CN100542608C - 树突细胞前体的血中水平上升剂 - Google Patents

Abstract

树突细胞在治疗中的应用虽然正在不断扩大，但由于树突细胞前体只存在于外周血中，为了获得用于治疗的量，只是在体外进行增殖是困难的。因此，谋求提高患者血中的树突细胞前体水平成为利用树突细胞使治疗实用化方面的关键。本发明是一种以针对在未成熟树突细胞中表达的受体的激动剂或其功能性衍生物作为有效成分的树突细胞前体的血中水平上升剂。

Description

树突细胞前体的血中水平上升剂

技术领域

本发明涉及到树突细胞的血中水平上升剂以及具有该作用的用两亲性高分子化学改性的新的激动剂(agonist)衍生物。

背景技术

已知树突细胞(dendritic cells；有时略记为DC)是由干细胞CD34⁺细胞分化，具有树枝状突起形态特征，广泛分布于生物体内，通过生物体内运输能力(移动能力)有效进行抗原的摄取和向T细胞进行抗原呈递的细胞。即，树突细胞与其他担任免疫的细胞同样都是来自骨髓干细胞，是一边在增殖分化、成熟的过程中改变分布的组织或器官，一边起着免疫监视细胞作用的细胞。

树突细胞的增殖分化·成熟的过程可以分为以下5该阶段。即(1)祖细胞期(DC progenitor)：主要存在于骨髓，边自我复制边产生前体细胞。(2)前体细胞期(DC precursor)：在恒定状态下由骨髓经血液循环恒定供给到生物体的脏器，通过各个脏器的血管壁进入组织内，分布于上皮内或间质。(3)警戒期(sentinel DC)：树突细胞在该阶段具有吞噬能力，摄取侵入到分布的各个脏器内的抗原。其代表性细胞有表皮的朗氏细胞、呼吸道上皮的树突细胞、心·肝等实质性脏器的间质DC等。(4)抗原输送期(antigen-transporting DC)：树突细胞通过整合抗原信息，进行一阶段成熟后，获得游走能力。在人扁桃体，树突细胞从阴窝上皮直至T细胞区域(滤胞间区域)游走于扁桃体组织内，在那里诱导免疫应答。在其他脏器，很多树突细胞进入输入淋巴管，通过淋巴循环游走于所属淋巴节，向T细胞区域(旁皮质)集积。(5)抗原呈递期(mature DC)：进入淋巴脏器的树突细胞直至在最终阶段成熟。然后与T细胞形成细胞群(cluster)，选出抗原特异的T细胞，进行抗原呈递。然后，树突细胞在T细胞区域通过凋亡结束一生(参照医学进展Vol.200，No.6，472-476(2002))。

已知将从外周血采集的树突细胞(前体)于体外，例如在GM-CSF和TNFα存在下使其增殖后，用疾病(相关)抗原、例如肿瘤细胞等疾病(相关)抗原刺激，然后使其返回到生物体内，可以增强对疾病的免疫疗法。这种疗法称之为利用树突细胞的免疫疗法、或疫苗疗法，可用于各种疾病，例如黑素瘤、肾癌、前列腺癌、白血病、转移性恶性肿瘤等。因此树突细胞在治疗上的应用正引人注目，使用树突细胞的免疫疗法不仅应用于肿瘤，而且已经扩展到感染、移植和自身免疫领域(例如，参照Kayo Inaba，Saibo Kogaku，Vol.19，No.9，1282-1286(2000)；Hiroshi Kawamot et al.，Saibo Kogaku，Vol.19，No.9，1311-1317(2000)；和Takuya Takayama等，BunshiSaibo Chiryo，Vol.2，No.6，53-56(2001))。

作为在未成熟树突细胞中表达的受体已知有CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR11以及CXCR4。作为针对这些受体的配体已知有MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MARC、LCC-1(ref)、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、TARC、MDC、MIP-3α、MIP-3β、LARC、TECK、BLC、SDF-1、Exodus-1、Exodus-2等等。其中作为对CCR1以及CCR5共通的配体，已知有MIP-1α、RANTES、MARC和LCC-1(ref)(参照例如中野英树、细胞工学Vol.19，No.9，1304-1310(2000))。

已知还存在具有与配体(激动剂)同样生物活性的配体的功能性衍生物，例如就MIP-1α来说，已知有将MIP-1α的26位Asp置换为Ala，由氨基末端从Ser开始的69个氨基酸构成的MIP-1α突变体(BB-10010)。发现这个MIP-1α突变体不仅具有显著改善的抗凝集能力，而且具有与野生型同等的活性，并已就作为癌症化疗的副作用的血中粒细胞减少症的改善进行了研究(E.Marshall et al.，EuropeanJournal of Cancer，Vol.34，No.7，pp.1023-1029(1998))。

作为制癌剂(通常名称：zinostatin stimalamer)已知有通过作为两亲性高分子一种的部分丁酯化苯乙烯-马来酸共聚物化学改性的新制癌菌素(特公平1-33119号)。已知当将它投到血中时，表现出所谓大致有选择地积聚成固体瘤，长时间后仍维持在肿瘤内的EPR效果，所以可作为癌特异的寻靶型制癌剂使用。另外，已知还有用两亲性高分子化学改性的肽性激动剂或其功能性衍生物(WO01/83548)。另外已知用聚乙二醇修饰的黄嘌呤氧化酶对肿瘤细胞也表现出EPR效果(特开平11-060499号)。无论使用这些物质中的哪一种对肿瘤细胞具有直接攻击性的物质，都可达到抗肿瘤效果，通过使攻击性物质选择性地集聚在目标患处，目的在于减少对正常细胞或组织的影响。

另外，已知通过用作为两亲性高分子一种的聚乙二醇衍生物对蛋白质进行修饰，可以使生物体内清除率延迟，或使抗原性降低(Yoshimotoet al.，Jpn.J.Cancer Res.，77，1264(1986)、Abuchowski etal.，Cancer Biochem.Biophys.，7，175(1984)、特开昭61-178926号公报、特开昭62-115280号公报、特再表WO96/28475号公报、特表平10-513187号公报、特开平11-310600号公报、特表2000-517304号公报)。另外已知聚乙二醇修饰的白介素-1、白介素-6、干扰素等(特开平5-117300号公报、特开平6-256394号公报、特开平9-25298号公报)。

