WO2020096371A1 - 신규 화합물 및 칼시뉴린 억제제를 포함하는 이식 거부 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 및 치료용 조성물 - Google Patents

신규 화합물 및 칼시뉴린 억제제를 포함하는 이식 거부 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 및 치료용 조성물 Download PDF

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WO2020096371A1
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transplant rejection
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조미라
신동윤
최종영
양철우
박성환
이선영
박민정
전주연
김세영
서현범
류재윤
조근형
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가톨릭대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to a composition for the prevention and treatment of transplant rejection or transplant rejection disease comprising a novel compound and a calcineurin inhibitor.
  • Immunosuppressants are drugs that block or reduce humoral or cellular immune responses that make antibodies against antigens, mainly graft-versus-host disease after immune rejection or bone marrow transplantation after organ transplantation. ). In addition, immunosuppressants are also used to treat autoimmune diseases such as lupus and rheumatoid arthritis, hyperimmune reactions such as allergies and atopy, and inflammatory diseases over a long period of time.
  • T cells type 1 auxiliary cells (Th1) mainly involved in cell-mediated immunity or type 2 auxiliary cells (Th2) involved in humoral immunity.
  • Th1 type 1 auxiliary cells
  • Th2 type 2 auxiliary cells
  • Treg immunoregulatory T cells
  • Th17 Th17
  • Treg can regulate Th1 cell activity, inhibit the function of abnormally activated immune cells and regulate the inflammatory response.
  • Th17 cells secrete IL-17, maximizing the signal of an inflammatory response, accelerating disease progression.
  • various studies of immunomodulatory treatments have been conducted as these Tregs and Th17s have emerged as new targets for the treatment of immune diseases (Wood, KJ et al., Nat. Rev. Immunol.
  • transplantation refers to the process of taking a cell or tissue or organ, ie, a graft, from one individual and transferring it to another.
  • the individual who provided the graft is called the donor, and the individual receiving it is called the recipient or host.
  • a rejection reaction is caused by an immunological response to a tissue-compatible antigen (transplant antigen) on the cell surface of the graft.
  • tissue-compatible antigen transplant antigen
  • Immunosuppressants that non-specifically inhibit T cells for suppressing transplant rejection or transplant rejection diseases are generally cytotoxic, immunocompromised infections, diabetes, tremor, headache, diarrhea, hypertension, nausea, renal dysfunction
  • the present inventors treated a compound called SD282 and a calcineurin inhibitor in combination to prevent and treat immune diseases that may occur after transplantation while suppressing transplant rejection and reducing side effects of non-specific inhibition of T cells. Confirmed to complete the present invention.
  • the object of the present invention is 1) a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and 2) calcineurin (Calcineurin) inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof containing as an active ingredient, transplant rejection (transplantation) It can provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of rejection reaction or transplant rejection disease.
  • the object of the present invention is 1) a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and 2) calcineurin (Calcineurin) inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, immunization after transplantation It is possible to provide a pharmaceutical composition for inhibition.
  • the present invention comprises 1) a compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof and 2) a calcineurin inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient. It provides a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of transplant rejection (transplantation rejection) reaction or transplant rejection disease.
  • the present invention comprises 1) a compound represented by the following formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and 2) a calcineurin inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient, for immunosuppression after transplantation
  • a pharmaceutical composition for immunosuppression after transplantation
  • Co-administration of the SD282 compound and calcineurin inhibitor of the present invention is in vivo or in vitro in allogenic models, transplant rejection disease models, skin transplant models and liver transplant patients, 1) pathogenic Th1 cells or Th17 cells. Reduces activity, 2) increases the activity of Tre, 3) has the effect of suppressing side effects such as tissue damage when administered alone, 4) inhibits various pathogenic pathways, 5) kills inflammatory cells Suppress, and 6) increase the activity of mitochondria to alleviate side effects that may occur when administering an existing immunosuppressive agent alone and suppress transplant rejection. Therefore, it can be used in the pharmaceutical field related to various immune diseases that may occur after transplant rejection or transplant.
  • 1 is a diagram confirming the T cell proliferation response by SD282 + FK506 combination treatment in a mouse allograft model by analyzing 3H-thymidine incorporation.
  • FIG. 2 (A) is a flow cytometry analysis of T cell proliferation response by SD282 + FK506 combination treatment in a mouse allograft transplant model, and (B) is a graph confirming this.
  • Figure 3 is a diagram confirming the effect of inhibiting the activity of pathogenic Th17 cells by SD282 + FK506 combination treatment in a mouse allograft model.
  • Figure 4 is a diagram confirming the effect of increasing the activity of Treg by SD282 + FK506 combination treatment in a mouse allograft model.
  • FIG. 5 is a diagram showing an experimental method for confirming the effect of co-administration in a graft-versus-host disease (GVHD) animal model.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • Figure 6 is a graft-versus-host disease (GVHD) is a diagram confirming the effect of GVHD treatment by the combination treatment of SD282 and FK506 in an animal model.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • Figure 7 is a graft-versus-host disease (GVHD) is a diagram confirming the effect of GVHD treatment by the combination treatment of SD282 and FK506 in an animal model.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • Figure 8 is a diagram confirming the long-term damage suppression efficacy by the combination treatment of SD282 and FK506 in a graft-versus-host disease (GVHD) animal model (Fig. 8a: fe, liver, skin; Fig. 8b: large intestine, small intestine, intestine).
  • GVHD graft-versus-host disease
  • Figure 9 is a graft-versus-host disease (GVHD) animal model in the SD282 and FK506 combination treatment confirms the effect of immune cell regulation
  • FIG. 10 is a schematic diagram of an experiment for confirming the effect by the combination treatment of SD282 and FK506 in a skin transplant animal model.
  • 11 is a view confirming the graft survival increase and pathogenesis inhibitory effect after skin graft by combination treatment of SD282 and FK506 in a skin graft animal model.
  • FIG. 12 is a view confirming the change in biomarkers after skin transplantation by the combination treatment of SD282 and FK506 in a skin graft animal model.
  • 13 is a view confirming the immunomodulatory effect by the combined treatment of SD282 and FK506 in human allo-response conditions.
  • 14 is a view confirming the immunomodulatory effect by the combination treatment of SD282 and FK506 in human allo-response conditions.
  • 15 is a diagram confirming the immunomodulatory effect by the combination treatment of SD282 and FK506 in human allo-response conditions.
  • Figure 16 It is a diagram confirming the change in expression of immune cell markers by the combination treatment of SD282 and FK506 in immune cells of liver transplant patients.
  • 17 is a diagram showing the inhibition of activity by the combined treatment of SD282 and FK506 in the liver transplantation KEGG pathway.
  • 18 is a diagram confirming the etiological cell control and gene regulation effect by the combination treatment of SD282 and FK506 in a liver transplant patient (18a: STAT control effect, 18b: mitochondrial function recovery effect, 18c: inflammatory cell death control effect; 18d: cell migration control effect)
  • 19 is a diagram confirming the effect of inhibiting cell death by the combination treatment of SD282 and FK506 in a liver transplant patient.
  • FIG. 20 is a view confirming the effect of inhibiting cell migration by the combination treatment of SD282 and FK506 in a liver transplantation model (FIG. 20A: mouse; FIG. 20B: human).
  • 21 is a view confirming the degree of inflammation and fibrosis (fibrosis) in the liver transplant patient avatar model.
  • the present invention includes 1) a compound represented by Formula 1 (hereinafter referred to as SD282 compound) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and 2) a calcinurin inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient to provide a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of transplant rejection (transplantation rejection) reaction or transplant rejection disease.
  • SD282 compound a compound represented by Formula 1
  • a calcinurin inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient
  • Co-administration of the SD282 compound and calcineurin inhibitor of the present invention is in vivo or in vitro in allogenic models, transplant rejection disease models, skin transplant models and liver transplant patients, 1) pathogenic Th1 cells or Th17 cells. Reduces activity, 2) increases the activity of Tre, 3) has the effect of suppressing side effects such as tissue damage when administered alone, 4) inhibits various pathogenic pathways, 5) kills inflammatory cells Suppress, 6) increase the activity of mitochondria, 7) decrease cell migration, effectively suppress various side effects of transplant rejection while suppressing side effects when administered alone.
  • the weight ratio of the compound of Formula 1 of the present invention and the calcineurin inhibitor may be used in the range of 1: 1 to 5000: 1, preferably 1: 1 to 2000: 1, 1: 1 to 1000: 1, 1: 1 to 500: 1. It may be 1: 1 to 300: 1, 1: 1 to 200: 1, 1: 1 to 100: 1, 1: 1 to 50: 1, 1: 1 to 10: 1, 1: 1 to 5: 1, It is not limited to this.
  • transplantation rejection of the present invention means that the transplanted tissue after transplantation is recognized as a non-self by the recipient's immune system and attacks the transplanted organ to reject the organ transplant. It says.
  • MHC major histocompatibility complex
  • Rejection responses involve both cell-mediated immune responses and humoral immune responses.
  • the recipient's lymphocytes begin to meet the donor MHC of the transplantation organ (CD4 T cell-type II MHC molecule, or CD8 T cell-type I MHC molecule).
  • Activated T cells secrete cytokine, increase the permeability of blood vessels, and infiltrate monocytes such as macrophage. As a result, microvascular damage, tissue ischemia, tissue destruction and cell destruction occur.
  • SD282 compound of the present invention is known from No. 10-1613371, and may include all of the compound represented by Formula 1 below or a pharmaceutically acceptable salt thereof.
  • calcineurin inhibitor is a type of immunosuppressant, which inhibits the formation of mRNA in T-lymphocytes and inhibits IL-2 production. Cyclosporine (Formula 2) ) And FK-506 (Tacrolimus, tacrolimus; right of formula 2) are typical.
  • FK-506 of the present invention was isolated from Streptomyces tsukubaensis, and structurally different from cyclosporin, but the mechanism of action similarly inhibits T-lymphocytes, indicating immunosuppressive function, and the effect of the drug Is known to have 10 to 100 times the efficacy of cyclosporine.
