WO2022108306A1 - 인터류킨-33을 처리하여 면역원성이 향상된 cd103+ fcgr3+ 수지상세포의 제조방법 및 상기 수지상세포를 포함하는 면역항암치료용 약학적 조성물 - Google Patents

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강명호
정이들
홍정협
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Definitions

  • the present invention relates to a method for increasing anti-tumor immunity of dendritic cell therapeutics. Specifically, in the differentiation of dendritic cells into dendritic cells by culturing them in a medium containing Flt3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand), interleukin-33 (Interleukin-33, IL-) 33), a method for producing a cluster of differentiation 103 (CD103)-positive dendritic cells comprising the step of treating the CD103-positive dendritic cells prepared by the method, and a pharmaceutical composition and kit for immunotherapy comprising the same.
  • Flt3L Flt3L
  • Interleukin-33 Interleukin-33, IL- 33
  • Dendritic cells are representative antigen-presenting cells that can activate cytotoxic T cells by presenting antigens to cytotoxic T cells.
  • in vitro cultured dendritic cells are used for tumor treatment.
  • Most of the existing in vitro cultured dendritic cells have been using GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor), and recently Flt3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand) has been used to produce cells more similar to dendritic cells in the body. making it.
  • GM-CSF Gramulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • Flt3L Flt3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand) has been used to produce cells more similar to dendritic cells in the body. making it.
  • GM/FL-BMDCs To increase the immunogenicity of these GM/FL-BMDCs, genetic modification is attempted or an adjuvant is used, but unexpected side effects such as off-target effect or excessive inflammation caused by inflammatory cytokines this exists.
  • the methods presented above focus only on changes in cytokines that can stimulate T cells and increase the expression of specific co-stimulatory molecules by affecting dendritic cells at the time of completion of differentiation.
  • dendritic cell therapeutics aim to enhance immunogenicity in a state where differentiation is completed, but research on methods to form new dendritic cell subgroups and increase immunogenicity by controlling the intermediate stage of differentiation is almost at the laboratory level. is currently staying.
  • dendritic cell therapeutics which show a significant effect in in vitro experiments, also have a problem in that they do not exhibit a tumor suppressive effect because they are inactivated due to immune checkpoint molecules increased by the tumor environment in the body. Accordingly, it is attempted to overcome the above problem by developing neutralizing antibodies against immune checkpoint molecules, but the applicable cases of tumors are limited.
  • Research on the development of dendritic cell therapy for intractable cancer has been greatly developed over the past 20 years as safety has been proven as an autologous cell therapy, but the lower-than-expected anti-tumor immunity and limited therapeutic effect still remain to be resolved.
  • the present invention discloses a subgroup of dendritic cells newly induced by interleukin-33 (IL-33) for the purpose of fundamentally increasing the immunogenicity of in vitro cultured dendritic cells, and by the dendritic cell subgroup By identifying that the induced anti-tumor immunity is significantly higher than that of the existing dendritic cell treatment, it was attempted to develop a more effective dendritic cell treatment method.
  • IL-33 interleukin-33
  • an object of the present invention is to differentiate dendritic cell progenitors into dendritic cells by culturing them in a medium containing Flt3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand). It is to provide a method for producing a CD103 (cluster of differentiation 103) positive dendritic cells comprising a.
  • Another object of the present invention is to provide CD103-positive dendritic cells prepared by the production method according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for immunotherapy comprising CD103-positive dendritic cells prepared by the method according to the present invention.
  • Another object of the present invention is to provide a kit for immunotherapy comprising CD103-positive dendritic cells prepared by the method according to the present invention as one component.
  • Another object of the present invention is to provide a method for evaluating the immunogenicity of dendritic cells, comprising measuring the proportion of CD103-positive dendritic cells.
  • dendritic cell progenitor cells are differentiated into dendritic cells by culturing them in a medium containing Flt3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand), differentiation of the dendritic cells It provides a method for producing CD103 (cluster of differentiation 103) positive dendritic cells, comprising the step of treating interleukin-33 (IL-33) in the step.
  • Flt3L Flt3L
  • IL-33 interleukin-33
  • the present inventors induced CD103-positive dendritic cells with excellent immunogenicity by treating IL-33 in the dendritic cell differentiation stage, which proved to have more effective tumor suppressive efficacy than dendritic cell therapeutics differentiated by the conventional method. was completed.
  • the present inventors have demonstrated that IL-33 has a tumor suppressive effect upon direct administration to experimental animals, and developed the present invention by showing that new CD103-positive dendritic cells are induced in the spleen.
  • the Flt3L may be included in the medium at a concentration of 10 to 1,000 ng/ml, but is not limited thereto.
  • the culture may be made for 5 to 20 days, but is not limited thereto.
  • the culture may be made for 10 days, but is not limited thereto.
  • the interleukin-33 may be treated on the 3rd to 7th day from the start date of the culture, but is not limited thereto.
  • the interleukin-33 may be treated at a concentration of 1 to 25 ng/ml, but is not limited thereto.
  • the interleukin-33 may be treated at a concentration of 5 ng/ml on the fifth day from the culture start date, but is not limited thereto.
  • the interleukin-33 may be treated at one point in the differentiation stage at which CD103-positive dendritic cells in a ratio of 30 to 100% relative to the total number of dendritic cells can be induced. not.
  • the manufacturing method can induce a ratio of the number of CD103-positive type 1 myeloid-derived dendritic cells (cDC1) to 70% or more, but is not limited thereto.
  • the present invention provides CD103-positive dendritic cells prepared by the production method according to the present invention.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for immunotherapy comprising CD103-positive dendritic cells prepared by the method according to the present invention.
  • the dendritic cells may induce the expression of IFN- ⁇ (Interferon gamma), but is not limited thereto.
  • the dendritic cells may have increased expression of Fcgr3 (Fc receptor, IgG, low affinity III), but is not limited thereto.
  • Fcgr3 Fc receptor, IgG, low affinity III
  • the dendritic cells are one or more genes selected from the group consisting of CD38 (cluster of differentiation 38), CD61 (Integrin beta-3), and Tigit (T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains).
  • CD38 cluster of differentiation 38
  • CD61 Integrin beta-3
  • Tigit T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains.
  • the expression of may be increased, but is not limited thereto.
  • the present invention provides (a) a first container containing a composition containing CD103-positive dendritic cells prepared by the manufacturing method according to the present invention; (b) a second container containing the tumor antigen; And (c) it provides a kit for immunotherapy comprising an instruction to mix the composition in the first container and the antigen in the second container 12 to 48 hours before administration to an individual in need thereof.
  • the present invention provides a method for evaluating the immunogenicity of dendritic cells, comprising the step of measuring the ratio of CD103-positive dendritic cells.
  • the method may further include, but is not limited to, evaluating the immunogenicity as good when the ratio of the number of CD103-positive dendritic cells to the total dendritic cells is 70% or more.
  • the present invention provides a method for immunotherapy, comprising administering to an individual in need thereof a pharmaceutical composition comprising CD103-positive dendritic cells prepared by the method according to the present invention.
  • the present invention provides the use of the composition for immunotherapy, comprising CD103-positive dendritic cells prepared by the method according to the present invention.
  • the present invention provides a use of the CD103-positive dendritic cells prepared by the preparation method according to the present invention for producing an immunotherapy drug.
  • the present invention revealed a subgroup of dendritic cells newly differentiated by interleuin-33 (IL-33), and as described above, dendritic cells differentiated by IL-33 are more antigen-specific cytotoxic than control dendritic cells.
  • the T cell inducing ability was high, and anti-tumor immunity was strongly induced by the dendritic cell subgroup.
  • IL-33 interleuin-33
  • anti-tumor immunity was strongly induced by the dendritic cell subgroup.
  • FIG. 1 is a schematic diagram showing the production flow of in vitro cultured dendritic cells using GM-CSF or Flt3L in time series.
  • Figures 2a and 2b are a road confirming the subgroup expressing CD103, the CD103+ cDC1 subgroup change according to the treatment time of IL-33 during production of FL-33-DC (Fig. 2a) and GM-DC, GM-33-DC, It is a diagram showing the results of CD103+ dendritic cell subgroup analysis (FIG. 2b) in FL-DC and FL-33-DC, respectively.
  • FIG. 3a and 3b show the results of CD103+ dendritic cell subgroup analysis in FL-DC, FL-GM-DC and FL-33-DC ( FIG. 3a ) and the analysis result of antigen-specific T cell division and activation inducibility ( FIG. 3b ). ) is a diagram showing
  • Figures 4a to 4d are FL-DC, FL-GM-DC and FL-33-DC transcript analysis original data (Fig. 4a) and FL-33-DC-specific high gene expression level comparison graph (Fig. 4b), gene expression analysis confirmed by RT-PCR (Fig. 4c), and CD38, CD61, TIGIT, and Fcgr3 protein expression analysis results confirmed by flow cytometry (Fig. 4d) are shown.
  • FIG. 5a and 5b show tumor growth inhibition of dendritic cell vaccine sensitized to GM-DC, GM-33-DC, FL-DC, FL-GM-DC, and FL-33-DC in the mouse EG.7 tumor model. It is a diagram showing the result of analyzing the effect (Fig. 5a) and the analysis result of cytotoxic lymphocytes induced after vaccine administration (Fig. 5b).
  • FIG. 6a and 6b are the results of analyzing the tumor-derived nodule formation inhibitory effect of the dendritic cell vaccine sensitized to FL-DC, FL-GM-DC, and FL-33-DC in the mouse B16F10-OVA lung metastasis model (Fig. 6a) and the analysis results of cytotoxic lymphocytes induced after vaccine administration ( FIG. 6b ) are diagrams.
  • FIG. 7a to 7d are graphs of CD103-positive dendritic cells in the spleen (Fig. 7a) after administration of GM-CSF or IL-33 to mice, tumor growth graph after administration of cytokines to the EG.7 tumor model (Fig. 7b), cytokines It is a diagram showing the ratio of CD103-positive dendritic cells in the spleen of the administered tumor model ( FIG. 7c ), and the analysis results of cytotoxic lymphocytes induced after cytokine administration ( FIG. 7d ).
  • FIG. 8 is a diagram showing the results of analyzing the protein expression levels of Fcgr3 and Fcgr4 in IL-33-induced CD103-positive dendritic cells by flow cytometry.
  • the present inventors in the preparation of in vitro cultured dendritic cells using a medium containing Flt3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand), interleukin-33 (interleukin-33, hereinafter 'IL- 33'), the present invention was completed by discovering that CD103 (cluster of differentiation 103)-positive dendritic cells with increased immunogenicity were newly induced to significantly increase anti-tumor immunity.