发明内容

如上所述，树突细胞在治疗中的应用领域正在不断扩大，但由于树突细胞前体只存在于外周血中，为了获得用于治疗的量即使是在体外进行增殖也是困难的。因此，谋求提高患者外周血中树突细胞前体的水平成为利用树突细胞使治疗实用化方面的关键。本发明的目的就在于提供用于实用化治疗的技术手段。

首先，如以下参考例1所示那样，本发明人通过将痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acnes，以下称P.acnes)的死菌注入小鼠，发现树突细胞前体(F4/80抗原阴性、B220抗原阴性、CD11c抗原阳性细胞)被诱导到血液中。通过随后的研究，发现这种树突细胞前体诱导作用被抗巨噬细胞炎性蛋白-1α(Macrophage inflammatoryprotein-1α，MIP-1α)抗体抑制，推断MIP-1α，以及针对未成熟树突细胞中表达的受体的激动剂参与树突细胞前体的诱导机制，再进一步研究，发现通过由生物体外给予上述激动剂、例如MIP-1α，存在于血中的树突细胞前体的浓度水平至少上升了数十倍数量级的意料之外的现象，直至完成本发明。在本说明书的记述中，只要没有特别指出，「树突细胞」用语可用作各种各样的处于成熟阶段的细胞的总称。

然而，象天然型MIP-1α那样的许多配体在生理条件下，形成凝集体沉淀，经常出现活性丧失的问题。为了解决这一问题，又进行了目的在于进一步提高上述配体使树突细胞前体的血中浓度水平上升作用以及改善在血中的稳定性的研究。

即，本发明人等着眼于作为针对未成熟树突细胞中表达的受体的激动剂的代表例MIP-1α以及其功能性衍生物的一个例子BB10010，尝试上述配体用两亲性高分子进行化学改性，发现化学改性的配体不抑制其活性，活性反而提高了，直至发明新的激动剂衍生物。

所以本发明涉及(1)一种以针对在未成熟树突细胞中表达的受体的激动剂或其功能性衍生物作为有效成分的树突细胞前体的血中水平上升剂，(2)一种以针对受体CCR1或CCR5的激动剂或其功能性衍生物作为有效成分的树突细胞前体的血中水平上升剂。

更具体讲，涉及(3)激动剂是选自MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MARC、LCC-1(ref)、MCP-3和MCP-4的树突细胞前体的血中水平上升剂，或(4)激动剂是选自MIP-1α、RANTES、MARC以及LCC-1(ref)的树突细胞前体的血中水平上升剂，(5)激动剂或其功能性衍生物为MIP-1α或其功能性衍生物的树突细胞前体的血中水平上升剂，(6)MIP-1α的功能性衍生物为BB-10010的树突细胞前体的血中水平上升剂。

更具体讲，涉及(7)激动剂的功能性衍生物为用两亲性高分子化学改性的针对在未成熟树突细胞表达的受体的激动剂的树突细胞前体的血中水平上升剂，(8)激动剂的功能性衍生物为用两亲性高分子化学改性的针对受体CCR1或CCR5的激动剂的树突细胞前体的血中水平上升剂，(9)激动剂的功能性衍生物是用两亲性高分子化学改性的MIP-1α、BB-10010、MIP-1β、RANTES、MARC、LCC-1(ref)、MCP-3或MCP-4的树突细胞前体的血中水平上升剂，(10)激动剂的功能性衍生物是用两亲性高分子化学改性的MIP-1α、BB-10010、RANTES、MARC或LCC-1(ref)的树突细胞前体的血中水平上升剂，(11)激动剂的功能性衍生物是用两亲性高分子化学改性的MIP-1α或BB-10010的树突细胞前体的血中水平上升剂，(12)激动剂的功能性衍生物是用两亲性高分子化学改性的BB-10010的树突细胞前体的血中水平上升剂，以及(13)两亲性高分子是部分烷基酯化的苯乙烯-马来酸共聚物的(7)至(12)所述的树突细胞前体的血中水平上升剂。

另外本发明还涉及(14)用两亲性高分子化学改性的针对在未成熟树突细胞中表达的受体的激动剂，(15)用两亲性高分子化学改性的针对受体CCR1或CCR5的激动剂。

更具体讲，还涉及(16)用两亲性高分子化学改性的MIP-1α、BB-10010、MIP-1β、RANTES、MARC、LCC-1(ref)、MCP-3或MCP-4，(17)用两亲性高分子化学改性的MIP-1α，(18)用两亲性高分子化学改性的BB-10010，(19)(14)至(18)的激动剂，其中两亲性高分子是部分烷基酯化苯乙烯-马来酸共聚物或聚乙二醇衍生物。

附图说明

图1表示抗MIP-1α抗体在将P.acnes给予B6小鼠引起的向外周血诱导树突细胞前体的效果。

图2表示通过给予B6小鼠MIP-1α引起的向外周血诱导树突细胞前体的诱导活性随时间的变化。

图3表示在将对MIP-1α诱导的树突细胞前体进行抗原致敏后与T淋巴细胞共培养进行的混合淋巴细胞反应中的T淋巴细胞的增殖效果。

图4表示在小鼠接种的肿瘤细胞的增殖中，使用MIP-1α诱导的树突细胞前体的疫苗疗法的效果。

图5表示用MIP-1α诱导的树突细胞前体在体外肿瘤特异的杀伤性T细胞的诱导中的效果。

图6表示通过用MIP-1α诱导的树突细胞前体诱导的肿瘤特异的杀伤性T细胞的MHC classI限制性的确认实验的结果。

图7表示使用MIP-1α诱导的树突细胞前体的疫苗疗法对肿瘤细胞在小鼠肺转移中的效果。

图8表示每个Bu-SMA-BB10010级分的280nm的吸光度。

图9表示Bu-SMA-BB10010以及作为原料的BB10010的Native-PAGE电泳结果。

图10表示BB10010以及Bu-SMA-BB10010静脉注入24小时后的血中树突细胞占有率。斜线柱图表示B220^-CD11c+，而无斜线柱图表示B220⁺CD11c+。