  • calcineurin Since calcineurin is expressed not only in T cells of the immune system, but also in other cells and tissues, the inhibitory action of calcineurin of cyclosporin or tacrolimus is accompanied by various side effects besides immunosuppression (Liu, EH et al, Nat Immunol 8 (1): 25- 30, 2007) Side effects of immunosuppressive agents have a long-term stable and successful effect on organ transplantation and the survival rate of transplant patients, and are also a major problem in the treatment of diseases other than organ transplantation that require immunosuppression.
  • Renal toxicity induced by calcineurin immunosuppressive agents is manifested by a decrease in renal function, such as a decrease in the renal tissue flow rate and glomerular filtration rate, as well as tissue changes in the kidneys, such as fear production in the tubules, interstitial fibrosis, and renalization of the arteries.
  • the "SD282 compound” in order to eliminate the side effects of suppressing the Treg of the calcineurin immunosuppressive agent as described above and increasing the pathogenic Th17 cells, the "SD282 compound" is added to the calcineurin immunosuppressive agent "FK-506". It was treated in combination. As a result, it was confirmed that in vivo and in vitro, Treg was increased and pathogenic Th17 cells were reduced, thereby alleviating the side effects of the calcineurin immunosuppressant.
  • the transplant rejection reaction is one or more transplant rejection reactions selected from the group consisting of cells, blood, tissues, and organs, and preferably, bone marrow transplantation, heart transplantation, corneal transplantation, intestinal transplantation, liver transplantation, lung transplantation, pancreatic transplantation, and kidney One or more selected from the group consisting of rejection of transplantation and skin transplantation, but is not limited thereto.
  • the transplant rejection disease of the present invention includes graft-versus-host disease (GVHD), but if the disease is associated with a transplant rejection reaction by treatment with SD282 or FK-506 alone or in combination, the present invention is limited thereto. Does not work.
  • GVHD graft-versus-host disease
  • the present invention can treat autoimmune diseases after transplantation, which may include autoimmune diseases or inflammatory diseases.
  • autoimmune disease refers to the non-responsiveness of a living body to an autoantigen as immunological unresponsiveness or tolerance, and when a problem arises in inducing or maintaining such self-tolerance Immune responses to self-antigens occur, thereby causing the phenomenon of attacking one's own tissue, which means a disease caused by this process.
  • inflammatory disease refers to TNF- ⁇ (tumor necrosis factor- ⁇ ), IL secreted by immune cells such as macrophages by excessively enhancing the human immune system due to harmful stimuli such as inflammatory factors or irradiation.
  • diseases caused by inflammatory substances such as -1 (interleukin-1), IL-6, prostaglandin, luecotriene, or nitric oxide (NO) .
  • the immune diseases include rheumatoid arthritis, Behcet's disease, polymyositis or dermatomyositis, autoimmune hematopoiesis, autoimmune myocarditis, atopic dermatitis, asthma, primary cirrhosis, dermatomyositis, Goodfeiter's syndrome, autoimmune meningitis, Sjogren's syndrome, lupus , Addison's disease, alopecia areata, ankylosing myelitis, autoimmune hepatitis, autoimmune parotitis, Crohn's disease, insulin dependent diabetes mellitus, dystrophic vesicular epidermis, epididymitis, glomerulonephritis, Graves' disease, Guillain-Barre syndrome, Hashimoto's disease, hemolytic anemia, Multiple sclerosis, myasthenia gravis, phimosis, psoriasis, rheumatoid fever,
  • composition inhibits the proliferation of T cells and differentiates undifferentiated T cells into Th1 cells or Th17 cells; Alternatively, the activity of Th1 cells or Th17 cells can be reduced.
  • composition increases, but is not limited to, differentiation of undifferentiated T cells into Treg cells and activity of Treg cells.
  • Treg cells have the property of controlling the inflammatory response by inhibiting the function of abnormally activated immune cells, and thus can treat immune diseases through the action of increasing the activity of Treg cells.
  • Th17 cells are known to be formed through a process similar to the differentiation of Treg cells in the differentiation process of undifferentiated T cells. That is, the differentiation of Treg cells and Th17 cells is commonly done in the presence of TGF- ⁇ , but in the case of Treg cells, IL-6 is not required, whereas in the case of Th17 cells, IL-6 is present together with TGF- ⁇ . Differentiate in situations. In addition, differentiated Th17 cells are characterized by secreting IL-17.
  • Th17 cells are involved at the forefront of the inflammatory response seen in the immune disease, thereby maximizing the signal of the inflammatory response and accelerating disease progression. Therefore, in the case of autoimmune diseases that are not controlled by Treg cells among immune diseases, the development of therapeutic agents for immune diseases targeting the inhibition of Th17 cell activity has been greatly emphasized.
  • T cell of the present invention is a cell involved in an immune response, and refers to a population of T cells expressing a specific cell surface marker.
  • Humans have several types of histocompatibility antigens, among which are Class I antigens containing HLA-A, -B and -C, and Class II antigens including HLADR, -DP and -DQ.
  • Class I antigens containing HLA-A, -B and -C
  • Class II antigens including HLADR, -DP and -DQ.
  • the biological function of these antigens delivers antigens to T lymphocytes, and Class I antigens are expressed in most nucleated cells, and the antigens transmitted through them are recognized by CD8 + cytotoxic T lymphocytes.
  • Class II antigens are expressed in dendritic cells, B lymphocytes, activated T lymphocytes, macrophages, etc., known as antigen-presenting cells, and function to deliver antigens to CD4 + T lymphocytes.
  • the antigens delivered to the T lymphocytes bind to the T lymphocyte receptors so that the T lymphocytes recognize the antigen.
  • tissue-compatible antigens derived from others other than their own are recognized at a high frequency.
  • About 1 to 10% of the donor or patient's total T lymphocytes recognize tissue-compatible antigens derived from the patient or donor, proliferate in response, and cause a series of immune responses. This is called "Alloresponse.” do.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may further include an adjuvant.
  • the adjuvant may be used without limitation as long as it is known in the art, but, for example, Freund's complete adjuvant or incomplete adjuvant may further be included to increase its immunity.
  • the pharmaceutical composition according to the present invention can be prepared in a form in which the active ingredient is incorporated into a pharmaceutically acceptable carrier.
  • pharmaceutically acceptable carriers include carriers, excipients and diluents commonly used in the pharmaceutical field.
  • the pharmaceutically acceptable carriers that can be used in the pharmaceutical composition of the present invention are not limited to these, but are lactose, dextrose, sucrose, sorbitol, mannitol, xylitol, erythritol, maltitol, starch, acacia rubber, alginate, gelatin, Calcium phosphate, calcium silicate, cellulose, methyl cellulose, polyvinyl pyrrolidone, water, methylhydroxybenzoate, propylhydroxybenzoate, talc, magnesium stearate and mineral oil.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can be used in the form of an oral dosage form such as powder, granule, tablet, capsule, suspension, emulsion, syrup, aerosol, external preparation, suppository, or sterile injectable solution, respectively, according to a conventional method. .
  • Solid preparations for oral administration include tablets, pills, powders, granules, capsules, and the like, and such solid preparations include at least one excipient in an active ingredient such as starch, calcium carbonate, sucrose, lactose, and gelatin. It can be prepared by mixing the back. In addition, lubricants such as magnesium stearate and talc may be used in addition to simple excipients.
  • Liquid preparations for oral administration include suspending agents, intravenous solutions, emulsions, syrups, etc.
  • Formulations for parenteral administration include sterile aqueous solutions, non-aqueous solvents, suspensions, emulsions, lyophilized preparations and suppositories.
  • Non-aqueous solvents and suspensions may include propylene glycol, polyethylene glycol, vegetable oils such as olive oil, and injectable esters such as ethyl oleate.
  • a base for suppositories witepsol, tween 61, cacao butter, laurin butter, and glycerogelatin may be used.
  • composition according to the present invention can be administered to a subject by various routes. All modes of administration can be expected, for example, by oral, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal injection.
  • the dosage of the pharmaceutical composition according to the present invention is selected in consideration of an individual's age, weight, sex, and physical condition. It is obvious that the concentration of the active ingredient contained in the pharmaceutical composition can be variously selected depending on the subject, and is preferably included in a concentration of 0.01 to 5,000 ⁇ g / ml in the pharmaceutical composition. If the concentration is less than 0.01 ⁇ g / ml, the pharmaceutical activity may not appear, and when it exceeds 5,000 ⁇ g / ml, it may exhibit toxicity to the human body.
  • a pharmaceutically effective amount of a calcineurin inhibitor included as an active ingredient is 1 to 5 mg / day / kg of body weight for cyclosporin, 001 to 01 mg / day / kg of body weight for tacrolimus, and metformin. 5 to 35 mg / day / kg body weight.
  • the pharmaceutically effective amount may be appropriately changed according to various factors such as the disease and its severity, the patient's age, weight, health status, sex, administration route, and treatment period.
  • the present invention includes 1) a compound represented by Formula 1 (hereinafter referred to as SD282 compound) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and 2) a calcinurin inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • SD282 compound a compound represented by Formula 1
  • a calcinurin inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof as an active ingredient.
  • the present invention in vitro 1) a compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and 2) calcineurin (Calcineurin) inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof by treating undifferentiated T cells Th1 cells or Differentiation into Th17 cells; Or a method for reducing the activity of Th1 cells or Th17 cells.
  • the present invention in vitro 1) a compound represented by the formula (1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and 2) calcineurin inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof differentiated T cells into Treg cells and Treg cells It provides a way to increase the activity of.
  • the present invention is a step of administering a pharmaceutically effective amount of the compound represented by Formula 1) or a pharmaceutically acceptable salt thereof and 2) a calcineurin inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof to an individual. It provides a method for preventing or treating transplant rejection or transplant rejection disease comprising a.
  • the present invention comprises the steps of administering an pharmaceutically effective amount of 1) a compound represented by Formula 1 or a pharmaceutically acceptable salt thereof and 2) a calcineurin inhibitor or a pharmaceutically acceptable salt thereof to an individual. It provides a method for immunosuppression and treatment after transplantation comprising a.
  • the pharmaceutical composition of the present invention is administered in a therapeutically effective amount or a pharmaceutically effective amount.
