CN116490196A - 通过处理白细胞介素-33制备免疫原性提高的分化簇103+fcgr3+树突状细胞的方法以及包含上述树突状细胞的用于免疫抗癌治疗的药物组合物 - Google Patents

通过处理白细胞介素-33制备免疫原性提高的分化簇103+fcgr3+树突状细胞的方法以及包含上述树突状细胞的用于免疫抗癌治疗的药物组合物 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种用于提高树突状细胞治疗剂的抗肿瘤免疫的方法，具体地，涉及一种分化簇103(cluster of differentiation 103，CD103)阳性树突状细胞的制备方法、通过上述制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞、包含分化簇103阳性树突状细胞的用于免疫抗癌治疗的药物组合物以及试剂盒等，上述制备方法包括在通过将树突状细胞前体细胞培养在包含FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS‑like tyrosine kinase 3 ligand，Flt3L)的培养基中来分化成树突状细胞的阶段处理白细胞介素‑33(Interleukin‑33，IL‑33)的步骤。通过本发明的制备方法来分化的树突状细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞诱导能力高于对照组的树突状细胞，并且抗肿瘤免疫由新分化的树突状细胞亚群强烈地诱导，不同于在树突状细胞分化完成后提高免疫原性的现有的方法，具有可以在分化阶段中提高免疫原性的效果。因此，期待可以通过本发明的制备方法以及利用其的体外培养树突状细胞提供能够飞跃性地提高治疗效果的新的免疫细胞治疗方法。

Description

通过处理白细胞介素-33制备免疫原性提高的分化簇103+ FCGR3+树突状细胞的方法以及包含上述树突状细胞的用于免 疫抗癌治疗的药物组合物
【技术领域】
本发明涉及一种用于提高树突状细胞治疗剂的抗肿瘤免疫的方法。具体地，涉及一种分化簇103(cluster of differentiation 103，CD103)阳性树突状细胞的制备方法、通过上述制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞、包含分化簇103阳性树突状细胞的用于免疫抗癌治疗的药物组合物以及试剂盒等，上述制备方法包括在通过将树突状细胞前体细胞培养在包含FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-like tyrosine kinase 3ligand，Flt3L)的培养基中来分化成树突状细胞的阶段处理白细胞介素-33(Interleukin-33，IL-33)的步骤。
本申请要求基于2020年11月17日申请的韩国专利申请第10-2020-0153308号以及2021年11月16日申请的韩国专利申请第10-2021-0158012号的优先权，在该申请的说明书以及附图中公开的全部内容均引用于本申请。
【背景技术】
树突状细胞(dendritic cells)为代表性的抗原呈递细胞，可以通过向细胞毒性T细胞呈递抗原来激活细胞毒性T细胞，通过应用其来正在积极开发用于肿瘤治疗的细胞治疗剂。
由于体内树突状细胞的数量不充分，因此将体外培养树突状细胞用于肿瘤治疗。现有的体外培养树突状细胞大多数利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)制备，近年来利用FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-like tyrosine kinase 3ligand，Flt3L)来制备体外培养树突状细胞以制备更类似于体内树突状细胞的细胞。为了提高这些GM/FL-BMDC的免疫原性而试图进行基因改造或利用免疫增强剂(adjuvant，佐剂)，但存在脱靶效应(off-target effect)或炎症细胞因子引起的过度炎症等无法预测的副作用。并且，上述提出的方法仅集中于通过影响分化完成时间点的树突状细胞来增加特定共刺激分子的表达以及可以刺激T细胞的细胞因子的变化。
像这样，大多数体外培养树突状细胞治疗剂的目的是在分化完成的状态下增强免疫原性，但对于通过调节分化的中间阶段来形成新的树突状细胞亚群以及提高免疫原性的方案的研究几乎停留在实验室水平。并且，在体外实验中表现出显著效果的树突状细胞治疗剂也会因体内肿瘤环境而增加的免疫检查点分子导致失活，因此存在无法表现出肿瘤抑制效果的问题。对此，试图通过开发对于免疫检查点分子的中和抗体来克服上述问题，但能够应用的肿瘤的病例有限。虽然自体来源细胞治疗剂的安全性得到证实，因而对于难治性癌症的树突状细胞治疗剂的开发研究在过去20年间有很大的发展，但低于预期的抗肿瘤免疫诱导能力以及有限的治疗效果是仍然需要解决的问题。
【发明内容】
【技术问题】
本发明为了从根源上增加体外培养树突状细胞的免疫原性的目的，查明由白细胞介素-33(Interleukin-33，IL-33)新诱导的树突状细胞的亚群，并说明由上述树突状细胞亚群诱导的抗肿瘤免疫显著高于现有的树突状细胞治疗剂，从而试图开发更有效的树突状细胞治疗剂的制备方法。
因此，本发明的目的在于，提供一种分化簇103(cluster ofdifferentiation103，CD103)阳性树突状细胞的制备方法，上述制备方法包括在通过将树突状细胞前体细胞培养在包含FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-like tyrosine kinase3ligand，Flt3L)的培养基中来分化成树突状细胞的阶段处理白细胞介素-33的步骤。
本发明的再一目的在于，提供一种通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞。
本发明的另一目的在于，提供一种用于免疫抗癌治疗的药物组合物，包含通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞。
本发明的还有一目的在于，提供一种用于免疫抗癌治疗的试剂盒，包含通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞作为一种组分。