具体实施方式

由使用了MIP-1α的本发明人等的研究结果预料针对在未成熟树突细胞中表达的受体CCR1、CCR2、CCR4、CCR5、CCR6、CCR11以及CXCR4等的配体、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、MARC、LCC-1(ref)、MCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MCP-5、TARC、MDC、MIP-3α、MIP-3β、LARC、TECK、BLC、SDF-1、Exodus-1、Exodus-2等有使树突细胞前体的血中浓度水平上升的作用。预料其中在本发明人等研究中认为与树突细胞在末梢脏器游走有关系的作为对CCR1以及CCR5共通的配体已知的MIP-1α、RANTES、MARC、LCC-1(ref)等在使树突细胞前体的血中浓度水平上升的作用中更优秀。

作为本发明中有效成分代表例的MIP-1α已知是属于CC亚家族的趋化因子，是受体CCR-1和CCR-5的配体(激动剂)。已知人成熟型MIP-1α是由70个氨基酸构成的，而由CD8⁺T细胞或HTLV-1感染细胞MT4培养上清中得到的MIP-1α含有66个氨基酸。在人MIP-1α中，已知由于个体差异，存在着基因拷贝数不同的非等位基因LD78β，与70氨基酸型MIP-1α在序列上有3个残基不同。上述这些MIP-1α，无论哪一个都可以在本发明中使用。

所谓在本发明中能够使用的激动剂的功能性衍生物指的是针对在未成熟树突细胞中表达的受体的配体的衍生物，具有激动剂作用的物质。例如，所谓MIP-1α的功能性衍生物是MIP-1α的衍生物，作为激动剂表现出与MIP-1α同样生物活性，作为这样的生物学同等物的代表例子，如BB-10010(已出版，European Journal of Cancer，Vol.14，No.7，pp.1023-1029(1998))。

在本发明中作为树突细胞前体的血中水平上升剂使用的激动剂如果用部分烷基酯化苯乙烯-马来酸共聚物或聚乙二醇衍生物为代表的两亲性高分子进行化学改性，确认不但可以维持其活性，而且能改善血中的稳定性，使水平上升作用维持以及由于EPR效果产生向癌部位集聚。激动剂向癌部位的集聚引起在外周血中增加的树突细胞向癌部位集聚，进一步提高了癌免疫疗法的效果。因此，本发明中使用的激动剂的功能性衍生物优选用两亲性高分子化学改性，这样一来，用两亲性高分子化学改性的激动剂以及其生物学同等物在本说明书中也称为「激动剂的功能性衍生物」。

作为在本发明中用于对肽性激动剂或其生物学同等物进行化学改性的两亲性高分子的优选例子，可以列举部分烷基酯化苯乙烯-马来酸共聚物，另外，作为其中的烷基部分的例子，可以列举直链或有分支的碳数为1至5的烷基，这样的烷基也可以用低级的烷氧基取代。更具体地，可以列举甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基、叔丁基、正戊基、3-甲基-1-丁基、2-甲基-1-丁基、2，3-二甲基-1-丙基、2-戊基、3-甲基-2-丁基、3-戊基、2-甲基-2-丁基、甲基乙二醇乙醚、乙基乙二醇乙醚等。

优选的部分烷基酯化苯乙烯-马来酸共聚物的例子为特公平1-33119号中记载的部分丁基酯化苯乙烯-马来酸共聚物，选择平均分子量为1000～10000，聚合度为1～100、优选3～35的共聚物。

在本发明中用于对激动剂或其生物学同等物进行化学改性的两亲性高分子的其他优选例子，可以列举聚乙二醇(以下有时也记为PEG)的衍生物。这里，所谓聚乙二醇衍生物指的是-O-(CH₂CH₂O)_n-所示的PEG部分(n为20至280的整数)具有可与激动剂或其生物学同等物的肽链结合的残基的化合物。作为聚乙二醇衍生物的例子，可以列举具有可与肽链的氨基(N末端氨基、赖氨酸残基的氨基)结合的残基的化合物。作为聚乙二醇衍生物的其他例子，可以列举具有可与肽链的羧基(C末端羧基、天冬氨酸残基、谷氨酸残基的羧基)结合的残基的化合物。

另外，作为可用于本发明的两亲性高分子的其他例子，可以列举聚乙烯基吡咯烷酮等。

本发明涉及到的用两亲性高分子化学改性的激动剂及其生物学同等物可以通过使两亲性高分子与激动剂及其生物学同等物因场合不同借助于连接臂进行化学结合，经部分纯化获得。即，在缓冲液中使两亲性高分子与激动剂及其生物学同等物反应，然后使用柱色谱进行纯化，对洗脱出的各个级分进行分离。

以两亲性高分子为部分烷基酯化苯乙烯-马来酸共聚物的情况为例，如果更具体说明，首先，使苯乙烯与马来酸酐的自由基共聚合得到的苯乙烯-马来酸共聚物(SMA)的酸酐溶解于枯烯等有机溶剂，在搅拌下向该溶液中滴加正丁醇，使其反应，通过对无水环进行部分丁基酯化，可以获得部分丁基酯化苯乙烯-马来酸共聚物(Bu-SMA)。这样获得的Bu-SMA与激动剂或其生物学同等物的结合可以通过使两者在pH8.5的碳酸氢钠0.3M溶液中反应，在Bu-SMA中的酸酐与激动剂或其生物学同等物中的氨基之间形成酰胺键进行。Bu-SMA对激动剂或其生物学同等物的键数可以为1以上，优选3至10，更优选6至8。