  • a pharmaceutically effective amount means an amount sufficient to treat a disease at a reasonable benefit / risk ratio applicable to medical treatment, and the “effective dose level” refers to the type and severity of the individual, the age, the sex, the activity of the drug, and the drug. Sensitivity to, ⁇ duration of administration, ⁇ route of administration and discharge rate, duration of treatment, ⁇ factors including concurrent drugs and other factors well known in the medical field
  • each well of a 96 well round bottom plate was injected with 2x10 5 normal recipients (Balb / c, responder) of CD4 + T cells. After that, for allogeneic transplantation, 2 x 10 5 normal recipient-derived T cell-removed splenocytes irradiated were added to each well. In addition, for allogeneic transplantation, donor (C57BL / 6, stimulator) -derived T cell-removed splenocytes were added to each well and cultured.
  • hematopoietic stem cells and spleen in the femur and tibia of donor mouse C57BL / 6 were subjected to whole-body irradiation (TBI) 800cGy with a donor mouse Balb / c (H-2k / d).
  • TBI whole-body irradiation
  • the cells were separated and transplanted into hematopoietic stem cells 5x10 6 and splenocytes 1x10 7 to the recipient mouse Balb / c (H-2k / d).
  • each drug was administered orally to analyze the effect of disease control.
  • mice Balb / c H-2k / d
  • H-2k / d mice were infused with the drug 3 days before skin transplantation.
  • An incision of 1 cm or less was made from the skin of the donor mouse C57BL / 6 (H-2k / b), and the end was dried well so that the end was not dried, and then transplanted into a BALB / C mouse to observe the rejection reaction.
  • the injection concentration of drugs was SD282 50mg / kg, FK506 10mg / kg.
  • the untreated allogeneic group and the untreated allogeneic group of Example 1-1 were placed as controls.
  • allogeneic models were treated with 50, 250 and 500 ⁇ M SD282 or 1, 5 nM FK506 alone.
  • 1, 5 nM of FK506 and 250 nM of SD282 were combined.
  • the cells were cultured for 4 days, and the T cell proliferation reaction of the cultured cells was observed according to the 3H-thymidine incorporation method, CFSE assay, or flow cytometry method to confirm the alloresponse.
  • T cell proliferation was not inhibited in the untreated allogenic group, but it was confirmed that the T282 proliferation response was significantly inhibited when SD282 of 250 nM or more was treated alone.
  • Fig. 1B it was confirmed that the inhibitory reaction was not effective enough to be similar to the untreated group in the FK506-only treatment group.
  • the combination treatment of SD282 and FK506 significantly inhibited the proliferation of allogenic T cells.
  • T cell proliferation was not inhibited in the untreated allogenic group, but proliferation of T cells was inhibited in the SD282 or FK506 treatment group, and SD282 and FK506 combination treatment was more effective. It was confirmed that proliferation was significantly suppressed in the group.
  • CI Combination Index (drug treatment)
  • the CI value was obtained by the following equation, and when it is 1 or less, it means that there is a synergistic action between the two combined drugs, and when it is 1 or more, an antagonism appears.
  • T cell response regulates the activity of T 17 (T helper 17 cell) / IL-17 (Interleukin 17), and the IL-17 is classified as an inflammatory cytokine.
  • T cells were effectively inhibited by treatment of SD282 and FK506 alone or in combination, and the inhibition of inflammatory cytokine activity by SD282 and FK506 alone or in combination was confirmed.
  • the untreated syngenic group and the untreated allogenic group of Example 1-1 were placed. Allogeneic models were treated with 50, 250 and 500 ⁇ M SD282 or 1, 5 nM FK506 alone. In addition, 1, 5 nM of FK506 and 250 ⁇ M SD282 were treated in combination.
  • Example 1-1 The allogeneic model of Example 1-1 was treated with 20, 500 ⁇ M SD282 or 1, 5 nM FK506 alone.
  • each 1, 5nM FK506 and 250 ⁇ M SD282 were treated in combination to give Th17 cell differentiation conditions to the separated T cells, and cultured for 4 days to induce differentiation of Th17 cells.
  • Foxp3 Treg cells were analyzed with flow cells and homogeneous reactions were confirmed.
  • the combination administration has an effect of reducing the activity of pathogenic Th17 and increasing the activity of Treg.
  • the experiment as shown in FIG. 5 was conducted on the GVHD animal model of Example 1-2, and after the occurrence of GVHD, 50 or 100 mg / kg SD282 or 10 mg / kg FK506 was treated alone. In addition, after 10 mg / kg of FK506 and 50 or 100 mg / kg SD282 were treated in combination and administered orally, the weight (g), weight change rate (%), and weight change rate (%) for the GVHD mouse model was confirmed.
  • the GVHD mouse model had a 20, 50 or 100 mg / kg SD282 treatment group alone and a 2 or 10 mg / kg FK506 treatment group alone.
  • a 50 mg / kg SD282 + 2 or 10 mg / kg FK506 combination treatment group was placed to confirm a disease score.
  • the experiment as shown in FIG. 5 was conducted on the GVHD animal model of Example 1-2, and after GVHD was generated, 50 mg / kg SD282 or 10 mg / kg FK506 was treated alone. In addition, after 10 mg / kg of FK506 and 50 mg / kg SD282 were treated in combination and administered orally, skin, lungs, liver, large intestine, small intestine, and membrane intestine were administered. The therapeutic effect of GVHD was confirmed through histological score indicating the severity of the condition.
  • FIG. 8A it was confirmed that histological values were lowered in the skin, lung and liver in the D282 and FK506 combination treatment group compared to the FK506 treatment group alone.
  • Figure 8b it was confirmed that the histological values of the small intestine, the large intestine, and the membrane intestine are also low.
  • GVHD animal model of Example 1-2 as shown in FIG. 5, after the occurrence of GVHD, 50 mg / kg SD282 or 10 mg / kg FK506 was treated alone.
  • each 10mg / kg of FK506 and 50mg / kg SD282 was treated in combination and administered orally, and the activity of each cell and cytokine was confirmed.
  • the site transplanted 21 days after skin transplantation into a skin animal model under the same treatment conditions as in the above example The activity levels of STAT3, phosphorylated STAT3 (pSTAT3 (Tyr705) and pSTAT3 (Ser727)), IL-17 and Foxp3 were confirmed.
  • the expression group of SD282 and FK506 was significantly reduced in expression of STAT3, phosphorylated STAT3 (pSTAT3 (Tyr705) and pSTAT3 (Ser727)), and IL-17 compared to the single treatment group.
  • STAT3 phosphorylated STAT3
  • pSTAT3 Tyr705
  • pSTAT3 Ser727
  • Foxp3 expression was increased, suggesting that the combination treatment of SD282 and FK506 has excellent immune activity regulation.
  • T cell proliferation was not inhibited in the untreated allogenic group, but it was confirmed that when SD282 of 50 nM or more was treated alone, the T cell proliferation reaction was suppressed compared to the control group.
  • Fig. 13B it was confirmed that the inhibitory reaction in the FK506-only treatment group was not so effective as to be similar to that of the untreated group.
  • the proliferation of allogenic T cells was significantly inhibited in the SD282-only treatment group or the combination treatment group of SD282 and FK506.
  • Example 7 Confirmation of inhibition of inflammatory cytokine activity by normal or combined treatment of SD282 and FK506 in normal human blood cells
  • PBMC Peripheral blood cells
  • immunomodulatory subtype cells CD4 + Treg, CD8 + Treg, plasmacytoid Dendritic cells
  • CD4 + Treg, CD8 + Treg, plasmacytoid Dendritic cells increase and transplantation of immune cell subtypes (central memory Th17, transient B) , plasma B cell).
  • PBMC peripheral blood cells
  • FIG. 18A As a result of analyzing which genes are actually increased or decreased under the above conditions, it was confirmed in FIG. 18A that the inhibitory effect of the STAT3 pathway in combination administration compared to SD282 alone was excellent. As shown in FIG. 18B, the combination of SD282 alone administration It was confirmed that the effect of restoring mitochondrial function was excellent, and as shown in FIG. 18C, it was confirmed that the effect of suppressing inflammatory cell death of the combination administration compared to SD282 alone was excellent, and as shown in FIG. 18D, the cell migration inhibition of the combination administration compared to SD282 alone The effect was confirmed to be excellent.
  • mice and liver transplant patients After each drug was treated for 48 hours in immune cells of mice and liver transplant patients, cells were obtained and migration assay was performed. 2x10 5 cells were loaded on the upper transwell, and no treatment was performed in the lower chamber or sDF-1 treatment was performed for 2 hours. The number of cells shifted after 2 hours was counted.
  • Example 9 Evaluation of effectiveness in the avatar model of a liver transplant patient
  • NSG mice are injected intravenously with human-derived peripheral blood mononuclear cells (PBMCs), followed by intravenous liver stellate cell lines.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • Intra-injection and injection of CCl 4 caused liver damage (liver fibrosis).
  • NSG mice were injected intravenously with PBMC of normal or liver disease patients (HBV-induced liver cirrhosis patients or alcoholic cirrhosis patients), and intravenously injected with hepatic stellate cells and CCl 4 one day later, and 20 days later. Tissue analysis was performed at 39 days after engraftment was confirmed and mice were sacrificed.
  • Inflammation and fibrosis are induced by blood infusion of transplanted patients than in normal people in the liver injury induction model (manufactured in 9-1) by CCL4 infusion with blood infusion in normal or liver transplant patients. The degree of inflammatory and fibrosis according to treatment alone or in combination was confirmed.

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Abstract

신규 화합물 및 칼시뉴린 억제제를 포함하는 이식 거부 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 병용투여는 in vivo 또는 in vitro 상의 동종동형(allogenic) 모델, 이식거부 질환 모델, 피부이식 모델 및 간이식 환자에서, 1) 병인성 Th1 세포 또는 Th17 세포의 활성을 감소시키며, 2) Treg의 활성을 증가시키며, 3) 단독 투여시 나타나는 조직 손상과 같은 부작용을 억제하는 효과를 갖으며, 4) 다양한 병인성 경로를 억제하며, 5) 염증세포의 사멸을 억제하고, 6) 미트콘드리아의 활성을 증가시켜 기존 면역억제제 단독 투여시 발생할 수 있는 부작용을 완화함과 더불어 이식 거부 반응을 억제한다. 따라서, 이를 이식 거부 반응 또는 이식 후 발생 가능할 수 다양한 면역 질환과 관련된 약학 분야에 이용될 수 있다.