  • Flt3L Flt3L
  • interleukin-33 interleukin-33
  • FL-33-DC dendritic cells treated with IL-33 in Flt3L environment
  • FL-33-DC dendritic cells treated with IL-33 in Flt3L environment
  • FL-DC dendritic cells cultured in Flt3L environment
  • a vaccine containing FL-33-DC when produced and administered to a tumor model, not only the FL-DC vaccine but also the conventionally used GM-DC (dendritic cultured in a GM-CSF environment) cells) and GM-33-DC (BMDC treated with IL-33 in a GM-CSF environment) it was confirmed that it can inhibit tumor growth more effectively than vaccines (see Example 5).
  • GM-DC dendritic cultured in a GM-CSF environment
  • GM-33-DC BMDC treated with IL-33 in a GM-CSF environment
  • FL-GM-DC dendritic cells cultured under Flt3L and GM-CSF environment
  • FL-GM-DC dendritic cells cultured under Flt3L and GM-CSF environment
  • IL-33 treated at the differentiation stage in the preparation of in vitro cultured dendritic cell vaccine induces immunogenic CD103+ dendritic cells and induces cytotoxic T It was confirmed that the cells were more effectively induced to show a strong tumor suppressive effect (see Example 5).
  • IL-33 In another embodiment of the present invention, after intraperitoneal administration of IL-33 or GM-CSF to mice, the inducing ability and tumor suppressive ability of CD103-positive dendritic cells in the spleen are analyzed, and IL-33 or It was confirmed that additional CD103-positive dendritic cells were induced in both mouse groups by GM-CSF, but it was confirmed that the anti-tumor immunity effect was strongly shown in IL-33 (see Example 7).
  • the present invention relates to the differentiation of dendritic cells into dendritic cells by culturing them in a medium containing Flt3L, comprising the step of treating interleukin-33 (IL-33) in the dendritic cell differentiation stage, A method for producing dendritic cells can be provided.
  • IL-33 interleukin-33
  • DC dendritic cells
  • APC antigen-presenting cell
  • MHC major histocompatibility complex class II
  • CD8+ T cell activation endogenous antigens
  • DCs have a special ability to cross-present exogenous antigens through MHC class II as well as MHC class I.
  • DCs can more effectively activate CD4+ and CD8+ T cells.
  • the DC After acquiring the antigen, the DC, which has undergone the maturation process, moves to the lymphatic organ and presents the antigen to the naive T cells.
  • T cell activation requires not only antigen presentation by APC, but also stimulation of costimulatory molecules (CD80, CD86, CD40, etc.) expressed on the surface of APC and pro-inflammatory cytokines.
  • Fully mature DC induces CD4+ T cells to differentiate into Th1 (T helper 1) cells through these signals, and also activates CD8+ T cells (cytolytic T lymphocytes).
  • CD4+ T cells are differentiated into Th2 cells or regulatory T cells (Tregs) in the absence of stimulation of APC co-stimulatory factors and pro-inflammatory cytokines or when stimulated by immunosuppressive cytokines.
  • TAE tumor and tumor microenvironment
  • the tumor and tumor microenvironment (TME) directly induces DC dysfunction or suppresses anticancer immune activity by hiding tumor antigens and secreting large amounts of immunosuppressive cytokines.
  • autologous DCs are loaded with antigens and trained outside the body to express co-stimulatory factors and secrete inflammation-promoting cytokines.
  • Research for inducing T cell activity is being conducted, and the preparation method of the present invention is a result of newly discovered and completed in vitro culture method for obtaining dendritic cells having excellent immunogenicity and anti-tumor efficacy in the course of such research.
  • immunologicality refers to a property capable of inducing or maintaining an immune response, in particular capable of inducing an immune response, when administered to a mammal and particularly when administered to a human individual.
  • the manufacturing method includes a process of culturing dendritic cell progenitor cells in a medium containing Flt3L to differentiate them into dendritic cells.
  • dendritic cells when dendritic cells are cultured in the Flt3L-containing medium, dendritic cells with better immunogenicity and anti-tumor efficacy compared to the widely used GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor) are produced. It was confirmed that it was made, therefore, GM-CSF may not be contained in the dendritic cell culture medium according to the manufacturing method of the present invention.
  • GM-CSF Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor
  • Flt3L is an abbreviation of FMS-like tyrosine kinase 3 ligand. It refers to a cytokine that functions as a growth factor that increases the number of cells.
  • the Flt3L may be of human origin and may be a protein having the amino acid sequence of GenBank: AAA19825.1.
  • the Flt3L may be included in the medium at a concentration of 10 to 1,000 ng/ml, but is not limited thereto. In one embodiment, when dendritic cells are cultured for 10 days, a medium containing 100 ng/ml of Flt3L may be used.
  • the culture may be made for 5 to 20 days, preferably for 10 days, but is not limited thereto.
  • the interleukin-33 may be treated on the 3rd to 7th day from the culture start date, but is not limited thereto, and treatment is preferably performed at the differentiation stage.
  • the "differentiation stage” is used to refer to all successive stages in which dendritic cell progenitor cells, for example, hematopoietic bone marrow progenitor cells, are differentiated into immature dendritic cells or mature dendritic cells.
  • the “immature dendritic cells” are found in the early stages of differentiation, do not express cell surface markers such as CD14, and express low levels of HLA-DR, CD86, CD80, CD83 or CD40, and CD1a like mature dendritic cells. and dendritic cells expressing CCR1, CCR2, CCR5 and CXCR1 at normal levels. Differentiation of immature dendritic cells is initiated by receiving various signals, and this differentiation leads to complete or partial differentiation depending on the combination of the signals received. Because immature dendritic cells have low levels of expressed inflammatory cytokines, they cannot activate T cells even when they come into contact with T cells.
  • the “mature dendritic cell” refers to a cell formed by maturation of immature dendritic cells, and cell surface markers involved in B cell and T cell activity, for example, MHC class I or MHC class II (HLA-DR), cell adhesion Refers to a cell that expresses a factor (CD54, CD18, CD11), a co-stimulatory factor (eg, CD86, CD80, CD83 or CD40) at a high level or a relatively increased level compared to immature dendritic cells, typically mature Dendritic cells express high levels of CCR7 and CXCR4.
  • a factor CD54, CD18, CD11
  • a co-stimulatory factor eg, CD86, CD80, CD83 or CD40
  • Mature dendritic cells release proinflammatory cytokines, and increase proliferation of primitive allogeneic T cells and syngeneic T cells in a mixed lymphocyte reaction and / or other immune response-related cytokines are characterized by increased expression and secretion.
  • the production method of the present invention is not limited to the specified time and concentration, and the treatment time and concentration of interleukin-33 may be appropriately adjusted by those skilled in the art depending on the state of dendritic cell progenitor cells, the number of cells, the culture environment, etc. . Therefore, the interleukin-33 may be treated at an appropriate concentration, for example, may be treated at a concentration of 1 to 25 ng/ml, but is not limited thereto.
  • the treatment time and concentration of the interleukin-33 may be treated at a time point at which the ratio of the number of CD103 positive dendritic cells to the total dendritic cells can be induced to 30 to 100%.
  • a time point at which the ratio of the number of CD103 positive dendritic cells to the total dendritic cells can be induced to 30 to 100%.
  • interleukin-33 can be treated by selecting any one of the above periods, preferably CD103 Interleukin-33 can be treated by selecting a time point when the ratio of positive dendritic cells is highest.
  • the manufacturing method may induce a ratio of the number of CD103-positive type 1 myeloid-derived dendritic cells (cDC1) to 70% or more, but is not limited thereto.
  • the present invention can provide CD103-positive dendritic cells prepared by the production method according to the present invention.
  • the present invention can provide a pharmaceutical composition for immunotherapy comprising CD103-positive dendritic cells prepared by the method according to the present invention.
  • the dendritic cells can induce the expression of IFN- ⁇ (Interferon gamm), but is not limited thereto.
  • the dendritic cells may have increased expression of Fcgr3 (Fc receptor, IgG, low affinity III), but is not limited thereto.
  • Fcgr3 Fc receptor, IgG, low affinity III
  • the dendritic cells have increased expression of one or more genes selected from the group consisting of CD38 (cluster of differentiation 38), CD61 (Integrin beta-3), and Tigit (T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains). may be, but is not limited thereto.
  • the Fcgr3 plays an important role in host defense such as phagocytosis of pathogens and regulation of immune cell differentiation.
  • the CD38 is a glycoprotein on the surface of immune cells such as natural killer cells, and the CD61 is a differentiation cluster expressed in platelets and white blood cells.
  • the TIGIT is an immune receptor present in T cells or natural killer cells. The increase in their gene expression means that the immune effect is excellent.
  • the present invention provides an immunotherapy method comprising administering to an individual in need thereof a pharmaceutical composition comprising CD103-positive dendritic cells prepared by the method according to the present invention.
  • the present invention can provide the use of a composition comprising CD103-positive dendritic cells prepared by the manufacturing method according to the present invention for immunotherapy.
  • the present invention may provide the use of CD103-positive dendritic cells prepared by the production method according to the present invention for producing an immunotherapy drug.
  • a method for immunotherapy comprising administering the interleukin-33 to an individual, but is not limited thereto.
  • the interleukin-33 may newly form CD103-positive dendritic cells in vivo, but is not limited thereto.
  • the in vivo injection of the interleukin-33 may be performed at an appropriate dose, and may be administered at 5 to 500 ⁇ g/kg, but is not limited thereto.
  • the in vivo administration of the interleukin-33 may be performed daily for 4 to 11 days, but is not limited thereto.
  • the interleukin-33 can increase the expression of the Fcgr3 (Fc receptor, IgG, low affinity III) or Fcgr4 (Fc receptor, IgG, low affinity IV) gene of newly formed CD103-positive dendritic cells in vivo.
  • Fcgr3 Fc receptor, IgG, low affinity III
  • Fcgr4 Fc receptor, IgG, low affinity IV
  • Fcgr3 Fc receptor, IgG, low affinity III
  • CD103-positive dendritic cells induced in vitro and in vivo after the interleukin-33 treatment, but is limited thereto. it is not
  • the term “pharmaceutical composition for immunotherapy” may be used interchangeably with the term “cell therapy agent”, and in order to restore the function of cells and tissues, live autologous, allogeneic or A drug used for the purpose of treatment, diagnosis and prevention through a series of actions such as proliferation and selection of xenogenic cells in vitro or changing the biological characteristics of cells by other methods.