本发明的又一目的在于，提供一种树突状细胞的免疫原性评价方法，包括测定分化簇103阳性树突状细胞的比例的步骤。
然而，本发明所要解决的技术问题并不限于以上提及的问题，本发明所属领域的技术人员可以从以下记载明确理解未提及的其他问题。
【解决问题的方案】
为了实现如上所述的本发明的目的，本发明提供一种分化簇103(cluster ofdifferentiation 103，CD103)阳性树突状细胞的制备方法，上述制备方法包括在通过将树突状细胞前体细胞培养在包含FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-like tyrosine kinase3ligand，Flt3L)的培养基中来分化成树突状细胞的阶段处理白细胞介素-33(Interleukin-33，IL-33)的步骤。
本发明人通过在树突状细胞分化阶段处理IL-33来诱导具有优异免疫原性的分化簇103阳性树突状细胞，这证明比通过现有的方法分化的树突状细胞治疗剂具有更有效的肿瘤抑制功效，从而完成了本发明。并且，本发明人证明向实验动物直接给药白细胞介素-33时具有肿瘤抑制功效，并且表现出在脾脏中诱导新的分化簇103阳性树突状细胞，从而推进了本发明。
在本发明一实例中，上述FMS样酪氨酸激酶3配体在培养基中的浓度可以为10ng/ml至1000ng/ml，但不限于此。
在本发明再一实例中，上述培养可以进行5天至20天，但不限于此。
在本发明另一实例中，上述培养可以进行10天，但不限于此。
在本发明还有一实例中，可以在开始培养第3天至第7天处理上述白细胞介素-33，但不限于此。
在本发明又一实例中，可以以1ng/ml至25ng/ml的浓度处理上述白细胞介素-33，但不限于此。
在本发明又一实例中，可以在开始培养第5天以5ng/ml的浓度处理上述白细胞介素-33，但不限于此。
在本发明又一实例中，可以在分化阶段中的一个时间点处理上述白细胞介素-33，在上述分化阶段中，能够诱导占总树突状细胞的30％至100％的分化簇103阳性树突状细胞，但不限于此。
在本发明又一实例中，在上述制备方法中，可以诱导占总树突状细胞的70％以上的分化簇103阳性1型骨髓来源树突状细胞，但不限于此。
并且，本发明提供一种通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞。
并且，本发明提供一种用于免疫抗癌治疗的药物组合物，包含通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞。
在本发明一实例中，上述树突状细胞可以诱导干扰素-γ(Interferon gamma，IFN-γ)的表达，但不限于此。
在本发明再一实例中，上述树突状细胞可以增加Fcgr3(Fc receptor，IgG，lowaffinity III)的表达，但不限于此。
在本发明另一实例中，上述树突状细胞可以增加选自由分化簇38(cluster ofdifferentiation 38，CD38)、分化簇61(整合素β3，Integrin beta-3)以及T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，Tigit)组成的组中的一种以上基因的表达，但不限于此。
并且，本发明提供一种用于免疫抗癌治疗的试剂盒，包括：(a)第一容器，用于收容包含通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞的组合物；(b)第二容器，用于收容肿瘤抗原；以及(c)说明书，说明在将第一容器中的组合物和第二容器中的抗原给药到需要其的个体之前12小时至48小时混合。
并且，本发明提供一种树突状细胞的免疫原性评价方法，包括测定分化簇103阳性树突状细胞的比例的步骤。
在本发明一实例中，上述方法还可以包括在分化簇103阳性树突状细胞占总树突状细胞的70％以上的情况下评价为免疫原性良好的步骤，但不限于此。
并且，本发明提供一种免疫抗癌治疗方法，包括将包含通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞的药物组合物给药到需要其的个体的步骤。
并且，本发明提供一种包含通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞的组合物在免疫抗癌治疗中的用途。
并且，本发明提供一种用于生产免疫抗癌治疗药剂的通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞的用途。
【发明的效果】
本发明查明由白细胞介素-33(interleuin-33，IL-33)新诱导的树突状细胞亚群，如上所述，由白细胞介素-33分化的树突状细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞诱导能力高于对照组的树突状细胞，并且抗肿瘤免疫由上述树突状细胞亚群强烈地诱导，不同于在树突状细胞分化完成后提高免疫原性的现有的方法，具有可以在分化阶段提高免疫原性的效果。因此，通过本发明的制备方法以及利用其的体外培养树突状细胞，期待可以提供一种能够显著提高治疗效果的新的免疫治疗方法。
【附图说明】
图1为时序性地示出利用粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子或FMS样酪氨酸激酶3配体的体外培养树突状细胞的制备流程的示意图。
图2a以及图2b为确认表达分化簇103的亚群的图，是示出在制备FL-33-DC时不同白细胞介素-33处理时期的分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞亚群的变化(图2a)以及在GM-DC、GM-33-DC、FL-DC、FL-33-DC中分别分析分化簇103+树突状细胞亚群的结果(图2b)的图。
图3a以及图3b为示出分别在FL-DC、FL-GM-DC以及FL-33-DC中的分化簇103+树突状细胞亚群的分析结果(图3a)以及抗原特异性T细胞分裂及激活诱导能力的分析结果(图3b)的图。
图4a至图4d为示出FL-DC、FL-GM-DC以及FL-33-DC的转录组分析原始数据(图4a)以及FL-33-DC特异性基因的高表达量比较柱形图(图4b)、通过RT-PCR确认的基因表达分析(图4c)以及通过流式细胞仪确认的分化簇38、分化簇61、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白以及Fcgr3蛋白的表达量分析结果(图4d)的图。