Description

신규 화합물 및 칼시뉴린 억제제를 포함하는 이식 거부 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 및 치료용 조성물
신규 화합물 및 칼시뉴린 억제제를 포함하는 이식 거부 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.
면역억제제는 항원에 대하여 항체를 만드는 체액성 면역반응이나 세포성 면역반응을 차단하거나 저하시키는 약물로, 주로 장기이식 후 발생하는 면역 거부반응이나 골수이식 후의 이식편대숙주병(graft-versus-host disease)을 치료하는데 사용되어 왔다. 뿐만 아니라, 면역억제제는 낭창(lupus), 류마티스 관절염(rheumatoid arthritis)과 같은 자가면역질환과 알러지, 아토피와 같은 과면역반응, 염증성 질환의 증상을 장기간에 걸쳐 치료하는 데에도 중요하게 쓰인다.
현재 사용되고 있는 면역억제제는 작용기작에 따라 코티코스테로이드(corticosteroid), 대사길항물질(antimetabolite), 칼시뉴린 억제제(calcineurin inhibitor), 라파마이신 타겟 억제제(mammalian target of rapamycin inhibitor), 항체(antibody) 등으로 나뉘는데, 이들은 각기 다른 단계에서 면역계의 T 세포의 증식 또는 활성화를 차단함으로써 면역억제 효과를 낸다(Dalal, P et al. Int. J. Nephrol. Renovasc. Dis. 3:107-115 (2010)). 면역억제제의 주요 표적인 T 세포는 인체의 흉선에서 생성되어 주로 세포 매개성 면역에 관여하는 1형 보조 세포(Th1) 또는 체액성 면역에 관여하는 2형 보조 세포(Th2)로 분화한다. 두 T 세포군은 서로 과활성되지 않도록 견제하고 있다가 균형이 깨지면 자가면역이나 과민반응 같은 이상 반응이 일어나는 것으로 알려져 있다. 이외에도 면역반응을 조절할 수 있는 면역조절 T 세포(Treg)나 Th17과 같은 새로운 종류의 T 세포들이 알려졌다. Treg은 Th1 세포 활성을 조절할 수 있으며, 비정상적으로 활성화된 면역 세포의 기능을 억제하고 염증 반응을 조절한다. 이와 반대로 Th17 세포는 IL-17을 분비하며, 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시킨다. 최근 이들 Treg이나 Th17이 면역질환 치료제의 새로운 표적으로 크게 부각되어 다양한 면역조절 치료제 연구가 이루어지고 있다(Wood, K J et al., Nat. Rev. Immunol. 12(6):417-430, 2012; Miossec, P et al., Nat. Rev. Drug Discov. 11(10):763-776, 2012; Noack, M et al., Autoimmun. Rev. 13(6):668-677, 2014).
한편, 이식(transplantation)이란 한 개체로부터 세포나 조직 혹은 기관, 즉 이식편(graft)를 취하여 다른 개체로 이를 전이시키는 과정을 말한다. 이식편을 제공한 개체를 공여자(donor)라 하며, 이를 받는 개체를 수용자(recipient) 혹은 숙주(host)라고 한다. 이식된 장기의 경우에는 이식편의 세포표면에 있는 조직적합성 항원(이식항원)에 대하여 면역학적 반응에 의해 거부반응이 발생한다. 면역 억제되지 않은 수용자에서 이식편이 장기간 생착되는 경우는 조직적합성이 완전히 일치하거나 대부분이 일치할 때에 한하며, 공여자와 수용자간의 유전학적 관계가 이식편의 생착기간을 크게 좌우하는 인자가 된다. 일반적으로 자가이식(autograft)과 동계이식(isograft)에서는 거의 거부반응이 발생하지 않으나, 이종이식(allograft)에서는 거의 대부분에서 거부반응이 발생한다. 조직이나 기관 등의 이식 시 공여자와 수여자 간의 유전적 상이성은 쉽게 숙주 면역 체계에 의해 감지되어 이식 조직에 대한 숙주의 반응(host-versus-graft response) 및/또는 숙주에 대한 이식 조직의 반응(graft-versus-host response)을 유발한다. 이러한 사실은 조직과 기관 이식 시 나타나는 거부 반응에 의해 입증되었다(Nash 등, Blood, 80, 1838 - 1845, 1992). 또한, 이식된 세포의 표면에 존재하는 MHC에 대한 면역 반응으로 활성화된 T 세포들에 의해 타가이식된 조직의 거부반응이 일어난다는 보고가 있었다(Benichou 등, J. Exp. Med. 175, 305 - 308, 1992; Benichou 등, J. Immunol. 162, 352 - 358, 1998; Fangmann 등, J. Exp. Med. 175, 1521 - 1529, 1992; Lombardi 등, Proc. Acad. Sci. USA, 86 , 4190 - 4194, 1989).
이러한 이식 거부 반응 또는 이식 거부 질환을 억제하기 위한 T 세포를 비특이적으로 억제하는 면역억제제는 일반적으로 세포독성, 면역저하로 인한 감염, 당뇨병, 진전(tremor), 두통, 설사, 고혈압, 오심, 신기능 장애 등의 부작용을 동반하기 때문에 장기간 치료 효과가 지속되기 어렵다는 단점이 있다. 이에 심각한 부작용을 줄이고 면역억제 치료 효과를 높이기 위해 특히 장기이식 분야에서 서로 다른 작용기작의 면역억제제를 병용투여하거나 대체하는 방법들이 시도되어 오고 있으나, 최적화된 면역억제제의 병용투여의 조합이나 치료법은 아직 미비한 상태이다.
따라서 기존 면역억제제의 부작용을 줄이고 치료 효과는 향상시킬 수 있는 새로운 면역억제 또는 면역조절 요법의 개발과 더욱 안전하고 부작용이 적은 새로운 면역억제제 후보 물질의 발굴이 시급한 실정이다.
이에 본 발명자들은 SD282라는 화합물 및 칼시뉴린 억제제를 병용 처리한 결과, 이식 거부 반응을 억제하고, T 세포를 비특이적으로 억제하는 부작용등을 줄이면서 이식 후 발생 가능할 수 있는 면역 질환을 예방 및 치료함을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 1) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 2) 칼시뉴린(Calcineurin) 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 이식 거부(transplantation rejection) 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
또한 본 발명의 목적은 1) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 2)칼시뉴린(Calcineurin) 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 이식 후 면역억제용 약학적 조성물을 제공할 수 있다.
상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 1) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 2) 칼시뉴린(Calcineurin) 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 이식 거부(transplantation rejection) 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한 본 발명은 1) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 2) 칼시뉴린(Calcineurin) 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 이식 후 면역억제용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 SD282 화합물 및 칼시뉴린 억제제의 병용투여는 in vivo 또는 in vitro 상의 동종동형(allogenic) 모델, 이식거부 질환 모델, 피부이식 모델 및 간이식 환자에서, 1)병인성 Th1 세포 또는 Th17 세포의 활성을 감소시키며, 2)Treg의 활성을 증가시키며, 3) 단독 투여시 나타나는 조직 손상과 같은 부작용을 억제하는 효과를 갖으며, 4)다양한 병인성 경로를 억제하며, 5)염증세포의 사멸을 억제하고, 6)미트콘드리아의 활성을 증가시켜 기존 면역억제제 단독 투여시 발생할 수 있는 부작용을 완화함과 더불어 이식 거부 반응을 억제한다. 따라서, 이를 이식 거부 반응 또는 이식 후 발생 가능할 수 다양한 면역 질환과 관련된 약학 분야에 이용될 수 있다.
도 1은 마우스 동종이형 이식 모델에서 SD282+FK506 병용 처리에 의한 T 세포 증식 반응을 3H-thymidine incorporation 분석하여 확인한 도이다.
도 2의 (A)는 마우스 동종이형 이식 모델에서 SD282+FK506 병용 처리에 의한 T 세포 증식 반응을 유세포 분석하고 (B)는 이를 그래프로 확인한 도이다.
도 3은 마우스 동종이형 이식 모델에서 SD282+FK506 병용 처리에 의한 병인성 Th17 세포의 활성 억제 효과를 확인한 도이다.
도 4는 마우스 동종이형 이식 모델에서 SD282+FK506 병용 처리에 의한 Treg의 활성 증가 효과를 확인한 도이다.
도 5는 이식편대숙주병(GVHD) 동물 모델에서의 병용투여의 효과를 확인하기 위한 실험 방법을 나타낸 도이다.
도 6은 이식편대숙주병(GVHD) 동물 모델에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 GVHD 치료효과를 확인한 도이다.
도 7은 이식편대숙주병(GVHD) 동물 모델에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 GVHD 치료효과를 확인한 도이다.
도 8는 이식편대숙주병(GVHD) 동물 모델에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 장기 손상억제 효능을 확인한 도이다(도 8a: 페, 간, 피부; 도 8b: 대장, 소장, 막창자).
도 9는 이식편대숙주병(GVHD) 동물 모델에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 면역세포 조절효과를 확인한 도이다
도 10은 피부 이식 동물 모델에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 효과를 확인하기 위한 실험의 개략도이다.
도 11은 피부 이식 동물 모델에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 피부 이식 후, 이식편 생존률 증가 및 병인억제 효과를 확인한 도이다.
도 12는 피부 이식 동물 모델에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 피부 이식 후 바이오마커의 변화를 확인한 도이다.
도 13은 human allo-response 조건에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 면역조절 효과를 확인한 도이다.
도 14는 human allo-response 조건에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 면역조절 효과를 확인한 도이다.
도 15는 human allo-response 조건에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 면역조절 효과를 확인한 도이다.
도 16은 간이식 환자 면역세포에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 면역세포 마커 발현 변화를 확인한 도이다.
도 17은 간이식 환자에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 활성이 억제된KEGG 경로를 나타낸 도이다.
