL-12 e IL-4, respectivamente). Usando estas construcciones de vacunas de ADN como antígenos modelo, se observó que los genes CSF puede regular dramática y distintamente las respuestas inmunes específicas de antígenos in vi vo , y dirigir la producción de ß-quimiocina de una manera específica de vacuna.

Materiales y Métodos Plásmidos de ADN Las construcciones de vacunas de ADN que expresan la proteína de cubierta VIH-1 (pCEnv) y la proteína gag/pol (pCGag/Pol) se prepararon como se describe en Boyer, J.D., et al. (1997) Nature Med. 3, 526-532, que se incorpora aquí por referencia. Los genes para G-CSF y M-CSF de humano así como GM-CSF de murino, se clonaron en el vector de expresión pCDNA3 (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) como se describe en Kim, J.J., et al. (1998) Eur. J. Immunol. 28, 1O89-1103 and Kim, J.J., et al. (1998) J. Clin. Invest. 102, 1112-1124, que se incorporan aquí por referencia. G-CSF y M-CSF de humano se han reportado que son activas en las células de rató'n. El ADN del plásmido limpio se produjo en bacterias y se purificó usando estuches Qiagen Maxi Prep (Qiagen, Santa Clara, CA) .

Reactivos y líneas celulares Las líneas celulares P815 de mastocitoma de ratón se obtuvieron de ATCC (Rockville, MD) . Las vacunas recombinantes que expresan cubierta VIH-1 (vMN462), gag/pol (vVKl) y ß-galactosidasa (vSC8) se obtuvieron de NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Las proteínas gpl20 o p24 recombinante se obtuvieron de ImmunoDiagnost íes , Inc. (Bedford, MA) .

Inocul a ci ón de ADN de ra tones Los músculos cuadríceps de ratones BALB/c hembras de 6 a 8 semanas de edad (Harían Sprague Dawley, Inc., Indianapolis , IN) se inyectaron con 50 µg de cada construcción de ADN de interés formulada en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y 0.25% de bupivacaína-HCl (Sigma, St. Louis, MO) . La coadministración de varios casetes de expresión del gen involucrados hacen los plásmidos elegidos antes de la inyección. Los ratones de control se inmunizaron con 50 µg del vector pCDNA3. Cada grupo de estudios se realizó tres veces y se presenta un grupo de resultados representati o. Los ratones que recibieron dos inmunizaciones de ADN (50 mg cada una) se separaron en dos semanas. En una semana después de la inyección de estimulación, los ratones se sacrificaron, los bazos se cosecharon y los linfocitos se aislaron y probaron para las respuestas celulares (Th o CTL) . Todos los animales se alojaron a temperatura controlada, instalado el ciclo de luz en la Universidad de Pennsylvania y su cuidado estuvo bajo la guía del National Institute ok Health y la Universidad de Pennsylvania.

ELISA Cincuenta µl de la proteína p24 o gpl20 diluida con amortiguador de carbonato-bicarbonato 0. ÍM (pH 9.5) a la concentración de 2 mg/ml, se adsorbió en pozos de microtitulación durante toda la noche a 4°C. La placa se lavó con PBS-0.05% de Tween-20 y se bloqueó con BSA al 3% en PBS con Tween-20 al 0.05% durante una hora a 37°C. El antisuero del ratón se diluyó con Tween-20 al 0.05% y se incubó durante una hora a 37°C, después se incubó con IgG de anti-ratón macho HRP-conj ugado (Sigma, St . Louis, MO) . Las placas se lavaron y revelaron con solución amortiguadora 3'3'5'5' TMB (Sigma) . Para la determinación de los niveles relativos de las subclases IgG específicas de gpl20, IgGl anti-murino e IgG2a conjugado con HRP (Zymed, San Francisco, CA) se sustituyó por IgG-HRP antimurino. Esto se siguió mediante la adición de la solución de sustrato ABTS (Chemicon, Temecula, CA) . En cada etapa, las placas se lavaron 3 veces con la solución amortiguadora (PBS+Tween-X al 0.05%).

Las placas se leyeron en una placa lectora MR5000 Dynatech con la densidad óptica a 450 nm.

Prueba de prol ifera ci ón de cél ula s T a uxi l i a res Los linfocitos se cosecharon de los bazos y se prepararon como las células efectoras removiendo los eritrocitos y lavando varias veces con medio fresco. Las suspensiones de células aisladas se resuspendieron hasta una concentración de 5xl06 células/ml. Una alícuota de 100 µl que contenía 5xl05 células se adicionó inmediatamente a cada pozo de una placa de fondo plano de microtitulación de 96 pozos. La proteína p24 o gpl20 recombinante a la concentración final de 5 µg/ml y 1 µg/ml se adicionó a los pozos por triplicado. Las células se incubaron a 37°C en C02 al 5% durante tres días. Un mCi de timidina tritiada se adicionó a cada pozo y las células se incubaron durante 12 a 18 horas a 37°C. La placa se cosechó y la cantidad de timidina tritiada incorporada se midió en una placa lectora Beta (Wallac, Turku, Finland), el índice de estimulación se determinó a partir de la fórmula: índice de Estimulación (IE) = (cuenta exper iment al /cuenta espontánea ) Los pozos de la cuenta espontánea incluyen 10% de suero de becerro fetal que sirve como control de la proteína relevante.

Prueba de l infoci to T ci t o tóxi ca Una prueba de liberación CTL de liberación 51Cr de cinco horas se realizó usando blancos infectados con vacunas. La prueba se realizó con estimulación de efector in vi tro , en donde los efectores se estimularon con células infectadas con vacunas relevantes (vMN462 para la cubierta y vVKl para gag/pol) que se fijaron con glutaraldehído al 0.1% durante cinco días en medio de cultivo de CTL a 5xl06 células/ml. Los efectores se estimularon no específicamente durante dos días con medio de cultivo CTL que consistía de RPMI 1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY), suero fetal de becerro al 10% (Gibco-BRL) y RAT-T-STIM al 10% sin Con A (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) . Los blancos infectados con la vacuna se prepararon infectando 3xl06 células P815 a la multiplicidad de infección (MOI) de 10-20 durante cinco a doce horas a 37°C. Una prueba de liberación de cromo estándar se realizó, en la que las células blanco se marcaron con 100 mCi/ml de Na251Cr02 durante 60 a 120 minutos y se usaron para incubar con los esplenocitos efectores estimulados durante cuatro a seis horas a 37°C. La lisis de CTL se determinó a las relaciones efector : blanco (E:T) en el rango de 50:1 a 12.5:1. Los sobrenadantes se cosecharon y contaron en un contador gamma LKB . CliniGamma . La lisis específica porcentual se determinó de la fórmula: 100 x liberación experimental - liberación espontánea Liberación mínima - liberación espontánea La liberación máxima se determinó por lisis de las células blanco en medio que contiene 1% de Tritón X-100 que. No se consideró una prueba válida si el valor para las cuentas de ^liberación espontánea' está en exceso de 20% de la 'liberación máxima' .

Lisi s compl emen to de cél ula s T CD8 + Las células T CD8+ se removieron de los esplenocitos mediante un .tratamiento con el anticuerpo monoclonal a-CD8 (Pharmingen, San Diego, CA) seguido por la incubación con complemento de conejo (Sigma) durante 45 min a 37°C.

Anál i sis de exprés i on de ci tocina/ quimi oc ina Los sobrenadantes de los efectores estimulados por la prueba CTL se colectaron en el día 6 y se probaron para los perfiles de citocina y quimiocina usando estuches ELISA para IFN-? e IL-4 (Biosource International, Inc., Camarillo, CA) y MlP-la (R&D Systems, Minneapolis, MN) , MlP-lß y RANTES (Intergen, Pace, NY) .

RESULTADOS Construcción de los casetes de expresión de citocina Los genes de citocina se clonaron individualmente en los vectores del plásmido de expresión pCDNA3. Para probar si las construcciones de citocina expresaron sus proteínas relevantes, se transfirieron in vitro en la línea celular muscular RD, y la expresión de estas construcciones se analizaron por ELISA de citocina. Los resultados demuestran que cada uno de los casetes de expresión produjeron citocinas específicas (G-CSF -40-60 pg/ml; GM-CSF>70 pg/ml; M-CSF -60-70 pg/ml) ..

G-CSF induce el mejoramiento de la respuesta auxiliar T La C-CSF es un factor de crecimiento producido por los macrofagos, fibroblastos, células endoteliales y células estrómicas de la médula ósea. G-CSF activa los neutrófilos, células endoteliales y plaquetas, pero se piensa que tiene pocos efectos directos sobre las células que presentan antígenos. Se examinaron los efectos de la co-expresión G-CSF sobre las respuestas de anticuerpos específicos. Los antisueros de ratones inmunizados con pCEnv y pCEnv+G-CSF se colectaron y analizaron para "las respuestas específicas de antígenos contra la proteína gpl20 de VIH-1 por ELISA. Se midió la titulación del anticuerpo específico gpl20 del suero colectado a 6 semanas de la inmunización post ADN. La co-inmunización G-CSF no afectó significativamente el nivel de la respuesta de anticuerpo específica gpl20. Se observó un resultado similar con los grupos inmunizados con pCGag/pol. Además, se determinaron las subclases de IgGs específica gpl20 inducidas por la co-administración con genes G-CSF. Se ha reportado que la producción del tipo IgGl se induce por las citocinas de tipo Th2, mientras que la producción de tipo IgG2a se induce por las citocinas de tipo Thl. Se midieron las relaciones relativas de IgG2a a IgGl (Thl a Th2) . El grupo inmunizado pCEnv tuvo una relación IgG2a a IgGl de 0.8. Por otra parte, la co-inmunización de los genes IL-12 de citocina Thl proteolítica aumentaron la relación a 1.28 y mientras que la co-inyección con el gen IL-4 de citocina Th2 resultó en una reducción de la relación a 0.68. La co-administración con G-CSF aumentó la relación relativa a 1.1, indicando un cambio a la respuesta de tipo Thl.

También se examinó el efecto de la co-expresión G-CSF sobre la respuesta proliferativa de células T auxiliares. Los linfocitos auxiliares T juegan un papel crítico en la inducción de la respuesta humoral e inmune por vía de la respuesta inmune celular y de células B por vía de células T citotóxicas CD8+. La co-inmunización de los genes IL-12 mejoró dramáticamente el nivel de respuestas proliferativas Th específicas de antígeno. Por el contrario, la co-inyección con el gen IL-4 tuvo mínimos efectos sobre las respuestas proliferativas Th. La coexpresión G-CSF con inmunógenos de VIH-1 resultó en el mejoramiento positivo de las respuestas proliferativas de células T auxiliares específicas de antígeno.

Además, también se investigaron los efectos de la co-expresión de citocina sobre la respuesta de CTL. Un nivel medio de muerte específica se observó de los animales de control, mientras que los animales inmunizados con pCEnv o pCGag/pol mostraron un nivel pequeño, pero positivo de las respuestas CTL específicas de antígeno. La co-inyección con genes IL-12 mejoró dramáticamente el nivel de respuestas CTL específicas de antígeno. Por el contrario, la co-inmunización con genes IL-4 tuvo mínimo efecto sobre las respuestas. Similarmente, la coadministración de G-CSF no tuvo ningún efecto de mejoramiento sobre las respuestas de CTL específicas de antígeno Las citocinas juegan un papel clave en la dirección y blanco de las células inmunes durante la respuesta inmune. Por ejemplo, la IFN-? está involucrada complicadamente en la regulación de las respuestas inmunes citotóxicas mediadas por células T, mientras que la IL-4 juega un papel dominante en las respuestas inmunes mediadas por células B. Se analizó el sobrenadante de las células efectoras estimuladas in vi t ro para la prueba de CTL y se probaron para la liberación de las citocinas IFN-y. Se encontró que la expresión G-CSF aumentó el nivel de IFN-g (2 veces), pero no afectó el nivel de la producción de IL-4.

GM- CSF es un po t en t e induc tor de la s respues ta s a uxi l i a res T y de an ti cue rp o s GM-CSF activa y diferencia las células granulocí ticas y puede servir como el factor de crecimiento para las células endoteliales, células eritroides, megacarioci t os y células T auxiliares. No es claro si la GM-CSF puede tener efectos sobre las células T asesinas. Por el contrario, la co-expresión de G-CSF, la co-expresión de GM-CSF tuvo un efecto de mejoramiento significativo (el más alto en todos los grupos) en la inducción de la respuesta humoral específica de antígeno. Similar a la coinyección de IL-4, la co-inmunización de GM-CSF resultó en el nivel más alto de la respuesta de anticuerpo específica de cubierta. Un resultado similar se observó con los grupos inmunizados con pCGag/pol. Por otra parte, la coinmunización pCEnv+GM-CSF no tuvo ningún efecto sobre la relación IgG2a/IgGl cuando se comparó con el grupo inmunizado con pCEnv sólo. Además, junto con la coinmunización IL-12, la co-expresión GM-CSF con inmunógenos VIH-1 (pCEnv o pCGag/pol) resultó en el nivel más elevado de respuestas proliferativas de células T auxiliares específicas de antígeno. También se encontró que la expresión GM-CSF disminuyó el nivel de IFN-? (2 veces), pero no afectó el nivel de la producción de IL-4. Por el contrario, la co-inmunización GM-CSF sólo tuvo efecto ligero sobre la respuesta CTL específica de antígeno.

M-CSF es un po t en t e indu c t or de l a respues ta CTL M-CSF es un potente inhibidor de los macrofagos así como de las células progenitoras de macrofagos. El receptor M-CSF tiene un patrón de expresión restringido, nuevamente limitado a los macrofagos. Como tal, pueden evaluarse los efectos directos de la co-liberación de M- CSF sobre. este tipo de población APC. A diferencia de GM-CSF, la co-expresión de M-CSF con pCEnv tuvo efecto de mejoramiento positivo (pero menos que IL-4 o GM-CSF) sobre la respuesta de anticuerpo específica de cubierta VIH-1. Se determinaron las relaciones relativas de IgG2a a IgGl después de la co-administración con pCEnv+M-CSF. El grupo pCEnv inmunizado tuvo una relación de IgG2a a IgGl de 0.8. Por otro lado, la co-inyección con pCEnv+M-CSF aumentó la relación relativa a 1.2, indicando un fuerte cambio a la respuesta de tipo Thl. Además, la co-expresión M-CSF con inmunógenos VIH-1 (pCEnv o pCGag/pol) resultó en el aumento significativo de las respuestas proliferativas de células T auxiliares específicas de antígeno. A diferencia de la co-inyección con pCEnv+G-CSF o pCEnv+GM-CSF lo cual resultó en un efecto mínimo en la actividad de CTL, un aumento más dramático en la muerte específica de los blancos infectados con la vacuna (vMN462) que expresa la cubierta VIH-1 se observó después de la co-inyección con pCEnv+M-CSF a una relación de efector a blanco (E:T) 50:1. Similarmente, los ratones inmunizados con pCGag/pol+M-CSF resultó en un mejoramiento significativo de la lisis de CTL específica de antígeno infectada con la vacuna (vVKl) que expresa VIH-1 gag/pol. El nivel de liberación de IFN-? por los ratones inmunizados con pCEnv+M-CSF fue significativamente mayor que los de los grupos pCEnv inmunizados o de control. Por otro lado, el nivel de IL-4 de estos grupos fueron similares.

Mej orami en to de las respues ta de CTL por co -inmuni za ci ón M-CSF es res tringido por las cél ul a s T CD8 Para determinar si el aumento en la respuesta CTL por vía de la co-expresión de M-CSF se restringió a las células T CD8+, se realizaron pruebas CTL usando un péptido de cubierta VIH-1 ( RIHIGPGRAFYTTKN ) que ha mostrado que es un epítope específico para la CTL restringida 1 de clase MHC para ratones balb/c.. Los ratones recibieron dos inmunizaciones de 50 µg de cada construcción de ADN separadas por dos semanas y sus bazos se cosecharon una semana después de la segunda inmunización. La prueba CTL se realizó sobre los esplenocitos aislados después de la estimulación in vi t ro con péptidos de cubierta específica como se describió. Se observó un mejoramiento significativo de la respuesta CTL después de la co-inyección con M-CSF a 40% de muerte específica a una relación E:T de 50:1. Se verificó esta observación midiendo la actividad CTL después de la remoción de las células T CD8+ de la población de células efectoras por lisis complementaria. La remoción de células T CD8+ resultó en la supresión del mejoramiento de la CTL específica de antígeno observada después de co-inyecciones con M-CSF. Estos resultados indican que el mejoramiento de la actividad citotóxica fue dependiente de células T CD8+ y restringidas de clase 1.

