WO2021149971A1 - 신규 화합물 및 이의 용도 - Google Patents

신규 화합물 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2021149971A1
WO2021149971A1 PCT/KR2021/000555 KR2021000555W WO2021149971A1 WO 2021149971 A1 WO2021149971 A1 WO 2021149971A1 KR 2021000555 W KR2021000555 W KR 2021000555W WO 2021149971 A1 WO2021149971 A1 WO 2021149971A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
transplant rejection
transplantation
compound
present
immune
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/000555
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
양철우
신동윤
조미라
이선영
임선우
신유진
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
가천대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단, 가천대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Priority to US17/794,823 priority Critical patent/US20230095498A1/en
Publication of WO2021149971A1 publication Critical patent/WO2021149971A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D401/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom
    • C07D401/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, at least one ring being a six-membered ring with only one nitrogen atom containing three or more hetero rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/50—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines
    • A61K31/502—Pyridazines; Hydrogenated pyridazines ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. cinnoline, phthalazine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
    • A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection

Definitions

  • the present invention relates to novel compounds and their use for the treatment of immune diseases.
  • Immune diseases are diseases in which components of the mammalian immune system cause, mediate or otherwise contribute to the pathology of mammals.
  • inflammatory disorders are one of the most important health problems in the world.
  • Inflammation is generally a localized protective response of body tissues against host invasion by foreign substances or harmful stimuli. Inflammation can be caused by infectious causes such as bacteria, viruses, and parasites; physical causes such as burns or radiation; chemicals such as toxins, drugs or industrial agents; immune responses, such as allergies and autoimmune responses, or conditions associated with oxidative stress.
  • Inflammation is characterized by pain, redness, swelling, fever, and eventual loss of function of the affected area. These symptoms are the result of a complex series of interactions between cells of the immune system.
  • the cellular response results in an interactive network of several groups of inflammatory mediators: proteins (eg cytokines, enzymes (eg proteases, peroxidases), major basic proteins, adhesion molecules (ICAM, VCAM), lipid mediators (e.g., eicosanoids, prostaglandins, leukotriene, platelet activating factor (PAF)), reactive oxygen species (e.g., hydroperoxide, superoxide anion O2-, nitric oxide (NO) ) etc.)
  • proteins eg cytokines, enzymes (eg proteases, peroxidases), major basic proteins, adhesion molecules (ICAM, VCAM), lipid mediators (e.g., eicosanoids, prostaglandins, leukotriene, platelet activating factor (PAF
  • autoimmune disease which is one of the immune diseases, is characterized in that the immune system attacks its own organs and causes a spontaneous reaction. These responses are due to the recognition of auto-antigens by T lymphocytes, which provokes humoral (autoantigen production) and cellular (increased lymphocyte and macrophage cytotoxic activity) immune responses.
  • Autoimmune diseases include: rheumatoid disease, psoriasis, systemic dermatomyositis, multiple sclerosis, lupus erythematosus, or exacerbation of the immune response by an antigen, ie asthma, allergy to drugs or food, etc. These diseases are all limited and chronic diseases, in some cases fatal, and there is no effective treatment method for treating the diseases to date. Therefore, any drug, drug or medium capable of alleviating or alleviating the disease during the course of the disease will be an important solution for the health of the patient.
  • transplantation refers to the process of taking a cell, tissue, or organ, that is, a graft from one individual and transferring it to another individual.
  • the individual who provides the graft is called a donor, and the individual who receives it is called the recipient or host.
  • rejection occurs due to an immunological reaction to the histocompatibility antigen (transplant antigen) on the cell surface of the graft.
  • Transplant antigen histocompatibility antigen
  • Long-term engraftment of grafts from recipients who are not immunosuppressed is limited to those with complete or almost identical histocompatibility, and the genetic relationship between the donor and recipient is a factor that greatly influences the engraftment period of the graft.
  • rejection rarely occurs in autografts and isografts, but rejection occurs in almost all cases in allografts.
  • T cells The main mediator of transplant immune rejection is T cells, and T cell receptors recognize major histocompatibility complex (MHC) expressed in the graft, thereby inducing an immune response and rejecting the transplant. reaction will occur.
  • MHC major histocompatibility complex
  • immunosuppressants include glucocoticosteroids, azathioprine and mycophenolate mofetil, which block DNA synthesis to inhibit T cell proliferation, and calcineurin inhibitors. (calcineurin inhibitors) such as cyclosporine A and tacrolimus.
  • autoimmune diseases and transplant rejection are mainly based on the use of immunosuppressive drugs such as glucocorticoids, calcineurin inhibitors and antiproliferatives-antimetabolites.
  • immunosuppressive drugs such as glucocorticoids, calcineurin inhibitors and antiproliferatives-antimetabolites.
  • pharmacological therapy acts on various targets, it may decrease the immune function as a whole. Otherwise, when such pharmacological therapy is used for a long period of time, various cytotoxic effects become a problem, suppressing the immune system in a non-specific manner, thereby exposing the patient to the risk of contracting infections and cancer.
  • calcineurin and glucocorticoids present another problem due to their nephrotoxicity and diabetes-inducing properties, their use is limited in some clinical cases (eg renal insufficiency, diabetes, etc.).
  • An object of the present invention is to provide a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • Another object of the present invention is to provide an immunosuppressive agent comprising the above compound as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating immune diseases, comprising the above compound as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating an immune disease by administering to an individual an effective amount of a compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • Another object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for preventing or treating transplantation rejection reaction or transplant rejection disease, comprising the above compound as an active ingredient.
  • Another object of the present invention is to provide a method for preventing or treating a transplantation rejection reaction or a transplant rejection disease in which an effective amount of a compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof is administered to a subject. .
  • the present invention provides a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • the present invention provides an immunosuppressive agent comprising the above compound as an active ingredient.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of immune diseases, comprising the above compound as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating an immune disease by administering to an individual an effective amount of the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a transplantation rejection reaction or a transplant rejection disease, comprising the above compound as an active ingredient.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a transplantation rejection reaction or a transplant rejection disease by administering an effective amount of the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject.
  • the novel compound of the present invention is not toxic to the body and has excellent immunological control ability, and unlike conventional immunosuppressants, it has no renal toxicity and has a renal protective effect, so autoimmunity induced by abnormal regulation of various immune responses. It can be used for the treatment of immune diseases such as diseases, inflammatory diseases, and transplant rejection diseases.
  • the transplant rejection avatar animal model of the present invention increases serum creatinine and human CD4 positive cells, which are indicators of a patient's transplant rejection response. And it was confirmed that IL-17, an inflammatory cytokine, infiltrated into the kidney tissue of the animal model.
  • Figure 3 shows the inhibitory efficacy of ROS production in the HK-2 cell line of the SD911 compound of the present invention.
  • Figure 6a shows the ROS production inhibitory effect of the SD911 compound of the present invention in the HK-1 cell line.
  • 6b is a quantification of ROS production in the HK-1 cell line of the SD911 compound of the present invention.
  • Figure 7a shows the effect of the SD911 compound of the present invention to reduce apoptosis by tacrolimus (tacrolimus, Tac).
  • 7b is a quantification of the effect of the SD911 compound of the present invention on reducing apoptosis by tacrolimus.
  • FIG. 8 is a schematic diagram of the production process of the mouse animal model of the present invention.
  • 9A is a diagram illustrating the analysis of engraftment of human cells by flow cytometry in the mouse model of the present invention.
  • Figure 9b is a diagram analyzing the level of SCR in the mouse model of the present invention.
  • 10A is a view confirming the extent of damage to kidney tissue in a mouse model injected with normal PBMCs of the present invention.
  • 10B is a view confirming the extent of damage to kidney tissue in a mouse model injected with PBMC of a transplant rejection patient of the present invention.
  • FIG. 10c is a diagram illustrating quantification of kidney injury scores according to treatment with the immunosuppressant SD911 in a mouse model injected with normal PBMCs and a mouse model injected with PBMCs from transplant rejection patients of the present invention.
  • 11a is a diagram confirming human CD4-positive cell infiltration by immunochemical histology staining in a mouse model injected with normal PBMCs of the present invention.
  • 11B is a diagram confirming the infiltration of human CD4-positive cells by immunochemical histology staining in a mouse model injected with PBMC of a transplant rejection patient of the present invention.
  • Figure 11c is a quantification of the number of CD4 positive cells according to the treatment of the immunosuppressant SD911 in the mouse model injected with normal PBMCs of the present invention and PBMCs injected with transplant rejection patients.
  • 12a is a diagram confirming the infiltration of IL-17-positive cells by immunochemical histology staining in the mouse model injected with normal PBMCs of the present invention.
  • 12B is a diagram confirming the infiltration of IL-17-positive cells by immunochemical histology staining in a mouse model injected with PBMC of a transplant rejection patient of the present invention.
  • 12c is a quantification of the number of IL-17-positive cells following treatment with the immunosuppressant SD911 in a mouse model injected with normal PBMCs and a mouse model injected with PBMCs from transplant rejection patients of the present invention.
  • the present invention provides a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof:
  • the compound may be synthesized through a process as shown in the following scheme, but is not limited thereto:
  • the pharmaceutically acceptable salt may include an acid addition salt formed by a pharmaceutically acceptable free acid, and the free acid may be an organic acid or an inorganic acid.
  • the organic acids include citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, maleic acid, fumaric acid, formic acid, propionic acid, oxalic acid, trifluoroacetic acid, benzoic acid, gluconic acid, metasulfonic acid, glycolic acid, succinic acid, 4-toluenesulfonic acid, glutamic acid, aspartic acid, and the like.
  • the inorganic acid may include, but is not limited to, hydrochloric acid, hydrobromic acid, sulfuric acid, phosphoric acid, and the like.
  • the compound may have a renal protective effect, but is not limited thereto.
  • the compound may have an S1P lyase activity inhibitory ability, but is not limited thereto.
  • the present invention provides an immunosuppressive agent comprising the above compound as an active ingredient.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating immune diseases comprising the compound of the present invention or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the "immune disease” refers to a disease in which components of the mammalian immune system cause, mediate, or otherwise contribute to the pathology of the mammal.
  • any disease in which stimulation or interruption of an immune response has a compensatory effect on the progression of the disease may be included, and in the present invention, diseases caused by an overactive immune response may be included.
  • immune diseases include, but are not limited to, autoimmune diseases; or an inflammatory disease; and the like.
  • the immune diseases that can be prevented and treated in the present invention include rheumatoid arthritis, Behcet's disease, polymyositis or dermatomyositis, autoimmune cytopenia, autoimmune myocarditis, atopic dermatitis, asthma, primary liver cirrhosis, dermatomyositis, Goodfitzer's syndrome, Autoimmune meningitis, Sjogren's syndrome, lupus, Addison's disease, alopecia areata, ankylosing myelitis, autoimmune hepatitis, autoimmune mumps, Crohn's disease, insulin-dependent diabetes mellitus, dystrophic epidermolysis bullosa, epididymitis, glomerulonephritis, Graves disease, Guillain-Barré Syndrome, Hashimoto's disease, hemolytic anemia, multiple sclerosis, myasthenia gravis, pemphigus vulgaris, psoriasis, r
  • composition of the present invention may contain a pharmaceutically effective amount of the compound or extract alone or may contain one or more pharmaceutically acceptable carriers, excipients or diluents.
  • the pharmaceutically effective amount refers to an amount sufficient to prevent, improve and treat the symptoms of a disease.
  • pharmaceutically acceptable refers to a composition that is physiologically acceptable and does not normally cause gastrointestinal disorders, allergic reactions such as dizziness, or similar reactions when administered to humans.
  • carriers, excipients and diluents include lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, gum acacia, alginate, gelatin, calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinylpyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • fillers, anti-agglomeration agents, lubricants, wetting agents, fragrances, emulsifiers and preservatives may be further included.