도 18은 간이식 환자에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 병인세포 제어 및 유전자 조절효과를 확인한 도이다(18a: STAT 제어 효과, 18b:미트콘드리아 기능 회복 효과, 18c: 염증성세포 사멸 제어 효과; 18d: 세포이동 조절 효과)
도 19은 간이식 환자에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 세포 사멸 억제효과를 확인한 도이다.
도 20은 간이식 모델에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 세포 이동 억제효과를 확인한 도이다(도 20a: 마우스; 도 20b: 인간)
도 21은 간이식 환자 아바타모델에서 염증 및 섬유화(fibrosis) 정도를 확인한 도이다.
본 발명은 1) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물(이하, SD282 화합물이라고 함) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 2) 칼시뉴린(Calcineurin) 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 이식 거부(transplantation rejection) 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명의 SD282 화합물 및 칼시뉴린 억제제의 병용투여는 in vivo 또는 in vitro 상의 동종동형(allogenic) 모델, 이식거부 질환 모델, 피부이식 모델 및 간이식 환자에서, 1)병인성 Th1 세포 또는 Th17 세포의 활성을 감소시키며, 2)Treg의 활성을 증가시키며, 3)단독 투여시 나타나는 조직 손상과 같은 부작용을 억제하는 효과를 갖으며, 4)다양한 병인성 경로를 억제하며, 5)염증세포의 사멸을 억제하고, 6)미트콘드리아의 활성을 증가시키고, 7)세포 이동을 감소시켜, 단독 투여시 나타나는 부작용을 억제하면서, 다양한 종류의 이식 거부 반응을 효과적으로 억제한다.
본 발명의 화학식 1의 화합물과 칼시뉴린 억제제의 중량비는 1:1 내지 5000:1 범위로 사용할 수 있고, 바람직하게는 1:1 내지 2000:1, 1:1 내지 1000:1, 1:1 내지 500:1. 1:1 내지 300:1, 1:1 내지 200:1, 1:1 내지 100:1, 1:1 내지 50:1, 1:1 내지 10:1, 1:1 내지 5:1 일수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 용어, "이식 거부(transplantation rejection)"는 이식 후 이식된 조직을 수여자의 면역체계가 비자기(non-self)로 인식하여 이식된 장기를 공격하여 제거하고자 하는 반응을 장기 이식 거부라 한다. 이식 거부에 관여하는 가장 중요한 요인은 major histocompatibility complex(MHC) 이고, minor histocompatibility complex 또한 관련이 있다고 알려져 있다. 거부반응은 세포매개면역(cellmediated immune response)와 체액 면역(humoral immune response)이 모두 관여한다. 세포매개반응의 경우 수용자의 림프구가 이식장기의 공여자 MHC를 만나 (CD4 T cell-type II MHC molecule, 혹은 CD8 T cell-type I MHC molecule) 시작된다. 활성화된 T 세포는 cytokine을 분비, 혈관의 투과성이 증가되고, macrophage 등의 monocytes의 침윤을 일으키게 된다. 그 결과 미세혈관의 손상, 조직 허혈, 이식조직의 및 세포의 파괴가 일어나게 된다.
본 발명의 용어, "SD282 화합물"은 제10-1613371호에 공지되고, 하기와 같은 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 모두 포함할 수 있다.
[화학식 1]
[규칙 제91조에 의한 정정 23.12.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-39a
본 발명의 용어, "칼시뉴린(Calcineurin) 억제제"는 면역억제제의 한 종류로, T-림프구에서 mRNA의 형성을 방해하여 IL-2가 생성되는 것을 저해하는 것으로, 사이크로스포린 (Cyclosporine; 화학식 2의 왼쪽)과 FK-506(Tacrolimus, 타크로리무스; 화학식 2의 오른쪽)가 대표적이다.
[화학식 2]
[규칙 제91조에 의한 정정 23.12.2019]　
Figure WO-DOC-FIGURE-39b
본 발명의 용어, "FK-506"은 스트렙토마이세스 쯔꾸바엔시스(Streptomyces tsukubaensis)로부터 분리되었고, 사이클로스포린과 구조적으로는 다르지만 작용기전은 유사하게 T-림프구를 억제하여 면역억제 기능을 나타내는데, 약의 효과는 사이클로스포린의 10~100배의 효능을 가진다고 알려져 있다.
칼시뉴린은 면역계의 T 세포뿐 아니라 다른 세포와 조직에서도 발현되기 때문에 사이클로스포린이나 타크로리무스의 칼시뉴린 억제 작용은 면역억제 외에 다양한 부작용을 동반한다(Liu, E H et al, Nat Immunol 8(1):25-30, 2007) 면역억제제의 부작용은 장기적으로 안정적이고 성공적인 장기이식과 이식 환자의 생존률에심각한 영향을 미치며, 나아가 면역억제가 필요한 장기이식 이외의 질환의 치료에도 큰 문제가 된다. 상기 칼시뉴린 면역 억제제의 부작용 중 특히 중요한 것으로 급성, 만성 신장 독성(nephrotoxicity)이 있다(Naesens, M et al, Clin J Am Soc Nephrol 4(2):481-508, 2009). 칼시뉴린 면역억제제가 유발하는 신장 독성은 세뇨관내 공포생성, 간질 섬유화, 세동맥의 초자화 등의 신장의 조직적 변화와 유효신혈류와 사구체 여과율 감소 등의 신장 기능 저하로 나타난다.
본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기와 같은 칼시뉴린 면역억제제의 Treg는 억제시키고 병인성 Th17 세포를 증가시키는 부작용을 해소하기 위하여, 칼시뉴린 면역억제제인 "FK-506"에 "SD282 화합물"을 병용하여 처리하였다. 그 결과, in vivo 및 in vitro 상에서 Treg를 증가시키고 병인성 Th17 세포를 감소시켜, 칼시뉴린 면역억제제의 부작용을 완화함을 확인하였다.
상기 이식 거부 반응은 세포, 혈액, 조직 및 장기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 이식 거부 반응이고, 바람직하게는 골수 이식, 심장 이식, 각막 이식, 장 이식, 간 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 신장 이식 및 피부이식의 거부반응으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 이식 거부 질환은 이식편대숙주병(GVHD,graft-versus-host disease)을 포함하나, 본 발명의 SD282 또는 FK-506의 단독 또는 병용 처리에 의하여 이식 거부 반응과 관련된 질환이라면, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 이식 후 면역질환을 치료할 수 있는데, 상기 면역질환은 자가면역질환 또는 염증성 질환을 포함할 수 있다.
본 발명에서 용어, "자가면역질환"은 자기항원에 대한 생체의 무반응을 면역학적 무반응성(immunologic unresponsiveness) 또는 관용(tolerance)이라 하며, 이러한 자기관용을 유도하거나 계속 유지하는데 있어서 문제가 생기게 되면 자기항원에 대하여 면역반응이 일어나게 되고, 이로 인하여 자신의 조직을 공격하는 현상이 발생하는데 이러한 과정에 의해 발생되는 질환을 의미한다.
본 발명에서 용어, "염증성 질환"이란 염증유발인자 또는 방사선조사 등 유해한 자극으로 인해 인체 면역체계를 과도하게 항진시켜 대식세포와 같은 면역세포에서 분비되는 TNF-α(tumor necrosis factor-α), IL-1(interleukin-1), IL-6, 프로스타글란딘(prostagladin), 루코트리엔(luecotriene) 또는 산화질소(nitric oxide, NO)와 같은 염증유발물질(염증성 사이토카인)에 의해 유발되는 질환을 말한다.
상기 면역질환은 류마티스 관절염, 베체트병, 다발성 근육염 또는 피부 근육염, 자가면역 혈구감소증, 자가면역 심근염, 아토피피부염, 천식, 일차성간경변, 피부근염, 굿파이처 증후군, 자가면역 뇌수막염, 쇼그렌 증후군, 루프스, 애디슨병, 원형 탈모증, 강직성 척수염, 자가면역성 간염, 자가면역성 이하선염, 크론병, 인슐린 의존성 당뇨병, 이영양성 수포성 표피박리증, 부고환염, 사구체 신염, 그레이브스병, 길랑바레 증후군, 하시모토병, 용혈성 빈혈, 다발성 경화증, 중증 근무력증, 심상천포창, 건선, 류마티스열, 유육종증, 피부 경화증, 척추관절증, 갑상선염, 혈관염, 백반증, 점액수종, 악성빈혈, 미토콘드리아 관련 증후군 및 궤양성 대장염이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 조성물은 T 세포의 증식을 억제하고, 미분화 T 세포의 Th1 세포 또는 Th17 세포로의 분화; 또는 Th1 세포 또는 Th17 세포의 활성을 감소시킬 수 있다.
또한, 상기 조성물은 미분화 T 세포의 Treg 세포로의 분화 및 Treg 세포의 활성을 증가시키나, 이에 제한되지 않는다.
상기 Th1 세포의 분화에 대한 최근 연구 결과에 따르면, Th1 세포의 활성을 조절할 수 있는 새로운 그룹인 면역조절 T 세포(Treg)의 존재가 알려지면서 이를 이용한 면역질환의 치료에 대한 연구가 대두되고 있는데, Treg 세포는 비정상적으로 활성화된 면역세포의 기능을 억제하여 염증 반응을 제어하는 특성이 있어, Treg 세포의 활성을 증가시키는 작용을 통해 면역질환을 치료할 수 있다.
또한, Treg 세포 이 외에 분화 과정에서 만들어지는 또 다른 그룹으로 Th17 세포가 있는데, Th17 세포는 미분화 T세포의 분화 과정에서 Treg 세포의 분화와 유사한 과정을 거치며 형성되는 것으로 알려져 있다. 즉, Treg 세포와 Th17 세포의 분화는 공통적으로 TGF-β의 존재 하에서 이루어지지만 Treg 세포의 경우 IL-6을 필요로 하지 않는 반면, Th17 세포의 경우에는 TGF-β와 함께 IL-6가 존재하는 상황에서 분화를 한다. 또한, 분화된 Th17 세포는 IL-17을 분비하는 것을 특징으로 한다.