La Co -l ibera ci ón de genes M-CSF modul an la producci ón de ß -quimi ocina por cél ula s T es t im ul a da s Se examinaron los perfiles de expresión de las ß-quimiocinas (MlP-la, MlP-lß, y RANTES) de las células T estimuladas. Estas ß -quimiocinas son los factores supresores de VIH principales producidos por los virus de células T CD8+ por el trópico macrofago, pero no el trópico de células T. Además, estas quimiocinas producidas de células T CD8+ han mostrado que juegan un papel crítico en la expansión inmune celular en la periferia. Específicamente, se observó que la inmunización de ADN con pCEnv induce las ß -quimiocinas MlP-la, MlP-lß y RANTES. Además, se observó que la co-inmunización con genes de citocina hematopoyéticos resultó en la expresión aumentada de quimiocinas por las células T estimuladas. Por ejemplo, se observó que la expresión MlP-la podría mejorarse dramáticamente por la co-inmunización con pCEnv+G-CSF sobre el nivel expresado por la inmunización pCEnv sola. Además, se encontró que la expresión MlP-lß se mejoró dramáticamente por la co-inmunización pCEnv+M-CSF. Por otro lado, las co-inmunizaciones pCEnv+M-CSF, pCEnv+G-CSF y pCEnv+GM-CSF no resultó en el mejoramiento significativo de la expresión de RANTES por las células efectoras estimuladas sobre las inducidas por los casetes de la vacuna de ADN sola. En forma interesante, sin embargo, la M-CSF parece bajar la modulación de los niveles de MlP-la aún inferiores que los inducidos por la inmunización del gen en su propiedad. Estos resultados podrían sugerir que la MlP-la no se involucra directamente en la dirección de la respuesta CTL y en realizada podría interferir con su inducción .

DISCUSIÓN La manipulación del ambiente inmune local, posiblemente en la periferia del nodulo linfático en el sitio inyectado o en el músculo, podría influenciar la magnitud y dirección de la respuesta inmune. Se examinaron los efectos de los genes de co-liberación para G-CSF, GM-CSF y M-CSF como adyuvantes moleculares para las vacunas de ADN.

Se observó que las construcciones de ADNc de G-CSF, GM-CSF y M-CSF modulan únicamente el perfil inmune de la vacuna de ADN. La G-CSF es una citocina pleiotrópica mejor conocida por sus efectos sobre la proliferación, diferenciación y activación de células hematopoyéticas de la línea de granulocito neutrofílica . Se produce principalmente por los monocitos y macrofagos debido a la activación por una variedad de estímulos que incluyen, endotoxinas, IL-1, TNF-a e IFN-?. Regula la proliferación y maduración de los precursores de granulocito neutrofílico y actúa directamente sobre los neutrófilos maduros para mejorar la fagocitosis, ADCC, generación de superóxido, quimiotaxis y la expresión de las moléculas de adhesión de la superficie celular. La administración in vi t ro de la G-CSF puede estimular la formación de colonia de neutrófilos de las células progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea. Clínicamente, la G-CSF se administra más comúnmente durante el tratamiento de quimioterapia y de la neutropenia inducida por terapia de radiación. Se encontró que la co-inmunización de G-CSF tuvo mínimo efecto global sobre las respuestas del anticuerpo. La co-expresión de G-CSF modula el cambio de las respuestas inmunes al tipo Thl, indicado por el aumento de la relación de IgG2a/IgGl y la expresión mejorada de IFN-?. Además, la co-expresión de la G-CSF resultó en un mejoramiento mejorado de las respuestas de proliferación de células T auxiliares. La G-CSF global, que no debería afectar directamente la presentación del antígeno, tuvo un mejor efecto moderado sobre las respuestas inmunes específicas del antígeno.

La GM-CSF es una citocina pleiotrópica que puede estimular la proliferación, maduración y función de una variedad de células hematopoyéticas. La GM-CSF se reconoció primero por su capacidad para estimular el neutrófilo, monocito/macrofago y la formación de colonia de eosinófilo. Se produce por una variedad de tipos de células, incluyendo células T, células B, macrofagos, mastocitos, células endoteliales y fibroblastos, en respuesta a las citocinas o el estímulo inmune e inflamatorio. Se observó que la GM-CSF fue una fuerte inductora de células CD4+Th, indicado por las respuestas proliferativas de células T auxiliares, así como fuerte estimulación de las respuestas de anticuerpo. Por otro lado, la co-inmunización pCEnv+GM-CSF no tuvo ningún efecto sobre la relación IgG2a/IgGl. Además, la co-administración de GM-CSF no pareció tener efecto observable sobre las células T CD84', demostrado por la carencia de cualquier efecto en la inducción de las respuestas CTL específicas de antígeno. De esta manera, la ayuda de la vacuna dirigida por esta citocina se enfocó completamente en la célula T auxiliar. Estos resultados soportan y extienden los estudios previos sobre el uso de las construcciones de GM-CSF de ADNc como un adyuvante molecular. Se ha reportado que la co-inoculación intramuscular de del plásmido que expresa la glicoproteína de los virus de rabias y el plásmido que codifica la GM-CSF de ratón mejoró la actividad celular de células T auxiliares. Similarmente, se reportó que la coinmunización de GM-CSF de ADNc con construcciones de vacunas de ADN aumenta las respuestas de proliferación de células Th y anticuerpos específicos de antígeno. Por el contrarío, casi no se observó efecto sobre la inducción de CTL con los genes para GM-CSF en estos estudios. Se reportó un descubrimiento similar usando la co-liberación de GM-CSF con el inmunógeno de ADN que codifica la nucleoproteína de influenza (NP) . También se co-liberaron las construcciones de GM-CSF de ADNc con la construcción de expresión de ADN que codifica la proteína HSV-2 gD. Después se analizaron los efectos moduladores de la vacuna sobre el fenotipo inmune resultante y sobre la mortalidad y la morbidez de los animales inmunizados después de la estimulación letal HSV. Se observó que la coadministración del gen GM-CSF no sólo mejoró la tasa de supervivencia, sino que también redujo la frecuencia y severidad de las lesiones herpéticas después de la estimulación HSV intravaginal.

La M-CSF se ha mostrado que es reguladora del crecimiento, diferenciación y función de los fagocitos mononucleares. También aumenta la expresión y adhesión de moléculas y receptores Fc, aumenta la actividad ' tumoricidal, mejora la liberación secundaria de citocinas que incluyen IL-1, TNF-a e IFN-?. La M-CSF se descubrió originalmente en el suero, la orina y otros fluidos biológicos como un factor que podría estimular la formación de las colonias de macrofagos de células progenitoras hematopoyéticas de la médula ósea. La M-CSF puede producirse mediante un número de células, incluyendo fibroblastos, células epiteliales secretoras _ del endometrio, células estrómicas de la médula ósea, t astrocitos del cerebro, osteoblastos,, células mesangiales renales, queratinocitos y LPS o macrofagos activados por citocinas, células B, células T y células endoteliales. Entre las CSFs examinadas, la M-CSF fue el activador más potente de las CTLs CD8 + . El mejoramiento de las respuestas CTL inducidas por la expresión de M-CSF, fue la célula T CD8+ y restringidas de clase I MHC dependientes. Los resultados de la CTL mejorada se soportan por la producción aumentada de IFN-? y la relación aumentada de IgG2a/IgGl. A diferencia de los efectos de GM-CSF, la coinmunización de M-CSF tuvo efecto débil sobre las respuestas de anticuerpos. Similar a los efectos de la GM-CSF, la co-expresión de la M-CSF con inmunógenos VIH-1 resultó en el aumento de las respuestas proiiferat ivas de células T auxiliares específicas de antígeno, aunque a un grado inferior. Parece que la ruta CTL se beneficia particularmente por esta citocina.

Fue interesante comparar los efectos inmunomoduladores de los genes de CSF y citocina de tipo Thl/Th2. Por ejemplo, la co-inyección moduló positivamente el nivel de respuestas del anticuerpo similares a la coinmunización IL-4. Por otro lado, la co-inmunización IL-4 permitió una mayor respuesta tipo Th2 como se observa por la reducción dramática en la relación IgG2a/IgGl. Además, el efecto de mejoramiento dramático de la co-inyección de GM-CSF en las respuestas proliferativas Th, se igualó sólo por el de la co-administración de IL-12. Por otro lado, la co-liberación del gen por M-CSF, y no G-CSF o GM-CSF, resultó en un mejoramiento significativo de las respuestas CTL restringidas de células T CD8+. Estos resultados indican que la producción de estos factores de crecimiento en el sitio de la activación inmune podrían regular el nivel de las respuestas inmunes inducidas por vacunas de ADN i n vi vo . Además, estos resultados implican que estos factores de crecimiento podrían jugar un papel más activo en la cascada de la respuesta inmune moduladora, que se pensado previamente que está bajo el dominio de las citocinas de tipo Thl y Th2 tradicionales.

Además de los análisis de las respuestas basadas en células, también se examinó la modulación de la producción de citocina resultante de la co-expresión de los genes CSF. Las quimiocinas son moduladores importantes de las respuestas inmunes e inflamatorias. Son especialmente importantes en la regulación molecular del transporte de leucocitos de los vasos a los sitios periféricos de la defensa del huésped. Además, algunas quimiocinas se han mostrado que juegan un papel crítico en la regulación de la expansión inmune en la periferia. Se observó que los niveles de expresión de quimiocina elevados de células T efectoras de CD8+, mientras que ceban las respuestas inmunes sugieren un papel regulador para estas células efectoras de etapa final en la fase de expansión de una respuesta inmune específica de antígeno. Además de sus funciones en la respuestas inflamatorias e inmunes, algunas quimiocinas podrían jugar un papel crítico en la transmisión y progresión del SIDA. Se ha anticipado durante una década que el enlazamiento de la glicoproteína de cubierta de VIH gpl20 a CD4 no es suficiente para la fusión viral y la entrada, que sugiere el requerimiento de un cofactor de superficie celular adicional para la infección por VIH. Los estudios recientes han identificado que los co-receptores requeridos para la fusión de la célula T trópica y las cepas de VIH trópicas de macrofagos con sus células blanco son CXCR-4 y CCR-5, respectivamente. Las ß-quimiocinas MlP-la, MlP-lß y RANTES son ligandos naturales para CCR-5 y están entre los factores supresores de VIH principales producidos por las células T CD8+ por el macrofago trópico, pero no por los aislados de VIH, de células T trópicas.

Se examinó la expresión de MlP-la, MlP-lß y RANTES por células estimuladas de vacunas in vi vo y se observó que la co-inmunización con los genes CSF resultó en la expresión aumentada de quimiocinas por células T estimuladas de antígeno. Se observó que la producción de MlP-la podría mejorarse dramáticamente por la coinmunización con pCEnv+G-CSF sobre el nivel producido por la inmunización de pCEnv sola. En particular, se encontró que la expresión de MlP-lß se mejoró dramáticamente por la co-inmunización pCEnv+M-CSF. Por el contrario, ninguna de las estrategias de co-inyección resultó en el mejoramiento significativo de la expresión RANTES- por las células efectoras estimuladas. Se observó otro efecto nuevo de aumento dramático en RANTES y MlP-lß y al mismo tiempo, la disminución en MlP-la. De hecho, los niv les de MlP-la inducidos por M-CSF fueron en realidad inferiores que los niveles de control. Este resultado sugiere que la señalización MlP-la a través de CCR1, CCR4 y CCR5 resulta en seales diferentes que lo liberado por RANTES o MlP-lß a través de CCR3 o CCR9. Este descubrimiento podría distinguir estos efectos de los receptores putativos sobre las respuestas inmunes.

Estos resultados muestran que la co-liberación de las construcciones de ADNc del factor de crecimiento modulan las respuestas inmunes humorales y celulares (incluyendo la producción de las quimiocinas) . En particular, la coinyección con M-CSF tuvo mayor efecto modulador sobre la inducción de CTL específico de antígeno y la producción de quimiocina.

Ejemplo 5: ICAM-1 proporciona la coestimulación de célula T y la producción de quimiocina Se examinaron los efectos inmunomoduladores de las tres moléculas de adhesión específicas que se regulan estrechamente por las quimiocinas. Se utilizó la tecnología de vacunas de ADN para explorar el papel de ICAM-1, LFA-3 y VCAM-1 en la activación inmune in vi vo . Específicamente, se clonaron los genes para ICAM-1, LFA-3 y VCAM-1 individualmente en los vectores de expresión bajo el control de un promotor de citomegalovirus (CMV) . Estas construcciones después se co-inmuni zaron con inmunógenos de ADN que codifican los antígenos gag/pol o cubierta de VIH-1. Se analizaron los efectos inmunológicos de la coinyección con estos casetes de la molécula de adhesión en el nivel de las respuestas inmunes específicas de antígeno .

Se observó que las respuestas de células T específicas de antígeno puede mejorarse por la coexpresión del inmunógeno de ADN y las moléculas de adhesión ICAM-1 y LFA-3. Sin embargo, ICAM-1 y LFA-3 pareció que no jugaba el papel en la expresión de las respuestas humorales específicas de antígeno. En vez de esto, parece que afectan específicamente las respuestas de células T. LFA-3 mejoró las respuestas de células T CD4+ y exhibió efecto menor en la función de células T CD8+. En forma más importante, la co-administración de ICAM-1 aumentó dramáticamente las respuestas de células T CD4+ y CD8+. La co-expresión de ICAM-1 también mejoró dramáticamente la producción de ß-quimiocina específica de antígeno, lo que sugiere un papel importante para la ligación de LFA-1 en la expansión de células T periféricas. El fenotipo de activación de estas moléculas parece que es distinto de las moléculas co-estimuladoras CD80/CD86 prototípicas. Estos resultados soportan que la red periférica de citocina, quimiocina y moléculas de adhesión regulan coordinadamente las respuestas de células T en el sitio de la función efectora.

Materiales y Métodos Plásmidos de ADN Las construcciones de vacunas de ADN que expresan la proteína de cubierta VIH-1 (pCEnv) y la proteína gag/pol (pCGag/Pol) se prepararon como se describe en Kim, J.J., et al. Nature Biot. 15: 641-645, que se incorpora aquí por referencia. Los genes para ICAM-1, LFA-3 y VCAM-1, se clonaron en el vector de expresión pCDNA3 (Invitrogen, Inc., San Diego, CA) y se produjo el plásmido de ADN limpio como se describe en Kim, J.J., et al. Eur. J. Immunol. 28, 1089-1103.

Reactivos y líneas celulares Las líneas celulares P815 de mastocitoma de ratón y rabdomiosarcoma de humano (RD) se obtuvieron de ATCC (Rockville, MD) . Las vacunas recombinantes que expresan la cubierta VIH-1 (vMN462), gag/pol (vVKl) y ß-galactosidasa (vSC8) se obtuvieron de NIH AIDS Research and Reference Reagent Program. Las proteínas gpl20 o p24 recombinante se obtuvieron de ImmunoDiagnos t ics , Inc. (Bedford, MA) .

Expresi ón de cons trucci ones de expresi ón de mol écula s de adh esi ón La expresión de las construcciones ICAM-1, LFA-3, VCAM-1 se analizaron transfiriéndolas en células RD. Las células se cosecharon 72 horas después de la transfección y se probaron para la expresión usando análisis FACS con anticuerpos monoclonales conjugados de isotiocianato de fluoresceina (FITC) para ICAM-1, LFA-3, VCAM-1 (Pharmingen, San Diego, CA) .

In ocul a ci ón de ADN de ra t ones Los músculos cuadríceps de ratones BALB/c hembras de 6 a 8 semanas de edad (Harían Sprague Dawley, Inc., Indianapolis , IN) se inyectaron con 50 µg de cada construcción de ADN de interés formulada en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) y 0.25% de bupivacaína-HCl (Sigma, St. Louis, MO) . La co-administración de varios casetes de expresión del gen involucrados hacen los plásmidos elegidos antes de la inyección. Los ratones de control se inmunizaron con 50 µg del vector pCDNA3. Cada grupo de estudios se realizó tres veces y se presenta un grupo de resultados representativo. Los ratones que recibieron dos inmunizaciones de ADN (50 mg cada una) se separaron en dos semanas. En una semana después de la inyección de estimulación, los ratones se sacrificaron, los bazos se cosecharon y los linfocitos se aislaron y probaron para las respuestas celulares (Th o CTL (linfocito T citotóxico) ) .

ELISA Cincuenta µg de la proteína p24 o gpl20 diluida con amortiguador de carbonato-bicarbonato 0. ÍM (pH 9.5) a la concentración de 2 µg/ml, se adsorbió en pozos de microtitulación durante toda la noche a 4°C. La placa se lavó con PBS-0.05% de Tween-20 y se bloqueó con BSA al 3% en PBS con Tween-20 al 0.05% durante una hora a 37°C. El antisuero del ratón se diluyó con Tween-20 al 0.05% y se incubó durante una hora a 37°C, después se incubó con IgG de anti-ratón macho HRP-conj ugado (Sigma, St . Louis, MO) .