  • compositions of the present invention may be formulated using methods known in the art to provide rapid, sustained or delayed release of the active ingredient after administration to a mammal.
  • Formulations may be in the form of powders, granules, tablets, emulsions, syrups, aerosols, soft or hard gelatin capsules, sterile injectable solutions, sterile powders.
  • the dosage of the active ingredient of the composition of the present invention may be appropriately selected according to various factors such as the route of administration, age, sex, weight and severity of the patient, and the composition according to the present invention prevents symptoms of osteoarthritis , it can be administered in combination with a known compound having an effect of improving or treating.
  • a suitable dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is variously prescribed depending on factors such as formulation method, administration method, age, weight, sex, pathological condition, food, administration time, administration route, excretion rate, and reaction sensitivity of the recipient.
  • the dosage of the pharmaceutical composition of the present invention is preferably 1 x 10 3 to 1 x 10 12 cells/kg per day.
  • the compound may be included in a concentration of 1 to 20 ⁇ M, for example, 1 to 15 ⁇ M, 1 to 10 ⁇ M, 1 to 5 ⁇ M, 2 to 20 ⁇ M, 5 to 20 ⁇ M Or it may be included in a concentration of 10 to 20 ⁇ M, but is not limited thereto.
  • the present invention provides a method for preventing or treating an immune disease by administering to an individual an effective amount of the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • the treatment method of the present invention comprises administering the pharmaceutical composition to a subject in a therapeutically effective amount.
  • a specific therapeutically effective amount for a particular subject will depend on the type and extent of the response to be achieved, the specific composition, including whether other agents are used, if necessary, the subject's age, weight, general health, sex and diet, administration time, It is preferable to apply differently depending on various factors including the route of administration and secretion rate of the composition, the duration of treatment, the drug used together with or concurrently with the specific composition, and similar factors well known in the pharmaceutical field. Therefore, the effective amount of the composition suitable for the purpose of the present invention is preferably determined in consideration of the foregoing.
  • the subject is applicable to any mammal, and the mammal includes not only humans and primates, but also domestic animals such as cattle, pigs, sheep, horses, dogs and cats.
  • the present invention also provides a pharmaceutical composition for preventing or treating a transplantation rejection reaction or a transplant rejection disease, comprising the above compound as an active ingredient.
  • the transplant rejection reaction may be one or more types of transplant rejection reaction selected from the group consisting of cells, blood, tissue and organs, preferably organ transplant rejection, but is not limited thereto. does not
  • the transplant rejection reaction is at least one transplant rejection selected from the group consisting of bone marrow transplantation, heart transplantation, corneal transplantation, intestinal transplantation, liver transplantation, lung transplantation, pancreatic transplantation, kidney transplantation, and skin transplantation. It may be a reaction, preferably a kidney transplant rejection reaction, but is not limited thereto.
  • the transplant rejection disease may be graft-versus-host disease (GVHD) or post transplantation late and chronic solid organ rejection. , but not limited thereto.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • post transplantation late and chronic solid organ rejection , but not limited thereto.
  • the present invention provides a method for preventing or treating a transplantation rejection reaction or a transplant rejection disease by administering an effective amount of the compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof to a subject.
  • the present invention provides a humanized transplant rejection animal model in which immunodeficient mice are administered with PBMCs (peripheral blood mononuclear cells) derived from transplant rejection patients.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • transplantation rejection refers to the rejection of organ transplantation in response to the recipient's immune system recognizing the transplanted tissue as non-self, attacking the transplanted organ and removing it.
  • MHC major histocompatibility complex
  • Rejection involves both cell-mediated immune response and humoral immune response.
  • the recipient's lymphocytes meet the donor MHC of the transplanted organ (CD4 T cell-type II MHC molecule, or CD8 T cell-type I MHC molecule) to initiate.
  • Activated T cells secrete cytokines, increase vascular permeability, and cause infiltration of monocytes such as macrophages. As a result, damage to microvessels, tissue ischemia, and destruction of graft tissue and cells occur.
  • the transplant rejection reaction is at least one transplant rejection reaction selected from the group consisting of cells, blood, tissue and organs, and preferably bone marrow transplantation, heart transplantation, corneal transplantation, intestinal transplantation, liver transplantation, lung transplantation, pancreatic transplantation, and kidney transplantation. At least one selected from the group consisting of graft and skin graft rejection, but is not limited thereto.
  • the PBMC derived from the transplant rejection patient may be administered at a concentration of 1 to 5 x 10 6 , preferably 5 x 10 6 , but is not limited thereto.
  • the derived mouse is not limited, and general laboratory mice, immunodeficient mice, and the like may be used.
  • immunodeficient mouse means a mouse characterized by one or more of the following lists: defects in functional immune cells such as T cells and B cells; DNA repair defects; defects in the rearrangement of genes encoding antigen-specific receptors in lymphocytes; and defects in immune function molecules such as IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 and IgA.
  • immunodeficient mice can be characterized by a deficiency in one or more genes, such as Rag1 and Rag2, involved in immune function (Oettinger et al, Science, 248:1517-1523, 1990; and Schatz et al, Cell, 59:1035-1048, 1989), immunodeficient mice may have these or other defects that result in abnormal immune function in the mouse.
  • Particularly useful immunodeficient mouse strains include NOD, Cg-PrkdcscidIl2rgtml Wjl/SzJ, commonly referred to as NOD scid gamma (NSG) mice, as detailed in Shultz et al., J Immunol, 174: 6477-6489, 2005. and NOD.Cg-Rag1tmlMoml12rgtml Wjl/SzJ, which generally refers to NRG mice (Shultz et al, Clin Exp Immunol, 154(2):270-284, 2008).
  • NRG NOD scid gamma
  • serum creatinine may be increased compared to the reference value of the control group.
  • human CD4-positive cells in the animal model, may be increased compared to the reference value of the control group.
  • the infiltration of the inflammatory cytokine IL-17 into tissue cells may be increased compared to the reference value of the control group.
  • the transplant rejection reaction may be rejection by a kidney transplant.
  • the present invention also provides a method for constructing a humanized transplant rejection animal model, comprising injecting PBMC isolated from transplant rejection patients into immunodeficient mice.
  • the step of injecting the PBMC may be performed 1 to 5 times for 0 to 4 weeks.
  • the present invention provides a method for screening a transplant rejection therapeutic agent, comprising the step of treating a candidate material in the humanized transplant rejection response animal model.
  • immunosuppressant used in the present invention is a drug that reduces or inhibits the body's immune system activity, largely steroids, cell proliferation inhibitors, antibody preparations, drugs acting on immunophilin, mycophenolate, tumor necrosis factor It is a drug classified as a (TNF- ⁇ ) inhibitor.
  • Immunosuppressive drugs administered to patients with many immune diseases as well as transplant surgery have a problem that causes various side effects in the body.
  • side effects are unavoidable in order to suppress immune rejection.
  • Immunosuppressive agents have to be prescribed even in consideration of the possibility that they may occur. Therefore, in transplant rejection, it is important to screen for an appropriate immunosuppressant agent according to the recipient's immune system.
  • the candidate substance may be an immunosuppressant, and the immunosuppressant is SD911, tacrolimus, cyclosporine A, prodnisolone, methylpredisolone. Any selected from the group consisting of ), deflazacort, mycophenolic acid, azathioprine, mizoribine, sirolimus and everolimus may be one.
  • the SD911 may be represented by the formula (1).
  • the candidate substance may decrease creatinine in serum.
  • the candidate substance may reduce human CD4-positive cells.
  • the candidate substance may be to reduce the infiltration of the inflammatory cytokine IL-17 into tissue cells.
  • the human kidney-2 cell line used in this experiment was purchased from ATCC (Manassas, VA, USA). These cells were cultured in Dulbecco's modified Eagle's medium (DMEM; Wisent) containing 10% fetal bovine serum (FBS; Wisent, St. Bruno, Que, Canada), 100 U/mL penicilllin and 100 mg/mL streptomycin (Wisent). % CO 2 , and incubated at 37° C.
  • DMEM Dulbecco's modified Eagle's medium
  • FBS fetal bovine serum
  • streptomycin Wisent
  • the cytoprotective effect of the SD911 compound was investigated under the induction of HK-2 cytotoxicity by tacrinimus (Tac).
  • tacrinimus As can be seen in FIG. 1 , compared to Nil, SD911 at concentrations of 1, 5, 10, and 20 ⁇ M did not have its own drug toxicity. When Nil was 100%, tacrinimus (Tac) showed a survival rate of 56.7%, but when 1, 5, and 10 ⁇ M SD911 was combined with tacrinimus (Tac), 81.7%, 81.8%, and 72.0, respectively.
  • Cell culture for ELISA was coated with 250 ul of mouse anti-CD3 antibody diluted in ccPBS at 0.5 ⁇ g/ml in a 24-well plate as much as the condition number. After incubation for 2 hours, the supernatant was removed and the cells were seeded at 1 X 10 6 /cells/1 ml and treated with each drug. After culturing for 3 days, only the cell culture medium was removed and used as IL-10 and IL-17 ELISA samples.
  • the SD911 compound which is an SPL (S1P lyase) inhibitor, showed about 30% reduced S1P (Sphingosine 1-phosphate) lyase activity, confirming that S1P lyase activity inhibitory power.
  • SPL S1P lyase
  • the SD911 compound has the ability to inhibit SPL activity, so it can be applied to the treatment of diseases related to abnormal immune activity.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells derived from normal or transplant rejection patients were intravascularly administered to 8-10 week-old immunodeficient mice (NSG) at 5x10 ⁇ 6/mice. After injection, engraftment of cells from normal persons or transplant rejection patients (renal transplant rejection patients) was confirmed in blood cells 3 weeks after injection. Thereafter, the mice were sacrificed 4 weeks after cell transplantation to confirm the infiltration of human cells and histological changes in the tissue ( FIG. 8 ).
  • Example 8 In order to confirm that the avatar model mimicking the transplant rejection response patient in Example 8 was properly constructed, engraftment of human cells was analyzed through flow cytometry. Specifically, blood was obtained from the transplant rejection humanized mice of Example 1 (normal PBMC injection group, HC; transplant rejection patient PBMC injection group, Patient), and then cells reacted with human antibodies to analyze positive cells. In addition, the blood creatine (SCR) concentration was measured as an index for measuring kidney damage in PBMC-injected mice of normal subjects and transplant rejection patients. SCR was measured by the quantitative enzymatic colorimetric method (Stanbio laboratory, 0430-120) by separating animal blood serum.
  • SCR serum creatine
  • the transplant rejection humanized mouse model established in Example 8 was described as 1) a normal PBMC-injected group, 2) a normal PBMC-injected group, treated with an immunosuppressant agent, 3) a transplant-rejected patient PBMC-injected group, and 4) Transplant rejection patients were classified into the immunosuppressant-treated group in the PBMC injection group, and SD911 was used as the immunosuppressant.
  • the animal model of Example 8 was treated with SD911 at 3 weeks after PBMC engraftment, and the same amount of physiological saline as a control. One week after drug treatment, the mice were sacrificed, the kidneys were removed, and the degree of tissue damage was checked.
  • GN score membrane glomerulonephritis score
  • IN score renal interstitial nephritis score
  • Vasculitis an indicator of the degree of infiltration of immune cells around blood vessels
  • FIGS. 10A and 10B it was confirmed that the group injected with transplant rejection patients PBMC showed a significant increase in renal tissue damage than the group injected with normal PBMC.
  • FIGS. 10B and 10C it was confirmed that when the immunosuppressant SD911 was administered to the transplant-rejected patient PBMC-injected group, the damage to the kidney tissue was reduced.
  • CD4+T a human immune cell subtype
  • Example 10-1 immunohistochemical staining was performed. After the extracted tissue was fixed with formalin, it was embedded in paraffin to produce a 5 ⁇ m thick section. In order to observe immune cells in the tissue, immunohistochemical analysis was performed by reacting with human CD4 antibody on the section slide.
  • Example 10-1 In order to confirm that IL-17, an inflammatory cytokine, in the kidney tissue extracted in Example 10-1 was infiltrated, immunohistochemical staining was performed. After the extracted tissue was fixed with formalin, it was embedded in paraffin to generate a 5 ⁇ m thick section. In order to observe the immune cells in the tissue, immunohistochemical analysis was performed by reacting with human IL-17 antibody on the section slide.
  • the novel compound of the present invention has excellent immunological control ability without being toxic to the body, and unlike conventional immunosuppressants, it has no renal toxicity and rather has a renal protective effect, which is caused by abnormal regulation of various immune responses. It can be used for the treatment of immune diseases such as autoimmune diseases, inflammatory diseases, and transplant rejection diseases, and the transplant rejection avatar animal model of the present invention has an increase in serum creatinine, which is an indicator of a patient's transplant rejection response, and human CD4 positivity. It was confirmed that the cells were increased and IL-17, an inflammatory cytokine, was infiltrated into the kidney tissue of the animal model, confirming that it was humanized.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Rheumatology (AREA)
  • Pain & Pain Management (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Abstract