상기 Th17 세포는 Treg 세포와는 달리 면역질환에서 보이는 염증반응의 최전방에서 관여하여 염증 반응의 신호를 최대화시켜 질병의 진행을 가속화시키는 것이 밝혀지고 있다. 그러므로 면역질환 중 Treg 세포에 의해 제어되지 않는 자가면역질환의 경우, Th17 세포 활성의 억제를 표적으로 한 면역질환의 치료제 개발이 크게 부각되고 있다.
본 발명의 용어, "T 세포"는 면역 반응에 관여하는 세포로, 특정 세포 표면 마커(cell surface marker)를 발현하는 T 세포 집단(population)을 의미한다.
사람에게는 여러 종류의 조직적합항원이 있는데, 그 중 HLA-A, -B,-C를 포함하는 Class I 항원이 있고, HLADR,-DP, -DQ를 포함하는 Class II 항원이 있다. 이들 항원의 생물학적 기능은 T 림프구에게 항원을 전달하며,Class I 항원은 대부분의 유핵세포에서 발현되며 이를 통해 전달되는 항원들은 CD8+ 세포독성 T 림프구에 의해 인식된다. Class II 항원은 항원제시세포로 알려진 수지상세포, B 림프구, 활성화된 T 림프구, 큰포식세포 등에서 발현되며, CD4+ T 림프구에게 항원을 전달하는 기능을 한다. T 림프구에 전달된 항원들은 T 림프구 수용체에 결합함으로써 T 림프구가 항원을 인식하게 되는데 이식하는 과정에서 자신의 것이 아닌 다른 사람으로부터 유래한 조직적합항원을 높은 빈도로 인식하게 된다. 공여자 또는 환자의 전체 T 림프구 중 1~10% 정도가 환자 또는 공여자로부터 유래한 조직적합항원을 인식하여 이에 대한 반응으로 증식하게 되고, 일련의 면역반응을 일으키게되는데 이를 "동종반응(Alloresponse)"라고 한다.
본 발명의 약학 조성물에는 보조제(adjuvant)를 추가로 포함할 수 있다. 상기 보조제는 당해 기술분야에 알려진 것이라면 어느 것이나 제한 없이 사용할 수 있으나, 예를 들어 프로인트(Freund)의 완전 보조제 또는 불완전 보조제를 더 포함하여 그 면역성을 증가시킬 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 유효성분을 약학적으로 허용된 담체에 혼입시킨 형태로 제조될 수 있다. 여기서, 약학적으로 허용된 담체는 제약 분야에서 통상 사용되는 담체, 부형제 및 희석제를 포함한다. 본 발명의 약학 조성물에 이용할 수 있는 약학적으로 허용된 담체는 이들로 제한되는 것은 아니지만, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로스, 메틸 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다.
본 발명의 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀전, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.
제제화할 경우에는 통상 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 그러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제, 예를 들면 전분, 칼슘 카르보네이트, 수크로스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데, 일반적으로 사용되는 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수용성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제 및 좌제가 포함된다. 비수용성용제, 현탁제로는 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브유와 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식이 예상될 수 있는데, 예를 들면 경구, 정맥, 근육, 피하, 복강내 주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명에 따른 약학 조성물의 투여량은 개체의 연령, 체중, 성별, 신체 상태 등을 고려하여 선택된다. 상기 약학 조성물 중 포함되는 유효성분의 농도는 대상에 따라 다양하게 선택할 수 있음은 자명하며, 바람직하게는 약학 조성물에0.01 ~ 5,000 ㎍/ml의 농도로 포함되는 것이다. 그 농도가 0.01 ㎍/ml 미만일 경우에는 약학 활성이 나타나지 않을 수 있고, 5,000 ㎍/ml를 초과할 경우에는 인체에 독성을 나타낼 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물에 유효성분으로 포함되는 칼시뉴린 억제제의 약학적으로 유효한 양으로는 사이클로스포린의 경우 1 내지 5mg/day/체중kg, 타크로리무스의 경우 001 내지 01mg/day/체중kg, 메트포민의 경우 5 내지 35mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 질환 및 이의 중증 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등과 같은 여러 인자에 따라 적절히 변화할 수 있다.
또한 본 발명은 1) 화학식 1로 표시되는 화합물(이하, SD282 화합물이라고 함) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 2) 칼시뉴린(Calcineurin) 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 이식 후 면역억제용 조성물을 제공할 수 있다.
또한 본 발명은 시험관 내에서 1) 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 2) 칼시뉴린(Calcineurin) 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 미분화 T 세포에 처리하여 Th1 세포 또는 Th17 세포로의 분화; 또는 Th1 세포 또는 Th17 세포의 활성을 감소시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 시험관 내에서 1) 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 2) 칼시뉴린 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 미분화 T 세포의 Treg 세포로의 분화 및 Treg 세포의 활성을 증가시키는 방법을 제공한다.
또한 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 상기 1) 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 2)칼시뉴린 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 이식 거부 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 또는 치료 방법을 제공한다. 또한, 본 발명은 약학적으로 유효한 양의 1) 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 2) 칼시뉴린 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분을 개체에 투여하는 단계를 포함하는 이식 후 면역억제 및 치료 방법을 제공한다.
　본 발명의 약학적 조성물은 치료적 유효량 또는 약학으로 유효한 양으로 투여한다.　용어　"약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며,　유효 용량 수준은 개체 종류 및 중증도,　연령,　성별,　약물의 활성,　약물에 대한 민감도,　투여 시간,　투여 경로 및 배출 비율,　치료기간,　동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다
하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 실험 방법
1-1. in vitro 상의 동종동형 이식(syngenic graft transplantation) 또는 동종이형 이식(allogenic transplantation) 모델
In vitro 상에서, 96 웰 둥근 바닥 플레이트(round bottom plate)의 각 웰에 2x105개의 정상 수여자(Balb/c, responder)의 CD4+T 세포를 주입하였다. 그 후, 동종동형 이식을 위하여, 방사선 조사시킨 2x105개의 정상 수여자 유래 T 세포 제거 비장세포를 상기 각 웰에 추가하였다. 또한, 동종이형 이식을 위하여, 공여자(C57BL/6, stimulator) 유래 T 세포 제거 비장세포를 상기 각 웰에 추가하여 이를 혼합 배양하였다.
1-2. 급성 이식편대숙주병(Acute Graft versus host disease, aGVHD) 동물 모델
aGVHD 모델을 제작하기 위하여, 수여마우스 Balb/c (H-2k/d)를 전신방사선조사(TBI) 800cGy를 하고 공여마우스 C57BL/6(H-2k/b)의 대퇴골과 경골에서 조혈모세포와 비장세포를 분리하여 조혈모세포 5x106과 비장세포 1x107을 수여마우스 Balb/c(H-2k/d)에 이식하였다. aGVHD 발생 후 각각의 약물을 경구 투여하여 질환 제어 효력을 분석하였다.
1-3. 피부 이식 동물 모델
피부 이식 동물 모델을 제작하기 위하여, 수여마우스 Balb/c(H-2k/d)는 피부 이식 전 3일전부터 약물을 주입하였다. 공여 마우스 C57BL/6(H-2k/b)의 스킨으로부터 1cm 이하의 incision을 만들고 끝이 말리지 않도록 잘 편 다음 BALB/C 마우스에 이식한 후 경과를 관찰하여 거부반응을 관찰하였다. 약물의 주입농도는 SD282 50mg/kg, FK506 10mg/kg로 주입되었다.
실시예 2. 마우스 세포에서 SD282 및 FK506의 단독 또는 병용처리에 의한 T 세포 증식 반응 확인
SD282 및 FK506의 단독 또는 병용처리에 의한 T 세포 증식 반응을 확인하기 위하여, 대조군으로서 상기 실시예 1-1의 무처리 동종동형(syngenic) 군 및 무처리 동종이형(allogenic) 군을 두었다. 또한, 동종이형 모델에 50, 250 및 500 μM SD282 또는 1, 5 nM의 FK506을 단독처리 하였다. 또한, 각 1, 5 nM의 FK506 및 250 nM의 SD282를 병용 처리하였다. 처리 후 4일간 배양하고, 3H-thymidine incorporation 방법, CFSE assay 또는 유세포 분석 방법에 따라 배양된 세포의 T 세포 증식 반응을 관찰하여 동종반응(Alloresponse)을 확인하였다.
도 1a에 나타낸 바와 같이, 무처리 동종이형(allogenic) 군에서는 T 세포 증식이 억제되지 않았으나, 250 nM 이상의 SD282을 단독 처리 시, T 세포 증식 반응을 유의적으로 억제함을 확인하였다. 또한, 도 1b에 나타낸 바와 같이, FK506의 단독 처리군에서는 억제 반응이 무처리 군과 유사할 정도로 효과적이지 않음을 확인하였다. 그러나, SD282 및 FK506의 병용 처리에서는 동종이형(allogenic) T 세포의 증식을 유의적으로 억제함을 확인하였다.
또한, 도 2a 및 2b에 나타낸 바와 같이, 무처리 동종이형(allogenic) 군에서는 T 세포 증식이 억제되지 않았으나, SD282 또는 FK506 단독 처리군에서는 T 세포의 증식이 억제되었으며, 더욱 효과적으로 SD282 및 FK506 병용 처리군에서 증식이 현저히 억제됨을 확인하였다.
또한, SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 시너지 효과(synergistic effect)를 확인하기 위하여, CI(Combination Index (drug treatment))값을 확인하였다. CI 값은 하기 수학식으로 구하였으며, 1 이하일 경우 두 병용 약물간의 시너지 작용이 있고, 1 이상일 경우 길항작용(antagonism)이 나타나는 것을 의미한다.
그 결과, 본 발명의 SD282 및 FK506의 CI 값은 0.6임을 확인하여, 1보다 더 작은 값이 나타나 우수한 시너지 효과가 나타남을 확인하였다.