  • Cell therapy products have been administered as pharmaceuticals since 1993 in the United States and 2002 in Korea. These cell therapy products can be broadly classified into two fields. The first is “stem cell therapy” for tissue regeneration or organ function recovery, and the second is immune response regulation such as suppression of immune response or enhancement of immune response in vivo. It is an “immune cell therapy” for
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the excipient may be, for example, at least one selected from the group consisting of a diluent, a binder, a disintegrant, a lubricant, an adsorbent, a humectant, a film-coating material, and a controlled-release additive.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared according to a conventional method, respectively, in powders, granules, sustained-release granules, enteric granules, liquids, eye drops, elsilic, emulsions, suspensions, alcohols, troches, fragrances, and limonaade.
  • Carriers, excipients and diluents that may be included in the pharmaceutical composition according to the present invention include lactose, dextrose, sucrose, oligosaccharide, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, microcrystalline cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the injection according to the present invention includes distilled water for injection, 0.9% sodium chloride injection, Ringel injection, dextrose injection, dextrose + sodium chloride injection, PEG (PEG), lactated Ringel injection, ethanol, propylene glycol, non-volatile oil-sesame oil , solvents such as cottonseed oil, peanut oil, soybean oil, corn oil, ethyl oleate, isopropyl myristate, and benzene benzoate; Solubilizing aids such as sodium benzoate, sodium salicylate, sodium acetate, urea, urethane, monoethyl acetamide, butazolidine, propylene glycol, tweens, nijeongtinamide, hexamine, and dimethyl acetamide; Weak acids and their salts (acetic acid and sodium acetate), weak bases and their salts (ammonia and ammonium acetate), organic compounds, proteins, buffers such as albumin, pe
  • composition according to the present invention is administered in a pharmaceutically effective amount.
  • pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit/risk ratio applicable to medical treatment, and the effective dose level is determined by the type, severity, drug activity, and type of the patient's disease; Sensitivity to the drug, administration time, administration route and excretion rate, treatment period, factors including concurrent drugs and other factors well known in the medical field may be determined.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or may be administered in combination with other therapeutic agents, may be administered sequentially or simultaneously with conventional therapeutic agents, and may be administered singly or multiple times. In consideration of all of the above factors, it is important to administer an amount capable of obtaining the maximum effect with a minimum amount without side effects, which can be easily determined by a person skilled in the art to which the present invention pertains.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered to an individual by various routes.
  • Any mode of administration may be contemplated, for example, subcutaneous injection, intraperitoneal administration, intravenous injection, intramuscular injection, paraspinal space (intrathecal) injection, sublingual administration, buccal administration, rectal insertion, vaginal insertion, It can be administered according to ocular administration, ear administration, nasal administration, skin administration, transdermal administration, etc., and preferably intradermally, intranodally, subcutaneously, intravenously, or directly intratumorally. There is this. However, the optimal route of administration has not yet been established.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is determined according to the type of drug as an active ingredient along with several related factors such as the disease to be treated, the route of administration, the patient's age, sex, weight, and the severity of the disease.
  • “individual” means a subject in need of treatment for a disease, and more specifically, human or non-human primates, mice, rats, dogs, cats, horses, and cattle means mammals such as
  • administration means providing a predetermined composition of the present invention to an individual by any suitable method.
  • prevention means any action that suppresses or delays the onset of a target disease
  • treatment means that the target disease and its metabolic abnormalities are improved or It means any action that is changed for the better.
  • the present invention provides (a) a first container containing a composition comprising CD103-positive dendritic cells prepared by the manufacturing method according to the present invention; (b) a second container containing the tumor antigen; And (c) it can provide a kit for immunotherapy comprising an instruction to mix the composition in the first container and the antigen in the second container 12 to 48 hours before administration to an individual in need thereof.
  • TAAs tumor-associated antigens
  • Tumor-specific antigens induce a tumor-specific immune response in the host, but in the case of tumor-associated antigens expressed not only in tumor cells but also in normal cells, self-tolerance expression may not induce a tumor-specific immune response in the host. .
  • Mixing the composition in the first container and the antigen in the second container is a process of loading the antigen on the dendritic cells.
  • a method of loading antigens on dendritic cells in general, a method of killing and culturing peptides, proteins, and autologous/allogeneic cancer cells is used. Short synthetic peptides (8-15 aa) are mounted directly on MHC molecules on the surface of dendritic cells, whereas long synthetic peptides (28-35 aa), proteins and cancer cells undergo peptide processing prior to loading on MHC molecules.
  • a CD8+ T cell epitope for TAA is being used in clinical trials, and the patient's HLA haplotype must be known and capable of binding to a specific haplotype.
  • a long synthetic peptide it can be cross-presented during antigen processing in dendritic cells, so that it can induce not only CD8+ T cells but also CD4+ T cell responses and present antigens for a longer period of time.
  • the present invention provides a method for evaluating the immunogenicity of dendritic cells, comprising the step of measuring the ratio of CD103-positive dendritic cells.
  • the method may further include, but is not limited to, evaluating the immunogenicity as good when the ratio of the number of CD103-positive dendritic cells to the total dendritic cells is 70% or more.
  • the CD103-positive dendritic cells are a marker of cDC1 (type 1 conventional DC), and in one embodiment of the present invention, it was confirmed that the higher the ratio of the CD103+ dendritic cell subgroup, the stronger the antigen-specific T cells are induced.
  • the bone marrow cells were isolated from the hind legs of mice, they were cultured in a GM-CSF environment at a concentration of 20 ng/ml.
  • GM-DC dendritic cells cultured for 7 days from the first day by exchanging with a new culture medium
  • GM-33-DC dendritic cells treated with 5 ng/ml of IL-33 on the third day of the GM-DC culture
  • dendritic cells prepared by culturing bone marrow cells in an Flt3L environment at a concentration of 100 ng/ml for 10 days they were named FL-DC.
  • dendritic cells cultured by adding 5 ng/ml of IL-33 on the 3rd to 7th day of the FL-DC culture were named FL-33-DC.
  • Cell analysis was performed for GM-DC and GM-33-DC on the 7th day of culture, and for FL-DC and FL-33-DC on the 10th day of culture.
  • Dendritic cells for vaccine administration for confirmation of anticancer effect were treated with egg white albumin (Ovalbumin, hereinafter 'OVA') corresponding to the antigen one day before use, and then administered to tumor model mice (see schematic diagram in FIG. 1 ).
  • Ovalbumin hereinafter 'OVA'
  • CD103+ cDC1 with strong antitumor immunogenicity in GM-DC, GM-33-DC, FL-DC, and FL-33-DC prepared in Example 1 was analyzed.
  • CD103+ cDC1 was hardly induced in GM-DC, and the CD103+ cDC1 subgroup was not induced significantly in GM-33-DC to which IL-33 was added.
  • FL-DC XCR1 was expressed but CD103 was hardly expressed.
  • FL-33-DC CD103+ cDC1 accounted for more than 75% of total dendritic cells ( FIG. 2b ).
  • Example 2 it was confirmed that CD103+ dendritic cells were newly induced in FL-33-DC. Accordingly, the present inventors compared with FL-33-DC whether or not CD103+ cDC1 was induced when GM-CSF was added during the production process of FL-DC, which is a conventional method.
  • FL-DC, FL-GM-DC and FL-33-DC were treated with OVA protein and the OVA antigen-specific T cell receptor was After co-culture with OT-I mouse T cells, the proliferation of OT-1 T cells and the expression of IFN- ⁇ , one of the activating cytokines, were investigated.
  • FL-33-DC and FL-GM-DC showed higher proliferative capacity of OT-1 T cells than FL-DC.
  • FL-33-DC effectively induced IFN- ⁇
  • FL-GM-DC did not induce IFN- ⁇ ( FIG. 3b ).
  • the present inventors conducted transcriptomic analysis of FL-DC, FL-GM-DC and FL-33-DC.
  • each dendritic cell showed a specific gene expression pattern (Fig. 4a). Among them, it was found that the expression levels of CD38, CD61, Tigit, and Fcgr3 were specifically high in FL-33-DC (Fig. 4b), and as a result of performing RT-PCR after actually isolating RNA, the genes were found to be FL It was confirmed that -33-DC was specifically highly expressed (FIG. 4c).
  • the four genes were analyzed at the protein level by flow cytometry.
  • Example 3 it was confirmed that FL-33-DC had significantly higher antigen-specific T cell induction and activation ability than FL-DC and FL-GM-DC, and in Example 4, FL-33-DC was an immunogen It was confirmed that the expression of sex-related CD38, CD61 and Fcgr3 was relatively high. Therefore, in order to check whether it can be applied to the treatment of tumors, the dendritic cell vaccine prepared by the method shown in the schematic diagram of FIG. 1 was injected subcutaneously into EG.7 tumor-inoculated mice, on the 3rd and 10th days after tumor inoculation, respectively. Then, tumor growth was monitored.
  • Example 5 the anti-tumor immunity was most strongly induced in mice administered with the FL-33-DC vaccine, and it was confirmed whether the application was possible in a lung metastasis model.
  • the dendritic cell vaccine prepared by the method shown in the schematic diagram of FIG. 1 was subcutaneously injected into the B16F10-OVA lung metastasis model on the 3rd and 10th days after tumor inoculation, respectively, and then on the 16th day, nodular formation in the lungs was analyzed. .
  • Example 7 Tumor suppression and induction of CD103-positive dendritic cells in vivo through IL-33 administration
  • the present inventors analyzed the inducibility and tumor suppression ability of CD103-positive dendritic cells in the spleen.
  • Example 7 both IL-33 and GM-CSF could induce CD103-positive dendritic cells, but the anti-tumor immune response was completely different. Therefore, an attempt was made to identify a marker that can divide the difference between the two.
  • FL-33-DC of the present invention unlike FL-DC or FL-GM-DC, highly expresses CD38, CD61, and Fcgr3, and increases immunogenicity CD103+ cDC1, and CD103+ expressing these molecules
  • cDC1 exhibits an improved cancer treatment effect by effectively inducing antigen-specific cytotoxic T lymphocytes, it is expected to be widely used as a cell therapy for immunotherapy.
  • Fcgr3 is commonly expressed in CD103+ cDC1 among dendritic cells produced in vitro and in vivo by IL-33, it is thought that if the expression of this molecule can be enhanced, it can be used for tumor treatment.
  • the present invention revealed a subgroup of dendritic cells newly differentiated by interleuin-33 (IL-33).