当作为两亲性高分子使用PEG，对激动剂或其生物学同等物的肽链的氨基进行改性时，优选在PEG的末端导入可与氨基反应的官能团，例如羧基。为了使其能与激动剂或其生物学同等物的肽中的氨基结合，优选是将该官能团变换为反应性基团，对于羧基，优选活性酯法、混合酸酐法等。

具体来说，活性酯的情况下，可以列举对硝基苯酯、五氟苯酯等苯酯类，N-羟基苯二甲酰亚胺酯、N-羟基琥珀酰亚胺酯等二羧酰亚胺酯，N-羟基哌啶酯等羟基系活性酯等。这些活性酯的制备可以按照常规方法进行，例如使用二环己基碳二亚胺和1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺等缩合剂在-20℃至室温使PEG衍生物的羧基与对应于上述活性酯的醇体反应1至24小时进行。或也可以在三乙胺等碱存在下在0℃至80℃使PEG衍生物的羧基与对应于上述活性酯的卤化物反应1至72小时进行制备。运用混合酸酐法时，可以通过在N-甲基吗啉、N-乙基哌啶等碱存在下，与氯甲酸异丁酯、氯甲酸乙酯、异戊酰氯等于-20℃至0℃反应1至30分钟进行制备。

也可以将PEG衍生物直接导入激动剂或其生物学同等物的肽链，也可以借助于连接臂导入。例如将含有赖氨酸的短的氨基酸序列导入目的肽链，该赖氨酸的氨基用PEG衍生物进行修饰。在修饰反应中，相对于被修饰肽链中含有的氨基数，优选使用10至30倍摩尔的PEG衍生物。

当作为两亲性高分子使用PEG，对激动剂或其生物学同等物的肽链的羧基进行修饰时，优选在PEG的末端导入可与羧基反应的官能团，例如导入氨基。

这样获得的用两亲性高分子化学改性的肽性激动剂或其生物学同等物预期可以由于EPR效果有选择地向固体肿瘤等目标患处集聚。

本发明涉及到的树突细胞的血中水平上升剂优选是非口服给予作为有效成分的激动剂或其功能性衍生物、即蛋白质，优选是以与例如水、或其他药学上容许的液体的无菌溶液或悬浮液等注射剂形式给药。用于注射的无菌组成物可以按照使用象注射用水那样的媒液、天然植物油等，使有效成分溶解或悬浮等通常的制剂手段处方。作为注射用的水性液体，例如生理盐水、葡萄糖或含有其他辅助药的等渗液(例如，D-山梨糖醇、D-甘露糖醇、氯化钠等)等，也可以与适当的溶解辅助剂，例如醇(例如乙醇等)、多元醇(例如丙二醇、聚乙二醇等)、非离子性表面活性剂(例如，聚山梨酸酯80^TM、HCO-50等)等并用。作为油性液可以使用例如芝麻油、椰子油、大豆油等，作为溶解辅助剂也可以与苯甲酸苄酯、苄醇等并用。另外也可以与缓冲剂(例如、磷酸盐缓冲液、醋酸钠缓冲液等)、安慰剂(例如，烷基二甲基苄基氯化铵、盐酸普鲁卡因等)、稳定剂(例如，人血清白蛋白、聚乙二醇等)、保存剂(例如，苄醇、苯酚等)、抗氧化剂等配合。

在本发明中得到的结合了Bu-SMA的激动剂或其生物学同等物可以使用水溶性或油性注射用剂的形式。水溶性注射用剂主要用于静脉给药。油性注射剂通过固定在肿瘤营养动脉上游的导管将使均一分散于例如碘化罂粟油等油剂的结合了Bu-SMA的激动剂或其生物学同等物投到肿瘤组织等的目标患部。本发明人等发现结合了Bu-SMA的激动剂或其生物学同等物在血中与清蛋白结合后以高分子化合物起作用以及Bu-SMA结合物可溶于油剂，其结果，如果将油剂化的结合了Bu-SMA的激动剂或其生物学同等物注射到局部动脉，预期通过所谓EPR效果可有选择地集聚于固体肿瘤等目标患部。

象上述那样获得的制剂可以给予例如人或哺乳动物。本发明的有效成分的给药量因对象疾病、给药对象、给药路径等不同而有所差异，非口服给药时的该有效成分的一次给药量，例如给予成人(体重为60kg)时，一次约0.01～10mg左右，优选约0.1～5mg左右。对于其他动物也可以给予换算为每60kg的量。

参考例1

利用P.acnes进行血中树突细胞前体的诱导和利用抗MIP-1α抗体抑制诱导

由尾静脉向B6小鼠(雌、8-10周龄、CLEA公司生产)注入P.acnes(1mg/只；American Type Culture Coleection 118289)，向血中诱导树突细胞前体。在注入P.acnes的6小时前，由尾静脉向其中的一组注入具有功能抑制活性的抗MIP-1α抗体(山羊多克隆抗体；100μg/μl；Genzyme/Techne公司生产)。作为阴性对照同样注入山羊IgG(Sigma-Aldrich公司生产)。

用NycoPrep(Axis-Shield公司生产)从注入P.acnes 3日后各个小鼠采集的肝素采血液进行分离，采集外周血单核细胞。使该外周血单核细胞与FITC标记抗CD11c抗体(Clone HL3，PharMingen公司生产)和PE(Phycoerythrin)标记抗B220抗体(Clone RA3-6B2；PharMingen公司生产)于4℃下反应后，通过流式细胞仪(EPICS-Elite，Coulter公司生产)进行解析。以B220抗原阴性、CD11c抗原阳性细胞作为树突细胞前体，算出外周血单核细胞中树突细胞前体的比例。结果如图1所示。图1中「PBS」是作为对照只注入PBS的组的结果。

注入P.acnes与没有注入组相比，外周血单核细胞中的树突细胞前体的比例急剧上升。这表明树突细胞前体已经被诱导到血液中。在注入抗MIP-1α抗体组中，确认由于注入P.acnes外周血单核细胞中的树突细胞前体的出现频率的上升约一半都被抑制了。