Las placas se lavaron y revelaron con solución amortiguadora 3'3'5'5' TMB (Sigma) . Las placas se leyeron en una placa lectora MR5000 Dynatech con la densidad óptica a 450 nm, Prueba de proli fera ci ón de cél ula s T a uxi l ia res Los linfocitos se cosecharon de los bazos y se prepararon como las células efectoras removiendo los eritrocitos y lavando varias veces con medio fresco. Las suspensiones de células aisladas se resuspendieron hasta una concentración de 5xl06 células/ml. Una alícuota de 100 µl que contenía 5xl05 células se adicionó inmediatamente a cada pozo de una placa de fondo plano de microtitulación de 96 pozos. La proteína p24 o gpl20 recombinante a la concentración final de 5 µg/ml y 1 µg/ml se adicionó a los pozos por triplicado. Las células se incubaron a 37°C en C02 al 5% durante tres días. Un mCi de timidina tritiada se adicionó a cada pozo y las células se incubaron durante 12 a 18 horas a 37°C. La placa se cosechó y la cantidad de timidina tritiada incorporada se midió en una placa lectora Beta (Wallac, Turku, Finland), el índice de estimulación se determinó a partir de la fórmula: índice de Estimulación (IE) = (cuenta experimental /cuenta espontánea ) Los pozos de la cuenta espontánea incluyen 10% de suero de .becerro fetal que sirve como un control de la .proteína relevante. Además, pCEnv o los • animales de control inmunizados tienen rutinariamente IE de 1 contra la proteína Pr55. Similarmente, pCGag/pol o control tienen rutinariamente IE de 1 contra la proteína gpl20. Para asegurar que las células fueron saludables, PHA o con A (Sigma) se usó como un control positivo de estimulador policlonal. Las muestras de PHA o con A tuvieron IE de 20-40.

Prueba de l infoci to T ci totóxi ca Una prueba de liberación CTL de liberación 51Cr de cinco horas se realizó usando blancos infectados con vacunas. La prueba se realizó con estimulación de efector ín vitro, en donde los efectores se estimularon con células infectadas con vacunas relevantes (vMN462 para la cubierta y vVKl para gag/pol) que se . fijaron con glutaraldehído al 0.1% durante cinco días en medio de cultivo de CTL a 5xl0b células por ml . Los efectores se estimularon no específicamente durante dos días con medio de cultivo CTL que consistía de RPMI 1640 (Gibco-BRL, Grand Island, NY), suero fetal de becerro al 10% (Gibco-BRL) y RAT-T-STIM al 10% sin Con A (Becton Dickinson Labware, Bedford, MA) . Los blancos infectados con la vacuna se prepararon infectando 3xl06 células P815 a la multiplicidad de infección (MOI) de 10-20 durante cinco a doce horas a 37°C. Una prueba de liberación de cromo estándar" se realizó, en la que las células blanco se marcaron con 100 mCi/ml de Na251Cr02 durante 60 a 120 minutos y se usaron para incubar con los esplenocitos efectores estimulados durante cuatro a seis horas a 37°C. La lisis de CTL se determinó a las relaciones efector : blanco (E:T) en el rango de 50:1 a 12.5:1. Los sobrenadantes se cosecharon y contaron en un contador gamma LKB CliniGamma. La lisis específica porcentual se " determinó de la fórmula: 100 x liberación experimental - liberación espontánea Liberación mínima - liberación espontánea La liberación máxima se determinó por lisis de las células blanco en medio que contiene 1% de Tritón X-100 que. No se consideró una prueba válida si el valor para las cuentas de 'liberación espontánea' está en exceso de 20% de la 'liberación máxima' .

Li s i s compl em en t o de cél u l a s T CD8+ Las células T CD8+ se removieron de los esplenocitos mediante un tratamiento con el anticuerpo monoclonal a-CD8 (Pharmingen, San Diego, CA) seguido por la incubación con complemento de conejo (Sigma) durante 45 min a 37°C.

Anál i si s de expresi ón de ci tocina / quimi oci na Los sobrenadantes de los efectores estimulados por la prueba CTL se colectaron en el día 6 y se probaron para la expresión usando estuches ELISA para IFN-? e IL-4 y para MlP-la, MlP-lß y RANTES (Biosource, Camarillo, CA; R&D Systems, Minneapolis, MN; Intergen. Purchase, NY) .

Resultados ICAM- 1 , LFA-3 y VCAM-1 pueden expresa rse por la s cél ul a s transfec ta da s Los genes para ICAM-1 (pCICAM-1), LFA-3 (pCLFA-3) y VCAM-1 (pCVCAM-1) se clonaron individualmente en el vector de expresión pCDNA3 (Figura 2) . Para probar si las construcciones pCICAM-1, pCLFA-3 y pCVCAM-1 podrían expresar sus proteínas relevantes, se transfirieron in vi t ro en las células de rabdomiosarcoma (RD) de humano. Usando el análisis FACS se observó que la transfección de los casetes de expresión pCICAM-1, pCLFA-3 y pCVCAM-1 resultó en la expresión específica de ICAM-1, LFA-3 y VCAM-1, respectivamente. También se observó que la coinmunización de dos casetes de expresión de ADN resultaron intramuscularmente en la co-expresión de las proteínas codificadas en las mismas células del músculo in vi vo .

La Co -expresi ón de la s mol éculas de adhesi ón no a fecta las respues ta s inm un es h umora l es Ag-especí fi ca s Después se investigaron los efectos de la coexpresión de las moléculas de adhesión que tienen sobre la inducción de las respuestas inmunes específicas de antígeno. Para todos los experimentos, 50 µg de cada construcciones de la expresión de ADN se inyectaron en ratones BABL/c intramuscularmente a las semanas 0 y 2. El primer parámetro inmune examinado fue la respuesta humoral específica de antígeno. Los antisueros de los ratones inmunizados se colectaron a las semanas 0, 2 y 6 y se analizaron para las respuestas de anticuerpos específicas contra la proteína gpl20 de VIH-1 por ELISA. La coexpresión de ICAM-1, LFA-3 y VCAM-1 pareció tener un efecto mínimo sobre el perfil de enlazamiento del anticuerpo específico inducido por la inmunización pCEnv. Un resultado similar se observó con los grupos coinmunizados con pCGag/pol.

La co-expresi ón de ICAM-1 o LFA-3 mej ora la respues ta s prol i fera tiva s Th especí fi ca s Ag También se investigó el efecto de la co-expresión de la molécula de adhesión sobre la magnitud de las respuestas inmunes celulares. La inducción de la respuesta proliferativa de células T auxiliares de CD4+ es importante, debido a que las células Th juegan un papel crítico en la inducción de una respuesta inmune humoral por vía de las células B y la respuesta CTL por vía de las células T CD8+. Se midieron las respuestas proliferativas Th para los ratones inmunizados con pCGag/pol y los ratones co-inmuni zados con pCICAM-1, pCLFA-3 o pCVCAM-1. La proteína de cubierta VIH-1 gpl20 recombinante (5 µg/ml y 1 µg/ml) se colocó en placas en cada pozo para la estimulación específica de la proliferación de células T. También se analizaron estos grupos para la estimulación no específica de células T usando las proteínas irrelevantes y se observó que el antígeno no específico no indujo las respuestas proliferativas de células T in vi tro . Un nivel de proliferación medio se observó en el grupo de control inmunizado con un vector de control", y un nivel de proliferación moderado se observó en el grupo inmunizado con pCEnv sola. Por el contrario, los grupos co-inmunizados con pCICAM-1 o pCLFA-3 tuvieron niveles significativamente superiores de las respuestas proliferativas. Por otro lado, el grupo co-inmuni zado con genes VCAM-1 no mostró ningún mejoramiento de la respuesta Th específica de antígeno. Un resultado similar se observó con los grupos co-inmuni zados con pCGag/pol. En los experimentos de repetición usando inmunógenos, la coliberación de pCICAM-1 o pCLFA-3 resultó en un aumento de 3 a 4 veces en las respuestas proliferativas específicas de antígeno.

La co -expresi ón de ICAM-1 o LFA-3 mej ora l a s respues ta s CTL especí fi ca s Ag Para investigar adicisnalmente -el mejoramiento de la inmunidad celular, se realizaron las pruebas CTL usando esplenocitos de ratones co-inmuni zados con pCEnv y pCGag/pol. La prueba se realizó con estimulación in vi t ro de los esplenocitos del efector antes de medir la liberación de cromo de los blancos tratados de péptidos o infectados con vacunas específicas y no específicas. Para calcular la lisis específica de los blancos, el por ciento de lisis de los blancos irrelevantes se substrajeron de la lisis por ciento de los blancos específicos. Un nivel medio de la muerte específica se observó de los animales de control con inmunizaciones pCDNA3, pCICAM-1, pCLFA-3 o pCVCAM-1, mientras que los animales inmunizados con pCEnv mostraron bajo nivel de la respuesta CTL. Por otra parte, la co-inmunización con pCEnv+pCICAM-1 resultó en un aumento dramático en la actividad CTL. Más de 40% de los blancos infectados con la vacuna de cubierta de VIH-1 (vMN462) de muerte específica, se observó después de la co-inmunización con pCEnv+pCICAM- 1 a una relación de efector a blanco (E:T) de 50:1. La actividad CTL se tituló a 20% de lisis específica a una relación de E:T de 12.5:1. En contraste, la co-inmunización pCEnv+pCLFA- 3 resultó en un aumento más moderado en la actividad CTL. Los resultados de CTL similares se observaron después de las co-inmunizaciones con pCGag/pol-fpCICAM-1 y pCGag/pol+pCLFA-3.

Para determinar si el aumento en la respuesta de CTL por vía de la co-expresión de pCICAM-1 y pCLFA-3, se restringieron a las células T CD8+, las pruebas CTL se realizaron midiendo la actividad CTL con y sin la remoción de las células T CD8+ de la población de células efectoras por lisis complemento. La remoción de las células T CD8+ resultó en la supresión del mejoramiento de CTL específico de antígeno observado después de las co-inyecciones con pCICAM-1 y pCLFA-3. Estos resultados indican que el mejoramiento de la actividad citolítica fue dependiente de las células T CD8+ y específicas de antígeno.

La Co -expresi ón de ICAM-1 o LFA-3 a umen ta l a producci ón de IFN-? por cél ul a s T es timul a da s El análisis de la producción de citocina por CTLs estimuladas en los animales inmunizados soportan los resultados CTL observados. Las citocinas juegan un papel clave en la dirección y el blanco de la células inmunes durante el desarrollo de la respuesta inmune. Por ejemplo, IFN-? se involucra intrínsecamente en la regulación de las respuestas inmunes citotóxicas mediadas por células T, mientras que la IL-4 juega un papel dominante en las respuestas inmunes mediadas por células T. Se analizó el sobrenadante de las células efector.as estimuladas i n vi t ro para la prueba CTL y se probaron para la liberación de las citocinas IFN-? e IL-4. Se encontró que la co-inyección con pCICAM-1 aumentó significativamente el nivel de IFN-y. La co-inmunización con pCLFA-3 resultó en un aumento más moderado en la producción de IFN-?. Por otro lado, fueron similares el nivel de IL-4 liberado de todos los grupos.

La co-expresi ón de ICAM-1 a umen ta dramá ti camen te la producción de ß -quimi ocinas por cél ula s T es timulada s • Se reportó recientemente que las células T efectoras CD8+ expanden las respuestas específicas de antígeno i n vi vo por medio de la producción de quimiocinas específicas en el sitio periférico de infección. Por lo tanto, se analizó la producción de ß-quimiocinas por CTLs estimuladas. Se analizó el sobrenadante de las células efectoras estimuladas i n vi t ro para la prueba CTL y se probaron para la liberación de las ß-quimiocinas MlP-la, MlP-lß y RANTES. Como se había observado previamente, se encontró que la inmunización de ADN con pCEnv indujo niveles significativamente mayores de expresión de MIP-la, MlP-lß y RANTES sobre los del vector de control. Además, se observó que la co-inyección con pCEnv+pCLFA-3 aumentó el nivel de la producción de ß-quimiocina sobre la del grupo inmunizado pCEnv. Aún más significativamente, la co-inmunización con pCEnv+pCICAM-1 resultó en un mejoramiento dramático (2-4 veces) de la producción de MlP-la, MlP-lß y RANTES sobre la del grupo inmunizado pCEnv. Por el contrario, la co-administración de pCVCAM-1 no mejoró el nivel de la expresión de quimiocina. Estos resultados soportan que ICAM-1 y LFA-3 proporcionan la co-estimulación directa de células T.

La co -expres i ?n de ICAM-1 y CD86 mej ora s i n ergí s t i cam en t e las respues ta s CTL especi fi ca s Ag La ruta B7 (CD80 y CD86) se considera que es una ruta de co-es t imulación principal para la liberación de las segundas señales críticas para cebar y expander las respuestas de células T. Estas moléculas se han examinado en el contexto de las vacunas de ADN como el agente modulador. En este contexto, parece que las moléculas CD86 juegan un papel prominente en la inducción específica de antígeno de los linfocitos T citotóxicos CD8+ cuando se liberan como adyuvantes de vacunas. La co-administración de CD86 ADNc junto con inmunógenos de ADN aumentó dramáticamente la respuesta CTL CD8+ específica de antígeno. Los efectos de ICAM-1 y LFA-3 podría ser dependiente sobre las señales B7-CD28, o podrían representar una ruta sinergística alternativa para dirigir la inducción CTL in vi vo . Por lo tanto, se investigó además si las moléculas ICAM-1 y LFA-3 cuando se co-expresan con la molécula CD86, podrían mejorar sinergísticamente el nivel de la inducción CTL. Se observó que la co-expresión de las moléculas ICAM-1 y CD86 podrían mejorar sinergísticamente la respuesta CTL específica de antígeno. Por otro lado, la co-expresión de las moléculas LFA-3 y CD86 no mejoraron el nivel de la respuesta CTL.

Estos resultados indican que las rutas ICAM-l/LFA-1 proporcionan la señales de co-estimulación de células T independientes de las rutas CD86/CD28, y podrían trabajar sinergísticamente para expander las respuestas de células T in vi vo .

El nivel de IFN-? y ß-quimiocinas MlP-la, MlP-lß y la producción de RANTES por CTLs estimuladas soportan además estos resultados, indicando que las señales ICAM-l/LFA-1 trabajan independientemente de las señales CD86/CD28 y trabajan en forma concordante para expander las respuestas de células T. Cuando se analizó el sobrenadante de las células T efectoras usando los métodos descritos anteriormente, se observó que la co-administración de los genes LFA-3 y CD86 resultó en un nivel dramáticamente superior de IFN-?, MlP-la, MlP-lß y RANTES. Estos resultados implican además la naturaleza sinergística de ICAM-1 y CD86 en la activación de células T.

Discusión Durante la respuesta inmune o inflamatoria, los linfocitos se transportan al sitio de exposición de antígeno. Las moléculas de adhesión o linfocitos y las células endoteliales juegan un papel importante en la proporción del contacto celular directo y la dirección de la migración de los leucocitos. Además, las moléculas de adhesión juegan un papel importante en el enlazamiento de los linfocitos T a APCs. ICAM-1 (CD54) es una molécula de 90-114 kD que se expresa en las células endoteliales, macrofagos y células dendríticas y se enlaza a LFA-1 y Mac-1. Casi todos los leucocitos, incluyendo linfocitos T expresan LFA-1, mientras que la expresión de Mac-1 se restringe más a monocitos, macrofagos y granulocitos. LFA-3 (CD58) es una molécula superficial de 55-70 kD expresada por varios tipos de células incluyendo APCs (Springer, T.A., et al. 1987 Ann . Rev . Imm unol . 5:223-252, que se incorpora aquí por referencia) . La molécula-1 de adhesión celular vascular (VCAM-1) es una molécula superficial de 110 kD que se expresa en células e?doteliales activadas y células de músculo liso (Osborn, L., et al. 1989. Cel l . 59:1203-1211 que se incorpora aquí por referencia) . VCAM-1 reconoce y enlaza al antígeno-4 muy tardío (VLA-4) que se expresa constitutivamente en la mayoría de los leucocitos mononucleares, incluyendo los eosinófilos, línfocitos, monocitos y basofilos, pero está ausente en los neutrófilos (Elices, M.J., et al. 1990 Cel l . 60:577-584, que se incorpora aquí por referencia) . La interacción VCAM-l/VLA-4 juega un papel importante en la migración de leucocitos y la diapédesis.

En es.te estudio, se utilizó un modelo de inmunógeno de ADN para investigar los papeles de estas moléculas de adhesión de superficie celular para proporcionar señales estimuladoras requeridas para la activación y la expansión de células -T . En un modelo de activación de células T de dos señales, la señal de activación primaria se regula por la ligación de los complejos MHC de péptidos antigénicos al receptor de células T. La señal de co-es timulación secundaria se proporciona a través de la ligación de las moléculas de co-estimulación CD80/CD86 con sus receptores (CD28/CTLA-4 ) presenten en las células T. Aunque este modelo de dos señales es conceptualmente lineal-hacia adelante y bien soportado por los resultados experimentales, las señales co - e s t imu 1 a do r a s proporcionadas durante el proceso de activación de células T, no podría restringirse sólo a moléculas B7 (CD80/CD86) . Las moléculas de superficie celular adicional tal como las moléculas de adhesión en los APCs también podrían tener una función importante en la proporción de la co-estimulación, y sus papeles en la proporción de señales directas a las células CD4+ y CD8+ están bajo investigación.