본 발명은 신규 화합물 이의 용도에 관한 것으로서, 본 발명의 신규한 화합물은 체내에 독성을 나타내지 않으면서도 면역학적 조절 능력이 우수하며, 종래 면역억제제와 달리 신장독성이 없고 오히려 신장 보호 효과를 가지고 있어, 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환 치료를 위한 용도로 사용될 수 있으며, 본 발명의 이식 거부 반응 아바타 동물모델은, 환자의 이식거부 반응의 지표인 혈청 크레아티닌의 증가, 인간 CD4 양성세포가 증가하고, 염증성 사이토카인인 IL-17이 동물모델의 신장 조직 내에 침윤한 것을 확인하여, 인간화 된 것을 확인하였다. 또한, 면역억제제의 투여에 따라, 증가된 혈청 크레아티닌, 인간 CD4 양성세포 및 염증성 사이토카인 IL-17의 침윤이 감소하는 것을 확인하여, 효과적으로 환자의 면역상태가 반영된 동물모델이 제작되고, 이에 따른 면역억제제의 효과를 확인하였다.

Description

신규 화합물 및 이의 용도
본 발명은 신규 화합물 및 이의 면역질환 치료 용도에 대한 것이다.
면역질환은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환으로서, 특히 염증성 장애는 전 세계에서 가장 중요한 건강 문제 중 하나이다. 염증은 일반적으로 외부 물질 또는 해로운 자극에 의한 숙주 침입에 대해 신체 조직의 국소화된 보호 반응이다. 염증의 원인은 박테리아, 바이러스 및 기생충과 같은 감염성 원인; 화상 또는 방사선 조사와 같은 물리적 원인; 독소, 약물 또는 산업적 제제와 같은 화학약품; 알레르기 및 자가면역 반응과 같은 면역적 반응, 또는 산화성 스트레스와 연관된 상태일 수 있다.
염증은 통증, 적화현상, 부기, 열 및 감염된 영역의 궁극적인 기능 손실을 그 특징으로 한다. 이들 증상은 면역계의 세포사이에서 일어나는 일련의 복잡한 상호작용의 결과이다. 세포의 반응으로 인해 결과적으로 여러 그룹의 염증 매개자의 상호작용 네트워크가 생성된다: 단백질(예를 들면, 사이토카인, 효소(예를 들면 프로테아제, 퍼옥시다제), 주요 염기성 단백질, 점착 분자(ICAM, VCAM), 지질 매개자(예를 들면, 에이코사노이드, 프로스타글란딘, 류코트라이엔, 혈소판 활성화 인자(PAF)), 반응성 산소 종(예를 들면, 하이드로퍼옥사이드, 슈퍼옥사이드 음이온 O2-, 산화질소(NO) 등). 그러나 염증의 이들 매개자중 대부분은 또한 정상적인 세포 활성의 조절자이다. 따라서 염증 반응의 결핍으로 인해 숙주가 제어되지 않으면서 손상(즉, 감염)되고, 따라서 만성 염증으로 인해 부분적으로는 상기 언급된 매개자중 여럿이 과다 생성됨으로써 매개되는 염증성 질환이 야기된다.
또한, 면역질환 중 하나인 자가면역 질환은 면역 체계가 그 자신의 기관을 공격하여 자발적인 반응을 일으키는 것을 특징으로 한다. 이러한 반응들은 T 림프구에 의한 자가항원(auto-antigen)의 인식에 기인하며, 이로 인하여 체액상(자가항원 생성) 및 세포상 (림프구 및 대식세포 세포독성 활성 증가) 면역 반응이 유발된다. 자가면역 질환으로서는 다음과 같은 것들을 들 수 있다: 류마티스성 질환, 건선, 전신성 피부근염, 다발성 경화증, 홍반성 낭창, 또는 항원에 의한 면역반응 악화, 즉, 천식, 약물 또는 음식에 대한 알레르기 등. 이러한 질환들은 모두 제한성이고 만성인 질환들이며, 경우에 따라서는 치명적이고, 현재까지 상기 질환들을 치료할 수 있는 효과적인 치료 방법이 존재하지 않는 실정이다. 그러므로 당해 질환의 진행 중에 질환을 경감시키거나 완화시킬 수 있는 약물, 의약 또는 매체라면 환자의 건강을 위해서 중요한 해결 수단이 된다고 할 것이다.
한편, 이식(transplantation)이란 한 개체로부터 세포나 조직 혹은 기관, 즉 이식편(graft)를 취하여 다른 개체로 이를 전이시키는 과정을 말한다. 이식편을 제공한 개체를 공여자(donor)라 하며, 이를 받는 개체를 수용자(recipient) 혹은 숙주(host)라고 한다. 이식된 장기의 경우에는 이식편의 세포표면에 있는 조직적합성항원(이식항원)에 대하여 면역학적 반응에 의해 거부반응이 발생한다. 면역 억제되지 않은 수용자에서 이식편이 장기간 생착되는 경우는 조직적합성이 완전히 일치하거나 대부분이 일치할 때에 한하며, 공여자와 수용자간의 유전학적 관계가 이식편의 생착기간을 크게 좌우하는 인자가 된다. 일반적으로 자가이식(autograft)과 동계이식(isograft)에서는 거의 거부반응이 발생하지 않으나, 이종이식(allograft)에서는 거의 대부분에서 거부반응이 발생한다.
성공적인 장기 이식을 위해서는 이식할 세포 및 장기에 대한 수혜자의면역 거부반응을 극복해야 한다.
이식면역 거부반응의 주요 매개체는 T 세포로서, 이식편(graft)에 발현되어져 있는 주조직적합성분자(major histocompatibility complex, MHC)를 T 세포 수용체(T cell receptor)가 인지함으로써 면역반응이 유도되어 이식 거부반응이 발생하게 된다.
최근 외과적 시술 및 HLA 유형(type) 판독기법의 발달과 면역억제제의 개발에 의해 이식 성공률은 높아졌지만 여전히 면역거부반응과 면역억제제의 부작용에 의한 사망률이 높아 효과적이고 안전한 새로운 면역억제제의 개발이 요구되고 있다. 기존에 사용하고 있는 모든 면역억제제들의 공통된 목적은 이식편에 대한 T 세포-매개 면역반응을 억제하는 것으로서, 임상적으로 이식 후 T 세포-매개 급성거부반응을 막기 위해 매일 비특이적 면역억제제가 투여된다(Pirsch, J. D., curr. opin. organ. transplant., 2, 76-81, 1997). 일반적으로 사용되는 면역억제제는 글루코코티코스테로이드(glucocoticosteroids)을 포함하여 DNA 합성을 차단하여 T 세포의 증식을 억제하는 아자치오프린(azathioprine)과 미코페놀레이트 모페틸(mycophenolate mofetil)이 있으며, 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor)인 사이크로스포린 A(cyclosporine A)와 타크로리무스(tacrolimus) 등이 있다.
이들 약재는 비록 장기이식을 수혜 받은 환자의 면역거부반응을 극복하는데 많은 발전을 이루었지만 치료효과가 일시적이고 높은 독성이 나타나는 문제점을 가지고 있다. 따라서 이식 거부 반응을 억제하기 위한 면역억제제의 개발도 중요하지만 뚜렷한 치료 효과를 보이는 면역억제제의 개발이 미흡한 현 시점에서 면역억제제의 투여로 인해 발생하는 부작용을 최소화 시킬 수 있는 가장 효과적이면서도 빠른 방법은 환자의 면역체계와 적합한 면역억제제를 투여하는 것이다.
그러나 이식 받은 환자에게, 환자 체내에서의 면역 상태를 확인하여, 면역 상태에 따른 면역억제제를 처리할 수 있는 방법이 개발된다면 면역억제제로 인한 환자의 고통을 감소시킬 수 있을 것이다.
자가면역 질환 및 이식 거부 반응의 치료방법을 탐색하여 적당한 약물과 방법을 찾고자 집중적인 노력을 해왔다. 오늘날, 자가면역 질환 및 이식 거부 반응의 치료는 주로 면역억제 약물, 예컨대 글루코코르티코이드(glucocorticoids), 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitors) 및 증식억제제-대사물 작용 억제제(antiproliferatives-antimetabolites)의 사용에 근거한 것이다. 그러나 이와 같은 약리 요법은 다양한 표적들에 대하여 작용하므로, 전체적으로는 면역기능을 저하시킬 수 있다. 그렇지 않으면, 이러한 약리 요법을 장기간 사용하였을 경우 여러 가지 세포 독성 작용이 문제가 되어, 면역 체계를 비특이적인 방식으로 억제함으로써, 환자를 감염증 및 암에 걸릴 위험에 노출시킬 수 있다. 칼시뉴린과 글루코코르티코이드는, 그들의 신독성과 당뇨병 유발 특성에 기인하여 또 다른 문제점을 나타내기 때문에, 몇 가지 임상학적 증상의 경우(예: 신기능 부전, 당뇨병 등)에는 그 사용이 제한된다.
따라서 자가면역질환, 이식 거부 반응, 염증성 질환 등과 같은 면역질환을 치료할 수 있는 물질로서, 부작용이 없으면서도 치료 효과가 우수한 새로운 면역질환 치료제의 개발이 필요하고, 환자 체내에서의 면역 상태를 확인하여, 면역 상태에 따른 면역억제제를 처리할 수 있는 방법의 개발이 필요한 실정이다.
본 발명의 목적은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공하는 것이다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021000555-appb-I000001
본 발명의 다른 목적은 상기의 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역억제제를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기의 화합물을 유효성분으로 포함하는, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효한 양을 개체에 투여하는 면역질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 상기의 화합물을 유효성분으로 포함하는, 이식 거부(transplantation rejection) 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은, 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효한 양을 개체에 투여하는 이식 거부(transplantation rejection) 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021000555-appb-I000002
또한, 본 발명은 상기의 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역억제제를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 화합물을 유효성분으로 포함하는, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효한 양을 개체에 투여하는 면역질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기의 화합물을 유효성분으로 포함하는, 이식 거부(transplantation rejection) 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효한 양을 개체에 투여하는 이식 거부(transplantation rejection) 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 신규한 화합물은 체내에 독성을 나타내지 않으면서도 면역학적 조절 능력이 우수하며, 종래 면역억제제와 달리 신장독성이 없고 오히려 신장 보호 효과를 가지고 있어, 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환 치료를 위한 용도로 사용될 수 있으며, 본 발명의 이식 거부 반응 아바타 동물모델은, 환자의 이식거부 반응 지표인 혈청 크레아티닌의 증가, 인간 CD4 양성세포가 증가하고, 염증성 사이토카인인 IL-17이 동물모델의 신장 조직 내에 침윤한 것을 확인하였다. 또한, 면역억제제의 투여에 따라, 증가된 혈청 크레아티닌, 인간 CD4 양성세포 및 염증성 사이토카인 IL-17의 침윤이 감소하는 것을 확인하였다. 따라서, 효과적으로 환자의 면역상태가 반영된 동물모델이 제작되고, 이에 따른 면역억제제의 효과를 확인할 수 있어, 관련 산업에 유용하게 이용할 수 있다.
도 1은 본 발명의 SD911 화합물의 세포 보호 효과를 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 SD911 화합물의 면역세포에 대한 독성 검사 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 본 발명의 SD911 화합물의 HK-2 세포주에서의 ROS 생산 억제 효능을 나타낸 것이다.