参考例2

MIP-1α法制法

利用PCR法获得人MIP-1α基因。将该人MIP-1α基因整合到表达穿棱载体·pNCMO2，通过大肠杆菌进行扩增。将该人MIP-1α基因表达载体导入Brevibacillus choshinensis(B.choshinensis)HPD31S5。对导入该人MIP-1α基因的B.choshinensis进行培养，采集培养上清。向该培养上清加终浓度为40％的硫酸铵，沉淀生成后进行离心，分离上清，然后再加使终浓度为60％的硫酸铵，沉淀生成后进行离心，回收该沉淀物。将该沉淀物溶解于Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，通过阴离子交换色谱(Q Sepharose；Amersham公司生产)对该溶解物进行分级。收集各个级分中含有MIP-1α的级分，加硫酸铵溶解(终浓度1.5M)。通过疏水性色谱(RESOURCE PHE；Amersham公司生产)对该溶解物进行分级。收集各个级分中含有MIP-1α的级分(非吸附级分)，加硫酸铵进行硫酸铵沉淀(终浓度60％饱和)。将沉淀物溶解于Tris-HCl缓冲液(pH8.0)中，再通过阴离子交换色谱(RESOURCE Q；Amersham公司生产)对该溶解物进行分级。收集各个级分中含有MIP-1α的级分，为了除去Tris-HCl，对20mM NH₄HCO₃(pH8.5)进行透析。对通过上述处理生成的沉淀进行离心，得到纯化的人MIP-1α。将它进行冷冻干燥后溶解于PBS，用于以下实验。

参考例3

BB10010的制法(表达与纯化)

BB10010的cDNA以人MIP-1α cDNA作为模板，使用Quik ChangeKit(Stratagene公司)通过定点特异突变进行制备。即，向在125ng突变引物RQ1：5’-CCAGCGAAGCCGGCAGGTCTGTGCTGACCCAG-3’(序列编号1)、RQ2：5’-CTGGGGTCAGCACAGACCTGCCGGCTTCGCTTGG-3’(序列编号2)、模板质粒DNA10ng中含有50μMdNTP的50μl反应体系中添加Pfuturbo(2.5U/μl)，于95℃下变性30秒钟，然后进行每一循环为95℃30秒钟、55℃1分钟、68℃7分钟的12次循环后，向反应体系中添加1μl限制酶DpnI，于37℃下反应1小时，切断模板DNA，只回收突变质粒。通过DNA序列解析确认突变部位正确置换后，使用MIPM2引物5’-CATGCCATGGCTTTCGCTTCACTTGCTGCTGACAC(序列编号3)以及MIPRV引物5’-CGCGGATCCTCAGGCACTCAGCTCTAG(序列编号4)，进行通常的PCR，用限制酶Ncol和BamHl切断后，插入到短芽孢杆菌表达载体pNCMO2的同样限制酶切位点。然后用该重组质粒转化Brevibacillus chonshinensis HPD31株，于30℃下，用TMN培养基在发酵灌培养3天、20L，使其分泌表达。将该培养基上清用0.45um的滤膜过滤除菌，作为纯化的初始材料。向该培养基上清中添加10倍浓度的磷酸缓冲液(0.1M磷酸钠)，最终为pH7.0，利用AKTA-prime系统(Amersham Biosciens公司)以5ml/min速度向用10mM磷酸缓冲液(pH7.0)平衡的肝素柱(5ml大小、Amersham Biosciens公司)送液，使BB10010吸附。洗脱以按照梯度添加含有1M氯化钠的磷酸缓冲液(pH6.5)进行。峰级分对于50mM甲酸缓冲液(pH4.0)进行透析。接着以1ml/min送入阳离子交换色谱SP-FF(1ml大小、AmershamBiosciens公司)，使BB10010吸附。洗脱以按照梯度添加含有1M氯化钠的甲酸缓冲液(pH3.8)进行。BB10010洗脱级分通过SDS-聚丙烯酰胺电泳确认。峰级分经凝胶过滤色谱(充填剂：BioRad公司生产Bio-GelP60，移动相：20mM碳酸氢铵溶液(pH8.5)、柱尺寸：1.6×83cm)纯化BB10010。对该峰级分进行冷冻干燥。

实施例1

MIP-1α向小鼠血中诱导树突细胞前体的活性

由尾静脉向B6小鼠(雌、8-10周令、C1EA公司生产)注入通过参考例2制法得到的纯化MIP-1α(5μg/只)，向血中诱导树突细胞前体。就注入MIP-1α后的4，8，16，24，48，72小时后由该小鼠采集的肝素采血液与参考例1一样用流式细胞仪进行解析，算出外周血单核细胞中树突细胞前体的比例。

结果如图2所示。就象图中

破折线图表示的那样，由于注入MIP-1α，在短时间内，外周血单核细胞中的树突细胞前体(B220^-CD11c⁺细胞)的比例急剧上升，在注入后8小时，达到峰值(12.45％±0.49)，该峰一直持续到24个小时后。由于在注入MIP-1α前(图2的时间为零时)的树突细胞前体的浓度为0.5至1％，显然血中水平上升了12至24倍数量级。

另外，就象图2中◇破折线图表示的那样，由于注入MIP-1α，外周血单核细胞中的树突细胞前体(B220⁺CD11c⁺细胞)的比例上升，在注入后8小时，达到峰值、该峰一直持续到24个小时后。通过最近本发明人等的研究，确认作为血浆细胞系的树突细胞前体的B220⁺CD11c⁺细胞依赖于E选凝素以及CXCL9与炎症淋巴节高内皮性细静脉(high endothelial venules)直接结合，并一起游出，支持作为骨髓性树突细胞的B220⁺CD11c⁺细胞的功能。而B220⁺CD11c⁺细胞产生干扰素γ，促进杀伤细胞的活化也被本发明人等阐明。由这些见解，外周血中B220⁺CD11c⁺细胞水平的上升在利用树突细胞进行的免疫疗法中带来了重要的意义。

