WO2022139517A1 - 혈액 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 - Google Patents

혈액 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학조성물 Download PDF

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최순호
이호준
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Definitions

  • the present invention relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or an immune disease, including a blood-derived substance and immune cells.
  • BACKGROUND OF THE INVENTION Cancer or malignant tumor is one of the representative modern intractable diseases, and the number of patients is increasing worldwide every year, and it is a disease that causes the social and economic burden that shows the highest mortality rate as a single disease even in Koreans.
  • Immunoblasts uses dendritic cells, natural killer cells, and T cells, which are immune cells in the human body, to activate the immune response in the body to treat diseases.
  • it is a treatment that enhances the body's natural healing power by strengthening the immune function by using the immune system that kills cancer cells possessed by immune cells.
  • Therapeutic agents using these immune cells generally use a method of isolating immune cells from a patient, culturing and proliferating in vitro to increase the activity of immune cells, and then injecting them back into the patient's body.
  • this method is not convenient because the activation of immune cells is not sufficient to treat the disease, or the patient has to visit the hospital multiple times, and in particular, the period required for culturing may be burdensome for patients with deteriorated health. there is a problem.
  • the present inventors have found that when a substance derived from nucleated cells or plasma in blood is mixed with immune cells, toxicity to cancer cells possessed by immune cells can be increased, and excellent cancer or immune disease by strengthening the immune system of the subject receiving it It has been demonstrated that it has a preventive or therapeutic effect and has completed the present invention.
  • the present invention relates to a substance derived from nucleated cells or plasma in blood; And immune cells; relates to a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or immune disease, including.
  • the present invention relates to a method for producing a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or immune disease.
  • the present invention relates to a method for preventing or treating cancer or an immune disease comprising administering the pharmaceutical composition of the present invention to an individual having cancer or an immune-related disease.
  • the present invention relates to a substance derived from nucleated cells or plasma in blood; and immune cells; provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or immune disease, including.
  • nucleated cell refers to a cell having a nucleus, that is, an organ containing chromosomal DNA.
  • the nucleated cells in the blood may mean that red blood cells are not included, and the “red blood cells-free” means that the red blood cells are about 50%, 55,%, 60%, 65%, 70%, 75% , 80%, 85%, 90% or 95% or more are not included (removed).
  • a substance derived from nucleated cells or plasma in blood refers to a substance that existed in nucleated cells or plasma in the blood but is in a separated state, and when mixed with immune cells, immune cells through increased activity of immune cells It refers to a substance that can increase or restore toxicity (or cell killing ability) to cancer cells, etc., and enhance the immune system to prevent or treat cancer or immune disease.
  • a substance derived from nucleated cells or plasma in blood means a substance derived (isolated) from nucleated cells in blood or a substance derived from plasma (isolated), and a substance derived from nucleated cells in blood (isolated). or plasma-derived (isolated) material.
  • the substance derived from the nucleated cells or plasma in the blood may be separated from the nucleated cells or plasma derived from the blood of an animal, and the animal may be preferably a mammal, more preferably a human.
  • the nucleated cells or plasma in the blood may be isolated from one or more selected from the group consisting of bone marrow, umbilical cord blood and peripheral blood, and preferably may be one isolated from umbilical cord blood or peripheral blood.
  • the nucleated cells in the blood may be peripheral blood mononuclear cells (PBMC).
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • peripheral blood mononuclear cell means a blood cell having a round nucleus, and is composed of lymphocytes, monocytes, and the like.
  • the peripheral blood mononuclear cells may be isolated from, for example, blood using Ficoll and centrifugation, but is not limited thereto.
  • the substance derived from the nucleated cells or plasma in the blood may include an extracellular vesicle, a subcellular organelle, or a mixture thereof.