  • IL-33 interleuin-33
  • dendritic cells differentiated by IL-33 are more antigen-specific cytotoxic than control dendritic cells.
  • the T cell induction ability was high, and anti-tumor immunity was strongly induced by the dendritic cell subgroup.
  • the production method of the present invention and the in vitro cultured dendritic cells using the same can provide a new immune cell therapy that can dramatically increase the therapeutic effect, and thus have industrial applicability.

Abstract

본 발명은 수지상세포 치료제의 항종양면역을 높이기 위한 방법에 관한 것으로서, 구체적으로 수지상세포 전구세포를 Flt3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand)이 포함된 배지에서 배양하여 수지상세포로 분화 시킴에 있어서, 상기 수지상세포의 분화 단계에서 인터류킨-33 (Interleukin-33, IL-33)을 처리하는 단계를 포함하는 CD103 (cluster of differentiation 103) 양성 수지상세포의 제조방법, 상기 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포, 이를 포함하는 면역항암치료용 약학적 조성물 및 키트 등에 관한 것이다. 본 발명의 제조방법에 의해 분화된 수지상세포는 대조군 수지상세포와 비교하여 항원 특이적 세포독성 T 세포 유도능이 높았으며, 새롭게 분화된 수지상세포 아군에 의해 항종양면역이 강력하게 유도되는 바, 수지상세포 분화 완료 후 면역원성을 높이는 기존의 방법과는 다르게 분화 단계에서 면역원성을 높일 수 있는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 제조방법 및 이를 이용한 체외 배양 수지상세포를 통해 치료 효과를 비약적으로 상승시킬 수 있는 새로운 면역세포 치료법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.

Description

인터류킨-33을 처리하여 면역원성이 향상된 CD103+ FCGR3+ 수지상세포의 제조방법 및 상기 수지상세포를 포함하는 면역항암치료용 약학적 조성물
본 발명은 수지상세포 치료제의 항종양면역을 높이기 위한 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 수지상세포 전구세포를 Flt3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand)이 포함된 배지에서 배양하여 수지상세포로 분화시킴에 있어서, 상기 수지상세포의 분화 단계에서 인터류킨-33 (Interleukin-33, IL-33)을 처리하는 단계를 포함하는 CD103 (cluster of differentiation 103) 양성 수지상세포의 제조방법, 상기 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포, 이를 포함하는 면역항암치료용 약학적 조성물 및 키트 등에 관한 것이다.
본 출원은 2020년 11월 17일에 출원된 한국특허출원 제10-2020-0153308호 및 2021년 11월 16일에 출원된 한국특허출원 제10-2021-0158012호에 기초한 우선권을 주장하며, 해당 출원의 명세서 및 도면에 개시된 모든 내용은 본 출원에 원용된다.
수지상세포 (dendritic cells)는 대표적인 항원제시세포로 세포독성 T 세포에 항원을 제시함으로써 세포독성 T 세포 활성화시킬 수 있으며, 이를 응용하여 종양치료를 위한 세포치료제의 개발이 활발하게 진행 중에 있다.
체내 수지상세포는 그 수가 충분하지 않아 체외 배양 수지상세포를 종양 치료에 사용하고 있다. 기존의 체외 배양 수지상세포는 대부분 GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)를 이용해 왔고, 최근에는 좀 더 체내 수지상세포와 비슷한 세포를 제작하기 위해 Flt3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand)를 이용하여 제작하고 있다. 이들 GM/FL-BMDC의 면역원성을 높이고자 유전자 변형을 시도하거나 면역증강제 (adjuvant)를 이용하고 있지만 비표적효과 (off-target effect)나 염증성 사이토카인에 의한 과도한 염증 발생 등의 예측하지 못한 부작용이 존재한다. 또한, 상기 제시된 방법들은 분화가 완료된 시점의 수지상세포에 영향을 주어 특정 공동자극분자들의 발현 증가와 T 세포를 자극할 수 있는 사이토카인 변화에만 초점이 맞춰져 있다.
이렇듯 대부분의 체외 배양 수지상세포 치료제는 분화가 완료된 상태에서 면역원성을 증강시키는데 목적을 두고 있으나, 분화의 중간 단계를 조절하여 새로운 수지상세포 아군 형성 및 면역원성을 높이는 방안에 대한 연구는 거의 실험실 수준에 머물고 있는 실정이다. 또한, 체외 실험에서 유의미한 효과를 나타내는 수지상세포 치료제도 체내 종양환경에 의해 증가된 면역관문분자로 인하여 비활성화 되기 때문에 종양 억제 효과를 나타내지 못하는 문제점이 존재한다. 이에 면역관문분자에 대한 중화 항체들을 개발하여 상기 문제를 극복하고자 하고 있으나, 적용할 수 있는 종양의 증례가 제한되어 있다. 자가유래 세포 치료제로 안전성이 입증되어 난치성 암에 대한 수지상세포 치료제 개발 연구는 지난 20여년 동안 크게 발전되었으나, 기대보다 낮은 항종양면역 유도능 및 제한된 치료 효과는 여전히 해결해야 할 숙제로 남아 있다.
본 발명은 체외 배양 수지상세포의 면역원성을 근원적으로 증가시키기 위한 목적으로, 인터류킨-33 (interleukin-33, IL-33)에 의해 새롭게 유도되는 수지상세포의 아군을 밝혀내고, 상기 수지상세포 아군에 의해 유도되는 항종양면역이 기존의 수지상세포 치료제보다 유의미하게 높음을 규명함으로써 보다 효과적인 수지상세포 치료제의 제조방법을 개발하고자 하였다.
따라서 본 발명의 목적은 수지상세포 전구세포를 Flt3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand)이 포함된 배지에서 배양하여 수지상세포로 분화시킴에 있어서, 상기 수지상세포의 분화 단계에서 인터류킨-33을 처리하는 단계를 포함하는, CD103 (cluster of differentiation 103) 양성 수지상세포의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 포함하는, 면역항암치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 일 구성요소로 포함하는 면역항암치료용 키트를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 CD103 양성 수지상세포의 비율을 측정하는 단계를 포함하는, 수지상세포의 면역원성 평가 방법을 제공하는 것이다.
그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수지상세포 전구세포를 Flt3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand)이 포함된 배지에서 배양하여 수지상세포로 분화시킴에 있어서, 상기 수지상세포의 분화 단계에서 인터류킨-33 (Interleukin-33, IL-33)을 처리하는 단계를 포함하는, CD103 (cluster of differentiation 103) 양성 수지상세포의 제조방법을 제공한다.
본 발명자들은, IL-33을 수지상세포 분화 단계에 처리함으로써 면역원성이 뛰어난 CD103 양성 수지상세포를 유도하였고, 이는 기존의 방법으로 분화된 수지상세포 치료제보다 더 효과적인 종양 억제 효능을 가짐을 증명함으로써 본 발명을 완성하였다. 또한, 본 발명자들은, IL-33을 실험동물에 직접 투여 시 종양 억제 효능을 가짐을 증명하였고, 비장에서 새로운 CD103 양성 수지상세포가 유도됨을 보임으로써 본 발명을 발전시켰다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 Flt3L은 배지에 10 내지 1,000 ng/ml 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 배양은 5 내지 20일 동안 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 배양은 10일 동안 이루어질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 인터류킨-33은 배양 개시일로부터 3 내지 7일째 되는 날 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 인터류킨-33은 1 내지 25 ng/ml의 농도로 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 인터류킨-33은 배양 개시일로부터 5일째 되는 날 5 ng/ml의 농도로 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 인터류킨-33은 전체 수지상세포 대비 30 내지 100% 수 비율의 CD103 양성 수지상세포가 유도될 수 있는 분화 단계의 일 시점에서 처리될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 제조방법은 전체 수지상세포 대비 CD103 양성 제1형 골수성유래 수지상세포 (cDC1) 수 비율을 70% 이상으로 유도할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 포함하는 면역항암치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 수지상세포는 IFN-γ(Interferon gamma)의 발현을 유도할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 구현예에 있어서, 상기 수지상세포는 Fcgr3 (Fc receptor, IgG, low affinity III)의 발현이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구현예에 있어서, 상기 수지상세포는 CD38 (cluster of differentiation 38), CD61 (Integrin beta-3), 및 Tigit (T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 (a)본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 포함하는 조성물이 수용된 제1용기; (b)종양 항원이 수용된 제2용기; 및 (c)상기 제1용기의 조성물 및 제2용기의 항원을 이를 필요로 하는 개체에 투여하기 12 내지 48시간 전에 혼합할 것이 기재된 지시서를 포함하는 면역항암치료용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 CD103 양성 수지상세포의 비율을 측정하는 단계를 포함하는, 수지상세포의 면역원성 평가 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 방법은 전체 수지상세포 대비 CD103 양성 수지상세포의 수 비율이 70% 이상인 경우 면역원성이 좋은 것으로 평가하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 면역항암치료 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 포함하는, 조성물의 면역항암치료 용도를 제공한다.
또한, 본 발명은 면역항암치료 약제를 생산하기 위한, 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포의 용도를 제공한다.
본 발명은 인터류킨-33 (interleuin-33, IL-33)에 의해 새롭게 분화된 수지상세포 아군을 밝혀 내었으며, 상기와 같이 IL-33에 의해 분화된 수지상세포는 대조군 수지상세포보다 항원 특이적 세포독성 T 세포 유도능이 높았으며, 상기 수지상세포 아군에 의해 항종양면역이 강력하게 유도된 바, 수지상세포 분화 완료 후 면역원성을 높이는 기존의 방법과는 다르게 분화 단계에서 면역원성을 높일 수 있는 효과가 있다. 따라서 본 발명의 제조방법 및 이를 이용한 체외 배양 수지상세포를 통해 치료 효과를 비약적으로 상승시킬 수 있는 새로운 면역세포 치료법을 제공할 수 있을 것으로 기대된다.
도 1은 GM-CSF 또는 Flt3L를 이용한 체외 배양 수지상세포의 제조 흐름을 시계열적으로 나타낸 모식도이다.
도 2a 및 도 2b는 CD103을 발현하는 아군을 확인한 도로서, FL-33-DC 제작 시 IL-33의 처리 시기에 따른 CD103+ cDC1 아군 변화 (도 2a) 및 GM-DC, GM-33-DC, FL-DC, FL-33-DC에서 각각 CD103+ 수지상세포 아군 분석 결과 (도 2b)를 나타낸 도이다.
도 3a 및 도 3b는 FL-DC, FL-GM-DC 및 FL-33-DC에서 각각 CD103+ 수지상세포 아군 분석 결과 (도 3a) 및 항원 특이적 T 세포분열과 활성화 유도능의 분석 결과 (도 3b)를 나타낸 도이다.