实施例2

通过MIP-1α诱导到小鼠血中的树突细胞前体的功能解析

以解析通过MIP-1α诱导到小鼠血中的树突细胞前体是否具有与P.acnes诱导的树突细胞前体同样性状为目的进行以下实验。

<1>来自外周血树突细胞前体的制备

由尾静脉向B6小鼠(雌、8-10周令、C1EA公司生产)注入P.acnes死菌(1mg/只)或用参考例2的制法得到的纯化MIP-1α(5μg/只)。P.acnes死菌注入后第3天或MIP-1α注入后第16小时在麻醉下从该小鼠心脏进行肝素采血(0.8ml/只)。用NycoPrep对该肝素采血液进行分离，采集外周血单核细胞。使该外周血单核细胞与FITC标记抗CD11c抗体和PE标记抗B220抗体于4℃下反应30分钟后，用细胞分选器(EPICS-Elite、Coulter公司生产)分离B220抗原阴性、CD11c抗原阳性细胞。将该分离细胞在GM-CSF(4ng/ml；Kirin Brewery公司生产)和IL-4(10ng/ml；Genzyme/Thech公司生产)存在下培养5天后作为来自外周血的树突细胞前体。

<2>来自骨髓的树突细胞前体的制备

由B6小鼠的大腿骨和胫骨采取骨髓细胞。用NycoPrep对该骨髓细胞进行分离，采集外周血单核细胞。将该骨髓单核细胞于培养皿培养10-12小时，回收非附着骨髓单核细胞。将该非附着骨髓单核细胞与磁珠标记c-kit抗体混合培养，通过磁细胞分选器(MACS；MiltenyiBiotec公司生产)分离c-kit阳性细胞。将该c-kit阳性细胞调整到2.5×10⁵cells/ml浓度，于SCF(须藤先生(Toray公司)提供)、Flt3L(Immunex公司生产)、GM-CSF(4ng/ml)和IL-4(10ng/ml)存在下，培养7-9天的细胞作为来自骨髓的树突细胞前体。

<3>树突细胞前体的抗原致敏

作为抗原的癌细胞株的裂解物通过对癌细胞反复进行3次冷冻·溶解制备。将该来自外周血的树突细胞前体(来自注入P.acnes死菌或纯化MIP-1α的小鼠)和来自该骨髓的树突细胞前体与该癌细胞株裂解物按照树突细胞前体:癌细胞＝1:3混合，培养20小时。回收该癌细胞株裂解物致敏树突细胞前体，通过丝裂霉素C(10μg/ml)进行处理后，将清洗2次的细胞作为抗原致敏树突细胞前体。<4>抗原致敏树突细胞前体引起的T淋巴细胞增殖反应测定

由B6小鼠脾细胞通过磁细胞分选器(MACS；Miltenyi Biotec公司生产)制备CD3阳性T淋巴细胞。将T淋巴细胞与该抗原致敏树突细胞前体(来自用B16癌细胞株裂解物致敏的骨髓的树突细胞前体)的比按照1:20混合，在IL-2、IL-7存在下用24孔培养板培养。对该培养T淋巴细胞培养5天后，每隔2-3日将50％的培养基与新鲜的培养基交换对该细胞继续培养。在第7和第14天通过重新加入该抗原致敏树突细胞前体，对该培养T淋巴细胞进行再致敏。在培养第21天回收该培养T淋巴细胞。然后，使用96孔圆底培养板(Nunc公司制造)，将该培养T淋巴细胞分别与来自经MMC处理的B16癌细胞株裂解物致敏的该外周血的树突细胞前体(来自注入P.acnes死菌或纯化MIP-1α的小鼠)、来自B16癌细胞株裂解物致敏的该骨髓的树突细胞前体、用EL4癌细胞株裂解物致敏的该树突细胞前体、未致敏该树突细胞前体或只有癌细胞株裂解物混合，于37℃下培养4-5天。培养后，按照15μl/孔加5mg/ml的MMT(3-(4，5-dimethylthiazolyl-2yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide))溶液，于37℃下培养4小时。培养后，通过测定各个孔的550nm吸光度，测定该T淋巴细胞的增殖。

结果如图3所示。来自B16癌细胞株裂解物致敏的注入纯化MIP-1α的小鼠的该外周血的树突细胞前体与来自注入P.acnes死菌小鼠外周血树突细胞前体或来自骨髓的树突细胞前体同样增强该培养T淋巴细胞的增殖。另外，如果只是用EL4癌细胞株裂解物致敏的该树突细胞前体、未致敏该树突细胞前体或癌细胞株裂解物则没有看到该培养T淋巴细胞增殖的增强活性。

<5>在小鼠的肿瘤增殖中的免疫效果的研究

对B6小鼠的各个组(8只/组)于第0天、第7天两次通过腹侧皮下分别注入用B16癌细胞株裂解物致敏的该外周血树突细胞前体(来自注入P.acnes死菌或纯化MIP-1α的小鼠)、B16癌细胞株裂解物致敏的该骨髓树突细胞前体、用EL4癌细胞株裂解物致敏的该树突细胞前体、未致敏的该树突细胞前体(各1×10⁶/鼠)、癌细胞株裂解物或PBS。14天后向该小鼠的腹侧皮下接种B16癌细胞(2×10⁵/鼠)。接种后每隔3天，测定肿瘤面积，判定肿瘤的增殖。同时观察小鼠的存活天数。

结果如图4所示。通过用来自B16癌细胞株裂解物致敏的注入纯化MIP-1α的小鼠的外周血树突细胞前体进行免疫，可显著抑制接种于皮下的B16癌细胞的增殖。另外，在50％(5/10)的小鼠中，观察到肿瘤消失，确认存活可延长到60天以上。这一效果与来自注入P.acnes死菌小鼠外周血树突细胞前体或来自骨髓的树突细胞前体同等。另外，只是用EL4癌细胞株裂解物致敏的该树突细胞前体、未致敏该树突细胞前体或癌细胞株裂解物免疫的小鼠癌接种后20天内全部死亡。<6>肿瘤特异的细胞伤害活性的测定