图5a以及图5b为示出分析在小鼠EG.7肿瘤模型中用OVA对GM-DC、GM-33-DC、FL-DC、FL-GM-DC、FL-33-DC致敏的树突状细胞疫苗的肿瘤增殖抑制效果的结果(图5a)以及给药疫苗后诱导的细胞毒性淋巴细胞的分析结果(图5b)的图。
图6a以及图6b为示出分析在小鼠B16F10-OVA肺转移模型中用OVA对FL-DC、FL-GM-DC、FL-33-DC致敏的树突状细胞疫苗的抑制形成肿瘤来源结节的效果的结果(图6a)以及给药疫苗后诱导的细胞毒性淋巴细胞的分析结果(图6b)的图。
图7a至图7d为示出向小鼠给药粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子或IL-33后的脾脏中分化簇103阳性树突状细胞的比例(图7a)、向EG.7肿瘤模型给药细胞因子后的肿瘤生长折线图(图7b)、给药细胞因子的肿瘤模型的脾脏中分化簇103阳性树突状细胞的比例(图7c)以及给药细胞因子后诱导的细胞毒性淋巴细胞的分析结果(图7d)的图。
图8为示出通过流式细胞仪分析由IL-33诱导的分化簇103阳性树突状细胞中Fcgr3以及Fcgr4的蛋白表达量的结果的图。
【具体实施方式】
本发明人发现在利用包含FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-like tyrosinekinase3ligand，Flt3L)的培养基来制备体外培养树突状细胞(dendritic cells)的过程中，在树突状细胞分化阶段处理白细胞介素-33(interleukin-33，以下称为‘IL-33’)的情况下，新诱导出免疫原性提高的分化簇103(cluster of differentiation 103，CD103)阳性树突状细胞而显著提高抗肿瘤免疫，从而完成了本发明。
在本发明一实施例中，不同于现有的FL-DC(在FMS样酪氨酸激酶3配体环境下培养的树突状细胞)，FL-33-DC(在FMS样酪氨酸激酶3配体环境下处理IL-33的树突状细胞)新形成分化簇103+树突状细胞亚群，并更强烈地诱导抗原特异性细胞毒性T细胞的分裂(参照实施例2至实施例4)。
在本发明再一实施例中，经确认，当制备包含FL-33-DC的疫苗并向肿瘤模型给药时，不仅是FL-DC疫苗还比以往利用的GM-DC(在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子环境下培养的树突状细胞)以及GM-33-DC(在粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子环境下处理IL-33的BMDC)疫苗更有效地抑制肿瘤的生长(参照实施例5)。
在本发明另一实施例中，经确认，已知会生成分化簇103+树突状细胞的FL-GM-DC(在FMS样酪氨酸激酶3配体以及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子环境下培养的树突状细胞)与FL-33-DC类似地诱导分化簇103+树突状细胞，但不同于FL-33-DC，无法提高抗肿瘤免疫，相比之下，确认到在制备体外培养树突状细胞疫苗时的分化阶段处理的IL-33诱导免疫原性分化簇103+树突状细胞并更有效地诱导细胞毒性T细胞，从而表现出强烈的肿瘤抑制效果(参照实施例5)。
在本发明还有一实施例中，经确认，当制备包含FL-33-DC的疫苗并向肺转移模型给药时，与FL-DC给药组相比，结节的形成显著减少，并确认到最强烈地诱导抗肿瘤免疫(参照实施例6)。
在本发明又一实施例中，向小鼠的腹腔内给药IL-33或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子后，通过分析脾脏中分化簇103阳性树突状细胞的诱导能力以及肿瘤抑制能力，确认到在肿瘤模型的脾脏中，两只小鼠组均由IL-33或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子进一步诱导分化簇103阳性树突状细胞，但确认到在IL-33中表现出强烈的抗肿瘤免疫效果(参照实施例7)。
在本发明又一实施例中，经确认，不同于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，在由IL-33诱导的分化簇103阳性树突状细胞中表现出相对高的Fcgr3以及Fcgr4的表达(参照实施例8)。
因此，本发明可以提供一种分化簇103阳性树突状细胞的制备方法，包括在通过将树突状细胞前体细胞培养在包含FMS样酪氨酸激酶3配体的培养基中来分化成树突状细胞的阶段处理白细胞介素-33(IL-33)的步骤。
在本说明书中使用的术语“树突状细胞(dendritic cells，DC)”作为可以诱导固有免疫应答(innate immune response)以及适应性免疫应答(adaptive immuneresponse)的免疫系统中最核心的专职抗原呈递细胞(antigen-presenting cell，APC)，可以激活没有接触过抗原的naive以及记忆免疫反应。树突状细胞在未成熟状态下起到监视兵的作用并不断巡查以寻找抗原。通常，如果抗原呈递细胞(APC)摄取抗原，则外源性抗原主要通过主要组织相容性复合体II类(major histocompatibility complex class II)呈递(激活分化簇4+T细胞)，内源性抗原通过主要组织相容性复合体I类呈递(激活分化簇8+T细胞)。然而，树突状细胞具有可以通过主要组织相容性复合体II类以及主要组织相容性复合体I类来交叉呈递(cross presentation)外源性抗原的特别的能力。因此，树突状细胞可以更有效地激活分化簇4+以及分化簇8+T细胞。
获得抗原后经过成熟过程的树突状细胞移动到淋巴器官并向初始T细胞(naive T细胞)呈递抗原。T细胞的激活不仅需要抗原呈递细胞(APC)的抗原呈递还需要在抗原呈递细胞(APC)表面表达的共刺激分子(costimulatory molecule；分化簇80、分化簇86、分化簇40等)及促炎细胞因子的刺激。完全成熟的树突状细胞通过这种信号诱导分化簇4+T细胞分化成辅助性T细胞1(T helper 1，Th1)，同时也激活分化簇8+T细胞(cytolytic Tlymphocyte)。然而，如果没有抗原呈递细胞(APC)的共刺激分子以及促炎细胞因子的刺激，或者受到免疫抑制细胞因子的刺激，则分化簇4+T细胞分化成辅助性T细胞2(Th2)细胞或调节T细胞(regulatory T cell，Treg)。