도 4는 본 발명의 SD911 화합물의 면역학적 조절력을 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 본 발명의 SD911 화합물의 S1P lyase 활성 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6a은 본 발명의 SD911 화합물의 HK-1 세포주에서의 ROS 생산 억제 효과를 나타낸 것이다.
도 6b는 본 발명의 SD911 화합물의 HK-1 세포주에서의 ROS 생산을 정량화 한 것이다.
도 7a은 본 발명의 SD911 화합물이 타크로리무스(tacrolimus, Tac)에 의한 세포 사멸 감소 효과를 나타낸 것이다.
도 7b는 본 발명의 SD911 화합물이 타크로리무스에 의한 세포 사멸 감소 효과를 정량화 한 것이다.
도 8은 본 발명의 마우스 동물모델의 제작 과정을 도식화한 것이다.
도 9a는 본 발명의 마우스 모델에서, 인간세포의 생착을 유세포분석으로 분석한 도이다.
도 9b는 본 발명의 마우스 모델에서, SCR의 수준을 분석한 도이다.
도 10a은 본 발명의 정상인 PBMC 주입한 마우스 모델에서, 신장 조직 손상 정도를 확인한 도이다.
도 10b는 본 발명의 이식 거부 반응 환자 PBMC 주입한 마우스 모델에서, 신장 조직 손상 정도를 확인한 도이다.
도 10c는 본 발명의 정상인 PBMC 주입한 마우스 모델 및 이식 거부 반응 환자 PBMC 주입한 마우스 모델에서 면역억제제인 SD911의 처리에 따른 신장 손상 점수 정량화한 도이다.
도 11a는 본 발명의 정상인 PBMC 주입한 마우스 모델에서 인간 CD4 양성세포 침윤을 면역화학조직염색으로 확인한 도이다.
도 11b는 본 발명의 이식 거부 반응 환자 PBMC 주입한 마우스 모델에서 인간 CD4 양성세포 침윤을 면역화학조직염색으로 확인한 도이다.
도 11c는 본 발명의 정상인 PBMC 주입한 마우스 모델 및 이식 거부 반응 환자 PBMC 주입한 마우스 모델에서 면역억제제인 SD911의 처리에 따른 CD4 양성세포 수를 정량화한 것이다.
도 12a는 본 발명의 본 발명의 정상인 PBMC 주입한 마우스 모델에서 IL-17 양성세포 침윤을 면역화학조직염색으로 확인한 도이다.
도 12b는 본 발명의 본 발명의 이식 거부 반응 환자 PBMC 주입한 마우스 모델에서 IL-17 양성세포 침윤을 면역화학조직염색으로 확인한 도이다.
도 12c는 본 발명의 정상인 PBMC 주입한 마우스 모델 및 이식 거부 반응 환자 PBMC 주입한 마우스 모델에서 면역억제제인 SD911의 처리에 따른 IL-17 양성세포 수를 정량화한 것이다.
이하 첨부된 도면을 참조하여 본 발명의 실시예들을 상세히 설명한다. 이하의 설명에 있어, 당업자에게 주지 저명한 기술에 대해서는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 발명을 설명함에 있어서, 관련된 공지 기능 또는 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 그 상세한 설명을 생략할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 사용되는 용어(terminology)들은 본 발명의 바람직한 실시예를 적절히 표현하기 위해 사용된 용어들로서, 이는 사용자, 운용자의 의도 또는 본 발명이 속하는 분야의 관례 등에 따라 달라질 수 있다.
따라서 본 용어들에 대한 정의는 본 명세서 전반에 걸친 내용을 토대로 내려져야 할 것이다. 명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
이하에서는 도면을 참조하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 제공한다:
[화학식 1]
Figure PCTKR2021000555-appb-I000003
상기 화합물은 하기 반응식에 도시된 바와 같은 공정을 통해 합성될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다:
Figure PCTKR2021000555-appb-I000004
상기 약학적으로 허용가능한 염은 약학적으로 허용 가능한 유리산(free acid)에 의하여 형성된 산 부가염을 포함할 수 있으며, 상기 유리산은 유기산과 무기산을 사용할 수 있다. 상기 유기산은 구연산, 초산, 젖산, 주석산, 말레인산, 푸마르산, 포름산, 프로피온산, 옥살산, 트리플로오로아세트산, 벤조산, 글루콘산, 메타술폰산, 글리콜산, 숙신산, 4-톨루엔술폰산, 글루탐산, 아스파르트산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 또한 상기 무기산은 염산, 브롬산, 황산, 인산 등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화합물은 신장 보호 효능을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 화합물은 S1P lyase 활성 억제력을 갖는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 상기의 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역억제제를 제공한다.
타크리니무스 등과 같은 종래의 면역억제제는 신장 독성이 있어 장기간 복용에 문제가 있으나, 본 발명의 신규한 화합물은 신장 보호 효능을 가지고 있어, 부작용이 없는 면역억제제로서 사용될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 본 발명의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 대한 것이다.
본 발명에서 상기 "면역질환"은 포유류 면역계의 구성성분들이 포유류의 병리상태를 야기하거나, 매개하거나 또는 기타 공헌하는 질환을 의미한다. 또한, 면역 반응의 자극 또는 중단이 그 질병의 진행에 보상적인 효과를 갖는 질환을 모두 포함할 수 있는데, 본 발명에서는 과민성 면역반응으로 인해 야기되는 질환들을 포함할 수 있다. 이러한 면역질환의 예로는 이에 제한되지는 않으나, 자가면역질환; 또는 염증성질환;등을 모두 포함할 수 있다.
또한, 모든 정상 개체에 있어서 가장 중요한 특성 중의 하나는 자기(self)를 구성하고 있는 항원물질에 대해서는 해롭게 반응하지 않는 반면, 비자기(non-self) 항원들에 대해서는 이를 인식하고 반응하여 제거할 수 있는 능력을 가지고 있다. 이처럼 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라고 한다. 그러나 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 "자가면역질환"이라고 한다.
본 발명에서 예방 및 치료할 수 있는 상기 면역질환은 류마티스 관절염, 베체트병, 다발성 근육염 또는 피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 루프스, 애디슨병, 원형탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 미토콘드리아 관련 증후군, 궤양성 대장염등을 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 조성물은 약학적으로 유효한 양의 화합물 또는 추출물을 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 약학적으로 유효한 양이란 질환의 증상을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
또한, 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 상기 담체, 부형제 및 희석제의 예로는, 락토즈, 덱스트로즈, 수크로즈, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 폴리비닐피롤리돈, 물, 메틸하이드록시벤조에이트, 프로필하이드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 또한, 충진제, 항응집제, 윤활제, 습윤제, 향료, 유화제 및 방부제 등을 추가로 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 포유동물에 투여된 후 활성 성분의 신속, 지속 또는 지연된 방출을 제공할 수 있도록 당업계에 공지된 방법을 사용하여 제형화될 수 있다. 제형은 분말, 과립, 정제, 에멀젼, 시럽, 에어로졸, 연질 또는 경질 젤라틴 캅셀, 멸균 주사용액, 멸균 분말의 형태일 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물의 활성 성분의 투여량은 투여 경로, 환자의 연령, 성별, 체중 및 환자의 중증도 등의 여러 인자에 따라 적절히 선택될 수 있고, 본 발명에 따른 조성물은 골관절염의 증상을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여방식, 수용자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 본 발명의 약제학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 1 x 103 ~1 x 1012 세포/kg 이다.
본 발명의 조성물에서, 상기 화합물은 1 내지 20 μM의 농도로 포함되는 것일 수 있으며, 예를 들어, 1 내지 15 μM, 1 내지 10 μM, 1 내지 5 μM, 2 내지 20 μM, 5 내지 20 μM 또는 10 내지 20 μM의 농도로 포함될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효한 양을 개체에 투여하는 면역질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 치료 방법은 상기 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 개체에 투여하는 것을 포함한다. 특정 개체에 대한 구체적인 치료적 유효량은 달성하고자 하는 반응의 종류와 정도, 경우에 따라 다른 제제가 사용되는지의 여부를 비롯한 구체적 조성물, 개체의 연령, 체중, 일반건강 상태, 성별 및 식이, 투여 시간, 투여 경로 및 조성물의 분비율, 치료기간, 구체적 조성물과 함께 사용되거나 동시 사용되는 약물을 비롯한 다양한 인자와 의약 분야에 잘 알려진 유사 인자에 따라 다르게 적용하는 것이 바람직하다. 따라서 본 발명의 목적에 적합한 조성물의 유효량은 전술한 사항을 고려하여 결정하는 것이 바람직하다.
상기 개체는 임의의 포유동물에 적용가능하며, 상기 포유동물은 인간 및 영장류뿐만 아니라, 소, 돼지, 양, 말, 개 및 고양이 등의 가축을 포함한다.
또한 본 발명은 상기의 화합물을 유효성분으로 포함하는, 이식 거부(transplantation rejection) 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 이식 거부 반응은 세포, 혈액, 조직 및 장기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 이식 거부 반응인 것일 수 있으며, 바람직하게는 장기 이식 거부 반응이나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 이식 거부 반응은 골수 이식, 심장 이식, 각막 이식, 장 이식, 간 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 신장 이식 및 피부 이식으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 이식거부반응인 것일 수 있으며, 바람직하게는 신장 이식 거부 반응이나 이에 제한되지는 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 이식 거부 질환은 이식편대숙주병(GVHD, graft-versus-host disease) 또는 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증 (Post transplantation late and chronic solid organ rejection)인 것일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