通过与上述<4>同样的方法，由B6小鼠脾细胞制备CD3阳性T淋巴细胞，通过分别与来自B16癌细胞株裂解物致敏的该外周血树突细胞前体(来自注入P.acnes死菌或纯化MIP-1α的小鼠)、B16癌细胞株裂解物致敏的该骨髓树突细胞前体、或只是癌细胞株裂解物混合培养，制备培养T淋巴细胞。将该T淋巴细胞连续稀释后按照100μl/孔加到96孔板中。然后按照100μl/孔加B16癌细胞株的细胞浮游液。将该培养板于37℃下培养10小时。对该培养板离心后，将上清100μl/孔移至新的96孔板。按照100μl/孔向各个孔加CytotoxicityDetection Kit(LDH；Boehringer Mannheim公司生产)。使该反应板于室温下反应30分钟后，通过培养板吸光度测定仪器测定490nm的吸光度。

结果如图5所示。与来自B16癌细胞株裂解物致敏的注入纯化MIP-1α的小鼠的外周血树突细胞前体混合培养的T淋巴细胞可有效地伤害B16癌细胞，但不伤害EL4癌细胞。通过与来自B16癌细胞株裂解物致敏的注入P.acnes死菌小鼠外周血树突细胞前体或来自骨髓树突细胞前体混合培养的T淋巴细胞液同样伤害B16癌细胞。然而只与癌细胞株裂解物混合培养的T淋巴细胞不伤害B16癌细胞。

<7>在上述<5>中，在来自B16癌细胞株裂解物致敏的该外周血树突细胞前体(来自注入MIP-1α的小鼠)或来自该骨髓的树突细胞前体免疫的小鼠中，对于B16癌细胞株接种后第60天癌细胞消失了的小鼠，由该小鼠采取脾细胞。分离该脾细胞的CD8阳性T淋巴细胞(1×10⁶)后，与MMC处理的B16癌细胞株(1×10⁵)培养5天。将该培养T淋巴细胞连续稀释后按照100μl/孔加到96孔板中。然后按照100μl/孔加B16癌细胞株的细胞悬浮液。将该培养板于37℃下培养10小时。对该板离心后，将上清100μl/孔移至新的96孔板。按照100μl/孔向各个孔加Cytotoxicity Detection Kit(LDH；Boehringer Mannheim公司生产)。使该反应板于室温下反应30分钟后，通过培养板吸光度测定仪器测定490nm的吸光度，测定细胞伤害活性。对于MHC classI功能抑制实验，对B16癌细胞在添加前用MHC classI抗体(抗H2Kb/H2Db抗体)或对照抗体(抗H2Dd抗体)于37℃下处理30分钟。

结果如图6所示。该培养T淋巴细胞可有效地伤害B16癌细胞，但不伤害EL4癌细胞。而该活性，通过用抗MHC classI抗体处理该培养T淋巴细胞，完全被抑制。而用对照抗体没有看到这样的效果。

<8>对B6小鼠的各个组于第0天、第7天两次通过腹侧皮下分别注入用B16癌细胞株裂解物致敏的该外周血树突细胞前体(来自注入P.acnes死菌或纯化MIP-1α的小鼠)、B16癌细胞株裂解物致敏的该骨髓树突细胞前体、用EL4癌细胞株裂解物致敏的该树突细胞前体、未致敏该树突细胞前体(各1×10⁶/鼠)、癌细胞株裂解物或PBS。第二次免疫后第7天从该免疫小鼠采取脾细胞。用细胞分选器从该脾细胞分离分离CD4阳性细胞和CD8阳性细胞T细胞。将该T细胞与进行了MMC处理的B16癌细胞混合，使用24孔板培养48小时。使用该培养细胞，测定细胞伤害活性。另外使用IFN_γELISA系统(Endogen公司生产)测定该培养细胞的上清中的IFN_γ浓度。

<9>肺转移中效果的确认

由B6小鼠的尾静脉注入B16癌细胞(1×10⁶/鼠)。在癌细胞注入后第3天，第7天由尾静脉分别用B16癌细胞株裂解物致敏的该外周血树突细胞前体(来自注入MIP-1α的小鼠)、B16癌细胞株裂解物致敏的该骨髓树突细胞前体、用EL4癌细胞株裂解物致敏的该树突细胞前体、未致敏的该树突细胞前体(各1×10⁶/鼠)、癌细胞株裂解物或PBS。癌细胞注入后第21天摘出小鼠肺，测定癌转移巢数，判定转移的程度。

结果如图7所示。数据用各组3只鼠的平均值表示。在用来自用B16癌细胞株裂解物致敏的注入纯化MIP-1α的小鼠的外周血树突细胞前体以及来自骨髓的树突细胞前体进行癌接种后免疫的小鼠中，B16癌细胞向肺转移被明显抑制。而且，混合培养的T淋巴细胞液同样伤害B16癌细胞。但在用未致敏的该树突细胞前体免疫的小鼠中看不到这样的转移抑制效果。

实施例3

Bu-SMA结合BB10010的制法

将参考例3得到的BB10010按照终浓度为2mg/ml那样溶解于0.8M的碳酸氢钠缓冲液(pH8.5)中。向该溶液1ml慢慢加溶解在二乙基甲酰胺的Bu-SMA 2.6mg(换成摩尔比，Bu-SMA:BB10010＝10:1)，于27℃反应过夜。反应结束后，用凝胶过滤层析(充填剂：Bio-Gel P60、移动相：20mM的碳酸氢钠缓冲液(pH8.5)，柱尺寸：1.6×83cm)对反应混合物进行分离。分离到90根试管(每管2ml)(图8)。然后根据280nm的吸光度将洗脱到试管16～18的级分(6ml)进行冷冻干燥，获得白色粉末状的Bu-SMA结合BB10010(以下表示为「Bu-SMA-BB10010」)。