肿瘤以及肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)直接诱导树突状细胞的功能障碍，或者通过隐藏肿瘤抗原并分泌大量免疫抑制细胞因子来抑制抗癌免疫活性。为了克服这种障碍而正在进行如下的研究：在自体来源树突状细胞中加载抗原并再次向体内给药在体外经过训练的树突状细胞治疗剂，即所谓的“树突状细胞癌症疫苗”，以表达共刺激分子以及分泌促炎细胞因子来诱导抗癌T细胞活性，本发明的制备方法是通过在这种研究过程中尤其新发现用于获得具有优异的免疫原性以及抗肿瘤功效的树突状细胞的体外培养方法而完成的。
在本说明书中使用的术语“免疫原性”是指在向哺乳动物给药的情况下以及尤其在向人类个体给药的情况下，可以诱导或保持免疫反应，尤其可以诱导免疫反应的性质。
上述制备方法包括通过将树突状细胞前体细胞培养在包含FMS样酪氨酸激酶3配体的培养基中来分化成树突状细胞的过程。在一实例中，经确认，与广泛使用的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF)相比，在包含上述FMS样酪氨酸激酶3配体的培养基中培养树突状细胞的情况下，制备出具有更优异的免疫原性以及抗肿瘤功效的树突状细胞，因此，根据本发明制备方法的树突状细胞培养基中可以不包含粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子。
在本说明书中使用的术语“FLT3L”为FMS样酪氨酸激酶3配体(FMS-like tyrosinekinase 3ligand)的缩写，是指除了新血管的形成以外，还通过诱导造血前体细胞的增殖来激活造血前体细胞，从而作为增加免疫细胞数量的生长因子发挥功能的细胞因子。上述FMS样酪氨酸激酶3配体可以为人类来源，也可以为具有GenBank：AAA19825.1的氨基酸序列的蛋白质。
在本发明中，上述FMS样酪氨酸激酶3配体在培养基中的浓度可以为10ng/ml至1000ng/ml，但不限于此。在一实例中，在将树突状细胞培养10天的情况下，可以使用以100ng/ml的浓度包含上述FMS样酪氨酸激酶3配体的培养基。
在本发明中，上述培养可以进行5天至20天，优选地可以进行10天，但不限于此。
在本发明中，可以在开始培养第3天至第7天处理上述白细胞介素-33，但不限于此，优选地在分化阶段处理。上述“分化阶段”是指，树突状细胞前体细胞，例如，骨髓造血干细胞(hematopoietic bone marrow progenitor cell)分化成未成熟树突状细胞或成熟树突状细胞的所有连续步骤。
上述“未成熟树突状细胞”作为分化早期步骤中出现的细胞，是指与成熟树突状细胞一样不表达如分化簇14等细胞表面标志物，并以低水平表达HLA-DR、分化簇86、分化簇80、分化簇83或分化簇40，以正常水平表达分化簇1a及CCR1、CCR2、CCR5及CXCR1的树突状细胞。未成熟树突状细胞的分化是在接受各种信号的同时开始的，这种分化根据接受的信号的组合而达到完全分化或部分分化。由于未成熟树突状细胞表达的炎症细胞因子的水平低，因此即使与T细胞接触也无法激活T细胞。
上述“成熟树突状细胞”是指未成熟树突状细胞成熟后形成的细胞，是指参与B细胞以及T细胞激活的细胞表面标志物，例如，主要组织相容性复合体I类或主要组织相容性复合体II类(HLA-DR)、细胞粘附因子(分化簇54、分化簇18、分化簇11)、共刺激因子(例如，分化簇86、分化簇80、分化簇83或分化簇40)与未成熟树突状细胞相比以更高或相对增加的水平表达的细胞，典型的成熟树突状细胞表达高水平的CCR7以及CXCR4。成熟树突状细胞的特征在于，释放促炎细胞因子(proinflammatory cytokine)，并在混合淋巴反应(mixedlymphocyte reaction)中增加原始同种异体T细胞(allogeneic T cells)以及同源T细胞(syngeneic T cells)的增殖和/或增加其他免疫反应相关细胞因子的表达的分泌。
在一实例中，在开始培养第5天以5ng/ml的浓度处理上述白细胞介素-33的情况下，分化簇103+树突状细胞亚群形成效果以及抗原特异性细胞毒性T细胞的分裂诱导效果最优异，本发明的制备方法不限于上述特定的时期以及浓度，本领域技术人员可以根据树突状细胞前体细胞的状态、细胞数量、培养环境等适当地调节白细胞介素-33的处理时间点以及浓度。因此，可以以合适的浓度处理上述白细胞介素-33，例如可以以1ng/ml至25ng/ml的浓度处理，但不限于此。
在本发明中，上述白细胞介素-33的处理时间点以及浓度可以在能够诱导的分化簇103阳性树突状细胞占总树突状细胞的30％至100％的时间点进行处理。例如，当在固定的培养条件下开始培养第2、3、4、5、6、7或8天分别处理5ng/ml的白细胞介素-33时，仅在第3至7天处理的情况下诱导的分化簇103树突状细胞占总树突状细胞的30％以上时，可以选择上述期间中任一天来处理白细胞介素-33，优选地可以选择诱导分化簇103阳性树突状细胞的比例最高的时间点来处理白细胞介素-33。
在本发明中，在上述制备方法中，可以诱导占总树突状细胞的70％以上的分化簇103阳性1型骨髓来源树突状细胞，但不限于此。
作为本发明的再一实施方式，本发明可以提供一种通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞。
作为本发明的另一实施方式，本发明可以提供一种用于免疫抗癌治疗的药物组合物，包含通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞。
在本发明中，上述树突状细胞可以诱导干扰素-γ(Interferon gamma，IFN-γ)的表达，但不限于此。
在本发明中，上述树突状细胞可以增加Fcgr3(Fc receptor，IgG，low affinityIII)的表达，但不限于此。
在本发明中，上述树突状细胞可以增加选自由分化簇38(cluster ofdifferentiation 38，CD38)、分化簇61(整合素β3，Integrin beta-3)以及T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains，Tigit)组成的组中的一种以上基因的表达，但不限于此。