도 4a 내지 도 4d는 FL-DC, FL-GM-DC 및 FL-33-DC의 전사체 분석 원본 데이터 (도 4a) 및 FL-33-DC에 특이적으로 높은 유전자의 발현량 비교 그래프 (도 4b), RT-PCR로 확인한 유전자 발현 분석 (도 4c), 및 유세포분석기로 확인한 CD38, CD61, TIGIT, 및 Fcgr3 단백질의 발현량 분석 결과 (도 4d)를 나타낸 도이다.
도 5a 및 도 5b는 마우스 EG.7 종양모델에서 GM-DC, GM-33-DC, FL-DC, FL-GM-DC, FL-33-DC에 OVA를 감작시킨 수지상세포 백신의 종양증식 억제 효과를 분석한 결과 (도 5a) 및 백신 투여 후 유도된 세포독성 림프구의 분석 결과 (도 5b)를 나타낸 도이다.
도 6a 및 도 6b는 마우스 B16F10-OVA 폐 전이 모델에서 FL-DC, FL-GM-DC, FL-33-DC에 OVA를 감작시킨 수지상세포 백신의 종양유래 결절 형성 억제효과를 분석한 결과 (도 6a) 및 백신 투여 후 유도된 세포독성 림프구의 분석 결과 (도 6b)를 나타낸 도이다.
도 7a 내지 도 7d는 마우스에 GM-CSF 또는 IL-33을 투여 후 비장 내 CD103 양성 수지상세포 비율 (도 7a), EG.7 종양모델에 사이토카인 투여 후 종양성장 그래프 (도 7b), 사이토카인 투여 종양모델의 비장 내 CD103 양성 수지상세포 비율 (도 7c), 및 사이토카인 투여 후 유도된 세포독성 림프구의 분석결과 (도 7d)를 나타낸 도이다.
도 8은 IL-33에 의해 유도되는 CD103 양성 수지상세포에서 Fcgr3 및 Fcgr4의 단백질 발현량을 유세포분석기로 분석한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명자들은 Flt3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand)가 포함된 배지를 이용하여 체외 배양 수지상세포 (dendritic cells)를 제조함에 있어서, 수지상세포 분화 단계에 인터류킨-33 (interleukin-33, 이하 'IL-33'라 함)을 처리할 경우 면역원성이 높아진 CD103 (cluster of differentiation 103) 양성 수지상세포가 새로 유도되어 항종양면역이 유의미하게 높아짐을 발견함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 일 실시예에서는, FL-33-DC (Flt3L 환경하에서 IL-33을 처리한 수지상세포)는 기존의 FL-DC (Flt3L 환경하에서 배양한 수지상세포)와는 다르게 CD103+ 수지상세포 아군이 새로 형성되었으며, 항원 특이적인 세포독성 T 세포의 분열을 더 강력하게 유도하였다 (실시예 2 내지 4 참조).
본 발명의 다른 실시예에서는, FL-33-DC을 포함하는 백신을 제작하여 종양모델에 투여하였을 때, FL-DC 백신뿐만 아니라 기존에 이용되고 있는 GM-DC (GM-CSF 환경하에서 배양한 수지상세포) 및 GM-33-DC (GM-CSF 환경하에서 IL-33을 처리한 BMDC) 백신보다 더욱 효과적으로 종양의 성장을 억제할 수 있음을 확인하였다 (실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, CD103+ 수지상세포가 생성되는 것으로 알려진 FL-GM-DC (Flt3L 및 GM-CSF 환경하에서 배양한 수지상세포)는 FL-33-DC와 비슷하게 CD103+ 수지상세포가 유도되긴 하지만, FL-33-DC와는 다르게 항종양면역을 높이지는 못하는 것을 확인하였고, 이와 비교하여 체외 배양 수지상세포 백신의 제조 시 분화 단계에 처리된 IL-33은 면역원성 CD103+ 수지상세포를 유도하고 세포독성 T 세포를 보다 효과적으로 유도하여 강력한 종양억제 효과를 보임을 확인하였다 (실시예 5 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, FL-33-DC을 포함하는 백신을 제작하여 폐 전이 모델에 투여하였을 때, FL-DC 투여 군에 비해 결절 형성이 유의하게 감소함을 확인하였고, 항종양면역이 가장 강력하게 유도됨을 확인하였다 (실시예 6 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, 마우스에 복강 내 IL-33 또는 GM-CSF를 투여 후, 비장 내에서 CD103 양성 수지상세포의 유도능 및 종양억제능을 분석하여, 종양모델의 비장에서 IL-33 또는 GM-CSF에 의해 두 마우스 군 모두 추가적인 CD103 양성 수지상세포가 유도된 것을 확인하였으나, 항종약면역 효과는 IL-33에서 강력하게 나타남을 확인하였다 (실시예 7 참조).
본 발명의 또 다른 실시예에서는, IL-33에 의해 유도되는 CD103 양성 수지상세포에서 GM-CSF와는 달리 Fcgr3 및 Fcgr4의 발현이 상대적으로 높게 나타났음을 확인하였다 (실시예 8 참조).
따라서 본 발명은 수지상세포 전구세포를 Flt3L이 포함된 배지에서 배양하여 수지상세포로 분화시킴에 있어서, 상기 수지상세포의 분화 단계에서 인터류킨-33 (IL-33)을 처리하는 단계를 포함하는, CD103 양성 수지상세포의 제조방법을 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, “수지상세포 (dendritic cells, DC)”는 내재면역반응 (innate immune response)과 적응면역반응 (adaptive immune response)을 모두 유도할 수 있는 면역계의 가장 핵심적인 전문 항원제시세포 (antigen-presenting cell, APC)로서 항원을 접한 적이 없는 naive 및 기억면역반응을 활성화할 수 있다. DC는 미성숙 상태에서 감시병과 같은 역할을 하여 항원을 찾으러 끊임없이 순찰한다. 일반적으로 APC가 항원을 섭취하면, 외인성 항원은 주로 MHC 클래스 II (major histocompatibility complex class II)를 통해 제시하고 (CD4+ T 세포 활성화) 내인성 항원은 MHC 클래스 I을 통해 제시한다 (CD8+ T 세포 활성화). 그러나, DC는 외인성 항원을 MHC 클래스 II 뿐만 아니라 MHC 클래스 I을 통해 교차제시 (cross presentation)할 수 있는 특별한 능력이 있다. 따라서, DC는 보다 효과적으로 CD4+와 CD8+ T 세포를 활성화할 수 있다.
항원을 획득한 후 성숙과정을 거친 DC는 림프기관으로 이동하여 naive T 세포에게 항원을 제시한다. T 세포의 활성에는 APC의 항원 제시뿐만 아니라 APC 표면에 발현된 보조자극인자 (costimulatory molecule; CD80, CD86, CD40 등)와 염증 촉진 사이토카인의 자극도 필요하다. 완전히 성숙한 DC는 이러한 신호를 통해 CD4+ T 세포가 Th1 (T helper 1) 세포로 분화되도록 유도하고, CD8+ T 세포 (cytolytic T lymphocyte) 또한 활성화한다. 그러나 APC의 보조자극인자 및 염증 촉진 사이토카인의 자극이 없거나 면역억제 사이토카인의 자극을 받으면 CD4+ T 세포는 Th2 세포나 조절 T 세포 (regulatory T cell, Treg)로 분화된다.
종양 및 종양미세환경 (tumor microenvironment, TME)은 직접적으로 DC의 기능장애를 유도하거나 종양 항원을 감추고 면역억제 사이토카인을 다량 분비하여 항암면역 활성을 억제한다. 이러한 허들을 극복하기 위해 자가유래 DC에 항원을 탑재하고 보조자극인자의 발현 및 염증촉진 사이토카인을 분비하도록 체외에서 훈련을 거친 수지상세포 치료제, 일명 “수지상세포 암백신”을 다시 체내로 투여하여 항암 T 세포 활성을 유도하기 위한 연구가 이루어지고 있으며, 본 발명의 제조방법은 이러한 연구 과정에서 특히 면역원성 및 항종양 효능이 뛰어난 수지상세포를 얻기 위한 체외 배양 방법을 새롭게 발견하여 완성한 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 “면역원성”이란, 포유동물에 투여되는 경우 및 특히 사람 개인에게 투여되는 경우, 면역 반응을 유도하거나 유지할 수 있는, 특히 면역 반응을 유도할 수 있는 성질을 의미한다.
상기 제조방법은 수지상세포 전구세포를 Flt3L이 포함된 배지에서 배양하여 수지상세포로 분화시키는 과정을 포함한다. 일 구현예에서, 상기 Flt3L이 포함된 배지에서 수지상세포를 배양하는 경우 일반적으로 널리 사용되는 GM-CSF (Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor)와 비교하여 면역원성 및 항종양 효능이 더 우수한 수지상세포가 만들어지는 것을 확인하였고, 따라서 본 발명의 제조방법에 따른 수지상세포 배양 배지에는 GM-CSF가 포함되어 있지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “Flt3L”이란, FMS-유사 티로신 키나아제 3 리간드 (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand)의 약어로, 새로운 혈관 형성 외에 조혈전구세포의 증식을 유도하여 조혈전구세포를 활성화시켜 면역세포의 수를 증가시키는 성장인자로서 기능을 하는 사이토카인을 의미한다. 상기 Flt3L은 인간 유래일 수 있으며, GenBank: AAA19825.1의 아미노산 서열을 가지는 단백질일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 Flt3L은 배지에 10 내지 1,000 ng/ml 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 일 구현예에서, 수지상세포를 10일 동안 배양하는 경우 상기 Flt3L은 100 ng/ml 농도로 포함된 배지를 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 배양은 5 내지 20일 동안 이루어질 수 있고, 바람직하게는 10일 동안 이루이질 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 인터류킨-33은 배양 개시일로부터 3 내지 7일째 되는 날 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 분화 단계에서 처리하는 것이 바람직하다. 상기 “분화 단계”란, 수지상세포 전구세포, 예를 들어 조혈 골수 간세포 (hematopoietic bone marrow progenitor cell)가 미성숙 수지상세포 또는 성숙한 수지상세포로 분화되는 모든 연속적인 단계를 지칭하는 의미로 사용되었다.