[수학식 1]
CI=(D comb)1/(D alone)1 + (D comb)2/(D alone)2
실시예 3. 마우스 세포에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 Th17 또는 Treg 활성 확인
3-1 병인성 Th17 억제 효과 확인
T 세포 반응은 Th17(T helper 17 cell)/IL-17(Interleukin 17)의 활성을 조절하고, 상기 IL-17는 염증성 사이토카인으로 분류된다. 상기 실시예 2에 SD282 및 FK506의 단독 또는 병용 처리에 의하여 T 세포가 효과적으로 억제됨을 확인하였는 바, SD282 및 FK506의 단독 또는 병용처리에 의한 염증성 사이토카인의 활성 억제를 확인하였다. 대조군으로서 상기 실시예 1-1의 무처리 동종동형(syngenic) 군 및 무처리 동종이형(allogenic) 군을 두었다. 동종이형 모델에 50, 250 및 500 μM SD282 또는 1, 5 nM의 FK506을 단독처리 하였다. 또한, 각 1, 5 nM의 FK506 및 250 μM SD282를 병용 처리하였다. 상기 처리 후 4일간 배양한 후, anti-CD3(0.1μg/ml)로 각 군을 자극시키고 ELISA 방법에 따라 배양된 Th17 세포를 분석하여 IL-17+CD4+T세포 및 IL-17의 억제 효능을 확인하고, Treg 세포 분석을 통하여 Fox3+Treg 세포의 증식을 확인하였다.
도 3에 나타낸 바와 같이, FK506의 단독 처리군에서는 대조군인 CD3 처리군과 유사하게 병인성 Th17 세포의 증식을 효과적으로 억제시키지 못하여 염증성 사이토카인 IL-17 활성을 효과적으로 억제시키지 못함을 확인하였다. 반면, 각 SD282 및 Fk506 단독 처리에 의해 IL-17+CD4+T세포(%) 및 IL-17의 활성을 억제시키고, 병용 처리 시 더욱 유의적으로 활성을 억제함을 확인하였다.
3-2 Treg 활성 증가 확인
상기 실시예 1-1의 동종이형 모델에 20, 500μM SD282 또는 1, 5nM의 FK506 단독처리 하였다. 또한, 각 1, 5nM의 FK506 및 250μM SD282를 병용 처리하여 분리된 T 세포에 Th17 세포 분화 조건을 주어 4일 동안 배양한 후 Th17 세포의 분화를 유도하였다. 그 후, Th17 세포 분화 조건하에서도 이 상기 각 처리군에서 Treg 세포 활성이 유도되는지 확인하기 위하여, 유세포로 Foxp3 Treg 세포를 분석하고 동종 반응을 확인하였다.
또한, 도 4에 나타낸 바와 같이, FK506의 단독 처리군에서는 대조군인 CD3 처리군과 유사하게 Treg 세포의 증식을 증가시키지 못함을 확인하였다. 반면, 각 SD282 및 Fk506 단독 처리 및 병용 처리군은 매우 유의적으로 Treg 세포를 증가시킴을 확인하였다.
따라서, 병용투여는 병인성 Th17의 활성을 감소시키며, Treg의 활성을 증가시키는 효과가 있음을 확인하였다.
실시예 4. 이식편대숙주병(Acute Graft versus host disease, GVHD) 동물 모델에서 SD282 및 FK506병용처리에 의한 치료 효과 확인
4-1. SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 GVHD 마우스 모델의 변화
상기 실시예 1-2의 GVHD 동물 모델에 도 5에 나타낸 바와 같은 실험을 진행하였으며, GVHD 발생 후, 50 또는 100 mg/kg SD282 또는 10mg/kg의 FK506을 단독처리 하였다. 또한, 각 10mg/kg 의 FK506 및 50 또는 100 mg/kg SD282를 병용 처리하여 이를 경구 투여한 후, GVHD 마우스 모델에 대한 몸무게(g), 몸무게 변화율(%), 몸무게 변화율에 대한 수치(%)를 확인하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, SD282 및 FK506을 병용처리한 GVHD 마우스 모델 군에서는 정상 체중을 유지하였고, 몸무게 변화율 및 이에 대한 수치(%)는 SD282 또는 FK506 단독 처리군과 비교하여 이종이식에 따라 이식거부반응 유도에 따른 체중감소율(%)이 현저히 낮으며, 동종이식군과 유사한 변화율 및 수치가 나타남을 확인하였다. 따라서, GVHD 마우스 모델에서 약물의 GVHD 치료 효과가 존재함을 확인하였다.
또한, GVHD 마우스 모델에 단독 20, 50 또는 100의 mg/kg SD282 처리군과, 2 또는 10mg/kg의 FK506 단독 처리군을 두었다. 또한, 50 mg/kg SD282 + 2 또는 10mg/kg FK506 병용 처리군을 두어, 발병 지수(disease score)를 확인하였다.
도 7a에 나타낸 바와 같이, SD282 단독 처리군보다 병용 처리군에서 발병 지수가 낮음을 확인하였다. 또한, 도 7b에 나타낸 바와 같이, FK506 단독 처리군과 비교하여, 병용 처리군에서 발병 지수가 더 낮음을 확인하였다.
또한, 상기 수학식 1에 따라, CI 값을 적용한 결과, 0.7의 값을 확인하여, SD282 및 FK506 병용 처리는 시너지 효과가 나타남을 확인하였다.
4-2. SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 각 조직 세포의 침윤 및 조직 손상 억제 확인
상기 실시예 1-2의 GVHD 동물 모델에 도 5에 나타낸 바와 같은 실험을 진행하였으며, GVHD 발생 후, 50 mg/kg SD282 또는 10mg/kg의 FK506을 단독처리 하였다. 또한, 각 10mg/kg 의 FK506 및 50 mg/kg SD282를 병용 처리하여 이를 경구 투여한 후, 피부, 폐, 간, 큰 창자(lage intestine), 작은 창자(small intestine) 및 막 창자(cecum)의 병증의 심각도를 나타내는 조직학적 수치(histological score)를 통하여 GVHD의 치료 효과를 확인하였다.
도 8a에 나타낸 바와 같이, FK506 단독 처리군과 비교하여 D282 및 FK506 병용 처리군에서 피부, 폐 및 간에서 조직학적 수치가 낮아짐을 확인하였다. 또한, 도 8b에 나타낸 바와 같이, 작은 창자, 큰 창자 및 막 창자의 조직학적 수치 또한 낮아짐을 확인하였다.
따라서, SD282 및 FK506 병용 처리군에서 GVHD 의해 발생된 조직 내 염증세포의 침윤 및 조직 손상이 억제됨을 관찰하였다.
4-3. SD282 및 FK506의 단독 또는 병용처리에 의한 Th17 및 Th1 활성 확인
Th1(T helper 1 cell) 세포의 사이토카인 IFN-γ(Interferon-γ) 분비, Th2(T helper 2 cell)세포의 사이토카인 IL-4(Interleukin 4) 분비, Th17(T helper 17 cell)세포의 사이토카인 IL-17(Interleukin 17) 분비, Foxp3 전사인자가 발현하는 Treg 세포의 각 활성을 확인하였다. 구체적으로, 상기 실시예 1-2의 GVHD 동물 모델에 도 5에 나타낸 바와 같이, GVHD 발생 후, 50mg/kg SD282 또는 10mg/kg의 FK506을 단독처리 하였다. 또한, 각 10mg/kg 의 FK506 및 50mg/kg SD282를 병용 처리하여 이를 경구 투여하고, 각 세포 및 사이토카인의 활성을 확인하였다.
도 9a에 나타낸 바와 같이, IFN-γ 양성 CD4+T세포(%) 및 IL-17 양성 CD4+T세포(%)가 병용 처리군에서 유의적으로 감소함에 따라, Th1 및 Th17 세포의 발현이 억제됨을 확인하였다. 또한, IL-4 양성 CD4+T세포(%) 및 Foxp3+Treg 세포(%) 또한 병용 처리군에서 유의적으로 증가함에 따라, Th2 및 Treg 세포의 발현을 증가시킴을 확인하였다.
도 9b 내지 도 9d에 나타낸 바와 같이, 병용 처리된 군에서 STAT3, IL-17 양성 세포 및 IFN-γ 양성 세포의 수가 감소하여 염증성 사이토카인의 억제 효과가 우수함을 확인하였다. 또한, Foxp3+Treg 세포가 현저하게 증가함을 확인할 수 있다.
따라서, 본 발명의 SD282 및 FK506의 병용 처리는 in vivo 상에서 면역 조절능이 우수하여 GVHD에 대한 치료 효과가 존재함을 확인하였다.
실시예 5. 피부 이식 동물 모델에서 SD282 및 FK506의 병용처리에 의한 이식 거부 반응 확인
5-1. SD282 및 FK506의 단독 또는 병용처리에 의한 피부 이식 거부 반응 억제 확인
피부 이식 후 거부 반응을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-3의 피부 동물 모델에 도 10a 및 10b에 나타낸 바와 같은 순서로 실험을 진행하였다. 피부 이식 후 50mg/kg SD282 또는 10mg/kg의 FK506을 단독처리 하였다. 또한, 각 10mg/kg 의 FK506 및 50mg/kg SD282를 병용 처리하였고, 경구 투여하였다. 그 후, 표피 두께(epidermal thickness)를 측정하여 이식된 피부 조직의 생착 정도를 확인하였으며, H&E(haematoxylin and eosin stain) 분석하였다.
도 11에 나타낸 바와 같이, SD282 및 FK506의 병용 처리군에서 대조군과 비교하여 이식편의 표피 두께가 얇아 피부 조직의 생착이 우수하고, 피부 이식 조직의 손상이 낮은 것을 확인하였다. 이에 따라, 이식편의 생존률이 증가하고 염증세포가 침윤되어 병인이 억제됨을 확인하였다.
5-2. SD282 및 FK506의 단독 또는 병용처리에 의한 면역 활성 조절능 확인
Th17 세포의 사이토카인 IL-17 분비, Foxp3 전사인자가 발현하는 Treg 세포의 활성, STAT3의 조절능을 확인하기 위하여, 상기 실시예와 동일한 처리 조건의 피부 동물 모델에 피부 이식 21일 후 이식된 부위를 얻어 조직 내 STAT3, 인산화된 STAT3(pSTAT3(Tyr705) 및 pSTAT3(Ser727)), IL-17 및 Foxp3의 활성 정도를 확인하였다.