在本发明中，上述Fcgr3在病原体的吞噬作用、免疫细胞分化调节等宿主防御中起到重要的作用。上述分化簇38为存在于自然杀伤细胞等免疫细胞表面的糖蛋白，上述分化簇61为在血小板、白细胞等中表达的分化簇。上述T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白为存在于T细胞或自然杀伤细胞的免疫受体。它们基因表达的增加意味着免疫效果优异。
作为本发明的还有一实施方式，本发明可以提供一种免疫抗癌治疗方法，包括将包含通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞的药物组合物给药到需要其的个体的步骤。
作为本发明的又一实施方式，本发明可以包含通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞的组合物在免疫抗癌治疗中的用途。
作为本发明的又一实施方式，本发明可以提供一种用于生产免疫抗癌治疗药剂的通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞的用途。
作为本发明的又一实施方式，本发明可以提供一种免疫抗癌治疗方法，包括向个体给药上述白细胞介素-33的步骤，但不限于此。上述白细胞介素-33可以在生物体内新形成分化簇103阳性树突状细胞，但不限于此。
在本发明中，可以以适当剂量向生物体内注射上述白细胞介素-33，可以以5μg/kg至500μg/kg的剂量给药，但不限于此。并且，可以在4天至11天期间每天向生物体内给药上述白细胞介素-33，但不限于此。
在本发明中，上述白细胞介素-33可以增加在生物体内新形成的分化簇103阳性树突状细胞的Fcgr3(Fc receptor，IgG，low affinity III)或Fcgr4(Fc receptor，IgG，lowaffinity IV)基因的表达，但不限于此。
并且，在本发明中，处理上述白细胞介素-33后，Fcgr3(Fc receptor，IgG，lowaffinity III)可以在体外制备以及体内树突状细胞中诱导的分化簇103阳性树突状细胞中共同增加，但不限于此。
在本说明书中使用的术语“用于免疫抗癌治疗的药物组合物”是指可以与术语“细胞治疗剂”相互交换使用，为了恢复细胞及组织的功能，在体外增殖、筛选活着的自体(autologous)、同种异体(allogenic)或异种(xenogenic)细胞，或者通过用其他方法改变细胞的生物特性等一系列行为，用于治疗、诊断以及预防目的的医药品。美国从1993年开始、韩国从2002年开始将细胞治疗剂作为医药品进行管理。这种细胞治疗剂可以大致分为两个领域，第一为用于组织再生或恢复器官功能的“干细胞治疗剂”，第二为用于在生物体内抑制免疫反应或亢进免疫反应等调节免疫反应的“免疫细胞治疗剂”。
另一方面，本发明的药物组合物还可以包含药物组合物的制备中通常使用的合适的载体、赋形剂以及稀释剂。上述赋形剂可以为例如选自由稀释剂、粘合剂、崩解剂、润滑剂、吸附剂、保湿剂、薄膜-包衣物质以及控释添加剂组成的组中的一种以上。
本发明的药物组合物可以按常规方法分别制成散剂、颗粒剂、缓释颗粒剂、肠溶颗粒剂、液剂、滴眼剂、酏剂、乳剂、悬浮液剂、酒精、含片、芳香水剂、柠檬水剂、片剂、缓释片剂、肠溶片剂、舌下片剂、硬质胶囊剂、软质胶囊剂、缓释胶囊剂、肠溶胶囊剂、丸剂、酊剂、软浸膏剂、干浸膏剂、流浸膏剂、注射剂、胶囊剂、灌注液、硬膏剂、洗剂、糊剂、喷雾剂、吸入剂、贴剂、灭菌注射溶液或气雾剂等外用剂等的形式来使用，上述外用剂可以具有霜剂、凝胶、贴片、喷雾剂、软膏剂、硬膏剂、洗剂、擦剂、糊剂或泥敷剂等剂型，但优选地制成注射剂来使用。
可以包含在本发明的药物组合物中的载体、赋形剂以及稀释剂可以包括乳糖、葡萄糖、蔗糖、寡糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯橡胶、海藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸三钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁以及矿物油。
本发明的注射剂可以包括如注射用蒸馏水、0.9％的氯化钠注射液、林格氏液、葡萄糖注射液、葡萄糖+氯化钠注射液、聚乙二醇(PEG)、乳酸林格氏液、乙醇、丙二醇、非挥发性油-芝麻油、棉籽油、花生油、豆油、玉米油、油酸乙酯、异丙基肉豆蔻酸、苯甲酸苯等溶剂；如苯甲酸钠、水杨酸钠、乙酸钠、尿素、氨基甲酸乙酯、单乙基乙酰胺、丁唑烷、丙二醇、吐温类、烟酰胺、六胺、二甲基乙酰胺等助溶剂；如弱酸及其盐(醋酸以及乙酸钠)、弱碱及其盐(氨以及醋酸铵)、有机化合物、蛋白质、白蛋白、蛋白胨、胶类等缓冲剂；如氯化钠等张力剂；如亚硫酸氢钠(NaHSO3)二氧化碳气体、焦亚硫酸钠(Na2S2O5)、亚硫酸钠(Na2SO3)、氮气(N2)、乙二胺四乙酸等稳定剂；如0.1％的亚硫酸氢钠、甲醛次硫酸钠、硫脲、乙二胺四乙酸二钠、丙酮亚硫酸氢钠等硫酸化剂；如苯甲醇、三氯丁醇、盐酸普鲁卡因、葡萄糖、葡萄糖酸钙等镇痛剂；如羧甲基纤维素钠、海藻酸钠、吐温80、单硬脂酸铝等助悬剂。
本发明的药物组合物以药学上有效的量给药。在本发明中，“药学上有效的量”是指足以以可应用于医学治疗的合理的收益/风险比来治疗疾病的量，有效剂量水平可以取决于包括患者疾病的种类、严重程度、药物的活性、对于药物的敏感度、给药时间、给药途径以及排泄率、治疗期间、同时使用的药物等因素以及其他在医学领域公知的因素。
本发明的药物组合物可以作为单独的治疗剂给药或与其他治疗剂联合给药，可以与现有的治疗剂依次或同时给药，可以单次或多次给药。考虑到上述所有因素，重要的是以最小的量获得最大的效果而没有副作用的量进行给药，这可以由本领域技术人员容易地确定。
可以通过各种途经向个体给药本发明的药物组合物。可以预想给药的所有方式，例如，可以根据皮下注射、腹腔给药、静脉注射、肌肉注射、骨髓周围空间(硬膜内)注射、舌下给药、口腔黏膜给药、直肠内插入、阴道内插入、眼部给药、耳部给药、鼻腔给药、皮肤给药、经皮给药等进行给药，优选地有皮内(intradermally)、结内(intranodally)，皮下，静脉或者直接肿瘤内(intratumorally)给药的方法。但是，最佳给药途径还没有确立。
本发明的药物组合物取决于待治疗的疾病、给药途径、患者的年龄、性别、体重以及疾病的严重程度等各种相关要素以及作为活性成分的药物的种类。