상기 “미성숙 수지상세포”는 분화 초기 단계에서 발견되는 것으로서, 성숙한 수지상세포와 마찬가지로 CD14와 같은 세포 표면 마커를 발현하지 않으며, HLA-DR, CD86, CD80, CD83 또는 CD40을 낮은 수준으로 발현하고, CD1a 및 CCR1, CCR2, CCR5 및 CXCR1을 통상적 수준으로 발현하는 수지상세포를 말한다. 미성숙 수지상세포의 분화는 다양한 신호를 수용하면서 개시되며, 이러한 분화는 수용되는 신호의 조합에 따라 완전한 분화 또는 부분적 분화에 이르게 된다. 미성숙 수지상세포는 발현되는 염증성 사이토카인의 수준이 낮기 때문에 T 세포와 접촉하여도 T 세포를 활성화 시킬 수 없다.
상기 “성숙 수지상세포”는 미성숙 수지상세포가 성숙화되어 형성된 세포를 의미하며, B 세포 및 T 세포 활성에 관여하는 세포 표면 마커, 예를 들어 MHC 클래스 I 또는 MHC 클래스 II (HLA-DR), 세포 부착인자 (CD54, CD18, CD11), 공동 자극 인자 (예를 들어, CD86, CD80, CD83 또는 CD40)가 미성숙 수지상세포에 비하여 높은 수준 또는 상대적으로 증가된 수준으로 발현하는 세포를 의미하며, 전형적으로 성숙 수지상세포는 CCR7 및 CXCR4을 높은 수준으로 발현한다. 성숙한 수지상세포는 전염증성 사이토카인 (proinflammatory cytokine)을 방출하며, 혼합림프구 반응 (mixed lymphocyte reaction)에서 원시 동종이계 T 세포 (allogeneic T cells) 및 동종동계 T 세포 (syngeneic T cells)의 증식의 증가 및/또는 기타 면역반응 관련 사이토카인의 발현 분비가 증가된 것을 특징으로 한다.
일 구현예에서, 상기 인터류킨-33은 배양 개시일로부터 5일째 되는 날 5 ng/ml의 농도로 처리한 경우 CD103+ 수지상세포 아군 형성 효과 및 항원 특이적 세포독성 T 세포의 분열 유도 효과가 가장 우수하였으나, 상기 특정된 시기 및 농도에 본 발명의 제조방법이 제한되는 것은 아니며, 인터류킨-33의 처리 시점 및 농도는 수지상세포 전구세포의 상태, 세포 수, 배양 환경 등에 따라 당업자에 의해 적절하게 조절될 수 있다. 따라서 상기 인터류킨-33은 적절한 농도로 처리될 수 있으며, 예를 들어 1 내지 25 ng/ml의 농도로 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 인터류킨-33의 처리 시점 및 농도는 전체 수지상세포 대비 CD103 양성 수지상세포의 수 비율이 30 내지 100%로 유도될 수 있는 시점에서 처리될 수 있다. 예를 들어, 고정된 배양 조건에서 5 ng/ml의 인터류킨-33을 배양 개시일을 기준으로 각각 2일, 3일, 4일, 5일, 6일, 7일 또는 8일째 되는 날 처리하였을 때, 3 내지 7일째 되는 날 처리한 경우에만 전체 수지상세포 대비 CD103 수지상세포의 수 비율이 30% 이상 유도된 경우, 상기 기간 중 어느 한 일자를 선택하여 인터류킨-33을 처리할 수 있으며, 바람직하게는 CD103 양성 수지상세포의 비율이 가장 높게 유도된 시점을 선택하여 인터류킨-33을 처리할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 제조방법은 전체 수지상세포 대비 CD103 양성 제1형 골수성유래 수지상세포 (cDC1) 수 비율을 70% 이상으로 유도할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 포함하는 면역항암치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 수지상세포는 IFN-γ(Interferon gamm)의 발현을 유도할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 수지상세포는 Fcgr3 (Fc receptor, IgG, low affinity III)의 발현이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 수지상세포는 CD38 (cluster of differentiation 38), CD61 (Integrin beta-3), 및 Tigit (T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현이 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 있어서, 상기 Fcgr3는 병원체의 식균작용, 면역 세포 분화 조절 등 숙주 방어에 중요한 역할을 한다. 상기 CD38은 자연살해세포 등 면역세포의 표면에 있는 당단백질이고, 상기 CD61은 혈소판, 백혈구 등에서 발현되는 분화 클러스터이다. 상기 TIGIT는 T세포 또는 자연살해세포에 존재하는 면역 수용체이다. 이들의 유전자 발현이 증가하는 것은 면역 효과가 우수하다는 것을 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역항암치료 방법을 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 포함하는 조성물의 면역항암치료 용도를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 면역항암치료 약제를 생산하기 위한 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포의 용도를 제공할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 상기 인터류킨-33을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역항암치료 방법을 제공할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 인터류킨-33은 생체 내에서 CD103 양성 수지상세포 새로 형성할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 인터류킨-33을 생체 내 주사하는 것은 적정 용량으로 진행될 수 있으며, 5 내지 500 μg/kg으로 투여할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 인터류킨-33의 생체 내 투약은 4 내지 11일간 매일 진행될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 인터류킨-33은 생체 내에서 새로 형성된 CD103 양성 수지상세포의 Fcgr3 (Fc receptor, IgG, low affinity III) 또는 Fcgr4 (Fc receptor, IgG, low affinity IV) 유전자의 발현을 증가시킬 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 있어서, 상기 인터류킨-33 처리 후 체외 제작 및 체내 수지상세포에서 유도된 CD103 양성 수지상세포에서 공통적으로 Fcgr3(Fc receptor, IgG, low affinity III)가 증가된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서 사용된 용어 “면역항암치료용 약학적 조성물”은 용어 “세포치료제”와 상호 교환적으로 사용될 수 있으며, 세포와 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가 (autologous), 동종 (allogenic) 또는 이종 (xenogenic) 세포를 체외에서 증식·선별하거나 여타한 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다. 미국은 1993년부터, 우리나라는 2002년부터 세포치료제를 의약품으로 관리하고 있다. 이러한 세포치료제는 크게 두 분야로 분류할 수 있으며, 그 첫 번째는 조직재생 혹은 장기기능 회복을 위한 “줄기세포 치료제”이고, 두 번째는 생체 내 면역반응의 억제 혹은 면역반응의 항진 등 면역반응 조절을 위한 “면역세포 치료제”이다.
한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다. 상기 부형제는 예를 들어, 희석제, 결합제, 붕해제, 활택제, 흡착제, 보습제, 필름-코팅 물질, 및 제어방출첨가제로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 서방형 과립제, 장용과립제, 액제, 점안제, 엘실릭제, 유제, 현탁액제, 주정제, 트로키제, 방향수제, 리모나아데제, 정제, 서방형정제, 장용정제, 설하정, 경질캅셀제, 연질캅셀제, 서방캅셀제, 장용캅셀제, 환제, 틴크제, 연조엑스제, 건조엑스제, 유동엑스제, 주사제, 캡슐제, 관류액, 경고제, 로션제, 파스타제, 분무제, 흡입제, 패취제, 멸균주사용액, 또는 에어로졸 등의 외용제 등의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 상기 외용제는 크림, 젤, 패치, 분무제, 연고제, 경고제, 로션제, 리니멘트제, 파스타제 또는 카타플라스마제 등의 제형을 가질 수 있으나, 주사제로 제형화하여 사용하는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 올리고당, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명에 따른 주사제에는 주사용 증류수, 0.9% 염화나트륨주사액, 링겔주사액, 덱스트로스주사액, 덱스트로스+염화나트륨주사액, 피이지 (PEG), 락테이티드 링겔주사액, 에탄올, 프로필렌글리콜, 비휘발성유-참기름, 면실유, 낙화생유, 콩기름, 옥수수기름, 올레인산에칠, 미리스트산 이소프로필, 안식향산벤젠과 같은 용제; 안식향산나트륨, 살리실산나트륨, 초산나트륨, 요소, 우레탄, 모노에칠아세트아마이드, 부타졸리딘, 프로필렌글리콜, 트윈류, 니정틴산아미드, 헥사민, 디메칠아세트아마이드와 같은 용해보조제; 약산 및 그 염 (초산과 초산나트륨), 약염기 및 그 염 (암모니아 및 초산암모니움), 유기화합물, 단백질, 알부민, 펩톤, 검류와 같은 완충제; 염화나트륨과 같은 등장화제; 중아황산나트륨 (NaHSO3) 이산화탄소가스, 메타중아황산나트륨 (Na2S2O5), 아황산나트륨 (Na2SO3), 질소가스 (N2), 에칠렌디아민테트라초산과 같은 안정제; 소디움비설파이드 0.1%, 소디움포름알데히드 설폭실레이트, 치오우레아, 에칠렌디아민테트라초산디나트륨, 아세톤소디움비설파이트와 같은 황산화제; 벤질알코올, 클로로부탄올, 염산프로카인, 포도당, 글루콘산칼슘과 같은 무통화제; 시엠시나트륨, 알긴산나트륨, 트윈 80, 모노스테아린산알루미늄과 같은 현탁화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, “약학적으로 유효한 양”은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효용량 수준은 환자 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 본 발명이 속하는 기술분야에 통상의 기술자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에게 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 피하 주사, 복강 투여, 정맥 주사, 근육 주사, 척수 주위 공간 (경막내) 주사, 설하 투여, 볼점막 투여, 직장 내 삽입, 질 내 삽입, 안구 투여, 귀 투여, 비강 투여, 피부 투여, 경피 투여 등에 따라 투여될 수 있고, 바람직하게는 피내 (intradermally), 절내 (intranodally), 피하, 정맥, 혹은 직접적으로 종양 내 (intratumorally)로 투여하는 방법이 있다. 하지만 아직 최적의 투여 경로는 확립되지 않았다.
본 발명의 약학적 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께 활성성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에서 “개체”란, 질병의 치료를 필요로 하는 대상을 의미하고, 보다 구체적으로는 인간 또는 비-인간인 영장류, 생쥐 (mouse), 쥐 (rat), 개, 고양이, 말, 및 소 등의 포유류를 의미한다.
본 발명에서 “투여”란, 임의의 적절한 방법으로 개체에게 소정의 본 발명의 조성물을 제공하는 것을 의미한다.