Las moléculas de adhesión son importantes en la migración de leucocitos, recuperación de células inflamatorias y supervivencia inmunes. Recientemente, se ha sugerido un papel para las moléculas de adhesión en la activación de células T. Se investigó el papel usando un subgrupo de molécula de adhesión que se enlazan a ligandos en las células T. Se eligieron tres moléculas relacionadas ICAM-1 (CD54), LFA-3 (CD58) y VCAM-1 (CD106) . Utilizando casetes de expresión de ADN que codifican ICAM-1, LFA-3 y VCAM-1 junto con los inmunógenos de ADN, se buscó identificar los efectos específicos de la co-expresión de las moléculas de adhesión junto con los antígenos. Se observó que las respuestas de células T específicas de antígeno (células CD4+ y CD8+) pueden mejorarse por la coexpresión de moléculas de adhesión e inmunógeno de ADN ICAM-1 y LFA-3. La co-expresión de las moléculas de ICAM-1 o LFA-3 junto con los inmunógenos de ADN resultó en un mejoramiento significati o de las respuestas proliferativas de células Th. Además, la co-inmunización con pCICAM-1 (y más moderadamente con pCLFA-3) resultó en un mejoramiento dramático de las respuestas CTL restringidas de CD8. Estas observaciones se soportaron adicionalmente por el descubrimiento de que la coinyección con LFA-3 aumentó el nivel de producción de IFN-Y así como las ß-quimiocinas MlP-la, MlP-lß y RANTES por las células T CD8+ estimuladas. Más impresionantemente, la co-inmunización con ICAM-1 resultó en un mejoramiento más dramático de IFN-? y ß-quimiocinas. También es importante observar que el aumento del contacto celular o- la yuxtaposición de las células solas, no se permitió para mejorar las respuestas mediadas por células T específicas de antígeno. Anque ICAM-1 y VCAM-1 tienen tamaños moleculares similares, la co-inyección con VCAM-1 no tuvo ningún efecto mesurable sobre las respuestas de células T. Por otro lado, la co-expresión de ICAM-1 mejoró dramáticamente el nivel de las respuestas de células CD4+ y CD8+. Estos resultados implican que los efectos estimuladores de las células T no son inherentes a sus propiedades de adhesión o el tamaño de la molécula. Es interesante que las moléculas de adhesión que dirigen la CTL que mejoraron las CTLs (ICAM-1 y LFA-3) se expresan en una variedad de APCs. De hecho, podría ser importante que la mejor CTL que induce la molécula de adhesión, ICAM-1, se exprese en las células dendríticas.

También se comparó la inducción mejorada de las CTLs con la mejorada de la expresión CD86. Se observó que combinando la expresión de las moléculas CD86 con ICAM-1, pero no las moléculas LFA-3 podría mejorar las respuestas CTL específicas de antígeno. Estos resultados se soportaron además por la producción significati amente mejorada de IFN-? así como las ß-quimiocinas MlP-la, MIP- lß y RANTES que juegan importante papel en la activación inmune en la periferia. Aunque la elucidación del significado biológico de estas moléculas requiere estudios adicionales, un estudio reciente encontró una relación entre las quimiocinas MlP-lß y RANTES y la respuesta de CTL. Aunque los estudios adicionales podrían proporcionar más idea en el papel de co-es timulación de estas moléculas, estos resultados indican que las moléculas ICAM-1 pueden proporcionar las señales de co-est imulación de células T a través de una ruta independiente a CD86, y podrían trabajar sinergísticamente para amplificar el nivel total de las señales de co-es timulación proporcionadas por las células T.

En general, estos resultados soportan que las moléculas de adhesión, ICAM-1 y LFA-3 pueden proporcionar señales co-es timuladoras importantes, que indican que el modelo de dos señales simple de la activación de las células T, aunque conceptualmente útil, podría ser incompleto, y un modelo más nuevo con las fuentes múltiples de co-es timulación debería estudiarse y considerarse adicionalmente. Estos resultados también indican que se garantizan los estudios adicionales enfocados a utilizar la función de co-estimulación de células T de otras moléculas de superficie celular.

Un resultado importante con respecto a estos estudios, es exactamente en donde están estas moléculas funcionando para mejorar la respuesta inmune celular. Los estudios recientes han reportado que la inyección del ADN del plásmido, con menos eficiencia, puede transferir APCs residentes incluyendo macrofagos y células dendríticas . Estos resultados se soportan además por estudios que usan las quimeras de médula ósea que ilustran el requerimiento para las células derivadas de médula ósea para cebar las respuestas inmunes de ADN. Es consiste con la literatura que alguna co-es timulación observada en el estudio se puede presentar a través de la transfección y el cebado de las células T mejorado por las APCs profesionales residentes .

Junto con los reportes previos, estos resultados soportan el papel para ICAM-1 y LFA-3 en la coestimulación de células T. Parece que la LFA-3 tiene efectos particulares en las respuestas de Clase II, mientras que en general, la ICAM-1 fue un accionador dramáticamente fuerte de la inducción CTL y la función efectora CD8+ como se demuestra por la producción mejorada de las ß-quimiocinas. Estos resultados también soportan una hipótesis concordante para la recuperación y expansión de los efectores de células T en la periferia. Se reportó recientemente que además de sus funciones quimioatrayentes, las quimiocinas regulan la modulación y expansión de las respuestas inmunes específicas de antígeno en el sitio de la periferia. Se observó que las células efectoras T CD8+ controlan los niveles de expresión de quimiocina mientras que ceban las respuestas inmunes. De esta manera, en la quimiotaxis, las quimiocinas regulan el movimiento de los linfocitos a través del gradiente de concentración. Además, la redistribución conmensurada de la expresión de la molécula de adhesión proporciona el contacto directo célula a célula en la dirección de los linfocitos a la periferia. Además, la expresión de las moléculas de adhesión se modulan por varias citocinas y quimiocinas inflamatorias. Por ejemplo, IFN-? y TNF-a se han mostrado que sobre-regulan la expresión de ICAM-1 en las células endoteliales y del músculo .

Las células T efectoras CD8+, por lo tanto elaboran quimiocinas que reclutarían más células APCs y T al sitio de inflamación. Estas células T se estimularían por la producción de ß-quimiocina para mejorar la expresión de las moléculas de adhesión que podrían servir para dirigir la producción de IFN-? y permitir la co-es timulación de células T. De esta manera, una vez en el sitio de inflamación, estas CTLs efectoras puede regularse además a través de la expresión de las quimiocinas específicas y las moléculas de adhesión que expandirían el nivel de la función efectora. Estos resultados soportan que las células T efectoras de etapa terminal en la fase de expansión de una respuesta inmune específica de antígeno, podrían dirigir su densidad a través de la expresión coordinada y la liberación de estas moléculas.

Ej emplo 6 Las moléculas de adhesión y coestimulación inducen las respuestas inmunes específicas de antígeno distintas y mejoran la inmunidad protectora contra virus-2 herpes simple in vivo El ligando CD40 y las proteínas asociadas de función leucocito (LFA) en las células T, interactúan con las moléculas de adhesión CD40 e intercelulares (ICAM) sobre APC, respectivamente. Se co-inmunizó con las moléculas co-es timuladoras CD40 y el ligando CD40, y las moléculas de adhesión LFA-3 e ICAM-1, y después se analizaron los efectos moduladores inmunes sobre una vacuna de plásmido gD, y sobre la protección contra la estimulación letal con HSV-2. Se observó que .la producción de IgG específica de gD se mejoró significativamente por la co-inyección con LFA-3. Sin embargo, se observó poco cambio en la producción de IgG por co-inyección c on CD40, ligando CD40 •e ICAM-1. Además, las respuestas celulares de tipo Thl se dirigieron por el ligando CD40, mientras que las respuestas inmunes de Thl y Th2 se dirigieron por LFA-3. La co-liberación con el ligando CD40 y LFA-3 también mejoró la tasa de supervivencia de la estimulación HSV-2 letal. Estos estudios demuestran que las moléculas de coestimulación y adhesión tienen distintas rutas de coestimulación y que juegan un papel importante en la generación de inmunidad específica de antígeno protectora.

Los papeles específicos de las moléculas de adhesión y co-es timuladoras en la inducción de las respuestas inmunes específicas de antígeno, se probaron así como el efecto de la vacuna para usar la molécula co-est imuladora y de adhesión como parte de la liberación del plásmido para dirigir la inmunidad protectora inducida por la vacuna de ADN en un sistema de modelo de estimulación de HSV-2 de ratón. Se observó que las moléculas de adhesión y co-es timuladoras modulan diferentemente las respuestas inmunes específicas de antígeno. En particular, la coliberación con la molécula co-es t imuladora , el ligando CD40 y la molécula de adhesión, la actividades de las células T CD8+ significativas inducidas por LFA-3 de una manera dependiente de antígeno y mejoró la supervivencia de la estimulación HSV-2 letal.

Materiales y métodos Ra t on es - Ratones BALB/c hembra de 4 a 6 semanas de edad se adquirieron en Harían Sprague-Dawley ( Indianapolis , Ind.) . Se cuidaron bajo la guía de la National Institutes of Health (Bethesda, Md) y la Universidad de Pennsylvania IACUC (Philadelphia, Pa) .

Rea c t i vos : La cepa 186 de HSV-2 (un tipo de obsequio de P. Shaffer, Universidad de Pennsylvania, Philadelphia, Pa.) se propagó en la línea celular Vero (American Type Culture Collection, Rockville, Md..) . Las proteínas HSV-2 gD recombinantes se usaron como los antígenos recombinantes en estos estudios. La línea celular de rabdomiosarcoma de humano (RD) se obtuvo de ATCC (Rockville, Md. ) .

Prepa ra ci ón de pl ásm i dos y ADN : La vacuna de ADN, pAPL-gD2 que codifica la proteína HSV-2 gD, se preparó como se describe en Pachuk, et al, 1998 Current topics Microbiol. Immunol . 226, 79, que se incorpora aquí por referencia. El ADNc para CD40 y el ligando CD40, LFA-3 e ICAM-1 se clonaron en el vector de expresión pCDNA3 para producir pCDNA3-CD40, el ligando pCDNA3-CD40, pCDNA3-LFA y pCDNA3-ICAM-l, respectivamente. El ADN del plásmido se produjo en bacterias y se purificó por preparaciones de CsCl de banda doble.

Expresi ón in vi tro de la s cons trucci ones CD40 y l i ga n do CD40 : La expresión de las construcciones CD40, ligando CD40, LFA-3 e ICAM-1 se analizaron transfiriéndolas en células RD. Las células se cosecharon 72 horas después de la transfección y se probaron para la expresión usando el análisis FACS con anticuerpos monoclonales conjugados de isotiocianato de fluoresceína (FITC) para LFA-3, ICAM-1, CD40 y ligando CD40 (Pharmingen, San Diego, CA) .

In o cu l a ci ón de ADN de ra t on es - Los músculos cuadríceps de ratones BALB/c se inyectaron con construcciones de gD de ADN formuladas en 100 µl de solución salina amortiguada con fosfato y 0.25% de bupi vacaína-HCl (Sigma, St. Louis, MO) . por vía de una aguja de calibre 28 (Becton Dickinson, Franklin Lakes, N.J.) . Las muestras de varios casetes de expresión del gen de quimiocina y citocina se mezclaron con solución del plásmido pgD antes de la inyección. La co-administración de varios casetes de expresión del gen involucrados hacen los plásmidos elegidos antes de la inyección ELISA - La prueba inmunoabsorbente de enlace de enzima (ELISA) se realizó para determinar los niveles relativos de las subclases IgG específicas de gD usando IgGl anti-murino y IgG2a conjugado con HRP (Zymed, San Francisco, CA) . Los tituladores de ELISA se determinaron como la inversa de la dilución del suero más alta que muestra JLa misma densidad óptica como el suero de los ratones ingenuos .

Quimi o cina s - ci t ocina s de t ipo Th l y Th2 - Una alícuota de 1 ml de contiene 6xl06 esplenocitos se adicionó a los pozos de las placas de 24 pozos. Después, 1 µg de la proteína HSV-2 gD/ml se adicionó a cada pozo. Después de 2 días de incubación a 37°C en 5% de C02, los sobrenadantes celulares se aseguraron y después se usaron para determinar los niveles de IL-2, IL-10, IFN-?, RANTES, MCP-1 y MlP-la usando los estuches de citocina comerciales (Biosource, Intl., Camarillo, Ca. and R&D Systems, Minneapolis, Md.) adicionando los fluidos extracelulares a las placas de ELISA específicas de citocina o quimiocina .

Es t im ul a ci ón HSV-2 In t ra va gi n a 1 - Antes de la inoculación del virus, el área intravaginal se limpió con un aplicador de punta de algodón (Hardwood Products Company, Guiford, ME) se enjuagó con solución de NaOH al 0. ÍM y después se limpió con aplicadores de algodón secos.

Después se examinaron los ratones diariamente para evaluar las tasas de supervivencia.

Anál isi s es ta di s ti co - El análisis estadístico se hizo usando la prueba de Student apareada y ANOVA. Se compararon los diferentes valores entre los grupos de inmunización. Se consideraron significativos valores p<0.05.

Resultados CD40, ligando CD40, LFA-3 e ICAM-1 pueden expresarse por células transfectadas - Los genes para CD40, ligando CD40, LFA-3 e ICAM-1 se clonaron individualmente en el vector de expresión pCDNA3. Para probar si las construcciones de CD40, ligando CD40, LFA-3 e ICAM-1 podrían expresar sus proteínas relevantes, se transfirieron in vi t ro en células RD de humano. Usando el análisis FACS se observó que la transfección de los casetes de expresión de CD40, ligando CD40, LFA-3 e ICAM-1, resultó en la expresión específica de CD40, ligando CD40, LFA-3 e ICAM-1, respectivamente. Las células RD se transfirieron con pCDNA3 (control) o pCDNA3 que expresa CD40, ligando CD40, LFA-3 e ICAM-1. Tres días después de la transfección, las células se removieron de las placas y se analizaron por el análisis FACS usando anticuerpos a-CD40, ligando a-CD40, a-LFA-3, a-ICAM para detectar la expresión del producto del gen de transfección .

LFA-3 mejora la respuesta gG sistémica - Para determinar si la co-inyección de las vacunas genéticas gD con los vectores de expresión de CD40, ligando CD40, LFA-3 e ICAM-1 podrían influenciar las respuestas IgG sistémicas contra gD, se probó en ELISA la dilución por cien de suero después de la inoculación de ADN. Cada grupo de ratones (n = 8) se inmunizó dos veces con vacunas de gD de ADN (60 µg) más los genes de moléculas co-estimulantes (40 µg) . Los ratones se sangraron 2 semanas después de la segunda inyección de ADN y después el suero se diluyó a 1:100 para la.reacción con gD. La co-inyección con la vacuna de gD de ADN (60 µg por ratón) más CD40 o ADNs de plásmido de ligando de CD40 (40 µg por ratón) no tuvo efecto significativo sobre los niveles globales de IgG. Igualmente, el suero vertido por grupo se diluyó serialmente para determinar el titulador ELISA. Los tituladores ELISA de igualmente 2 semanas vertidos después de la segunda inmunización, también se determinaron como 6,400 (CD40), 6,400 (ligando CD40) y 6,400 (vacuna sola de gD de ADN) . También se observó el resultado similar cuando se probó el suero obtenido 1 mes después de la coinyección una vez con vacuna gD de ADN (10 µg por ratón) más estas moléculas co-estimulantes (40 µg por ratón) .

Los ratones (n = 8) se inmunizaron con vacunas gD de ADN (60 µg) más los genes de moléculas de adhesión LFA-3 (40 µg) a 0 y 2 semanas. Los ratones se sangraron cada dos semanas el suero se diluyó a 1:100 para la reacción con gD. La co-inyección con LFA-3 ADNc mejoró las respuestas IgG sistémicas significativamente mayor que la vacuna de gD de ADN sola, mientras que se observó muy poco cambio co-inyect ando ICAM-1 ADNc. Igualmente, el suero vertido por grupo se diluyó serialmente para determinar el titulador ELISA. La densidad óptica se midió a 405 nm . Los valores y las barras representan la media (n = 8) y la desviación estándar. Los tituladores de ELISA se determinaron que eran el inverso de la dilución más alta que muestra la misma densidad óptica como el suero de los ratones ingenuos. Los tituladores de. ELISA de igualmente 2 semanas vertidos después de la segunda inmunización, también se determinaron como 25,600 (LFA-3), 6,400 (ICAM-1) y 6,400 (vacuna de gD de ADN sola) .