在本发明中“个体”是指需要治疗疾病的对象，更具体地是指人类或作为非人类的灵长类、小鼠(mouse)、大鼠(rat)、狗、猫、马以及牛等哺乳类。
在本发明中“给药”是指通过任意合适的方法向个体提供规定的本发明的组合物。
在本发明中“预防”是指抑制或延缓目标疾病的发病的所有行为，“治疗”是指通过给药本发明的药物组合物使目标疾病及由此产生的代谢异常症状好转或有利地改变的所有行为。
作为本发明的又一实施方式，本发明可以提供一种用于免疫抗癌治疗的试剂盒，包括：(a)第一容器，用于收容包含通过本发明的制备方法制备的分化簇103阳性树突状细胞的组合物；(b)第二容器，用于收容肿瘤抗原；以及(c)说明书，说明在将第一容器中的组合物和第二容器中的抗原给药到需要其的个体之前12小时至48小时混合。
在本说明书中使用的术语“肿瘤抗原”是指使免疫细胞将肿瘤识别为外来物质而不是自体细胞的标志物(marker)，像这样能起到抗原作用的有肿瘤(细胞)的变异产物、由肿瘤(细胞)内基因调节异常导致的产物以及致癌病毒蛋白等。如果按特异性分类肿瘤抗原，则可以分为仅在肿瘤细胞中特异性地表达的肿瘤特异性抗原(tumor-specificantigens，TSAs)及肿瘤相关抗原(tumor-associated antigens，TAAs)。肿瘤特异性抗原在宿主中诱导肿瘤特异性免疫反应，但对于不仅在肿瘤细胞中表达而且还在正常细胞中表达的肿瘤相关抗原，存在由于自身耐受性(self-tolerance)表达而不能在宿主中引起肿瘤特异性免疫反应的情况。
混合上述第一容器中的组合物以及第二容器中的抗原是在树突状细胞中加载抗原的过程。作为在树突状细胞中加载抗原的方法，通常利用将肽、蛋白质以及自体来源/同种异体的癌细胞杀灭并一起培养的方法。短合成肽(8-15aa)直接加载到树突状细胞表面的主要组织相容性复合体分子中，相反，长合成肽(28-35aa)、蛋白质以及癌细胞在加载到主要组织相容性复合体分子中之前可能需要用肽进行处理的过程。在短合成肽的情况下，在临床试验中利用对于肿瘤相关抗原的分化簇8+T细胞表位(epitope)，需要知道患者的HLA单体型(haplotype)并能够与特定单体型结合。在长合成肽的情况下，在树突状细胞内经过抗原处理过程并可以交叉呈递，不仅可以诱导分化簇8+T细胞反应还可以诱导分化簇4+T细胞反应并可以长期呈递抗原。
作为本发明的又一实施方式，本发明提供一种树突状细胞的免疫原性评价方法，包括测定分化簇103阳性树突状细胞的比例的步骤。
在本发明中，上述方法还可以包括在分化簇103阳性树突状细胞占总树突状细胞的70％以上的情况下评价为免疫原性良好的步骤，但不限于此。上述分化簇103阳性树突状细胞作为1型骨髓来源树突状细胞(type 1conventional DC，cDC1)的标志物，在本发明一实施例中，确认到分化簇103+树突状细胞亚群的比例越高，更强地诱导抗原特异性T细胞。
在本说明书以及权利要求范围中使用的术语或单词不应被解释为仅限于常规含义或词典上的含义，基于发明人可以适当地定义术语概念以通过最佳的方法说明发明人的发明的原则，应被解释为符合本发明的技术思想的含义及概念。
以下，为了帮助理解本发明提出优先实施例。然而，下述实施例仅仅是为了更容易地理解本发明而提供的，本发明的内容不限于下述实施例。
【实施例】
【实施例1.制备体外培养树突状细胞】
从小鼠后退中分离骨髓细胞后，在20ng/ml的浓度的粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子环境下进行培养。在培养的第2天更换为新的培养液，并将以第一天为基准培养7天的树突状细胞命名为GM-DC。与此相反的，将在培养上述GM-DC的第3天用5ng/ml的IL-33处理的树突状细胞命名为GM-33-DC。
另一方面，通过在100ng/ml的浓度的FMS样酪氨酸激酶3配体环境下培养骨髓细胞10天来制备树突状细胞的情况下，将其命名为FL-DC。并且，将在培养上述FL-DC的第3～7天添加5ng/ml的IL-33培养的树突状细胞命名为FL-33-DC。在培养第7天进行GM-DC以及GM-33-DC的细胞分析，在培养第10天进行FL-DC以及FL-33-DC的细胞分析。
用于确认抗癌效果的疫苗给药用树突状细胞在使用前一天处理相当于抗原的卵清蛋白(Ovalbumin，以下‘OVA’)，之后将其向肿瘤模型小鼠给药(参照图1的示意图)。
【实施例2.确认在FL-33-DC中表达分化簇103的亚群的增加】
根据上述实施例1以及图1，为了寻找在制备FL-33-DC时诱导的分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞(type 1conventional DCs；以下‘cDC1’)最多的条件，在FL-DC的培养过程中使IL-33的处理日期不同，之后在第10天收获并进行分析。
确认作为1型骨髓来源树突状细胞的标志物的XCR1以及分化簇103的结果，如图2a以及图2b所示，在培养FL-DC的第3～7天时处理IL-33的情况下，分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞的比例显著增加，尤其在第5天添加IL-33的情况下，表现出诱导最多的免疫原性高的分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞(图2a)。因此，下述实施例的FL-33-DC使用在第5天处理IL-33的细胞。
另一方面，在上述实施例1中制备的GM-DC、GM-33-DC、FL-DC以及FL-33-DC中分析具有强抗肿瘤免疫原性的分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞的比例。在GM-DC中几乎没有诱导分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞，添加IL-33的GM-33-DC也没有显著诱导分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞亚群。并且，在FL-DC中表达了XCR1，但几乎没有表达分化簇103。与此相反，在FL-33-DC中分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞占总树突状细胞的75％以上(图2b)。