또한, 본 발명은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효한 양을 개체에 투여하는 이식 거부(transplantation rejection) 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 또는 치료하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은, 면역결핍 마우스에 이식 거부 반응 환자 유래 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)이 투여된, 인간화된 이식 거부 반응 동물 모델을 제공한다.
본 발명의 용어, "이식 거부(transplantation rejection)"는 이식 후 이식된 조직을 수여자의 면역체계가 비자기(non-self)로 인식하여 이식된 장기를 공격하여 제거하고자 하는 반응을 장기 이식 거부라 한다. 이식 거부에 관여하는 가장 중요한 요인은 major histocompatibility complex(MHC) 이고, minor histocompatibility complex 또한 관련이 있다고 알려져 있다. 거부반응은 세포매개면역(cellmediated immune response)와 체액 면역(humoral immune response)이 모두 관여한다. 세포매개반응의 경우 수용자의 림프구가 이식장기의 공여자 MHC를 만나(CD4 T cell-type II MHC molecule, 혹은 CD8 T cell-type I MHC molecule) 시작된다. 활성화된 T 세포는 cytokine을 분비, 혈관의 투과성이 증가되고, macrophage 등의 monocytes의 침윤을 일으키게 된다. 그 결과 미세혈관의 손상, 조직 허혈, 이식조직의 및 세포의 파괴가 일어나게 된다.
상기 이식 거부 반응은 세포, 혈액, 조직 및 장기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 이식 거부 반응이고, 바람직하게는 골수 이식, 심장 이식, 각막 이식, 장 이식, 간 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 신장 이식 및 피부이식의 거부반응으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 이식 거부 반응 환자 유래 PBMC는 1 내지 5 x 106의 농도로 투여하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 5 x 106이나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에 있어서, 유래되는 마우스는 제한되지 않고, 일반 실험용 마우스, 면역결핍 마우스 등이 이용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "면역결핍 마우스"는 하나 또는 그 이상의 하기 목록에 의해 특징되는 마우스를 의미한다: T 세포 및 B 세포와 같은 기능적 면역 세포의 결함; DNA 복구 결함; 림프구에서 항원 특이적 수용체를 코딩하는 유전자의 재배치 상의 결함; 및 IgM, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 및 IgA와 같은 면역 기능 분자들의 결함. 일 구현예에서, 면역결핍 마우스는 면역 기능에 관여하는 Rag1 및 Rag2와 같은 유전자의 하나 이상의 결핍에 의해 특징될 수 있으며 (Oettinger et al, Science, 248:1517-1523, 1990; 및 Schatz et al, Cell, 59:1035-1048, 1989), 면역결핍 마우스는 마우스에서 비정상적인 면역 기능을 초래하는 이들 또는 다른 결함을 가질 수 있다.
특히 유용한 면역결핍 마우스 종자(strains)는 Shultz et al., J Immunol, 174: 6477-6489, 2005에 상세히 기재된 바와 같이 일반적으로 NOD scid 감마 (NSG) 마우스를 의미하는 NOD, Cg-PrkdcscidIl2rgtml Wjl/SzJ 및 일반적으로 NRG 마우스를 의미하는 NOD.Cg-Rag1tmlMomIl2rgtml Wjl/SzJ (Shultz et al, Clin Exp Immunol, 154(2):270-284, 2008)가 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 동물 모델은, 혈청 내 크레아티닌(creatinine)이 대조군의 기준치와 비교하여 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 동물 모델은, 인간 CD4 양성세포가 대조군의 기준치와 비교하여 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 동물 모델은, 염증성 사이토카인인 IL-17의 조직 세포 내 침윤이 대조군의 기준치와 비교하여 증가된 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 이식 거부 반응은, 신장 이식에 의한 거부반응인 것일 수 있다.
또한, 본 발명은, 면역결핍 마우스에 이식 거부 반응 환자로부터 분리한 PBMC를 주입하는 단계를 포함하는 인간화된 이식 거부 반응 동물 모델을 제작하는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 PBMC를 주입하는 단계는, 0 내지 4주간 1 내지 5회 수행되는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은, 상기의 인간화된 이식 거부 반응 동물 모델에, 후보 물질을 처리하는 단계;를 포함하는, 이식 거부 반응 치료 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용하는 용어 “면역억제제”는 신체의 면역체계 활성을 줄이거나 억제하는 약물로서, 크게 스테로이드제, 세포증식 억제제, 항체 제제, 이뮤노필린에 작용하는 약물, 미코페놀레이트, 종양괴사인자(TNF-α) 억제제등으로 분류되는 약물이다.
이식 수술 뿐만 아니라 많은 면역질환 환자에 투여되고 있는 면역억제제는 체내에서 각종 부작용을 초래하는 문제점이 발생하고 있으나, 특히 이식과 같은 수술을 받은 환자의 경우, 면역 거부 반응의 억제를 위해 불가피하게 부작용이 일어 날 수 있음을 감안하고서라도 면역억제제를 처방할 수 밖에 없어, 이식 거부 반응에 있어서, 이식 받은 환자의 면역체계에 따른 적절한 면역억제제의 스크리닝이 중요하다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 후보 물질은 면역억제제인 것일 수 있으며, 상기 면역억제제는, SD911, 타크로리무스(tacrolimus), 사이클로스포린 A(cyclosporine A), 프로드니솔론(prednisolone), 메틸프레드니솔론(methylpredisolone), 데플라자코트(deflazacort), 마이코페놀산(mycophenolic acid), 아자티오프린(azathioprine), 미조리빈(mizoribine), 시롤리무스(sirolimus) 및 에베로리무스(everolimus)로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나인 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 SD911은 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 후보 물질은, 혈청 내 크레아티닌(creatinine)을 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 후보물질은, 인간 CD4 양성세포를 감소시키는 것일 수 있다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 상기 후보물질은, 염증성 사이토카인인 IL-17의 조직 세포 내 침윤을 감소시키는 것일 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<제조예 1> SD911 화합물의 제조
Figure PCTKR2021000555-appb-I000005
6-((R)-4(1-클로로프탈라진-4-일)-2-메틸피페라진-1-일)피리딘-3-카보니트릴 (3)
(2)번 화합물(502mg, 2.48mmol)을 NMP(3.5ml) 용액에 1,4-다이클로나프탈레인(494mg, 2.48mmol)을 가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기상을 화합하여 물로 세척하고 감압 하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 : N-헥산 = 1:2)로 정제하여 화합물 (3)(49.4mg, yield = 5.46%)을 얻었다. MS (ESI) [M+H]+ 365
6-((R)-2-메틸-4-(1-페녹시프탈라진-4-일)피페라진-1-일)피리딘-3-카보니트릴 (SD-911)
(3)번 화합물(15.7mg, 0.043mmol)과 페놀(5.3mg,0.059mmol)을 DMF 용매(0.05ml)에 K2CO3 (16mg, 0.1161mmol)을 가하였다. 24시간 후 반응 혼합물을 에틸 아세테이트로 희석하고, 유기상을 화합하여 물로 세척하고 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 실리카 겔 상에서 플래쉬 칼럼 크로마토그래피(에틸 아세테이트 : N-헥산 = 1:2)로 정제하여 화합물을 수득하고 이를 “SD-911”로 명명하였다(14.5mg, yield = 80%).
1H NMR (600MHz, CDCl3) 6(ppm) = 8.43 (d, J = 6.0Hz, 1H), 8.40 (t, J = 6.0Hz, 1H), 8.15 (m, 1H), 7.92 (m, 2H), 7.64 (m, 1H), 7.42 (m, 2H), 7.28 (d, J = 12Hz, 2H), 7.23 (m, 1H), 6.64 (d, J = 6.0Hz, 1H), 4.74 (bs, 1H), 4.32 (d, J = 18Hz, 1H), 3.80 (d, J = 18Hz, 1H), 3.67 (d, J = 18Hz, 1H), 3.54 (m, 1H), 3.29 (m, 1H), 3.20 (d, J = 6.0Hz, 1H), 3.15 (m, 1H), 1.52 (d, J = 6.0Hz ,3H); HMS (ESI) [M+H]+ 423.
<실시예 1> 세포주 배양
본 실험에 사용한 human kidney-2 세포주는 ATCC (Manassas, VA, USA)에서 구입하여 사용하였다. 이들 세포들은 10% fetal bovine serum(FBS; Wisent, St. Bruno, Que, Canada), 100 U/mL penicilllin과 100 mg/mL streptomycin (Wisent)이 들어있는 Dulbecco’s modified Eagle’s medium(DMEM; Wisent)에서 5% CO2, 37℃ 항온배양기에서 배양하였다.
<실시예 2> 세포 생존률 조사
HK-2 세포를 80% seeding 한 뒤 24시간 후 타크리니무스(tacrolimus)를 60 ~ 70 ㎍/㎖와 SD911을 1 ~ 20μM 농도로 처리하고 3 ~ 12시간 반응시키고, 마우스의 비장조직에서 single cell로 분리한 세포의 경우 96-well plate에 2 x 105/cell/200 ㎕를 triplicate로 seeding한 후 각 SD911 화합물을 1 ~ 20μM 로 처리하고 3일한 반응시켰다. 이후 cell counting kit-8(CCK-8, Dojindo molecular, Rockville, MA, USA) 시약을 2시간 동안 처리한 뒤 450nm의 흡광도에서 측정하고 분석하였다.
<2-1>HK-1세포에서 SD911의 세포 생존력 확인
타크리니무스(Tac)에 의한 HK-2 세포 독성유도 하에서 SD911 화합물의 세포 보호 효과를 조사하였다. 도 1에서 볼 수 있는 바와 같이, Nil에 비해 1, 5, 10, 20 μM 농도의 SD911는 자체의 약물독성은 확인되지 않았다. Nil을 100%로 보았을 때 타크리니무스(Tac)은 56.7%의 생존율을 보였으나 1, 5, 10 μM의 SD911을 타크리니무스(Tac)와 병합 처리한 경우는 각각 81.7%, 81.8%, 72.0%의 생존율을 유의하게 향상시켰으나, 20 μM의 SD911은 타크리니무스(Tac) 단독에 비해 37.4%의 낮은 생존율을 확인할 수 있었다($P<0.05 vs. Nil; #P<0.05 vs. Tac).