본 발명에서 “예방”이란 목적하는 질환의 발병을 억제하거나 지연시키는 모든 행위를 의미하고, “치료”란 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여에 의해 목적하는 질환과 그에 따른 대사 이상 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 (a)본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 포함하는 조성물이 수용된 제1용기; (b)종양 항원이 수용된 제2용기; 및 (c)상기 제1용기의 조성물 및 제2용기의 항원을 이를 필요로하는 개체에 투여하기 12 내지 48시간 전에 혼합할 것이 기재된 지시서를 포함하는 면역항암치료용 키트를 제공할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어 “종양 항원”이란, 면역 세포가 종양을 자기 세포가 아닌 이물질로 인식하게 하는 표식자 (marker)를 의미하는 것으로서, 이와 같이 항원으로 작용할 수 있는 것은 종양 (세포)의 변이 산물, 종양 (세포) 내 유전자 조절 이상에 의한 결과물과 발암성 바이러스 단백질 등이 있다. 종양 항원을 특이성에 따라 분류하면 종양 세포에서만 특이적으로 발현하는 종양 특이 항원 (tumor-specific antigens, TSAs)과 종양 관련 항원 (tumor-associated antigens, TAAs)으로 분류할 수 있다. 종양 특이 항원은 숙주에서 종양 특이적 면역 반응을 유도하지만, 종양 세포에서뿐만 아니라 정상세포에서도 발현되는 종양 관련 항원의 경우에는 관용성 (self-tolerance) 발현으로 숙주에서 종양 특이 면역 반응을 일으키지 못하는 경우가 있다.
상기 제1용기의 조성물 및 제2용기의 항원을 혼합하는 것은 수지상세포에 항원을 탑재하는 과정이다. 수지상세포에 항원을 탑재하는 방법으로, 일반적으로는 펩타이드, 단백질 및 자가유래/동종이계의 암세포를 사멸시켜 함께 배양하는 방법이 이용되고 있다. 짧은 합성 펩타이드 (8-15 aa)는 수지상세포 표면의 MHC 분자에 직접 탑재되는 반면에, 긴 합성 펩타이드 (28-35 aa), 단백질 및 암세포는 MHC 분자에 탑재되기 이전에 펩타이드로 처리되는 과정이 필요할 수 있다. 짧은 합성 펩타이드의 경우, TAA에 대한 CD8+ T 세포 에피토프 (epitope)를 임상시험에 이용하고 있는데 환자의 HLA 단상형 (haplotype)을 알아야 하고 특정 단상형에 결합할 수 있어야 한다. 긴 합성 펩타이드의 경우, 수지상세포 내에서 항원 처리 과정을 거치며 교차제시될 수 있어 CD8+ T 세포뿐만 아니라 CD4+ T 세포 반응도 유도할 수 있고 보다 장기적으로 항원을 제시할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태로서, 본 발명은 CD103 양성 수지상세포의 비율을 측정하는 단계를 포함하는, 수지상세포의 면역원성 평가 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 전체 수지상세포 대비 CD103 양성 수지상세포의 수 비율이 70% 이상인 경우 면역원성이 좋은 것으로 평가하는 단계를 더 포함할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 CD103 양성 수지상세포는 cDC1 (type 1 conventional DC)의 표지자로서, 본 발명의 일 실시예에서는 CD103+ 수지상세포 아군의 비율이 높을수록 항원 특이적 T 세포가 더 강하게 유도됨을 확인하였다.
본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실시예]
실시예 1. 체외 배양 수지상세포의 제조
마우스 뒷다리에서 골수세포를 분리한 후 20 ng/ml 농도의 GM-CSF 환경에서 배양하였다. 배양 2일차에 새로운 배양액으로 교환하여 첫 날을 기준으로 7일 동안 배양한 수지상세포를 GM-DC로 명명하였다. 이와 달리, 상기 GM-DC의 배양 3일차에 5 ng/ml의 IL-33을 처리한 수지상세포를 GM-33-DC로 명명하였다.
한편, 골수세포를 100 ng/ml 농도의 Flt3L 환경에서 10일간 배양하여 제작한 수지상세포의 경우, 이를 FL-DC라 명명하였다. 또한, 상기 FL-DC의 배양 3~7일차에 5 ng/ml의 IL-33를 첨가하여 배양한 수지상세포를 FL-33-DC로 명명하였다. GM-DC 및 GM-33-DC는 배양 7일차, FL-DC 및 FL-33-DC는 배양 10일차에 세포 분석을 수행하였다.
항암 효과의 확인을 위한 백신 투여용 수지상세포는 사용 하루 전에 항원에 해당되는 난백 알부민 (Ovalbumin, 이하 'OVA')을 처리한 뒤, 이를 종양모델 마우스에 투여하였다 (도 1의 모식도 참조).
실시예 2. FL-33-DC에서 CD103을 발현하는 아군의 증가 확인
상기 실시예 1 및 도 1에 따라 FL-33-DC 제작 시 CD103+ 제1형 골수성유래 수지상세포 (type 1 conventional DCs; 이하 'cDC1')가 가장 많이 유도되는 조건을 찾기 위해, FL-DC의 배양 과정에서 IL-33을 처리하는 날짜를 각기 달리한 뒤, 10일차에 수확하여 이를 분석하였다.
cDC1의 표지자인 XCR1 및 CD103을 확인한 결과, 도 2a 및 도 2b에 나타난 바와 같이 FL-DC 배양 3~7일차 때 IL-33을 처리할 경우 CD103+ cDC1의 비율이 크게 증가하였으며, 특히 5일차에 IL-33을 첨가한 경우 면역원성이 높은 CD103+ cDC1이 가장 많이 유도되는 것으로 나타났다 (도 2a). 따라서 하기 실시예의 FL-33-DC는 5일차에 IL-33이 처리된 세포를 사용하였다.
한편, 상기 실시예 1에서 제작한 GM-DC, GM-33-DC, FL-DC, 및 FL-33-DC에서 항종양 면역원성이 강한 CD103+ cDC1 비율을 분석하였다. GM-DC에서는 CD103+ cDC1이 거의 유도되지 않았으며, IL-33이 첨가된 GM-33-DC 또한 유의미하게 CD103+ cDC1 아군이 유도되지 않았다. 또한, FL-DC에서는 XCR1이 발현되었지만 CD103은 거의 발현되지 않았다. 이에 반해, FL-33-DC에서는 CD103+ cDC1이 전체 수지상세포의 75% 이상을 차지하였다 (도 2b).
상기 결과를 종합하면, Flt3L 환경하에 배양하면서, 배양 3일 내지 7일차에 IL-33을 처리한 경우 현저하게 높은 비율의 CD103+ 수지상세포 아군이 새로이 형성됨을 증명한 것이다.
실시예 3. FL-33-DC의 상승된 항원 특이적 T 세포 유도 효과
상기 실시예 2를 통해 FL-33-DC에서 CD103+ 수지상세포가 새롭게 유도되는 것을 확인하였다. 이에 본 발명자들은 기존의 방법인 FL-DC 제작 과정 중 GM-CSF를 첨가하는 경우에 CD103+ cDC1의 유도 여부를 FL-33-DC와 비교 확인하였다.
그 결과 도 3a 및 도 3b에 나타난 바와 같이, FL-DC 배양 5일차에 GM-CSF를 처리한 경우 (이하, FL-GM-DC로 명명함), FL-33-DC보다는 낮은 비율이지만 CD103+ cDC1가 60% 가량 유도되는 것을 확인하였다 (도 3a).
상기와 같은 변화가 수지상세포의 항원 제시 능력에 영향을 주었는지 분석하기 위하여, FL-DC, FL-GM-DC 및 FL-33-DC에 OVA 단백질을 처리하고 이를 OVA 항원 특이적 T 세포 수용체를 가진 OT-I 마우스 T 세포와 공배양한 뒤, OT-1 T 세포의 증식과 활성화 사이토카인 (cytokine) 중 하나인 IFN- γ의 발현을 조사하였다.
그 결과, FL-33-DC 및 FL-GM-DC는 FL-DC보다 OT-1 T 세포의 증식능이 높은 것으로 나타났다. 그러나, FL-33-DC가 IFN-γ를 효과적으로 유도하는 것과는 달리 FL-GM-DC는 IFN-γ를 유도하지는 못하였다 (도 3b).
상기와 같은 결과는 FL-33-DC 및 FL-GM-DC는 모두 CD103+ cDC1이 유도되나, FL-33-DC만이 T 세포에 대한 면역원성을 보임을 확인한 것이다.
실시예 4. FL-33-DC의 면역원성 관련 특이적 표지자 발현 확인
본 발명자들은 FL-33-DC에서 특이적으로 나타나는 면역원성과 관련된 표지자를 동정하기 위해, FL-DC, FL-GM-DC 및 FL-33-DC에 대한 전사체 분석을 진행하였다.
먼저, 각각의 수지상세포 (DC)는 특이적인 유전자 발현 패턴을 보이고 있었다 (도 4a). 이들 중 FL-33-DC에서 CD38, CD61, Tigit, 및 Fcgr3의 발현 수준이 특이적으로 높은 것을 발견하였고 (도 4b), 실제로 RNA을 분리한 후 RT-PCR을 수행한 결과도 상기 유전자들이 FL-33-DC에서 특이적으로 높게 발현되는 것을 확인하였다 (도 4c).
상기 네 유전자들을 유세포분석기를 통해 단백질 수준에서 이를 분석하였다.
그 결과 도 4d에서 나타난 바와 같이, FL-33-DC에서 CD38, CD61 및 Fcgr3이 상대적으로 높게 발현됨을 확인하였다. 상기 결과는 이러한 분자들을 포함하여 FL-33-DC가 FL-DC 및 FL-GM-DC와는 달리 면역원성 관련분자를 특이적으로 발현함으로써 T 세포 유도 및 활성화능을 높일 수 있음을 시사하는 것이다.
실시예 5. FL-33-DC의 현저한 종양 성장 억제 능력 확인
상기 실시예 3에서는 FL-33-DC가 FL-DC 및 FL-GM-DC보다 항원 특이적 T 세포 유도 및 활성화능이 유의미하게 높았음을 확인하였고, 상기 실시예 4에서는 FL-33-DC가 면역원성과 관련된 CD38, CD61 및 Fcgr3을 상대적으로 높게 발현한다는 것을 확인하였다. 따라서 이를 종양의 치료에도 응용이 가능한지 확인하기 위해 도 1의 모식도에 나타난 방법으로 제조한 수지상세포 백신을 EG.7 종양접종 마우스에, 종양 접종 후 3일 및 10일째 되는 날에 각각 피하로 주사한 뒤, 종양의 성장을 모니터링 하였다.