综合上述结果，证明当在FMS样酪氨酸激酶3配体环境下培养并在开始培养第3天至第7天处理IL-33时，新形成显著高的比例的分化簇103+树突状细胞亚群。
【实施例3.FL-33-DC的提高的抗原特异性T细胞诱导效果】
通过上述实施例2确认到在FL-33-DC中新诱导分化簇103+树突状细胞。对此，本发明人与FL-33-DC比较确认在作为现有的方法的制备FL-DC的过程中添加粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的情况下是否诱导分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞。
结果，如图3a以及图3b所示，确认到在培养FL-DC的第5天处理粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的情况下(以下，命名为FL-GM-DC)，虽然低于FL-33-DC的比例，但诱导60％左右的分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞(图3a)。
为了分析如上所述的变化是否影响树突状细胞的抗原呈递能力，对FL-DC、FL-GM-DC以及FL-33-DC处理OVA蛋白并将其与具有卵清蛋白(OVA)抗原特异性T细胞受体的OT-I小鼠T细胞共同培养，之后调查作为OT-1T细胞的增殖及活化细胞因子(cytokine)中一种的干扰素-γ的表达。
结果，表现出FL-33-DC以及FL-GM-DC的OT-1T细胞的增殖能力高于FL-DC。然而，不同于FL-33-DC有效地诱导干扰素-γ，FL-GM-DC没有诱导干扰素-γ(图3b)。
上述结果是确认FL-33-DC以及FL-GM-DC均诱导分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞，但只有FL-33-DC表现出对于T细胞的免疫原性。
【实施例4.确认FL-33-DC的免疫原性相关特异性标志物表达】
本发明人为了鉴定在FL-33-DC中特异性地表现出的与免疫原性相关的标志物，进行了对于FL-DC、FL-GM-DC以及FL-33-DC的转录组分析。
首先，每个树突状细胞(DC)表现出特异性的基因表达模式(图4a)。在这些中发现在FL-33-DC中分化簇38、分化簇61、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白以及Fcgr3的表达水平特异性地高(图4b)，实际上分离RNA后进行RT-PCR的结果也确认到上述基因在FL-33-DC中特异性地高的表达(图4c)。
通过流式细胞仪在蛋白质水平上分析上述4种基因。
结果，如图4d所示，确认到分化簇38、分化簇61以及Fcgr3在FL-33-DC中相对高的表达。上述结果示出包含这种分子并不同于FL-DC以及FL-GM-DC，FL-33-DC特异性地表达免疫原性相关分子，从而可以提高T细胞诱导能力以及激活能力。
【实施例5.确认FL-33-DC的显著的肿瘤生长抑制能力】
在上述实施例3中确认到FL-33-DC的抗原特异性T细胞诱导能力以及激活能力显著高于FL-DC以及FL-GM-DC，在上述实施例4中确认到FL-33-DC相对高地表达与免疫原性相关的分化簇38、分化簇61以及Fcgr3。因此，为了确认其是否可应用于肿瘤的治疗，向EG.7肿瘤接种小鼠分别在肿瘤接种第3天以及第10天皮下注射用图1的示意图中示出的方法制备的树突状细胞疫苗，之后监视肿瘤的生长。
结果，确认到与未给药树突状细胞的对照组以及给药FL-DC疫苗的组相比，给药FL-33-DC疫苗的组中显著有效地抑制肿瘤生长(图5a)。另一方面，与FL-33-DC类似地诱导分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞的FL-GM-DC没能有效地抑制肿瘤生长(图5a)。并且，用于现有的免疫治疗的GM-DC表现出与FL-DC类似的效果，添加IL-33的GM-33-DC不同于FL-33-DC没有表现出进一步的治疗效果(图5a)。
与此同时，在给药这种树突状细胞(DC)疫苗的小鼠中分析抗肿瘤免疫的结果，确认到在给药FL-33-DC疫苗的小鼠中诱导的抗肿瘤免疫最强(图5b；CTL，细胞毒性T淋巴细胞)。
上述结果确认到FL-33-DC疫苗的提高的肿瘤抑制效果是因为有效诱导抗原特异性细胞毒性淋巴细胞(CTL)。
【实施例6.确认FL-33-DC的肺转移肿瘤生长抑制能力】
在上述实施例5中，表现出给药FL-33-DC疫苗的小鼠中诱导的抗肿瘤免疫最强烈，由此确认是否也可以应用于肺转移模型中。向B16F10-OVA肺转移模型分别在肿瘤接种第3天以及第10天皮下注射用图1的示意图中示出的方法制备的树突状细胞疫苗，之后在第16天分析肺中结节形成。
结果，与基本上未给药树突状细胞的对照组相比，给药树突状细胞的组中的结节的数量显著减少(图6a)。并且，与FL-DC相比，给药FL-33-DC的组显著减少结节形成(图6a)。另一方面，与FL-33-DC类似地诱导分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞的FL-GM-DC并不比FL-33-DC更能抑制结节形成(图6a)。
与此同时，在给药这种树突状细胞(DC)疫苗的小鼠中分析抗肿瘤免疫的结果，确认到与图5b类似地在给药FL-33-DC疫苗的小鼠中诱导的抗肿瘤免疫最强烈(图6b)。
【实施例7.通过给药IL-33的肿瘤抑制以及体内分化簇103阳性树突状细胞的诱导】
本发明人向小鼠的腹腔内给药IL-33或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子后，在脾脏中分析分化簇103阳性树突状细胞的诱导能力以及肿瘤抑制能力。
结果，当向没有肿瘤的小鼠给药IL-33或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子时，在脾脏中新形成分化簇103阳性树突状细胞(图7a)。但是，当在肿瘤模型中诱导抗肿瘤免疫时，肿瘤仅由IL-33抑制(图7b)。在肿瘤模型的脾脏中，两种小鼠组均由IL-33或粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子进一步诱导分化簇103阳性树突状细胞(图7c)，但仅由IL-33表现出强烈的抗肿瘤免疫(图7d)。
【实施例8.发掘由IL-33诱导的体内分化簇103阳性树突状细胞的标志物】