El ligando CD40 y LFA-3 influencia el patrón de isótopo IgG. Las subclases IgG dan una indicación de la naturaleza Thl vs Th2 de las respuestas inmunes inducidas. Se analizaron las subclases IgG inducidas por las coinyecciones con CD40, ligando CD40, LFA-3 e ICAM-1. Se midieron los niveles de isótopos IgG específicos de IgG en ratones inmunizados con vectores de ADN. Cada grupo de ratones (n = 8) se inmunizó dos veces con vacunas de gD de ADN (60 µg) más genes de moléculas co-estimulantes (40 µg) o los genes de moléculas de adhesión (40 g) . Los ratones se sangraron 2 semanas después de la segunda inyección de ADN y después el suero vertido igualmente por grupo se diluyó a 1:100 para la reacción con gD. La densidad óptica se midió a 405 nm . La co-inyección con los genes de ligando CD40 aumentó la producción relativa de IgG2a a IgGl específico de gD, mientras que la co-inyección con los genes CD40 mostró el patrón de isótopo IgG similar a la vacuna gD de ADN. Este cambio en la producción de IgG ilustra que una mayor respuesta de tipo Thl se induce por la co-inyección con sólo el ADNc del ligando CD40. Sin embargo, la co-inyección con LFA-3 aumentó los isótopos IgGl e IgG2a significativamente mayor que la vacuna de gD de ADN sola o la co-inyección de ICAM-1. Este aumento indica que las respuestas de tipo Thl y Th2 se inducen por la co-inyección con ANDc de LFA-3.

El ligando CD40 y LFA-3 mejoran las respuestas de proliferación de células Th - Las células auxiliares Th juegan un papel importante en la elucidación de las respuestas inmunes humorales y celulares por vía de la expansión de células B estimuladas por Ag y la expansión de células T CD8+, respectivamente. Como un indicador específico, se examinó la proliferación de células T de activación CD4. Es importante medir los niveles de proliferación de las células T obtenidas después de la coinmunización con genes de citocina cuando se estimulan i n vi t ro con un antígeno específico. La proteína gD-2 (1 y 5 µg/ml) se usó para la estimulación del antígeno específico de células T. Para un control positivo, 5 µg/ml de PHA se usó como un estimulador policlonal. Un nivel de estimulación bajo de la proliferación de células Th se observó en controles negativos. Sin embargo, la vacunación de gD de ADN indujo las respuestas de proliferación de células Th mucho más que los controles negativos. Cuando se co-inyectó con el ligando CD40 y ADNcs de LFA-3, los niveles de proliferación de células Th se estimularon adicionalmente. Sin embargo, se detectó poco aumento en las respuestas de células Th en animales co-inyect ados con CD40 e ADNCs de ICAM-1. Esta tendencia se observó durante dos diferentes concentraciones de antígeno gD probadas, reflejando que este efecto es el ligando CD40 y mediado por LFA-3. La vacunación del plásmido gD no resulta en las respuestas CTL debido a una carencia del epítope CTL en el origen Balb/c. Sin embargo, para evaluar los efectos celulares en mayor detalle se examinas posteriormente los perfiles de producción de citocina.

El ligando CD40 y LFA-3 inducen la producción de citocinas de Thl y Th2.

Las citocinas Thl (IL-2 e IFN-?) y las citocinas de tipo Th2 (11-4, IL-5 e IL-10) han sido un fundamente en el entendimiento de la polarización de las respuestas inmunes. Las respuestas inmunes Thl se piensa que dirigen la inducción de la inmunidad celular, mientras que las respuestas inmunes Th2 dirigen preferentemente la inmunidad humoral. De esta manera, se examina si la vacunación de gD de ADN con o sin moléculas co-es timuladoras induce las respuestas inmunes Thl o Th2. Se midieron los niveles de producción de IL-2, IL-10, IFN-?, RANTES, MlP-la y MCP-1 de los esplenocitos en los ratones co-inmunizados con las moléculas co-est imuladoras y las moléculas de adhesión. Cada grupo de ratones (n = 2) se inmunizó con vacunas de gD de ADN (60 µg) más genes de moléculas co-estimuladoras o genes de moléculas de adhesión (40 µg) a las 0 y 2 semanas. Dos semanas después de la última inyección de ADN, dos ratones se sacrificaron y las células del bazo se vertieron. Los esplenocitos se estimularon con 1 µg/ml de proteínas gD-2 durante 2 días. Las producciones de IL-2 e IFN-? se mejoraron significativamente por co-inyección con el ADNc de ligando CD40, mientras que la producción de IL-10 se redujo por esta co-inyección. Sin embargo, la co-inyección con CD40 más genes gD había aumentado ligeramente el efecto en IFN-? en esta prueba. Si embargo, las producciones de IL-2, IL-10 e IFN-? se mejoraron todas por co-inyección con LFA-3 de ADNc, significativamente superior que la vacuna de gD de ADN, mientras que la co-inyección con ICAM más genes gD había aumentado ligeramente el efecto en esta prueba. Esto soporta que el ligando CD40 dirige las respuestas inmunes hacia el fenotipo Thl, mientras que LFA-3 influencia los fenotipos inmunes Thl y Th2 in vi vo .

El ligando CD40 y LFA-3 influencian la producción de ß quimiosinas - Las beta quimiocinas (tipo CC) incluyendo RANTES (regulada en la activación, expresada y secretada en células T normales), MIP (proteína inflamatoria de macrofago) -la y MCP (proteína quimiotáctica de monocito (MCP) -1, se quimioenlazan particularmente a fagocitos monocíticos, y activan las células T, basofilos, eosinófilos y fagocito mononuclear así como una variedad de otros moduladores inmunes solubles. Como se compara con MCP-1, RANTES y MlP-la, también se reportaron como un factor supresor de VIH principal. Estas moléculas se piensa que son importantes en las modulación de las respuestas inmunes. Sin embargo, su papel directo en las enfermedades infecciosas está bajo investigación. Se desconoce la relación de las moléculas CD40, ligando CD40, LFA-3 e ICAM-1 como un adyuvante de vacuna a la producción de quimiocina in vi vo . Se investigaron los niveles de quimiocinas (RANTES, MCP-1 y MlP-la) inducidos por co-inyección con vacuna de gD de ADN más ADNcs, del ligando CD40, CD40, LFA-3 e ICAM-1. La vacuna de gD de ADN solo mejoró la producción de RANTES, MCP-1 y MlP-la de una manera específica de antígeno. Además, la co-inyección con el ADNc de ligando CD40 mejoró la producción de RANTES y MlP-la significativamente superior que la vacuna de gD de ADN sola. Por el contrario, la producción de MIP-1 no se afectó por la co-inyección del ligando CD40. Sin embargo, la co-inyección con las moléculas CD40 disminuyó ligeramente aumentando el efecto en la producción de la ß quimiocina. Los resultados mostraron que la co-inyección con LFA-3 de ADNc mejoró la producción de RANTES y MlP-la significativamente mayor que la vacuna de gD de ADN sola. Similarmente, la producción de RANTES y MlP-la se mejoró por la co-inyección de ICAM-1. Por el contrario, la producción de MCP-1 se inhibió por la co-inyección de ICAM-1. Esta modulación soporta que las moléculas co-es timuladoras y de adhesión pueden tener efectos específicos sobre la producción de miembros individuales de la familia de la ß-quimiocina .

El ligando CD40 y LFA-3 mejoran la producción de la estimulación HSV intravaginal (i. vag . ) . Una dosis letal (LD)50 de HSV-2 (186) se midió previamente. Para determinar sí se usan ADNcs de CD40, el ligando CD40, LFA-3 e ICAM-1 como un adyuvante molecular en la .vacunación genética de gD podría influenciar la producción de la estimulación de HSV-2, los ratones se inmunizaron con vacunas de ADN y los ADNcs de las moléculas de co-es timulación y de adhesión individuales, y después se estimuló i. ag. con 4 LD50 de HSV-2. La ruta de infección intravaginal se eligió como las infecciones HSV-2 mucocut éneamente y las causas de infecciones urogenitales. Se midieron las tasas de supervivencia de los ratones inmunizados dos veces con vacunas de gD de ADN más los genes de moléculas de adhesión o co-es timuladores . Cada grupo de ratones (n = 10) se inmunizó sólo con vacunas de gD de ADN (10 µg) más los genes de moléculas de adhesión y co-estimuladoras •( 40 µg) . Cuatro semanas después de la inmunización con ADN, los ratones se estimularon i. vag. con 4 LD50 de cepa HSV-2 186 (1.4x1o4 pfu) . Cuando los ratones se inmunizaron con la vacuna de gD de ADN, se observó 60% de la supervivencia, pero todos los ratones ingenuos murieron dentro de los 13 días después de la estimulación viral. Sin embargo, la co-inyección con el ligando CD40 aumentó la tasa de supervivencia a 100%, un mejoramiento del 40% de la velocidad de protección, mientras que la coinyección con ADNc de CD40 mostró los efectos protectores mínimos, comparado con la vacuna gD de ADN sola. Además, la co-inyección con ADNc de LFA-3 aumentó la supervivencia de los ratones a 90%. Sin embargo, la co-inyección con ADNc de ICAM-1 mostró ligeramente mejores efectos sobre la producción de la infección HSV-2.

Discusión Durante la presentación del antígeno, las moléculas co-estimuladoras de APC son importantes para la iniciación y diferenciación de las respuestas de células T. En particular, la interacción CD40L-CD40 induce la expresión B7 e IL-12 de APC. IL-12 también mejora la expresión del ligando CD40 de las células T, mientras que IFN-? inhibe la expresión del ligando CD40, indicando que podría ser un mecanismo de auto-regulación para la inducción del ligando CD40 sobre las células T. Además, las citocinas, IL-2 e IL-4 también mejoran la expresión del ligando CD40 en las células T estimuladas por anti-CD3, indicando que existe una regulación cooperativa entre las moléculas co-estimuladoras y las citocinas en la mediación de las respuestas inmunes i n vi vo . Además, la interacción del ligando CD40-CD40 aumenta las respuestas del anticuerpo dependiente de las células Th, la producción de las citocinas pro-inflamatorias, y se requiere para las actividades tumoricidales y microbicidales del macrofago. En particular, el ligando CD40 no se expresa en las células T resultantes, sino que se induce por los procesos de funcionamiento de CD3-TCR. CD40 (glicoproteína de 45 a 50 kDa) es un miembro de la superfamilia del receptor TNF y se expresa en las células B, monocitos y células dendríticas. Sin embargo, su ligando, el ligando CD40 (gp39) es una proteína de transmembrana de tipo II con homología de la secuencia a TNF-a y se expresa transientemente sobre las células T activadas. Sin embargo, la interacción de la molécula de adhesión, LFA-3 en las células T con ICAM-1 en APC se regula altamente por el cambio de confirmación de la LFA-3 con una alta afinidad y disponibilidad para ICAM-1. Se conoce que la co-estimulación de LFA-3 en el contexto con el anticuerpo monoclonal CD3 o Clase II más el antígeno, resulta en la proliferación de células T y la producción superior de una variedad de citocinas de la células T. Además, la interacción de LFA-3 con ICAM-1 acciona las rutas de la señal. Como se compara con las moléculas de ligando CD40/CD40 co-estimuladoras, la co-locali zación de estas moléculas de adhesión y el anticuerpo anti-CD3 o anti-TCR sobre la superficie, es necesario para la señalización apropiada para las células T.

La co-inyección de las moléculas atrayentes o de estimulación APC junto con las vacunas de ADN, resulta en una inducción más eficiente de los brazos de inmunidad. En la inyección intramuscular (i.m.), el ADN se toma en miofibras con la expresión endógena subsecuente, conduciendo a la presentación de una forma natural de antígeno para el sistema inmune. Los antígenos secretados se ingieren por la fagocitosis y después se presentan como un complejo peptídico MHC II por los macrofagos que pueden proporcionar la señal de activación primaria, los ligandos de co-estimulación y las citocinas necesarias para la estimulación de las células T nativas. La evidencia reciente también soporta la transfección directa de APC in vi vo después de la liberación i.m. o la piel de las vacunas de ADN. La co-inyección de las vacunas de ADN con las moléculas co-estimuladoras, tal como B7.1 y B7.2, mejoró dramáticamente las respuestas inmunes celulares específicas de antígeno, tal como las respuestas de proliferación de células Th y las actividades de células T citotóxicas. Similarmente, la co-inyección con genes GM-CSF mejora las respuestas inmunes de anticuerpos y celulares en los modelos de vacunas de ADN viral. La co-inyección con pLacZ más ADNcs de ligando CD40 mejora la respuesta humoral y celular, en particular CTL en un antígeno de manera dependiente. Sin embargo, no hubo estudios de estimulación HSV por vía de la co-liberación con moléculas de adhesión y co-est imulación . También sería interesante comparar estas dos diferentes rutas en la inducción de las respuestas inmunes específicas de antígenos y la inmunidad protectora contra HSV-2.

No se observó aumento significativo en la producción de IgG específica de gD a través de la modulación de vacunas con los genes de CD40 y ligando CD40. Sin embargo, no es compatible con el descubrimiento previo que la coinyección con el ligando CD40 mejoró la producción de anticuerpo para un antígeno, cuando se liberó con el vector de ADN (ß-galactosidasa) . Esta discrepancia podría ser debido a la naturaleza de los antígenos probados. Sin embargo, existe un descubrimiento similar en el cual el patrón de producción del isótopo IgG similar, se indujo por la co-inyección con la co-inyección del ligando CD40. En los estudios, la co-liberación con el ligando CD40 indujo un aumento significativo en la producción de IgG2a, comparado con el isótopo IgGl que se cree que se modula por las respuestas inmunes de tipo Thl. Esto implica que la polarización de las respuestas inmunes específicas de gD al tipo Thl", se logra co-inyectando los vectores del plásmido que dirigen la expresión del ligando CD40. Por el contrario, el aumento significativo en la producción IgG específica de gD se observó co-inyectando con LFA-3, como se comparó con la vacuna de gD de ADN sola o la co-inyección de ICAM-1. Esto indica que LFA-3 podría mejorar las respuestas del anticuerpo in vi vo . También se observó que la co-inyección con LFA-3 mejoró la producción de los isótopos Thl y Th2 indicados por la producción aumentada de los isótopos IgGl e IgG2a, que implica que LFA-3 podría dirigir las respuestas inmunes Thl y Th2 i n vi vo .

'La proliferación aumentada de células Th se logró coinyectando los ADNs del plásmido que codifica el ligando CD40. Esto es nuevamente compatible con los descubrimientos previos en otros modelos que las moléculas del ligando CD40 aumentan la proliferación de células Th específicas de antígeno y la producción de IFN-? así como •las respuestas CTL. Este patrón está en línea con los niveles de producción de citocina observados como la co- inyección con el ADNc del ligando CD40, que mejoró la secreción de IL-2 e IFN-?, pero inhibió la producción de IL-10. De esta manera, el uso del ADNc del ligando CD40 en la vacunación de gD de ADN, fue efectiva para polarizar las respuestas inmunes con respecto al fenotipo Thl, aumentando la inmunidad mediada por las células. Sin embargo, la co-inyección con la producción mejorada de "LFA-3.de IL-2, IL-10 e IFN-? mientras se co-inyectó con ICAM-1, mejoró ligeramente la producción de citocina. Esto soporta el patrón del isótopo IgG que dirige las respuestas inmunes LFA-3 a los fenotipos Thl y Th2.

Las quimiocinas se han reportado recientemente que juegan un papel importante de una manera reminiscente de citocínas en las respuestas inmunes e inflamatorias. La enfermedad inflamatoria ocular mediada por la infección de HSV, se suprimió por la administración tópica de la proteína citocina de tipo Th2 (IL-10) . Esta aplicación resultó en la producción de quimiocina suprimida. La enfermedad (inflamación en el ojo) también se disminuyó por inyección con anti-MIP, pero no MCP-1, indicando que MlP-la nuevamente segrega como una quimiocina de tipo Thl. Sin embargo, el papel de las quimiocinas en el estado infeccioso está bajo investigación. Es este estudio, la producción de RANTES y MlP-la se mejoró co-liberando el ligando CD40 mayor de CD40, sugiriendo que las moléculas del ligando CD40 juegan un papel importante en la producción de ß-quimiocina de las células T. LFA-3 e ICAM-1 mejoraron la producción de MlP-la y RANTES. Por el contrario, la producción de MIP-1 no se afectó por LFA-3 o se inhibió por ICAM-1, indicando que las moléculas de adhesión también podrían regular la producción de ß-quimiocína in vi vo .

Se ha reportado que las respuestas inmunes humorales y celulares podrían ser responsables para la inmunidad protectora contra la infección de HSV. La inmunización pasiva con los anticuerpos monoclonales específicos de HSV resultó en la protección de la infección de HSV letal.

Durante la infección viral, los anticuerpos neutralizantes pueden inactivar las partículas virales libres, pero no son capaces de inhibir la infección de HSV intracelular.

Parece que la citotoxicidad mediada por células dependiente de anticuerpos y mediada por complemento dependiente de anticuerpos (ADCC) son insuficientes para controlar la infección de HSV. De esta manera, se ha sugerido que la inmunidad mediada celular específica de HSV podría jugar una función efectora principal para erradicar las células infectadas por HSV y controlar la infección HSV. Ha sido bien documentada la importancia de las respuestas inmunes celulares mediadas por las células T CD4+ y/o CD8+ sobre el control de la infección HSV.