<2-2>Mouse splenocyte에 대한 SD911의 독성검사
도 2에서 볼 수 있는 바와 같이, SD911 화합물(1,5,20μM)의 면역세포에 대한 독성조사를 실시한 결과 Nil군에 비해 유의한 차이는 보이지 않았다.
<실시예 3> 활성 산소종(Reactive oxygen species, ROS)측정
HK-2 세포를 80% seeding 한 뒤 24시간 후 타크리니무스(tacrolimus)를 60 ~ 70 ㎍/㎖와 SD911을 1 ~ 20μM 농도로 처리하고, 3 ~ 12시간 반응시킨 뒤 10μM DCF-DA(Molecular probes, Carlebad, CA, USA)를 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 다음 0.05% Trypsin과 0.53 mM EDTA로 세포를 수확하여 분석하였다. 분석은 FACS Calibur(BD bioscience, San Jose, CA, USA)를 이용하여 FSC(forward side scatter)와 SSC(side scatter) 산점도(dot plot)를 이용하여 응집된, 혹은 깨진 세포는 제거한 뒤, FL-1H channel(Excitation 488 nm, Emission 513 ~ 535 nm)에서 형광분율을 분석하였다.
실시예 1의 세포 생존력 확인 결과를 기초로 1, 5, 10 μM의 SD911에 대한 ROS 생성 억제 효과를 조사하였다. 도 3에서 볼 수 있는 바와 같이, 1, 5, 10 μM의 SD911 단독에 대하여, ROS 검출하는 시약인 DCF-DA의 형광분율은 control인 Nil과 거의 차이가 없었다. 타크리니무스(Tac)에 의한 HK-2 세포 독성 유도시 31.6%의 비율로 ROS가 증가되었으며 5, 10 μM에서는 각각 13.7% 9.3%로 유의하게 감소하였다. 하지만 1 μM의 SD911 병합군은 오히려 36.5%로 타크리니무스(Tac)군과 크게 차이를 보이지 않았다(#P<0.05 vs. Tac).
<실시예 4> ELISA 분석
ELISA용 세포배양은 24-well plate에 조건수만큼 mouse anti-CD3 항체를 0.5 ㎍/㎖로 ccPBS에 희석해서 250 ul로 코팅하였다. 2 시간 동안 인큐베이션한 후 상청액을 걷어내고 세포를 1 X 106/cells/1 ㎖ 로 seeding 후 각 약물 처리를 하였다. 3 일 동안 배양한 후 세포 배양액만 걷어내어 IL-10, IL-17 ELISA sample로 이용하였다.
도 4에서 볼 수 있는 바와 같이, anti-CD3에 의한 면역활성 하에서 SD911 약물은 SD911 화합물을 처리하지 않은 군에 비해 농도 의존적인 경향으로 IL-17은 감소시키고, IL-10은 증가시키는 것을 확인하였다(#P < 0.05 vs. aCD3 only; &P < 0.05 vs. 1 μM SD911; $P < 0.05 vs. 5 μM SD911).
<실시예 5> 통계학적 분석 방법
분석결과는 PRISM software (version7.03 for Windows; GraphPad Software, LaJolla, CA, USA) 통계 프로그램을 이용하여 multiple comparison은 1-way ANOVA with Bonferroni’s post hoc test를 사용하여 각 군 간의 평균치를 검정하였으며, P값이 0.05 이하인 경우를 통계학적으로 유의한 것으로 해석하였다.
<실시예 6> SD911 화합물의 SPL 억제효과
실험동물의 간 조직을 lysis buffer에서 homogenize한 뒤 단백질 정량을 시행하여 농도를 확보하고 하기 표 1의 조건으로 혼합액을 만들어 37℃에서 1시간 동안 반응시켰다. 20ul 0.1nmol/ul heptadecanal(C17) 및 180ul MeOH를 넣고 하기 표 2와 같이 standard를 만들어 HPLC로 측정하고 분석하였다.
Figure PCTKR2021000555-appb-T000001
Figure PCTKR2021000555-appb-T000002
그 결과, 도 5에서 볼 수 있는 바와 같이, Control에 비해서 SPL(S1P lyase) inhibitor인 SD911 화합물이 약 30% 감소된 S1P(Sphingosine 1-phosphate) lyase 활성을 보이고 있어 S1P lyase 활성 억제력이 있음을 확인할 수 있었다. 이와 같이, SD911 화합물이 SPL활성 억제력을 가지고 있어 비이상적인 면역활성과 관련된 질환의 치료에 적용할 수 있을 것으로 기대할 수 있다.
<실시예 7> 신장 보호 효과 확인
HK-1세포에서 SD911의 ROS production 억제력 및 세포 사멸 감소 효과를 확인하였다. 실시예 2의 세포 생존력 실험 결과(도 2)를 기초로 1, 5, 10 μM의 SD911에 대한 ROS production억제 효과를 조사하였다.
그 결과, 도 6a 및 도 6b에서 볼 수 있는 바와 같이, 1, 5, 10 μM의 SD911 화합물 단독에 대한 ROS 검출하는 시약인 DCF-DA의 형광분율은 control인 Nil과 거의 차이가 없었다. Tac에 의한 HK-2 세포 독성유도시 31.6%의 비율로 ROS가 증가되었으며 5, 10 μM에서는 각각 13.7% 9.3%로 유의하게 감소하였다. 하지만 1 μM의 SD911 병합군은 오히려 36.5%로 Tac군과 크게 차이를 보이지 않았다(#P<0.05 vs. Tac).
또한, Tac에 의한 세포 사멸에 대한 SD911의 효과를 조사하기 위해 PI와 Annexin-V의 약물로 분석한 결과 Tac과 SD911(10 μM)의 병합군에서 Necrotic cells, apoptotic cells, 그리고 early apoptotic cell & necrotic cell의 비율이 Tac 단독에 비해 현저히 완화되는 효과를 확인하였다(도 7a 및 도 7b).
<실시예 8> 이식 거부 반응 환자 모사 아바타 모델 평가 플랫폼 구축
본 발명의 이식 거부 반응 아바타 동물모델을 제작하기 위하여, 8-10주령의 면역결핍 마우스(NSG)에 정상인 또는 이식 거부 반응 환자 유래의 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)을 5x10^6/mice로 혈관 내 주사한 뒤, 3주 후 혈액 내 정상인 또는 이식 거부 반응 환자(신장이식거부 환자) 세포의 생착 확인을 혈액 세포에서 확인하였다. 그 후, 세포이식 4주 후 마우스를 희생하여 조직 내 인간 세포의 침윤 및 조직학적 변화를 확인하였다(도 8).
<실시예 9> 이식 거부 반응 환자 모사 아바타 모델의 혈액 내 인간 세포 생착 확인
상기 실시예 8에서 이식 거부 반응 환자 모사 아바타 모델이 제대로 구축되었는지 확인하기 위해, 인간 세포의 생착을 유세포 분석을 통해 분석하였다. 구체적으로 실시예 1의 이식 거부 반응 인간화 마우스 (정상인 PBMC 주입군, HC; 이식거부환자 PBMC 주입군, Patient)로부터 혈액을 수득한 뒤, 인간 항체와 반응하여 양성인 세포를 분석하였다. 또한, 정상인과 이식 거부 반응 환자의 PBMC 주입 마우스의 신장손상을 측정하는 지표로서 혈액 내 크레아틴 (SCR) 농도를 측정하였다. SCR측정은 동물의 혈액내 혈청을 분리하여 quantitative enzymatic colorimetric method 법(Stanbio laboratory, 0430-120)으로 측정하였다.
그 결과, 도 9a에 나타낸 바와 같이, 유세포 분석으로 인간세포가 생착 된 것을 확인하였다.
또한, 도 9b에 나타낸 바와 같이, 정상인 PBMC 주입군(정상인)에 비해 이식 거부 반응 환자 PBMC 주입군(신장 이식 거부 환자)에서 SCR수치가 높은 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 10> 이식 거부 반응 환자 모사 아바타 모델에서의 면역억제제 효과 확인
<10-1> 신장조직 손상 제어 확인
상기 실시예 8에서 수립한 이식 거부 반응 인간화 마우스 모델을 구체적으로, 1) 정상인 PBMC 주입군, 2) 정상인 PBMC 주입군에 면역억제제를 처리한 군, 3) 이식 거부 반응 환자 PBMC 주입군 및 4) 이식 거부 반응 환자 PBMC 주입군에 면역억제제를 처리한 군으로 분류하였으며, 면역억제제로는 SD911을 사용하였다. 구체적으로, 상기 실시예 8의 동물모델에, PBMC를 생착시킨 후 3주째에, SD911을 처리하였으며, 대조군으로는 동량의 생리식염수를 처리하였다. 약물 처리후 1주일 후 마우스를 희생하여, 신장을 적출한 뒤, 조직의 손상정도를 확인하였다. 구체적으로 사구체의 손상 확인 지표인 GN score(membranous glomerulonephritis score), 신장의 면역세포 침윤 지표인 IN score(renal interstitial nephritis score) 및 혈관 주위의 면역세포 침윤정도를 확인하는 지표인 Vasculitis를 각각 측정하였다.
그 결과, 이식 거부 반응 환자 PBMC가 주입된 군에서는 신장 조직의 손상이 정상인 PBMC가 주입된 군보다, 유의적으로 증가한 것을 확인하였다(도 10a 및 도 10b). 또한, 면역억제제인 SD911을 이식 거부 반응 환자 PBMC가 주입된 군 투여하면, 신장 조직의 손상이 감소하는 것을 확인하였다(도 10b 및 도 10c).
<10-2> 신장 조직 내 병인 T 세포 침윤 제어 확인
상기 실시예 10-1에서 적출된 신장조직내 인간의 면역세포아형인 CD4+T(CD4+) 가 침윤 되었는지 확인하기 위하여, 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. 적출한 조직은 포르말린으로 고정한 후, 파라핀에 임베딩하여 5㎛ 두께의 절편을 생성하였다. 조직 내 면역세포를 관찰하기 위해 상기 절편 슬라이드에서 인간 CD4 항체와 반응시켜 면역조직화학분석을 수행하였다.
그 결과, 실시예 8의 정상인과 이식 거부 반응 환자의 PBMC를 주입한 마우스 신장 조직 내 인간 CD4+T 세포가 검출되어 인간 세포가 잘 생착된 것을 확인하였으며, SD911을 처리하면, 본 이식 거부 반응 환자 PBMC를 주입한 군에서, CD4 양성세포의 침윤이 유의적으로 감소하였으며, 정상인 PBMC를 주입한 군보다 감소하는 것을 확인하였다(도 11a 내지 도 11c).
<10-3> 신장 조직 내 IL-17 침윤 제어 확인
상기 실시예 10-1에서 적출된 신장조직내 염증성 사이토카인인 IL-17이 침윤 되었는지 확인하기 위하여, 면역 조직 화학 염색을 수행하였다. 적출한 조직은 포르말린으로 고정한 후, 파라핀에 임베딩하여 5㎛ 두께의 절편을 생성하였다. 조직 내 면역세포를 관찰하기 위해 상기 절편 슬라이드에서 인간 IL-17 항체와 반응시켜 면역조직화학분석을 수행하였다.
그 결과, 실시예 8의 정상인과 신장이식거부 환자의 PBMC를 주입한 마우스 신장 조직 내 인간 IL-17 세포가 검출되어 인간 세포가 잘 생착된 것을 확인하였으며, SD911을 처리하면, 본 이식 거부 반응 환자 PBMC를 주입한 군에서, IL-17 양성세포의 침윤이 유의적으로 감소하였으며, 정상인 PBMC를 주입한 군보다 감소하는 것을 확인하였다(도 12a 내지 도 12c).
따라서, 본 발명의 신규한 화합물은 체내에 독성을 나타내지 않으면서도 면역학적 조절 능력이 우수하며, 종래 면역억제제와 달리 신장독성이 없고 오히려 신장 보호 효과를 가지고 있어, 각종 면역반응의 조절 이상으로 유발되는 자가면역질환, 염증성질환 및 이식거부질환과 같은 면역질환 치료를 위한 용도로 사용될 수 있으며, 본 발명의 이식 거부 반응 아바타 동물모델은, 환자의 이식거부 반응의 지표인 혈청 크레아티닌의 증가, 인간 CD4 양성세포가 증가하고, 염증성 사이토카인인 IL-17이 동물모델의 신장 조직 내에 침윤한 것을 확인하여, 인간화 된 것을 확인하였다. 또한, 면역억제제의 투여에 따라, 증가된 혈청 크레아티닌, 인간 CD4 양성세포 및 염증성 사이토카인 IL-17의 침윤이 감소하는 것을 확인하여, 효과적으로 환자의 면역상태가 반영된 동물모델이 제작되고, 이에 따른 면역억제제의 효과를 확인하였다.