在上述实施例7中，IL-33及粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子均可以诱导分化簇103阳性树突状细胞，但表现出完全不一样的抗肿瘤免疫反应。对此，尝试鉴定可以区分两者之间差异的标志物。
结果，可以确认到由IL-33诱导的分化簇103阳性树突状细胞中表现出相对高的不同于粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子的Fcgr3以及Fcgr4的表达(图8)。
结果，不同于FL-DC或FL-GM-DC，本发明的FL-33-DC高表达分化簇38、分化簇61、以及Fcgr3等，增加免疫原性高的分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞，表达这种分子的分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞有效地诱导抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞，从而从实验上说明表现出提高的癌症治疗效果，认为可以广泛用作用于免疫抗癌治疗的细胞治疗剂。
并且，如果有直接给药IL-33或在体内1型骨髓来源树突状细胞中提高Fcgr3以及Fcgr4的方法，则这也认为可以利用于免疫治疗。尤其，Fcgr3由IL-33在体外制备以及在体内树突状细胞中的分化簇103+1型骨髓来源树突状细胞中共同表达，因此如果可以增强该分子的表达，则认为可以利用于肿瘤治疗。
上述本发明的说明仅用于例示本发明，本领域技术人员可以理解在不改变本发明的技术思想或必要特征的情况下，可以容易地变更为其他具体形式。因此，应理解以上描述的实施例在所有方面都是示例性的而非限制性的。
【产业上的可利用性】
本发明查明由白细胞介素-33(interleuin-33，IL-33)新分化的树突状细胞亚群，如上所述，由IL-33分化的树突状细胞的抗原特异性细胞毒性T细胞诱导能力高于对照组的树突状细胞，并且抗肿瘤免疫由上述树突状细胞亚群强烈地诱导，不同于在树突状细胞分化完成后提高免疫原性的现有的方法，具有可以在分化阶段中提高免疫原性的效果，可以通过本发明的制备方法以及利用其的体外培养树突状细胞提供能够飞跃性地提高治疗效果的新的免疫细胞治疗方法，因此具有产业上的可利用性。

Claims (23)

1.分化簇103阳性树突状细胞的制备方法，其包括在通过将树突状细胞前体细胞培养在包含FMS样酪氨酸激酶3配体的培养基中来分化成树突状细胞的阶段处理白细胞介素-33的步骤。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述FMS样酪氨酸激酶3配体在培养基中的浓度为10ng/ml至1000ng/ml。
3.根据权利要求1所述的方法，其中所述培养进行5天至20天。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述培养进行10天。
5.根据权利要求1所述的方法，其中在开始培养第3天至第7天处理所述白细胞介素-33。
6.根据权利要求1所述的方法，其中以1ng/ml至25ng/ml的浓度处理所述白细胞介素-33。
7.根据权利要求1所述的方法，其中在开始培养第5天以5ng/ml的浓度处理所述白细胞介素-33。
8.根据权利要求1所述的方法，其中在分化阶段中的一个时间点处理所述白细胞介素-33，在所述分化阶段中，能够诱导占总树突状细胞的30％至100％的分化簇103阳性树突状细胞。
9.根据权利要求1所述的方法，其中在所述制备方法中，诱导占总树突状细胞的70％以上的分化簇103阳性1型骨髓来源树突状细胞。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述树突状细胞诱导干扰素-γ的表达。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述树突状细胞增加Fcgr3的表达。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述树突状细胞增加选自由分化簇38、分化簇61(整合素β3)以及T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白组成的组中的一种以上基因的表达。
13.分化簇103阳性树突状细胞，其中通过权利要求1至12中任一项所述的方法制备。
14.用于免疫抗癌治疗的药物组合物，其包含通过权利要求1至12中任一项所述的方法制备的分化簇103阳性树突状细胞。
15.根据权利要求14所述的组合物，其中所述树突状细胞诱导干扰素-γ的表达。
16.根据权利要求14所述的组合物，其中所述树突状细胞增加Fcgr3的表达。
17.根据权利要求14所述的组合物，其中所述树突状细胞增加选自由分化簇38、分化簇61(整合素β3)以及T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白组成的组中的一种以上基因的表达。
18.用于免疫抗癌治疗的试剂盒，其包括：
(a)第一容器，用于收容包含通过权利要求1至12中任一项所述的方法制备的分化簇103阳性树突状细胞的组合物；
(b)第二容器，用于收容肿瘤抗原；以及
(c)说明书，说明在将第一容器中的组合物和第二容器中的抗原给药到需要其的个体之前12小时至48小时混合。
19.树突状细胞的免疫原性评价方法，其包括测定分化簇103阳性树突状细胞的比例的步骤。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述方法还包括在分化簇103阳性树突状细胞占总树突状细胞的70％以上的情况下评价为免疫原性良好的步骤。
21.免疫抗癌治疗方法，包括将包含分化簇103阳性树突状细胞的药物组合物给药到需要其的个体的步骤，其中所述分化簇103阳性树突状细胞通过权利要求1至12中任一项所述的方法制备。
22.包含分化簇103阳性树突状细胞的药物组合物在免疫抗癌治疗中的用途，其中所述分化簇103阳性树突状细胞通过权利要求1至12中任一项所述的方法制备。
23.用于生产免疫抗癌治疗药剂的分化簇103阳性树突状细胞的用途，其中所述分化簇103阳性树突状细胞通过权利要求1至12中任一项所述的方法来制备。
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