Se observó que la co-inyección con las moléculas de ligandos CD40 induce significativamente la protección mejorada de la mortalidad que resulta de la infección de HSV-2. Esto sugiere que existe una correlación positiva entre la inmunidad protectora y la inmunidad celular de tipo Thl, que se soporta por las respuestas de proliferación celular Th aumentadas y los niveles de producción de IFN-? cuando se co-inyectan con las moléculas de ligandos CD40. La observación es compatible con el descubrimiento previo que la co-inyección con el ligando CD40 mejora la inmunidad contra la. estimulación con Lei shma n i a maj or o con antígeno de expresión de tumor metastático. También se observó que la LFA-3 induce significativamente la protección mejorada de la mortalidad que resulta de la infección de HSV-2. Parece que el mejoramiento de LFA-3 de la inmunidad celular y/o humoral es responsable para reducir la mortalidad derivada de HSV-2 en este sistema. También es posible que el ligando CD40 o IFN-? inducida por LFA-3 podría ser parcialmente responsable para la actividad anti-HSV-2 i n vi vo . De esta manera, el ligando CD40 y LFA-3 de inmunidad celular y humoral dirigida parece que se correlaciona con la protección de la infección de HSV.

En conclusión, los resultados presentados aquí sugieren que las moléculas de co-es timulación y adhesión tienen diferentes rutas co-estimuladoras en la inducción de las respuestas inmunes específicas de antígenos. En particular, el ligando CD40 dirige las respuestas inmunes a un tipo Thl, mientras que LFA-3 favorece los tipos Thl y Th2 inmunes. Tales actividades se han asociado previamente con las citocinas. Estos resultados indican que las moléculas co-estimulantes tienen tanto papel central como las citocina en la inducción de la inmunidad específica de antígeno. También el ligando CD40 y LFA-3 regulan la protección mejorada contra la estimulación HSV-2 letal en la vacunación de gD de ADN. Este descubrimiento amplia nuestras armas para las enfermedades infecciosas.

Ejemplo 7 Se analizaron los efectos moduladores de las quimiocinas (IL-8, IP-10, RANTES, MCP-1, MlP-la) sobre el fenotipo inmune y la protección contra la estimulación letal con HSV-2. Se observó que la co-inyección de IL-8 y RANTES mejoraron dramáticamente las respuestas inmunes específicas de antígeno y la protección de la estimulación de HSV-2 letal. Sin embargo, la co-inyección con MCP-1 e IP-10 aumentó la mortalidad de ios ratones estimulados. Estos estudios demuestran que las quimiocinas pueden dominar y dirigir las respuestas inmunes de una manera más reminiscente de las citocinas, que juegan un papel importante en la generación de inmunidad protectora específica de antígeno.

La iniciación de las reacciones . inmunes o inflamatorias es un proceso complejo que involucra la expresión coordinada de las moléculas co-estimuladoras, las moléculas de adhesión, las citocinas y las quimiocinas. En particular, las quimiocinas son importantes en la regulación molecular del .transporte de las células inmunes a los sitios periféricos de las defensas del huésped. La superfamilia de las quimiocinas consiste de dos subfamilias basadas en la presencia (o familia) o ausencia (familia ß) de una secuencia de aminoácido simple que separa dos residuos de cisteína. Las quimiocinas a y ß se han mostrado que inducen la migración directa de varios tipos de células inmunes, que incluyen neutrófilos, eosinófilos, basófilos y monocitos. Recientemente, la (familia de quimiocina (tipo CXC), interleucina (IL)-8 y la proteína inducible interferón-? (IP)-IO y la familia de ß-quimiocina (tipo CC), RANTES (reguladas en la activación, células T normales expresadas y secretadas), proteína quimiotáctica de monocito (MCP)-l y la proteína inflamatoria de macrofago (M?P)-la, se han mostrado .que quimioatraen a los linfocitos T. En particular, IL-8 e IP-10 se han conocido que quimioatraen neutrófilos, induciéndolos para salir de la corriente sanguínea y emigrar en los tejidos circundantes. Similarmente, RANTES quimioatrae a los monocitos, células T de la memoria CD4+/CD45RO+ no estimuladas y células T CD8+ y CD4+ estimuladas. MlP-la se ha conocido que quimioatraen y desgranulan los eosinófilos. MlP-la también induce la liberación de histamina de los basófilos y los mastocitos y quimioatrae los basófilos y las células B. MCP-1 es una quimiocina importante en la enfermedad inflamatoria crónica. MCP-1 induce los monocitos para emigrar desde la corriente sanguínea hasta llegar a los macrofagos del tejido. MCP-1 también quimioatrae los linfocitos T del subgrupo de la memoria activado. Los estudios recientes soportan que los receptores de quimiocina marcan los subgrupos de las células T y tales quimiocinas podrían involucrarse en la generación de las respuestas inmunes específicas de antígeno Para investigar a modulación de las respuestas inmunes y la inmunidad protectora, se co-liberó una construcción de expresión de ADN que codifica la proteína HSV-2 gD con los plásmidos que codifican las quimiocinas (IL-8, IP-10, RANTES, MCP-1, MlP-la) . Después se analizaron sus efectos moduladores en la inducción inmune específica de antígeno y la protección de la estimulación. Primero se investigaron los efectos in vi vo de las químiocinas seleccionadas sobre la inducción de las respuestas de anticuerpos específicos de antígenos. Como los controles, se inmunizaron animales con la vacuna gD y 2 citocinas proinflamatorias, los genes de la familia TNF (TNF-a y TNF-ß) . Estas citocinas proinflamatorias se estudiaron como se piensan que están involucradas similarmente en las respuestas inmunes previas y deberían servir como controles positivos. Se usó ELISA para medir los niveles de IgG específico de gD sistémicos en ratones (Balb/c) inmunizados con vectores de ADN. Cada grupo de ratones (n = 10) se inmunizó con vacunas de gD de ADN (60 µg por ratón) más genes de quimiocina (40 µg por ratón) o genes TNF (40 µ por ratón) a 0 y 2 semanas. Las construcciones de ADN que expresan antígenos gD y las quimiocinas se clonaron previamente (Pachuk, et al. 1998 Current topics Microbiol. Immunol. 226, 79; Kim et al. 1998 J. Clin. Invest. 102, 1112; y Kim et al. 1998 Eur-. J. Immunol . 28, 1089) . Los ratones se sangraron 2 semanas después de la segunda inmunización, y después el suero igualmente vertido por grupo, se diluyeron serialmente para la reacción con gD. Los tituladores de ELISA se determinaron como la inversa de la dilución del suero más alta que muestra la misma densidad óptica como el suero de ratones ingenuos. La absorbancia (O.D.) se midió a 405 nm . Los tituladores de ELISA de igualmente suero vertido colectado a 2 semanas después de la segunda inmunización, se determinaron como 12,800 para IL-8, 6,400 para IP-10, 6,400 para RANTES, 6,400 para MCP-1, 12,800 para MlP-la, 25,600 para TNF-a, 6,400 para TNF-ß y 6,400 para la vacuna de gD de ADN sola. Esto muestra que la co-inyección con los genes IL-8 y MlP-la resulta en un mejoramiento moderado, pero no significativo de los anticuerpos IgG específicos de gD. Por el contrario, IP-10, RANTES o MCP-1 mostraron niveles similares de las respuestas de anticuerpos para la de la vacunación pgD sola. El control TNF-a ADNc resultó en los niveles IgG sistémicos significati amente superiores que los de la vacuna de gD de ADN sola .

Se ha reportado que la inducción del isótopo IgGl se induce por las citocinas de tipo Th2, mientras que la producción del isótopo de tipo IgG2a se influencia y dirige in vi vo por las citocinas de tipo Thl. Esto se ha usado como un indicador para determinar si las respuestas inmunes están bajo el control de las citocinas Thl o Th2. Se analizaron las subclases IgG inducidas por las coinyecciones. Se midieron los isótopos IgG inducidos por el grupo de co-inmunización. Cada grupo de ratones (n = 10) se inmunizó con vacunas de gD de ADN (60 µg por ratón) más genes de quimiocina (40 µg por ratón) o genes TNF (40 µg por ratón) a 0 y 2 semanas. Los ratones se sangraron 2 semanas después de la última inmunización, y después los sueros se diluyeron a 1:100 para la reacción con gD. Para la determinación de los niveles relativos de las subclases IgG específicas de gD, IgGl, IgG2a, IgG2b o IgG3 antimurino conjugados con HRP (Zymed, San Francisco, CA) se sustituyeron para IgG-HRP anti-murino. La absorbancia (O.D.) se midió a 405 nm . La densidad óptica se calculó como la densidad óptica de cada subclase IgG/densidad óptica total. Las barras de la línea representan la media (n = 10) de las densidades' ópticas relativas de cada subclase de ratón IgG. Se midieron las relaciones relativas de IgG2a a IgGl (Thl a Th2) . El grupo inmunizado pgD tuvo una relación IgG2a a IgGl de 0.62. La co-inyección con los genes IL-8, RANTES o TNF-a aumentó la relación relativa de IgG2a a IgGl específica de gD a 0.8. Por otro lado, la co-inyección con IP-10 y MlP-la disminuyó la relación relativa de IgG2a a IgGl (0.3 y 0.4), mientras que la co-inmunización con los genes MCP-1 o TNF-ß resultó en un patrón de subtipo IgG similar a la vacunación pgD sola. Esta análisis soporta que IL-8 y RANTES dirigen las respuestas inmunes hacia el fenotipo Thl in vi vo de una manera similar a las citocinas de tipo IFN-?. De esta manera, estos resultados se extienden antes de los descubrimientos en el modelo de VIH que cambia en las respuestas inmunes humorales a Thl o Th2, podría modularse por las quimiocinas, nuevamente sugiriendo que las quimiocinas pueden modular la producción de la citocina in vi vo .

La proliferación celular es un parámetro estándar usado para evaluar la potencia de la inmunidad mediada por las células. Se midieron las respuestas proliferativas de células Th después de la co-inmunización con los genes de quimiocina estimulando los esplenocitos de los animales inmunizados in vi tro con las proteínas gD. Los niveles de proliferación celular de esplenocitos después de la estimulación gD i n vi tro en ratones (Balb/c) se coinmunizaron con ADNc de a-quimiocina , ADNc de ß-quimíocina y los controles de TNF. Cada grupo de ratones (n = 2) se inmunizó con vacunas de gD de ADN (60 µg por ratón) más genes de quimiocina (40 µg por ratón) o genes TNF (40 µg por ratón) a 0 y 2 semanas. Dos semanas después de la última inyección de ADN, dos ratones se sacrificaron y las células del bazo se vertieron para la prueba de proliferación. Los esplenocitos se estimularon con 1 y 5 µg de proteínas gD-2 por ml y 5 µg de PHA por ml como un control positivo. Después de 3 días de estimulación, las células se cosecharon y se contó cpm. Las muestras se probaron por triplicado. La muestra de control de PHA mostró un índice de estimulación de 40-50, la vacunación gD de ADN sola resultó en las respuestas proliferativas de células Th específicas de gD. También se observó el mejoramiento significativo de las respuestas proliferativas de células Th sobre la vacuna de gD de ADN sola por co-inyección con ADNcs de IL-8, RANTES y TNF-a. También se observó un ligero mejoramiento en la proliferación por co-inyección con genes de TNF-ß. Por el contrario, la co-inmunización con genes IP-10, MCP-1 y MlP-la pareció tener efectos mínimos sobre los niveles de las respuestas proliferativas de células Th. Sin embargo, las coinyecciones no mostraron efectos en las respuestas proliferativas de células Th no específicas inducidas por PHA (el rango del S.l. fue de 40 a 50) . La vacunación del plásmido gD no resulta en las respuestas CTL debido a una carencia .del epítope CTL en la estimulación Balb/c. Sin embargo, para evaluar los efectos celulares en más detalle, se examinan los perfiles de producción de citocinas .

Las citocinas Thl (IL-2 e IFN-?) y las citocinas Th2 (IL-4, IL-5 e IL-10) han sido un fundamento en nuestro entendimiento de la polarización de las respuestas inmunes. Las respuestas inmunes Thl se piensa que dirigen la inducción de la inmunidad celular, mientras que las respuestas inmunes Th2 dirigen preferentemente la inmunidad humoral. Con base en los resultados del fenotipo IgG se evalúa además el resultado de Thl vs Th2 analizando la liberación de citocina directamente. Como se muestra en la Tabla 4, la producción de IL-2 se aumentó dramáticamente casi 7 veces por co-inyección con TNF-a de ADN, y por co-inyección con el cásete MlP-la. En particular, la producción de IFN-? no se mejoró significativamente por co-liberación de RANTES, 20 veces e IL-8, 6 veces, además, soportando los resultados y la demostración de que IL-8 y RANTES regulan las respuestas inmunes celulares de tipo Thl de una manera dependiente de antígeno. Las co-inyecciones de RANTES, IL-8, TNF-a y TNF-ß también mejoran la producción de IL-10 significativamente mayor que la vacuna de pgD sola. Esto ilustra que la IL-8, RANTES dirigen las células T de Thl predominantemente sobre un tipo Th2.

Para determinar si la co-inyección de quimiocina podría inducir la producción de ß-quimiocina de una manera dependiente de antígeno, se co-inmuni zaron y después se analizaron los niveles de ß quimiocinas de esplenocitos después de la estimulación i n vi t ro con antígeno gD recombinante o antígeno de control. Como se muestra en la Tabla 5, la producción de MCP-1 se aumentó dramáticamente por co-inyección con IL-8 de ADNc, pero se disminuyó con co-ín-yección con casetes RANTES y MlP-la. En particular, la producción de MlP-la es mejora más significati amente por la co-liberación de RANTES e IL-8. En el caso de RANTES, las co-inyecciones de IL-8 y RANTES mejoraron la producción de RANTES más que la vacuna de pgD sola. Esto indica que RANTES modula las respuestas inmunes específicas de antígeno diferentemente de IL-8 en el modelo de HSV. Esto también soporta que las quimiocinas modulan su propia producción.

HSV es el agente causante de un espectro de enfermedades en el humano, tal como dolor frío, infecciones oculares, encefalitis e infecciones genitales. HSV puede establecer la latencia viral con casos frecuentes en el huésped. Durante la infección viral, el anticuerpo neutralizante inactiva las partículas virales, pero es incapaz de controlar la infección de HSV íntracelular . En vez de esto, la inmunidad mediada celular juega una función efectora para la erradicación de células infectadas con HSV y rociadas de HSV i n vi vo . La transferencia adoptiva del linfocito T citotóxico (CTL) aumentada contra HSV resulta en la protección incompleta de la estimulación de HSV letal en animales. Además, existen varios reportes de que las células T CD4+ de tipo Thl juegan el papel más crucial para la protección de la estimulación HSV-2. Cuando las células T CD4+ se redujeron in vi vo , se perdió la inmunidad protectora contra HSV. Además, las células T CD4+ de tipo Thl generan una mayor cantidad de IFN-?. IFN-? sobrerregula la expresión de clase I Y II en las células infectadas HSV para permitir el mejor reconocimiento por las células T CD4+ citotóxicas y CTL CD8+, y tiene efectos directos anti-HSV. La coliberación con los ADNcs de citocina de tipo Thl mejoró la supervivencia de la estimulación letal HSV-2, mientras la co-liberación con los ADNcs de citocina de tipo Th2 empeoró el estado de enfermedad. Similarmente, la protección mejorada por la co-liberación con un ADNc de citocina de tipo Thl prototípica IL-12 se reguló por las células T CD4+ de tipo Thl en el modelo de estimulación HSV, que hace hincapié en la importancia de la inmunidad protectora mediada por células T de tipo Thl contra la infección HSV.