도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이, SD282 및 FK506의 병용처리군은 단독 처리군과 비교하여, STAT3, 인산화된 STAT3(pSTAT3(Tyr705) 및 pSTAT3(Ser727)), IL-17의 발현은 현저히 감소됨을 확인하였다. 또한, Foxp3 발현이 증가됨을 확인하였는 바, SD282 및 FK506의 병용처리는 면역 활성 조절능이 우수함을 시사한다.
따라서, 본 발명의 SD282 및 FK506의 병용 처리는 in vivo 상에서 이식 동물 모델의 이식 거부를 감소시킴을 확인하였다.
실시예 6. 정상 인간 세포에서 SD282 및 FK506의 단독 또는 병용처리에 의한 T 세포 증식 반응 확인
정상 인간의 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell, PBMC) 에서 SD282 및 FK506의 단독 또는 병용처리에 의한 T 세포 증식 반응을 확인하기 위하여, 림프구 혼합 배양 반응(mixed leukocyte reaction, MLR) 및 CFSE(Carboxyfluorescein succinimidyl ester) 염색을 수행하였으며, 대조군으로서 무처리 동종동형군 및 무처리 동종이형군을 두었다. 또한, 동종이형 모델에 50, 250 및 500 μM SD282 또는 1, 5 nM의 FK506을 단독처리 하였다. 또한, 각 1, 5 nM의 FK506 및 250 μM의 SD282를 병용 처리하였다. 처리 후 4일간 배양하고, 3H-thymidine incorporation 방법 또는 유세포 분석 방법에 따라 배양된 세포의 T 세포 증식 반응을 관찰하고 동종 반응을 확인하였다.
도 13a에 나타낸 바와 같이, 무처리 동종이형(allogenic) 군에서는 T 세포 증식이 억제되지 않았으나, 50 nM 이상의 SD282을 단독 처리 시, 대조군과 비교하여 T 세포 증식 반응을 억제함을 확인하였다. 또한, 도 13b에 나타낸 바와 같이, FK506의 단독 처리군에서는 억제 반응이 무처리 군보다 유사할 정도로 효과적이지 않음을 확인하였다. 그러나, SD282 단독 처리군이나, SD282 및 FK506의 병용 처리군에서는 동종이형(allogenic) T 세포의 증식을 유의적으로 억제함을 확인하였다.
실시예 7. 정상 인간 혈액 세포에서 SD282 및 FK506의 단독 또는 병용처리에 의한 염증성 사이토카인의 활성 억제 확인
정상 인간 말초혈액세포(PBMC)에서 SD282 및 FK506의 단독 또는 병용처리에 의한 염증성 사이토카인의 활성 억제를 확인하기 위하여, 대조군으로서 무처리 동종동형 군 및 무처리 동종이형 군을 두었다. 동종이형 모델에 5, 250 및 500 μM SD282 또는 1, 5 nM의 FK506을 단독처리 하였다. 또한, 각 1, 5 nM의 FK506 및 250 μM SD282를 병용 처리하였다. 상기 처리 후 4일간 배양한 후, ELISA 방법에 따라 배양된 세포의 IL-17, IFN-γ 및 TNF-α의 억제 효능을 확인하였다. 이에 따른 효과를 ELISA로 분석하고 동종 반응을 확인하였다.
도 14 및 도 15에 나타낸 바와 같이, Fk506 단독 처리군보다, SD282 단독 처리군과 SD282 및 Fk506 병용 처리군에서 IL-17, IFN-γ 및 TNF-α의 활성이 억제됨을 확인하였다.
실시예 8. 간이식 환자에서 병용투여의 효과 확인
8-1 병용투여의 면역세포 마커 변화 효과 확인
간이식 환자의 혈액을 공급받아 ficoll을 이용하여 말초혈액세포(PBMC)를 분리하였다. TCR자극(CD3자극조건)조건에 250μM SD282 및 5nM의 FK506을 단독 또는 병합처리 하였다. 4일 동안 배양한 후, 각 약물처리에 따라 Treg 세포 활성이 유도되는지 확인하기 위하여, 유세포로 다양한 면역세포 아형을 분석하였다.
도 16a 및 도 16b에서 볼 수 있는 바와 같이, SD282 및 FK506 병용 처리군에서 면역조절 아형 세포(CD4+Treg, CD8+Treg, plasmacytoid Dendritic cell)증가 및 이식병인 면역세포 아형(central memory Th17, transient B, plasma B cell)이 감소됨을 확인 하였다.
8-2. 병용투여에 의한 KEGG pathway 및 유전자 조절 분석
간 이식환자의 말초혈액세포(PBMC)에 약물처리에 따른 면역세포 조절 관련 신호인자들의 변화를 조사하기 위하여, PBMC세포에 TCR자극(CD3자극조건) 조건에 250μM SD282 및 5nM의 FK506을 단독 또는 병합처리 하였다. 48시간 배양한 후 microarray 분석을 마크로젠에 의뢰하여 분석하였다.
도 17에 나타난 바와 같이, 간이식 환자에서 SD282 처리에 의해 간이식 환자에서 증가되어진 다양한 pathway를 억제됨을 확인하였다. 또한, SD282 및 FK506 병합에 의해서 chemokine signaling pathway, IL-17 signaling pathway등 병인관련 신호들을 의미있게 감소시키는 것을 확인하였다.
위의 조건에서 실제 어떠한 유전자들의 증감이 있는지 분석을 수행한 결과, 도 18a에서 SD282 단독 대비 병용투여의 STAT3 경로 관련 억제효과가 우수함을 확인하였고, 도 18b에 나타난 바와 같이, SD282 단독 대비 병용투여의 미토콘드리아 기능 회복효과가 우수함을 확인하였으며, 도 18c에 나타난 바와 같이, SD282 단독 대비 병용투여의 염증성 세포 사멸 억제효과가 우수함을 확인하였으며, 도 18d에 나타난 바와 같이, SD282 단독 대비 병용투여의 세포이동 억제효과가 현저히 우수함을 확인하였다.
또한, 도 19에 나타난 바와 같이, SD282 단독 대비 병용투여의 면역세포의 세포사멸 억제효과가 우수함을 확인하였다.
8-3. 간이식환자 병인세포 이동능 제어효과 확인
마우스 및 간이식환자의 면역세포에 각 약물을 48시간 처리한 후 세포를 수득하여 migration assay를 수행하였다. Upper transwell 위에 2x105 세포를 로딩하고, lower chamber에 아무것도 처리하지 않거나 sDF-1을 처리하여 2시간 배양하였다. 2시간 뒤 이동된 세포의 수를 카운트하였다.
도 20a 및 도 20b에 나타난 바와 같이, SD282 단독 대비 병용투여의 세포 이동 억제효과가 우수함을 확인하였다.
실시예 9. 간이식환자의 아바타 모델에서 유효성 평가
9-1. 간손상 인간화 마우스 모델 제조
인간 면역 시스템을 탑재한 간 손상 인간화 마우스 모델 (아바타 모델)을 수립하기 위해, NSG 마우스에 인간 유래 PBMC(Peripheral blood mononuclear cell)을 정맥내 주사한 뒤, 간 성상세포(liver stellate cell line)를 정맥내 주사하고 CCl4를 주사하여 간손상 (간 섬유증)을 유발하였다. 구체적으로, NSG 마우스에 정상인 또는 간질환 환자 (HBV 유발 간경화 환자 또는 알코올성 간경화 환자)의 PBMC를 정맥내 주사한 뒤, 하루 뒤에 간 성상세포와 CCl4를 정맥내 주사하였으며, 20일 뒤 인간 세포의 생착을 확인하고 39일 후 마우스들을 희생시켜 조직 분석을 수행하였다.
9-2. 간 손상 마우스 모델에서 염증 또는 섬유화(fibrosis) 확인
정상인 또는 간이식환자의 혈액 주입과 함께 CCL4 주입에 의해 간 손상 유도 모델(9-1에서 제조)에서 정상인보다 이식환자의 혈액 주입에 의해 염증 및 섬유화(fibrosis)가 유발된다. 단독 또는 병용처리에 따른 염증성 및 섬유화(fibrosis)정도를 확인하였다.
도 21a 및 도 21b에 나타난 바와 같이, SD282 단독 대비 병용투여에 의해 염증 및 fibrosis가 의미있게 감소됨을 확인하였다.

Claims (11)

  1. [규칙 제91조에 의한 정정 23.12.2019]　
    1) 하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 2) 칼시뉴린(Calcineurin) 억제제 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 이식 거부(transplantation rejection) 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure WO-DOC-FIGURE-18a
  2. 제1항에 있어서,
    상기 칼시뉴린 억제제는 FK506(tacrolimus, 타크로리무스) 또는 사이클로스포린(cyclosporine)인 것을 특징으로 하는, 조성물
  3. 제1항에 있어서,
    상기 이식 거부 반응은 세포, 혈액, 조직 및 장기로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 이식 거부 반응인 것을 특징으로 하는, 조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 이식거부반응은 골수 이식, 심장 이식, 각막 이식, 장 이식, 간 이식, 폐 이식, 췌장 이식, 신장 이식 및 피부이식의 거부반응으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상인 것을 특징하는, 조성물.
  5. 제1항에 있어서,
    상기 이식 거부 질환은 이식편대숙주병(GVHD,graft-versus-host disease)인 것인, 조성물.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 T 세포의 증식을 억제하는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 미분화 T 세포의 Th1 세포 또는 Th17 세포로의 분화; 또는 Th1 세포 또는 Th17 세포의 활성을 감소시키는 것을 특징을 하는, 조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 미분화 T 세포의 Treg 세포로의 분화 및 Treg 세포의 활성을 증가시키는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  9. [규칙 제91조에 의한 정정 23.12.2019]　
    1)하기 화학식 1로 표시되는 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염과 2)칼시뉴린(Calcineurin) 억제제 또는 이의 약학적으로 허용 가능한 염을 유효성분으로 포함하는, 이식 후 면역억제용 약학적 조성물.
    [화학식 1]
    Figure WO-DOC-FIGURE-18b
  10. 약학적으로 유효한 양의 제1항의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 이식 거부(transplantation rejection) 반응 또는 이식 거부 질환의 예방 또는 치료 방법.
  11. 약학적으로 유효한 양의 제9항의 약학적 조성물을 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 이식 후 면역억제 및 치료 방법.
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