图9给出了得到的Bu-SMA-BB10010和作为原料的BB10010的Native-PAGE(未变性的10-20梯度聚丙烯酰胺凝胶电泳)的结果。两者的电泳距离明显不同。认为这是由于BB10010的赖氨酸的氨基被SMA稀释减少了表面的正电荷，更容易向阳极一侧泳动的缘故。两者泳动距离差以及级分No.16～18的Bu-SMA-BB10010与未反应的Bu-SMA和BB10010的氨基与荧光试剂Fluorescamine(0.3mg/ml inacetone)反应，通过分光荧光计用激发波长390nm、荧光波长475nm进行测定、定量，估计1分子结合2～3个SMA。

实施例4

从健康人采血80ml，与Polymorphprep(第一科学)一起以1600rpm在20℃下离心35分钟，分离单核细胞层。为了除去淋巴细胞、中性白细胞，利用塑料吸附法。即，将单核细胞层用10％ FCS的RPMI 1640调整到2×10⁵cells/cm²，悬浮在预先用含有10％ FCS的RPMI 1640(SIGMA)于37℃下包被30分钟的细胞培养皿中，在37℃ CO₂分压下，放置1小时，使单核细胞附着在培养皿。除去培养液后，与预先加温到37℃的含有1％ FCS的RPMI 1640将培养皿清洗2次，于4℃加含有1％ FCS的RPMI 1640，于冰上静置30分钟。然后用移液管回收单核细胞，对单核细胞悬浮液在1600rpm 4℃下进行离心分离。除去上清后，用含有1％ FCS的RPMI 1640调整到1×10⁶个/ml。将其中的50ul置于46孔趋化室(家田贸易)的上室，下室放置趋化因子，于CO₂分压下放置90分钟。边界的滤膜使用孔径5um。用Diff Quick(国际试剂株式会社)I液染色10秒钟，用II液染色10秒钟，在显微镜下对染色细胞进行计数。结果，含有Bu-SMA-BB10010的级分表现出的单细胞趋化活性与其浓度有关，其活性当其浓度为未修饰BB10010的约100分之一浓度下表现出2倍以上的活性。由此可确认BB10010即使用Bu-SMA进行化学改性也保持生物活性，而且其活性比未修饰的更高。

实施例5

Bu-SMA-BB10010的血中树突细胞起因作用和BB10010的比较实验如下进行。由BALB/c小鼠(9周令，雄：Seac吉富)的尾静脉注入200ug/200ul Bu-SMA-BB10010(级分No.16～18)，或200ug/200ul未修饰BB10010，24小时后，从肠间膜静脉采取静脉血。将得到的单核细胞用PBS(-)+2％FCS调整到5×10⁵cells/50μl，将FITC标记抗CD11c抗体(FITC CONJUGATED HAMSTER ANTIMOUSE CD11c：Pharmingen)和PRE标记抗B220抗体(R-PE CONJUGATEI)都分别稀释25倍、200倍，于冰上，在避光条件下反应1小时后，用FACS(BECTONDICKINSON公司生产)对表面抗原倍荧光标记的细胞数的比例进行测定，并数值化(图10)。

结果，在单核细胞中CD11c(+)B220(-)细胞组占有的比例当对照组为2.52±0.34％时，在Bu-SMA-BB10010组为11.45±2.59％，上升到4.5倍，与未修饰BB10010注入组的6.65±0.78％比较，上升到1.7倍，用SMA修饰具有使血中稳定性增大等影响，确认对树突细胞向血中的移动作用有增强效果。另外CD11c(+)B220(+)细胞组的比例相对于对照组1.19±0.13％，在Bu-SMA-BB10010组为5.14±2.12％，上升到4.3倍，与未修饰BB10010注入组的2.12±0.69％比较，上升到2.4倍，同样可确认对这些细胞群向血中的移动作用有增强效果。

在肝中Kupffer cell产生MIP-1α，以及DC前体细胞表达对应于MIP-1α的受体CCR5已有报道(J.Exp.Med.，193：35-49(2001))。根据这些事实，推定一旦产生炎症，树突细胞的前体细胞不管有无免疫应答的必要性，以与中性白细胞同样的速度赶忙进行抗原的探查，有抗原存在时在最短时间引起免疫应答，使生物体的危险减少(医学进展Vol.200，No.6472-476(2002))。

另外，在外周血中存在作为分化为树突细胞的干细胞CD34⁺细胞，他可被MIP-1α动员也有报道。另外，已知为了在体外对CD34⁺细胞进行培养，使其增殖，抗原使用MIP-1α(USP 5922597(1999))。

而由生物体外注入的MIP-1α对前体细胞向血中的动员有直接贡献还不清楚，然而血中存在的树突细胞前体的浓度水平至少以数十倍数量级上升是本发明人等初次发现。

另外，本发明对于血中水平上升的树突细胞前体在生物体内起到充分的疫苗效果就象在实施例2中详细叙述的那样。

通过用两亲性高分子对MIP-1α进行化学改性，树突细胞前体的动员活性效果显著增加。由此预期其他的激动剂以及其生物学同等物也有同样效果。

因此，利用本发明可以从患者采取足够量的树突细胞前体，可以说开拓了利用树突细胞向免疫疗法的实用化道路。

序列表

<110>Effector Cell Institute

     MATSUSHIMA，Kouji

<120>树突细胞前体的血中水平上升剂

<130>NTK03-1564WO

<140>

<141>

<150>JP 2002-310090

<151>2002-10-24

<150>JP 2003-170091

<151>2003-06-13

<160>4

<170>Patentln version 3.1

<210>1

<211>32

<212>DNA

<213>人类

<400>1

<210>2

<211>34

<212>DNA

<213>人类

<400>2

<210>3

<211>35

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>结合到Brevibacillus choshinensis序列上的人类序列

<400>3

<210>4

<211>27

<212>DNA

<213>人类

<400>4

Claims (3)

1.一种使树突细胞前体的血中水平上升的药物组合物，包含用部分丁基酯化苯乙烯-马来酸共聚物化学改性的BB-10010作为活性成份和药学上可接受的载体。

2.用部分丁基酯化苯乙烯-马来酸共聚物化学改性的BB-10010在使树突细胞前体在血中水平上升的制剂的制备中的应用。

3.用部分丁基酯化苯乙烯-马来酸共聚物化学改性的BB-10010。

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