그 결과, 수지상세포를 투여하지 않은 대조군 및 FL-DC 백신을 투여한 군에 비해 FL-33-DC 백신을 투여한 군에서 유의미하게 종양 성장이 효과적으로 억제되는 것을 확인하였다 (도 5a). 한편, FL-33-DC와 유사하게 CD103+ cDC1을 유도하였던 FL-GM-DC는 종양 성장을 효과적으로 억제하지 못하였다 (도 5a). 또한, 기존 면역치료에 이용되고 있는 GM-DC는 FL-DC와 비슷한 효과를 나타내었으며, IL-33이 첨가된 GM-33-DC는 FL-33-DC와는 다르게 추가적인 치료 효과를 나타내지 않았다 (도 5a).
이와 더불어, 이들 수지상세포 (DC) 백신을 투여한 마우스에서 항종양면역을 분석한 결과, FL-33-DC 백신을 투여한 마우스에서 항종양면역이 가장 강력하게 유도됨을 확인하였다 (도 5b; CTL, 세포독성 T 림프구).
상기와 같은 결과는 FL-33-DC 백신의 향상된 종양 억제 효과가 항원 특이적인 세포독성 림프구 (CTL)를 효과적으로 유도하기 때문임을 확인한 것이다.
실시예 6. FL-33-DC의 폐 전이 종양 성장 억제 능력 확인
상기 실시예 5에서는 FL-33-DC 백신을 투여한 마우스에서 항종양면역이 가장 강력하게 유도됨을 보인 바, 폐 전이 모델에서도 응용이 가능한지 확인하였다. 도 1의 모식도에 나타난 방법으로 제조한 수지상세포 백신을 B16F10-OVA 폐 전이 모델에, 종양 접종 후 3일 및 10일째 되는 날에 각각 피하로 주사한 뒤, 16일차에 폐에서 결절 형성을 분석하였다.
그 결과, 수지상세포 투여한 군의 경우 기본적으로 수지상세포를 투여하지 않은 대조군에 비해 비해서 결절의 수가 유의미하게 감소하였다 (도 6a). 또한, FL-33-DC를 투여한 군의 경우, FL-DC에 비해 유의하게 결절 형성을 감소시켰다 (도 6a). 한편, FL-33-DC와 유사하게 CD103+ cDC1을 유도하였던 FL-GM-DC는 FL-33-DC보다는 결절 형성을 억제하지 못하였다 (도 6a).
이와 더불어, 이들 수지상세포 (DC) 백신을 투여한 마우스에서 항종양면역을 분석한 결과, 도 5b 결과와 유사하게 FL-33-DC 백신을 투여한 마우스에서 항종양면역이 가장 강력하게 유도됨을 확인하였다 (도 6b).
실시예 7. IL-33 투여를 통한 종양억제 및 체내 CD103 양성 수지상세포의 유도
본 발명자들은 마우스에 복강 내 IL-33 또는 GM-CSF를 투여 후, 비장 내에서 CD103 양성 수지상세포의 유도능 및 종양억제능을 분석하였다.
그 결과, 종양이 없는 마우스에 IL-33 또는 GM-CSF를 투여 시, 비장에서 CD103 양성 수지상세포가 새로 형성되었다 (도 7a). 하지만 종양모델에서 항종양면역 유도 시 IL-33에 의해서만 종양이 억제되었다 (도 7b). 종양모델의 비장에서 IL-33 또는 GM-CSF에 의해 두 마우스 군 모두 추가적인 CD103 양성 수지상세포가 유도되었으나 (도 7c), 항종양면역은 IL-33에 의해서만 강력하게 나타났다 (도 7d).
실시예 8. IL-33에 의해 유도된 체내 CD103 양성 수지상세포의 표지자 발굴
상기 실시예 7에서 IL-33과 GM-CSF 둘 다 CD103 양성 수지상세포를 유도할 수 있으나 항종양면역반응은 완전히 다르게 나타났다. 이에 둘 간의 차이를 나눌 수 있는 표지자 동정을 시도하였다.
그 결과, IL-33에 의해 유도되는 CD103 양성 수지상세포에서 GM-CSF와는 달리 Fcgr3 및 Fcgr4의 발현이 상대적으로 높게 나타났음을 확인할 수 있었다 (도 8).
결국, 본 발명의 FL-33-DC는 FL-DC 또는 FL-GM-DC와는 달리 CD38, CD61, 및 Fcgr3 등을 높게 발현시키고, 면역원성이 높은 CD103+ cDC1을 증가시키고, 이러한 분자들을 발현하는 CD103+ cDC1이 항원 특이적 세포독성 T 림프구를 효과적으로 유도함으로써 향상된 암 치료 효과를 나타냄을 실험적으로 규명한 것으로서, 면역항암치료용 세포치료제로서 널리 이용될 수 있을 것으로 생각된다.
또한, IL-33을 직접 투여하거나 체내 cDC1에서 Fcgr3 및 Fcgr4를 높일 수 있는 방안이 있다면 이 또한 면역치료에 이용 가능할 것으로 생각된다. 특히, Fcgr3는 IL-33에 의해 체외제작 및 체내 수지상세포 중 CD103+ cDC1에서 공통적으로 발현되므로 이 분자의 발현을 증강시킬 수 있다면 종양치료에 이용 가능할 것으로 생각된다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명은 인터류킨-33 (interleuin-33, IL-33)에 의해 새롭게 분화된 수지상세포 아군을 밝혀 내었으며, 상기와 같이 IL-33에 의해 분화된 수지상세포는 대조군 수지상세포보다 항원 특이적 세포독성 T 세포 유도능이 높았으며, 상기 수지상세포 아군에 의해 항종양면역이 강력하게 유도된 바, 수지상세포 분화 완료 후 면역원성을 높이는 기존의 방법과는 다르게 분화 단계에서 면역원성을 높일 수 있는 효과가 있으며, 본 발명의 제조방법 및 이를 이용한 체외 배양 수지상세포를 통해 치료 효과를 비약적으로 상승시킬 수 있는 새로운 면역세포 치료법을 제공할 수 있는 바, 산업상 이용가능성이 있다.

Claims (23)

  1. 수지상세포 전구세포를 Flt3L (FMS-like tyrosine kinase 3 ligand)이 포함된 배지에서 배양하여 수지상세포로 분화시킴에 있어서, 상기 수지상세포의 분화 단계에서 인터류킨-33 (Interleukin-33, IL-33)을 처리하는 단계를 포함하는, CD103 (cluster of differentiation 103) 양성 수지상세포의 제조방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 Flt3L은 배지에 10 내지 1,000 ng/ml의 농도로 포함되는 것을 특징으로 하는, CD103 양성 수지상세포의 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 5 내지 20일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, CD103 양성 수지상세포의 제조방법.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 배양은 10일 동안 이루어지는 것을 특징으로 하는, CD103 양성 수지상세포의 제조방법.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 인터류킨-33은 배양 개시일로부터 3 내지 7일째 되는 날 처리하는 것을 특징으로 하는, CD103 양성 수지상세포의 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 인터류킨-33은 1 내지 25 ng/ml의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는, CD103 양성 수지상세포의 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 인터류킨-33은 배양 개시일로부터 5일째 되는 날 5 ng/ml의 농도로 처리하는 것을 특징으로 하는, CD103 양성 수지상세포의 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 인터류킨-33은 전체 수지상세포 대비 30 내지 100% 수 비율의 CD103 양성 수지상세포가 유도될 수 있는 분화 단계의 일 시점에서 처리되는 것을 특징으로 하는, CD103 양성 수지상세포의 제조방법.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 제조방법은 전체 수지상세포 대비 CD103 양성 제1형 골수성유래 수지상세포 (cDC1) 수 비율을 70% 이상으로 유도하는 것을 특징으로 하는, CD103 양성 수지상세포의 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 수지상세포는 IFN-γ(Interferon gamm)의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는, CD103 양성 수지상세포의 제조방법.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 수지상세포는 Fcgr3 (Fc receptor, IgG, low affinity III)의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는, CD103 양성 수지상세포의 제조방법.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 수지상세포는 CD38 (cluster of differentiation 38), CD61 (Integrin beta-3), 및 Tigit (T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는, CD103 양성 수지상세포의 제조방법.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된, CD103 양성 수지상세포.
  14. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 포함하는, 면역항암치료용 약학적 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 수지상세포는 IFN-γ(Interferon gamm)의 발현을 유도하는 것을 특징으로 하는, 면역항암치료용 약학적 조성물.
  16. 제14항에 있어서,
    상기 수지상세포는 Fcgr3 (Fc receptor, IgG, low affinity III)의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는, 면역항암치료용 약학적 조성물.
  17. 제14항에 있어서,
    상기 수지상세포는 CD38 (cluster of differentiation 38), CD61 (Integrin beta-3), 및 Tigit (T cell immunoreceptor with Ig and ITIM domains)로 이루어지는 군으로부터 선택된 하나 이상의 유전자의 발현이 증가된 것을 특징으로 하는, 면역항암치료용 약학적 조성물.
  18. 하기 (a) 내지 (c)를 포함하는 면역항암치료용 키트:
    (a)제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 CD103 양성 수지상세포를 포함하는 조성물이 수용된 제1용기;
    (b)종양 항원이 수용된 제2용기; 및
    (c)상기 제1용기의 조성물 및 제2용기의 항원을 이를 필요로하는 개체에 투여하기 12 내지 48시간 전에 혼합할 것이 기재된 지시서.
  19. CD103 양성 수지상세포의 비율을 측정하는 단계를 포함하는, 수지상세포의 면역원성 평가 방법.
  20. 제19항에 있어서,
    상기 방법은 전체 수지상세포 대비 CD103 양성 수지상세포의 수 비율이 70% 이상인 경우 면역원성이 좋은 것으로 평가하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 수지상세포의 면역원성 평가 방법.
  21. CD103 양성 수지상세포를 포함하는 약학적 조성물을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는 면역항암치료 방법으로, 상기 CD103 양성 수지상세포는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 것을 특징으로 하는, 면역항암치료 방법.
  22. CD103 양성 수지상세포를 포함하는 조성물의 면역항암치료 용도로, 상기 CD103 양성 수지상세포는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 것을 특징으로 하는, 면역항암치료 용도.
  23. 면역항암치료 약제를 생산하기 위한 CD103 양성 수지상세포의 용도로, 상기 CD103 양성 수지상세포는 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항의 제조방법으로 제조된 것을 특징으로 하는, CD103 양성 수지상세포의 용도.
PCT/KR2021/016813 2020-11-17 2021-11-16 인터류킨-33을 처리하여 면역원성이 향상된 cd103+ fcgr3+ 수지상세포의 제조방법 및 상기 수지상세포를 포함하는 면역항암치료용 약학적 조성물 WO2022108306A1 (ko)

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