Es importante que la modulación inmune específica de antígeno influencia la replicación patógena. Las tasas de supervivencia de los ratones (Balb/c) inmunizados con vacunas de gD de ADN más ADNc de a-quimiocina y se midieron los controles TNF. Cada grupo de ratones (n = 8) se inmunizó con vacunas de gD de ADN (60 µg por ratón) más genes de quimiocina (40 µg por ratón) o genes TNF (40 µg por ratón) a 0 y 2 semanas. Tres semanas después de la segunda inmunización, los ratones se estimularon i. ag. con 200 LD50 de la cepa HSV-2 186 (7xl05 de PFU) . Antes de la inoculación del virus, el área intravaginal se limpió con un aplícador de punta de algodón (Hardwood Products Company, Guiford, ME) se enjuagó con solución de NaOH al 0. ÍM y después se limpió con aplicadores de algodón secados. Los ratones después se examinaron diariamente para evaluar las tasas de supervivencia. Los ratones sobrevivientes se contaron durante 61 días después de la estimulación viral. Esto se repitió una vez con los resultados esperados. Se analizó la eficiencia protectora de la co-inyección de quimiocina en el modelo de estimulación de herpes de murino. Los ratones se co-inmunizaron i.m. con vectores de ADN a 0 y 2 semanas y después se estimularon con HSV-2 a 3 semanas después de la segunda inmunización. La ruta de estimulación intravaginal se eligió como infecciones de HSV-2 mucocutáneament e . la inmunización con la vacuna de gD de ADN sola resultó en 63% de la supervivencia de los ratones de la estimulación intravaginal con LD50 200 de HSV-2. La co-inyección con ADNc de IL-8 y RANTES aumentó la tasa de supervivencia a 88%, un mejoramiento de casi 30% de la velocidad de protección, mientras que la co-inyección con MCP-1 e IP-10 disminuyó la tasa de supervivencia a 25%, más de un 50% de reducción en la supervivencia global de la vacuna gD sola. Similarmente, la co-inyección de MlP-la también influenció negativamente la tasa de supervivencia de los animales vacunados. Estas observaciones son sorprendentes si se considera el número total de animales probados en cada grupo de quimiocina (tasas de supervivencia de gD sola, 11 de 18, 61%; tasas de supervivencia de IL-8, 17 de 18, 94%; tasas de supervivencia de IP-10, 5 de 18, 28%; tasas de supervivencia de RANTES, 17 de 18, 94%; tasas de supervivencia de MCP-1, 6 de 18, 33%; tasas de supervivencia de MlP-la, 8 de 18, 44%) . Esto indica que la co-inyección con el gen de quimiocina IL-8 y RANTES mejora la protección de la estimulación HSV letal mientras que la co-inyección con IP-10 y MCP-1 y en menos grado MlP-la, hacen los animales más susceptibles a la infección viral a pesar de la inducción de las respuestas inmunes. Esta soporta que las quimiocinas IL-8 y RANTES mejoraron la protección de la infección de HSV-2 por medio de la modulación inmune específica de antígeno. Estos estudios soportan que las quimíocinas pueden actuar y modular las respuestas inmunes importantes y enfermar la procreación de una manera remiscente de citocinas (Thl vs Th2) la modulación inmune significativa podría alcanzarse por medio del uso de ADNcs de quimiocina co-1 iberados , impartiendo no solo una respuesta inmune, sino que también protección contra enfermedades. Además, el uso de adyuvantes liberados del gen de quimiocina, en particular IL-8 y RANTES, podría ser importante en la elaboración de vacunas más eficientes o en terapias inmunes para HSV. Se reportó previamente que la co-inyección con el gen de citocina de tipo Thl mejora la velocidad de protección de la estimulación de HSV letal, mientras que la co-inyección de la citocina de tipo Th2 aumenta la susceptibilidad del animal a la infección viral. En los estudios de patogénesis, se ha reportado la importancia de la respuesta de la citocina similar a Thl para la resistencia de la infección patogénica. De esta manera, parece probablemente que las respuestas inmunes de tipo Thl y/o Th2 se dirigen por estas quimiocinas, resultando en un impacto sobre la protección de la estimulación infecciosa de HSV basado en la calidad de las respuestas inmunes.

Se comparó la eficiencia protectora de la co-inyección de la familia TNF en el modelo de estimulación de herpes . La co-inyección con los genes TNF-a y TNF-ß también redujo la tasa de supervivencia de los ratones estimulados a 25%, más de 50% de reducción en la supervivencia global de la vacuna de gD sola. Aunque los niveles del anticuerpo específico de gD y proliferación celular Th así como los niveles de producción de citocina (IL-2, IFN-?, IL-10) de los ratones co-inyect ados con genes TNF-a, fueron mucho mayores que los de la vacunación con gD de ADN, se observó en estos animales la susceptibilidad mediada por la citocina TNF a la infección de HSV-2. La razón para esta observación no es clara, pero soporta fuertemente que la calidad de las respuestas es significati amente importante para controlar la infección patogénica.

En conclusión, los resultados presentados aquí demuestran que las quimiocinas podrían modulas las respuestas inmunes para los tipos Thl y/o Th2 de una manera dependiente de antígeno. Tales actividades solo se habían asociado previamente con las citocinas, implicando que las citocinas tienen tanto papel central como la citocinas en la inducción de la inmunidad específica de antígeno. El uso de las quimiocinas para modular las respuestas inmunes para las terapias inmunes es meritorio de investigación adicional.

Tabla 1 MadCAM-1 Acceso: U80016 Autores: Leung E., et al. Revista: Inmunogenet íes 46 (2), 111-119 (1997) MadCAM-1 Acceso: U43628 Autores: Shyjan, A.M., et al. Revista: J. Inmunol. 156 (8), 2851-2857 (1996) NGF Acceso: M57399 Autores: Kretschmer, P.J., et al. Revista: Growth Factors 5, 99-114 (1991) IL-7 Acceso : J0 156 Autores: Goodwin, R.G., et al. Revista: Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 86 (1), 302-30 (1989) VEGF Acceso: M32977 Autores: Leung, D.W., et al. Revista: Science 246, 1306-1309 (1989) TNF-R Acceso : m60275 Autores: Gray, P.W., et al. Revista: Proc. Natl. Acad Sci U.S.A, 87 7380-7384 (1990) TNF-R Acceso: M63121 Autores: Himmler, A., et al. Revista: DNA Cell Biol. 9, 705-715 (1990 Fas Acceso: M67454 Autores: Itoh, N., et al. Revista: Cell 66 (2), 233-243 (1991) CD40L Acceso: L07414 Autores: Gauchat, J.F.M., et al. Revista: FEBS Lett. 315, 259-266 (1992) IL-4 Acceso: M23442 Autores: Arai, N., et al. Revista: J. Inmunol. 142 (1), 274-282 (1989) IL-4 Acceso: M13982 Autores: Yokota, T,, et al. Revista: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 3 (16) , 5894-589! (1986) CSF Acceso: M37435 Autores: Wong, G.G., et al. Revista: Science 235 (4795), 1504-1508 (1987) G-CSF Acceso: X03656 Autores: Nagata, S., et al. Revista: EMBO J. 5 (3), 575-581 (1986) G-CSF Acceso: X03655 Autores: Nagata, S., et al. Revista: EMBO J. 5 (3), 575-581 (1986) GM-CSF Acceso: M11220 Autores: Lee, F., et al. Revista: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 2 (13) , 4360-4364 (1985) GM-CSF Acceso: M10663 Autores: Wong, G.G., et al. Revista: Science 228 £4701) 10-815 (1985 M-CSF Acceso: M27087 Autores: Takahashi, M., et al. Revista: Biochem. Biophys. Res. Común. 161 (2) , 892-901 (1989) M-CSF Acceso: M37435 Autores: Wong, G.G., et al. Revista: Science 235 (4795), 1504-1508 (1987) LFA-3 Acceso: Y00636 Autores: Wallner, B.P., et al.

Revista: J. Exp. Med. 166 (4), 923-932 (1987) ICAM-3 Acceso: X69819 Autores: de Fougerolles, A.R., et al Revista: Unpublished ICAM-2 Acceso : Xl 5606 Autores: Staunton, D.F., et al. Revista: Nature 339 (6219), 61-64 (1989; ICAM-1 Acceso: J03132 Autores: Staunton, D.F., et al. Revista: Cell 52 (6), 925-933 (191 PECAM Acceso: M28526 Autores: Newman, P.J., et al. Revista: Science 247, 1219-1222 (1990) P150.95 Acceso: Y00093 Autores: Corbi, A.L., et al.

Revista: EMBO J. 6 (13), 4023-4028 (1987) Mac-1 Acceso: J03925 Autores: Corbi, A.L., et al. Revista: J. Biol. Chem. 263 (25), 12403-12411 (19! LFA-1 Acceso: Y00796 Autores: Larson, R., et al. Revista: j'. Cell Biol. 108 (2), 703-712 (1 989) CD34 Acceso: M81104 Autores: Sj.mmons, D.L., et al. Revista: J. Inmunol. 148, 267-271 (1992) RANTES Acceso: M21121 Autores: Schall, T.J., et al. Revista: J. Inmunol. 141, 1018-1025 (1988) IL-8 Acceso: M28130 Autores: Mukaida, N., et al Revista: J. INMUNOL. 143 (4), 1366-1371 (1989) MlP-la Acceso: U72395 Autores: Fridell, R.A., et al. Revista: J. Cell. Sci. 110 (Pt 11), 1325-1331 (1997 E-select on Acceso: M24736 Autores: Bevilacqua, M.P., et al. Revista: Science 243 (4895), 1160-1165 (1989) CD2 Acceso: M14362 Autores: Sewell, W.A., et al. Revista-1: Proc. Natl. Acad. Sci . U.S.A 8718-8722 (1986) Revista-2: Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 84, 7256-7256 (1987) CD2 Acceso : Ml 6336 Autores: Sayre, P.H., et al. Revista: Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 84 (9) , 2941-2945 (1987) MCP-1 Acceso: S69738 Autores: Li, Y.S., et al. Revista: Mol. Cell. Biochem. 126 (1), 61-68 (1993) MCP-1 Acceso: S71513 Autores: Yoshimura, T., et al. Revista: Adv. Exp. Med. Biol. 305, 47-56 (1991) L-selection Acceso: X16150 Autores: Tedder, T.F., et al. Revista: J. Exp. Med. 170 (1), 123-133 (1989) P-selection Acceso: M25322 Autores: Johnston, G.I., et al. t Revista: Cell 56, 1033-1044 (1989) FLT Acceso: X94263 Autores: Mandriota, S.J., et al. Revista: J. Biol.. Chem. 271 (19), 11500-11505 (1996) FLT Acceso: X51602 Autores-1: Shibuya, M. et al. Revista-1: Oncogene 5 (4), 519-524 (1990) Autores-2: Han, H.J., et al. Revista-2: Hum. Mol. Genet. 2 (12), 2204 (1993 Apo-1 Acceso: X63717 Autores: Oehm et al., Revista: J. Biol.. Chem., 1992, 267(15), 10709-15 Fas Acceso: M67454 Autores: Itoh et al., Revista: Cell, 1991, 66(2), 233-43 TNFR-1 Acceso : M67454 Autores: Nophar et al., Revista: EMBO J., 1990, 9(10), 3269-78 P55 Acceso: M58286 Autores: Loetscher et al., Revista: Cell, 1990, 61, 351-359 WSL-1 Acceso: Y09392 Autores: Kitson et al., Revista: Nature, 1996, 384(6607), 372-5 DR3 Acceso: U72763 Autores: Chinnaiyan et al., Revista: Science, 1996, 274(5829), 990-2 TRAMP Acceso: U75381 Autores: Bodmer et al., Revista: In unity, 1997, 6(1), 79- Apo-3 Acceso: U74611 Autores: Marsters et al., Revista: Curr. Biol., 1996, 6(12), 1669-76; AIR Acceso: U78029 Autores: Degli-Espost i et al., Revista : LARD Acceso: U94512 Autores: Screaton et al., Revista: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1997, 94(9), 4615-19 NGRF Acceso: M14764 Autores: Johnson et al., Revista: Cell, 1986, 47(4), 545-554 DR4 (TRAIL) Acceso: U90875 Autores: Pan et al., Revista: Science, 1997, 276(5309), 111-113 DR5 Acceso: AF012535 Autores: Sheridan et al., Revista: Science, 1997, 277(5327), 818-821 KILLER Acceso : Autores: Wu et al., Revista: Nature Genetics, in press, TRAIL-R2 Acceso: AF020501 Autores: MacFarlane et al., Revista: J. Biol.. Chem., 1997, in press TRICK2 Acceso: AF018657 Autores; Screaton et al., Revista: Curr. Biol., 1997, in press DR6 Acceso: AF068868 Autores: Pan et al., Revista : ICE Acceso: U13698 Autores: Alnemri, E.S., et al. Revista: J. Biol. Chem. 270 (9), 4312-4317 (1995 ICE Acceso: U13697 Autores: Alnemri, E.S., et al Revista: j .' Biol. Chem. 270 (9), 4312-4317 (1995) ICE Acceso: U13699 Autores: Alnemri, E.S., et al. Revista: J. Biol. Chem. 270 (9), 4312-4317 (1995) VLA-1 Acceso: X17033 Autores: Takada., et al. Revista: J. Biol. Chem. 109(1), 397-407 (1989) CD86. (B7.2) Acceso: U04343 Autores: Azuma, et al. Revista: Nature. 366 (6450), 76 (1993) Tabla 2 Familia de los Picornavirus Género: Rinovirus: (Médico) responsable de ~50% de los casos de resfriado común. Eterovirus: (Médico) incluyen poliovirus, coxsackievirus , ecovirus y enterovirus de humano tal como el virus de la hepatitis A. Aptovirus: (Veterinario) estos son los virus de la enfermedad del pie y la boca.

Antígenos blanco: VPl, VP2, VP3, VP4, VPG Familia de los Calcivirus Género: Grupo de virus Norwalk: (Médico) estos virus son un agente causal importante de gastroenteritis epidémica.

Familia de los Togavirus Género: Alfavirus: (Médico y Veterinario) los ejemplos incluyen virus Senilis, virus RossRiver y encefalitis equina Eastern & Western . Reovirus: (Médico) virus de la rubéola.

Familia' de los Flariviridue Los ejemplos incluyen: (Médico) dengue, fiebre amarilla, encefalitis japonesa, encefalitis de San Louis y virus de la encefalitis que porta garrapata.

Virus de la hepatitis C: (Médico) estos virus aún no se colocan en una familia pero se cree que son un grupo de togavirus o flavivirus. Más similarmente es con la familia de los togavirus.

Familia de los Coronavirus (Médico y Veterinario) Virus de bronquitis infecciosa (aves de corral ) Virus ga s t r oen t é r i co transmisible de porcino (cerdo) Virus de encefalomielitis hemaglut inante de porcino (cerdo ) Virus de peritonitis infecciosa de felino (gatos ) Coronavirus entérico de felino (gato) Coronavirus de canino (perro ) Lo s , c o ro na v i ru s respiratorios de humano causan ~40 de casos de resfriado común. EX. 224E, 0C43 Nota - los coronavirus podrían causar hepatitis no A, B o C Antígenos blanco: El - también llamado M o proteína matrix E2 - también llamado proteina S o Spike E3 - también llamado HE o glucoproteína hemaglut ina-elterosa (no presente en todos los coronavirus) N - nucleocápside Familia de los Rabdovirus Género: Vesiliovirus Lyssavirus: (médico y veterinario) rabias Antígeno blanco: proteína G proteína N Familia de los Filoviridae (Médico ) Virus de la fiebre hemorrágica tal como el virus del Ebola y Marburg Familia .de los Paramixovirus: 4 Género: Paramixovirus: (Médico y Veterinario) Virus de la parotiditis, virus de la enfermedad . de New Castle (patógeno importante en gallinas) Morbillivirus : (Médico y Veterinario) Sarampión, moquillo de canino Pneuminvirus : (Médico y Veterinario) 'Virus sincitial respiratorio Familia de los Ortomixovirus (Médico) El virus de la influenza Familia de los Bungavirus Género: Bungavirus: (Médico) encefalitis de California, LA Crosse Plebovirus: (Médico) Fiebre Rift Valley Hantavirus:. Puremala es un virus de la fiebre hemahagin Nairvirus (Veterinario) Enfermedad de borrego Nairobi También muchos bungavirus no asignados •Familia de ios Arenavirus (Médico) LCM, virus de la fiebre de Lassa Familia de los Reovirus Género: Reovirus: un posible patógeno de humano Rotavirus: gastroenteritis aguda en niños Orbivirus: (Médico y Veterinario) Fiebre de garrapata de Colorado, Lebombo (humanos) encefalosis de equino, lengua azul Familia de los Retrovirus Subfamilia : Oncorivirinal : (Veterinario) (Médico) Virus de la Leucemia de felino, HTL VI y HTL VII Lentivirinal : (Médico y Veterinario) VIH, virus de inmunodeficiencia de felino, infecciones de equino, virus de la anemia Spumavirinal Familia de los Papovavirus Subfamilia : Poliomavirus: (Médico) virus BKU y JCU Subfamilia : Papilomavirus: (Médico) muchos tipos virales asociados con cáncer o progresión maligna de papiloma Adenovirus (Médico) EX AD7, ARD., O.B. - causa de enfermedad respiratoria - algunos adenovirus tal como el 275 causan enteritis Familia de los Parvovirus (Veterinario) Parvovirus de felino: causa de enteritis de felino Panleucopeniavirus de felino Parvovirus de canino Parvovirus de porcino Familia de los Herpesvirus Subfamilia: alfaherpesviridae Género: Virus simple (Médico) HSVI, HSVII Varicelovirus : (Médico - Veterinario) pseudorabia - zona de varicela Subfamilia - be t aherpesviridae Género: Citomegalovirus (Médico) HCMV t Murómegalovi rus Subfamilia: Gamaherpesviridae Género: Linfocriptovirus (Médico) EBV - (Burkitts linpho) Radinovirus Familia de los Poxvirus Subfamilia: Cordopoxviridae (Médico - Veterinario) Género: Viruela (smallpox) Vacuna (Vacuna) Parapoxivirus - Veterinario Auipoxvirus - Veterinario Capripoxvirus Leporipoxvirus Suipoxvirus Subfamilia: Entemopoxviridae Familia de los Hepadnavirus Virus de la Hepatitis B No clasificados Virus de la Hepatitis delta Tabla 3 Patógenos bacterianos _ Cocos gram-positivos patogénicos incluyen pneumococos; estafilococos; y estreptococos Cocos gram-negativos patogénicos incluyen meningococos ; y gonococos.