Claims (14)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021000555-appb-I000006
    .
  2. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 신장 세포 보호 효과를 갖는 것을 특징으로 하는, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 화합물은 S1P lyase 활성을 억제하는 것인, 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염.
  4. 제1항에 따른 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역억제제.
  5. 제1항에 따른 화합물을 유효성분으로 포함하는, 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  6. 제5항에 있어서, 상기 면역질환은 자가면역질환을 포함하는 것인 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  7. 제5항에 있어서, 상기 화합물은 신장 보호 효능을 갖는 것인 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  8. 제5항에 있어서, 상기 화합물은 S1P lyase 활성 억제력을 갖는 것인 면역질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  9. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효한 양을 개체에 투여하는 면역질환의 예방 또는 치료하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021000555-appb-I000007
    .
  10. 제1항에 따른 화합물을 유효성분으로 포함하는, 이식 거부(transplantation rejection) 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
  11. 제 10항에 있어서, 상기 이식 거부 반응은 세포, 혈액, 조직 및 장기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 이식 거부 반응인 것을 특징으로 하는 조성물.
  12. 제 11항에 있어서, 상기 이식 거부 반응은 골수 이식, 심장 이식, 각막 이식, 장 이식, 간 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 신장 이식 및 피부 이식으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 이식 거부 반응인 것을 특징으로 하는 조성물.
  13. 제 10항에 있어서, 상기 이식 거부 질환은 이식편대숙주병(GVHD, graft-versus-host disease) 또는 고형장기 이식 후기 및 만성 거부증(Post transplantation late and chronic solid organ rejection)인 것인 조성물.
  14. 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염의 유효한 양을 개체에 투여하는 이식 거부(transplantation rejection) 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 또는 치료하는 방법:
    [화학식 1]
    Figure PCTKR2021000555-appb-I000008
    .
PCT/KR2021/000555 2020-01-22 2021-01-14 신규 화합물 및 이의 용도 WO2021149971A1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/794,823 US20230095498A1 (en) 2020-01-22 2021-01-14 Novel compound and use thereof

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2020-0008356 2020-01-22
KR1020200008356A KR102394110B1 (ko) 2020-01-22 2020-01-22 신규 화합물 및 이의 용도

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021149971A1 true WO2021149971A1 (ko) 2021-07-29

Family

ID=76992321

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/000555 WO2021149971A1 (ko) 2020-01-22 2021-01-14 신규 화합물 및 이의 용도

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20230095498A1 (ko)
KR (1) KR102394110B1 (ko)
WO (1) WO2021149971A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220141030A (ko) * 2021-04-12 2022-10-19 가톨릭대학교 산학협력단 신규한 sd911 화합물을 유효성분으로 포함하는 이식 거부 반응의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070029246A (ko) * 2004-06-30 2007-03-13 얀센 파마슈티카 엔.브이. Ｐａｒｐ 저해제로서의 프탈아진 유도체
KR20090121386A (ko) * 2007-03-15 2009-11-25 노파르티스 아게 유기 화합물 및 그의 용도
WO2019170796A1 (de) * 2018-03-09 2019-09-12 Universität Duisburg-Essen Verwendung von modulatoren der sphingosin-1-phosphat-signaltransduktion

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2012026766A2 (ko) 2010-08-25 2012-03-01 (주)네오팜 신규한 헤테로고리 화합물 및 이를 이용한 염증성 질환 치료용 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20070029246A (ko) * 2004-06-30 2007-03-13 얀센 파마슈티카 엔.브이. Ｐａｒｐ 저해제로서의 프탈아진 유도체
KR20090121386A (ko) * 2007-03-15 2009-11-25 노파르티스 아게 유기 화합물 및 그의 용도
WO2019170796A1 (de) * 2018-03-09 2019-09-12 Universität Duisburg-Essen Verwendung von modulatoren der sphingosin-1-phosphat-signaltransduktion

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BILLICH ANDREAS; BEERLI CHRISTIAN; BERGMANN REINHARD; BRUNS CHRISTIAN; LOETSCHER ERIKA: "Cellular assay for the characterization of sphingosine-1-phosphate lyase inhibitors", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 434, no. 2, 13 December 2012 (2012-12-13), pages 247 - 253, XP028968916, ISSN: 0003-2697, DOI: 10.1016/j.ab.2012.11.026 *
SVEN WEILER, NADINE BRAENDLIN, CHRISTIAN BEERLI, CHRISTIAN BERGSDORF, ANNA SCHUBART, HONNAPPA SRINIVAS, BERNDT OBERHAUSER, AND AND: "Orally Active 7-Substituted (4-Benzylphthalazin-1-yl)-2-methylpiperazin-1-yl]nicotinonitriles as Active-Site Inhibitors of Sphingosine 1-Phosphate Lyase for the Treatment of Multiple Sclerosis", JOURNAL OF MEDICINAL CHEMISTRY, vol. 57, no. 12, 201405021, pages 5074 - 5084, XP055831493 *

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20220141030A (ko) * 2021-04-12 2022-10-19 가톨릭대학교 산학협력단 신규한 sd911 화합물을 유효성분으로 포함하는 이식 거부 반응의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2022220478A1 (ko) * 2021-04-12 2022-10-20 가톨릭대학교 산학협력단 신규한 sd911 화합물을 유효성분으로 포함하는 이식 거부 반응의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
KR102596232B1 (ko) 2021-04-12 2023-11-01 가톨릭대학교 산학협력단 신규한 sd911 화합물을 유효성분으로 포함하는 이식 거부 반응의 예방 또는 치료용 약학적 조성물

Also Published As

Publication number Publication date
KR20210094753A (ko) 2021-07-30
KR102394110B1 (ko) 2022-05-04
US20230095498A1 (en) 2023-03-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2014157918A1 (ko) 조절 t 세포로의 분화 유도 및 증식 촉진을 통한 면역 반응 억제용 약학 조성물
WO2017022962A1 (ko) Ripk 억제제를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2015026215A1 (ko) 바이구아나이드 유도체 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물
WO2013129739A1 (ko) 봉독-ｐｌａ2를 포함하는 이상 조절 ｔ 세포 활성 저하 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학적 조성물
WO2021149971A1 (ko) 신규 화합물 및 이의 용도
Tanner et al. Targeting KCa1. 1 channels with a scorpion venom peptide for the therapy of rat models of rheumatoid arthritis
WO2015167243A1 (ko) 면역질환 치료효과를 갖는 신규한 화합물 및 이의 용도
WO2015076430A1 (ko) 메트포민을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2023027317A1 (ko) 편도 중간엽 줄기세포 유래 엑소좀을 포함하는 근육 감소 관련 질환 치료용 조성물
WO2023113541A1 (en) Pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or inflammatory disease
WO2016117960A1 (ko) 면역질환 치료 효능을 갖는 grim19이 과발현된 중간엽줄기세포 및 이의 용도
WO2022108306A1 (ko) 인터류킨-33을 처리하여 면역원성이 향상된 cd103+ fcgr3+ 수지상세포의 제조방법 및 상기 수지상세포를 포함하는 면역항암치료용 약학적 조성물
WO2015023147A1 (ko) mTOR/STAT3 신호억제제 처리된 면역조절능을 갖는 간엽 줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물
WO2018034523A1 (ko) Jak 억제제를 포함하는 면역반응 억제용 조성물
WO2022119060A1 (ko) 불멸화 개 줄기세포 또는 이의 용도
WO2020096371A1 (ko) 신규 화합물 및 칼시뉴린 억제제를 포함하는 이식 거부 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 및 치료용 조성물
WO2021096199A1 (ko) 피리메타민을 유효성분으로 포함하는 면역 관련 질환의 치료 또는 예방용 약학 조성물
WO2015111971A1 (ko) Gpr119 리간드를 유효성분으로 포함하는 비알콜성 지방간 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2021033995A1 (ko) 초과 추출물을 함유하는 근육 감소 관련 질병의 예방, 개선, 또는 치료용 조성물
KR101273747B1 (ko) Ｓｔａ-21을 유효성분으로 함유하는 관절염의 예방 및 치료용 조성물
WO2011115458A2 (ko) 자가 면역 질환 예방 및 치료용 ＴＮＦ－α와 ＩＬ－２１ 이중 길항제
WO2015026205A1 (ko) 다우리놀 화합물을 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 및 치료용 조성물
KR20130106786A (ko) 골수유래억제세포 및 레바미피드를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2015194710A1 (ko) Stat3 억제제가 처리된 간엽줄기세포를 유효성분으로 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 조성물
WO2020071665A2 (ko) 세포의 텔로미어를 신장시키는 조성물 및 그 제조방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21745023

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 21745023

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1