Bacilos gram-negativos entéricos patogénicos incluyen: enterobacterias; pseudomonas, acinetobact eria y clebsiella; melioidosis; , sálmonella; shigelosis; hemophilus; chancroide; brucelosis; tularemia; yersinia (pasteurella); . streptobacillus moniliformis y spirillum; listeria monocytogenes; erysipelothrix rhusiopathiae ; difteria; cólera; ántrax; donovanosis (granuloma inguinal) ; y , bartonelosis .

Bacterias anaeróbicas patogénicas incluyen: tétanos; botulismo; otras clostridias; tuberculosis; lepra; y otras micobacterias. Enfermedades por espiroqueta patogénica incluyen: sífilis; t reponemat osis ; vitíligo, sífilis pinta y endémica; y leptospirosis .

Otras infecciones causadas por bacterias altamente patógenas y hongos patogénicos incluyen: actinomicosis; nocardiosis; criptococosis , blastomicosis , histoplasmosis y coccidiodomicosis ; candidiasis, aspergilosis y my c o rm i c o s i s ; e s p o r o t r i c o s i s ; paracoccidiodomicosis, petrielidiosis, torulopsos is , micetoma y cromomicosis ; y de rma t of i t osis .

Infecciones por ricketsias incluyen ricketsias y ricketsiosis .

Los ejemplos de infecciones por micoplasma y clamidia incluyen: micoplasma pneumoniae; linfogranuloma venéreo; sitacosis; e infecciones perinatales por clamidia.

Eucariotes patogénicos Protozoarios y helmintos patogénicos e infecciones por los mismos incluyen: amibiasis; malaria; leishmaniasis; tripanosomiasis; toxoplasmosis; pneumocystis carinni; babesiosis; giardiasis; triquinosis; filariasis; esquís tosomiasis ; nematodos; tremátodos o tremá t odo s ; i nf e c c i one s por cés t odo ( sol itaria ) .

Tabla 4. Niveles de producción de IL-2 , IL-10 e IFN-? de esplenocitos después de la estimulación gD in vitro* Inmunización IL-2 IFN-? IL-10 Grupo (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) Naive 16.7+0.8 10.5±0.7 17.1 + 6.12 pgD+ pCDNA3 134.7±3.5 22.4 +2.4 57.1±4.4 pgD+ IL-8 756.4±5. 138.5 + 4.7 128±13 pgD+ IP-10 143.5±3.9 31.5±2.5 69.9±1.9 pgD+ RANTES 59.9±1.1 520+13 360±46.5 PgD+ MCP-1 93.6±4.7 17.9±0.5 49.7±2.3 pgD+ MlP-la 345.4 + H 55.4±1.8 22 + 2.1 pgD+ TNF-a 403+13.3 77±6.3 86.8+6.2 pgD+ TNF-| 288+5.6 20.8±1.5 78.3±3.6 aCada grupo de ratones Balb/c (n=2) se inmunizó con vacunas gD de ADN (60µg por ratón) más genes de quimiocina (40µg por ratón) ce ADNcs de TNF (40µg por ratón) a 0 y 2 semanas. Dos semanas después de la última inyección de ADN, dos ratones se sacrificaron y se colectaron las células del bazo. Una alícuota de 1 ml que contiene 6 x 106 de esplenocitos se adicionó a pozos de placas de 24 pozos. Después, se adicionó lµ de proteina/ml HSV-2 gD a cada pozo. Después de 2 dias de incubación a 37°C en C02 al 5%, los sobrenadantes celulares se aseguraron y después se usaron para detectar los niveles de IL-2, IL-10 y'IFN-? usando estuches de citocina comerciales (Biosource, Intl., Camarillo, Ca.) adicionando los fluidos extracelulares a las placas ELISA de citoquina específicas. Las muestras se probaron en triplicado y los valores representan las medias de las concentraciones de citocina liberada + desviación estándar. Esto representa uno de tres experimentos separados que muestran el resultado esperado.

Tabla' 5. Niveles de producción de MCP-1, MlP-la y RANTES de esplenocitos después de la estimulación gD in vitro* Inmunización MCP-1 MlP-la RANTES órupo (pg/ml) (pg/ml) (pg/ml) Naive 153.8±5.7 247±11 76917 pgD+ Pcdna3 234.7±5.3 747±39 17±55 pgD+ IL-! 322±24 1, 411+113 1, 284±53 pgD+ IP-10 246.3+2.7 1, 407±459 31152 pgD+ RANTES 189.7+0 2, 267±219 1, 077132 PgD+ MCP-1 209.2+6.4 725+501 646+45 pgD+ MlP-la 142.7±3.3 787194 690139 aCada grupo de ratones Balb/c (n=2) se inmunizó con vacunas de gD de ADN (60µg por ratón) más genes de quimiocina (40 µg por ratón) a 0 y 2 semanas. Dos semanas después de la última inyección de ADN, dos ratones se sacrificaron y se colectaron las células del bazo. Una alícuota de 1 ml que contiene 6 x 10é de esplenocitos se adicionó a pozos de placas de 24 pozos. Después, se adicionó lµ de proteína/ml HSV-2 gD a cada pozo. Después de 2 dias de incubación a 37°C en C02 al 5%, los sobrenadan es celulares se aseguraron y después se usaron para detectar los niveles de RANTES, MCP-1 y MlP-la usando estuches de citoquina comerciales (R&D Systems, Minneapolis, Md.) adicionando los fluidos extracelulares a las placas ELISA de citoquina o quimiocina específicas. Las muestras se probaron en triplicado y los valores representan las medias de liberación de las concentraciones de citocina liberada ± desviación estándar. Esto representa uno de tres experimentos separados que muestran el resultado esperado.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un plásmido que comprende una secuencia nucleótida que codifica un inmunógeno enlazado operablemente a elementos reguladores y una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores, caracterizado porque la proteína inmunomoduladora se selecciona del grupo que consiste de: MCP-1, MlP-la, MlP-lß, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, I CAM- 3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6 y Caspase ICE.

2. El plásmido de la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunógeno es una proteína blanco que codifica un antígeno patógeno, un antígeno asociado con cáncer o un antígeno enlazado a células asociadas con enfermedades autoinmunes .

3. El plásmido de la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunógeno es un antígeno patógeno.

4. El plásmido de la reivindicación 1, caracterizado porque el inmunógeno es un antígeno VIH-1.

5. El plásmido de la reivindicación 1, caracterizado porque la proteina inmunomoduladora es ICAM-1 y comprende además una secuencia nucleótida que codifica la proteina CD86 enlazada operablemente a elementos reguladores.

6. Una composición farmacéutica inyectable, caracterizada porque comprende el plásmido de la reivindicación 1.

7. Un método para inducir una respuesta inmune en un individuo contra un inmunógeno, caracterizado porque comprende administrar al individuo un plásmido de la rei indicación 1.

8. Un plásmido que comprende una secuencia nucleótida que codifica un antígeno de herpes simple enlazado operablemente a elementos reguladores y una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores, caracterizado porque la proteína inmunomoduladora se •selecciona del grupo que consiste de: IL-8, RANTES, LFA-3 Y CD4ÜL.

9. El plásmido de la reivindicación 1, caracterizado porque el antígeno de herpes simple es HSV2gD.

10. Una composición farmacéutica inyectable, caracterizada porque comprende el plásmido de la reivindicación 8.

11. Un método de inmunizar un individuo contra una infección por el virus herpes simple, caracterizado porque comprende administrar al individuo un plásmido de la reivindicación 8.

12. Una composición, caracterizada porque comprende dos plásmidos: un primer plásmido que comprende una secuencia nucleótida que codifica un inmunógeno enlazado operablemente a elementos reguladores; y un segundo plásmido que comprende una secuencia * nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores, en donde la proteína inmunomoduladora se selecciona del grupo que •consiste de: MCP-1, MlP-la, MlP-lß, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL-4, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6 Y Caspase ICE. •

13. La composición de la reivindicación 12, caracterizada porque el inmunógeno es una proteína blanco que codifica un antígeno patógeno, un antígeno asociado con cáncer o un antígeno enlazado a células asociadas con enfermedades autoinmunes.

14. La composición de la rei indicación 12, caracterizada porque el inmunógeno es un antígeno patógeno.

15. La composición de la reivindicación 12, caracterizada porque el inmunógeno es un antígeno de VIH-1.

16.. La composición de la reivindicación 12, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es ICAM-1 y comprende además una secuencia nucleótida que codifica la proteína CD86 operablemente enlazada a elementos reguladores, en donde el primer plásmido, el segundo plásmido o un tercer plásmido que comprenden la secuencia nucleótida que codifica la proteína CD86.

17. Una composición farmacéutica inyectable, caracterizada porque comprende la composición de la reivindicación 12.

18. Un método para inducir la respuesta inmune en un individuo contra un inmunógeno, caracterizado porque comprende administrar al individuo una composición de la reivindicación 12.

19. Una composición, caracterizada porque comprende dos plásmidos: un primer plásmido que comprende una secuencia nucleótida que codifica un antígeno de herpes simple enlazado operablemente a elementos reguladores; y un segundo plásmido que comprende una secuencia nucleótida que codifica IL-8, RANTES, LFA-3 0 CD40L.

20. La composición de la reivindicación 19, caracterizada porque el antígeno de herpes simple es HSV2gD.

21. Una composición farmacéutica inyectable, caracterizada porque comprende la composición de la reivindicación 19.

22. Un método para inmunizar un individuo contra una infección del virus herpes simple, caracterizado porque comprende administrar al individuo un plásmido de la reivindicación 19.

23. Una vacuna recombinante que comprende la secuencia nucleótida que codifica un inmunógeno enlazado operablemente a elementos reguladores y una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora se selecciona del grupo que consiste de: MCP-1, MlP-la, MIP-Iß, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6 Caspase ICE. *

24. La vacuna recombinante de la reivindicación 23, caracterizada porque el inmunógeno es una proteína blanco que codifica un antígeno patógeno, un antígeno asociado con cáncer o un antígeno enlazado a células asociadas con enfermedades autoinmunes.

25. La vacuna recombinante de la reivindicación 23, caracterizada porque el inmunógeno es un antígeno patógeno .

26. La vacuna recombinante de la reivindicación 23, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es ICAM- 1 y comprende además una secuencia nucleótida que codifica la proteína CD86 enlazada operablemente a elementos reguladores .

27. Un método para inducir una respuesta inmune en un individuo contra un inmunógeno, caracterizado porque comprende administrar al individuo una vacuna recombinante de la reivindicación 1.

28. La vacuna recombinante de la reivindicación 23, caracterizada porque la vacuna recombinante es una vacuna de vacuna recombinante.

29. La vacuna recombinante de la reivindicación 23, caracterizada porque el ínmunógeno es un antígeno patógeno .

30. Un método para inducir una respuesta inmune en un individuo contra un inmunógeno, caracterizado porque comprende administrar al individuo una vacuna recombinante de la reivindicación 23.

31. Un patógeno atenuado activo que comprende una secuencia nucleótida que codifica la proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores, caracterizado porque la proteína inmunomoduladora se selecciona del grupo que consiste de: MCP-1, MlP-la, MlP-lß, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6 Y Caspase ICE.

32. Un método para inmunizar una respuesta inmune en un individuo contra un patógeno, caracterizado porque comprende administrar al individuo el patógeno vivo atenuado de la reivindicación 31.

33. Un método para inducir una respuesta inmune en un individuo contra un inmunógeno, caracterizado porque comprende administrar al individuo: el inmunógeno y/o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida que codifica el inmunógeno enlazado operablemente a elementos reguladores; y una proteína inmunomoduladora y/o una molécula de ácido nucleico que comprende una secuencia nucleótida que codifica la proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores, en donde la proteína inmunomoduladora se selecciona del grupo que consiste de: MCP-1, MlP-la, MlP-lß, IL-8, RANTES, L- •selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, 'ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6 Y Caspase ICE.

34. El método de la reivindicación 33, caracterizado porque el inmunógeno es una proteína blanco que codifica un antígeno patógeno, un antígeno asociado con cáncer o un antígeno enlazado a células asociadas con enfermedades autoinmunes .

35. El método de la reivindicación 33, caracterizado porque el inmunó.geno es un antígeno patógeno.

36. El método de la reivindicación 33, caracterizado porque el inmunógeno es un antígeno de VIH-1.

37. El método de la reivindicación 33, caracterizado porque la proteína inmunomoduladora es ICAM-1 y el método comprende además administrar la proteína CD86 o -una secuencia nucleótida que codifica la proteína CD86 enlazada operablemente a elementos reguladores.

38. Una composición farmacéutica inyectable, caracterizada porque comprende una cantidad terapéuticamente efectiva de un anticuerpo que se enlaza específicamente a una proteína inmunomoduladora que se selecciona del grupo que consiste de: MCP-1, MlP-la, MIP-lß, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, formas mutantes de IL-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor de TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6 y Caspase ICE .

39. Un método de tratar un individuo quien tiene una enfermedad autoinmune, caracterizado porque comprede la etapa de administrar al individuo una composición farmacéutica inyectable de acuerdo a la reivindicación 38.

40. Una composición que comprende al menos un plásmido, caracterizada porque el plásmido comprende una secuencia nucleótida que codifica un inmunógeno enlazado operablemente a elementos reguladores y una secuencia nucleótida que codifica una proteína inmunomoduladora enlazada operablemente a elementos reguladores, en donde la proteína inmunomoduladora se selecciona del grupo que consiste de: MCP-1, MlP-la, IL-8, RANTES, L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2, LFA-3, M-CSF, G-CSF, IL- , formas mutantes de 1L-18, CD40, CD40L, factor de crecimiento vascular, IL-7, factor de crecimiento nervioso, factor de crecimiento endotelial vascular, Fas, receptor TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4 , DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2, DR6 y Caspase ICE.

41. La composición de la reivindicación 40, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora se selecciona del grupo que consiste de MCP-1, MlP-la, MIP-Iß, IL-8 y RANTES.

42. La composición de la reivindicación 41, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es MCP-1.

43. La composición de la reivindicación 41, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es MIP-la.

44. La composición de la reivindicación 41, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es MIP-lß-

45. La composición de la reivindicación 41, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es IL-8.

46. La composición de la reivindicación 41, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es RANTES .

47. La composición de la reivindicación 40, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora se selecciona del grupo que consiste de L-selectina, P-selectina, E-selectina, CD34, GlyCAM-1, MadCAM-1, LFA-1, VLA-1, Mac-1, pl50.95, PECAM, ICAM-1, ICAM-2, ICAM-3, CD2 y LFA-3.

48. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es L-selectina.

49. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es P-select ina .

50. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es E-select ina .

51. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es CD34.

52. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es GlyCAM-1.

53. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es MadCAM-1.

54. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es LFA-1.

55. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es VLA-

56. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es Mac- 1.

57. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es pl50.95.

58. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es PECAM.

59. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es ICAM-1.

60. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es ICAM-2.

61. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es ICAM-3.

62. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es CD2.

63. La composición de la reivindicación 47, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es LFA- 3.

64. La composición de la reivindicación 40, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora se selecciona del grupo que consiste de M-CSF, G-CSF, IL-4 y una forma mutante de IL-18.

65. La composición de la reivindicación 64, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es M-CSF.

66. La composición de la reivindicación 64, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es G-CSF.

67. La composición de la reivindicación 64, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es IL-4.

68. La composición de la reivindicación 64, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es una forma mutante de IL-18

63. La composición de la reivindicación 40, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora se selecciona del grupo que consiste de CD40 y CD40L.

70. La composición de la reivindicación 69, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es CD40.

71. La composición de la reivindicación 69, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es CD40L.

72. La composición de la reivindicación 40, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora se selecciona del grupo que consiste del factor de crecimiento vascular, IL-7, factor de crecimiento nervioso y factor de crecimiento endotelial vascular.

73. La composición de la reivindicación 72, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es factor de crecimiento vascular.

74. La composición de la reivindicación 72, caracterizada porque la protelna inmunomoduladora es IL-7.

75. La composición de la reivindicación 72, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es factor de crecimiento nervioso.

76. La composición de la reivindicación 72, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es factor de crecimiento endotelial vascular.

77. La composición de la reivindicación 40, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora se selecciona del grupo que consiste de Fas, receptor TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 y DR6.

78. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es Fas.

79. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es receptor TNF.

80. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es Fit.

La composición de la reivindicación 77 caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es Apo-1.

82. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es p55.

83. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es WSL-1.

84. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es DR3.

85. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es TRAMP.

86. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es Apo-3.

87. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es AIR.

La composición de la reivindicación 77 caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es LARD

89. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es NGRF.

90. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es DR4.

91. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es DR5.

92. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es KILLER.

93. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es TRAIL-R2.

94. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es TRICK2.

95. La composición de la reivindicación 77, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es DR6.

96. La composición de la reivindicación 40, caracterizada porque la proteína inmunomoduladora es Caspase ICE.

97. Una composición farmacéutica inyectable, caracterizada porque comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 40-96.

98. Un método para inducir una respuesta inmune en un individuo contra un inmunógeno, caracterizado porque comprende administrar al individuo la composición de cualquiera de las reivindicaciones 40-97.

99. Una vacuna recombinante, caracterizada porque comprende la composición de cualquiera de las reivindicaciones 40-97.