  • extracellular vesicle refers to vesicles of various sizes surrounded by membranes derived from cells and released outside the cells, and the extracellular vesicles are proteins, lipids, and several types of RNA (mRNA, microRNA, tRNA, rRNA), and DNA.
  • the extracellular vesicles are classified into dexosomes, oncosomes, prostasomes, and the like depending on the type of cell from which they are derived, and microvesicles, extosomes, etc. ), exsosomes, and apoptotic bodies.
  • the extracellular vesicle may have a size (diameter) of a nanometer or micrometer size, and specifically may be 1 to 1000 nm, 20 to 1000 nm, 20 to 100 nm, or 50 to 100 nm, but is limited thereto it is not
  • the extracellular vesicle may include one or more selected from the group consisting of microvesicles, ectosomes, exosomes and apoptotic bodies, and specifically, separated from nucleated cells in blood or plasma It may include one or more selected from the group consisting of microvesicles, ectosomes, exosomes and apoptotic bodies, but is not limited thereto.
  • the extracellular ER may contain one or more selected from the group consisting of RNA, DNA, growth factors and organelles, but is not limited thereto.
  • subcellular organelle refers to an organ having a special function constituting a cell.
  • the organelle may have a nanometer or micrometer size (diameter), specifically, 0.1 to 100 ⁇ m, 0.1 to 50 ⁇ m, 0.1 to 25 ⁇ m, 0.1 to 15 ⁇ m, 0.1 to 10 ⁇ m, 0.1 to 5 ⁇ m, or 0.1 to 3 ⁇ m, but is not limited thereto.
  • the organelle is, for example, a cell nucleus, a nuclear membrane, a cytoplasm, a cell membrane, a cell matrix (cytosol), a mitochondria, a lysosome, an endoplasmic body (endoplasmic) reticulum, ER), Golgi apparatus, peroxisome, etc., but is not limited thereto.
  • the organelle may include one or more selected from the group consisting of Golgi, lysosome, peroxisome, endoplasmic reticulum and mitochondria, preferably separated from nucleated cells in blood or plasma (Derived) may include, but is not limited to, Golgi, lysosomes, peroxisomes, endoplasmic reticulum and mitochondria.
  • the organelles may include both those that function normally and those that lack (decreased) function. That is, some of the isolated organelles may include those lacking (decreased) function.
  • “normally functioning” means that the organelle can exert its own unique function.
  • “lack of function (decreased)” means that the intrinsic function is not exerted or deteriorated, and can be used interchangeably with “impaired function", and the function is lacking (decreased)
  • the organelle may exhibit less than 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% or 50% functionality compared to a functionally normal organelle.
  • the plasma-derived material may be cell-free.
  • cell-free refers to a substance that flows out of cells due to cell destruction in the human body or is released from non-destructive cells and circulates in plasma, a liquid component of blood. means state.
  • the substance derived from plasma is cell-free microvesicles circulating in plasma, cell-free ectosome, cell-free exosome, cell-free apoptosis body, cell-free It may be one or more selected from organelles and platelets, but is not limited thereto.
  • the plasma-derived material is composed of cell-free Golgi, cell-free lysosome, cell-free peroxisomal, cell-free endoplasmic reticulum and cell-free mitochondria circulating in plasma. It may include one or more selected from the group, but is not limited thereto.
  • methods commonly used in the art may be used as a method for separating substances derived from nucleated cells or plasma in blood.
  • a method of separating substances through centrifugation may be used, and may further include culturing before centrifugation and/or disrupting cells.
  • the substance derived from the nucleated cells or plasma in the blood may be fresh, thawed after freezing, or separated from the nucleated cells or plasma in the blood in a cultured state, but is not limited thereto.
  • freshness state refers to a state that has not been cultured or frozen after being obtained from an individual.
  • the plasma-derived material may be isolated from fresh plasma, but is not limited thereto.
  • the material derived from the nucleated cells in the blood may be isolated after culturing the nucleated cells isolated from bone marrow, umbilical cord blood or peripheral blood, and according to an embodiment of the present invention , The material derived from nucleated cells in the blood may be isolated from peripheral blood mononuclear cells (PBMC) in a cultured state, but is not limited thereto.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • the period of the culture in the present invention may be 7 days, 8 days, 9 days, 10 days, 11 days, 12 days, 13 days, or 14 days or more, and according to embodiments of the present invention, 7 days to 30 days Days, specifically 7 to 20 days, 10 to 20 days, more specifically may be a period of about 14 days, but is not limited thereto.
  • the substance derived from the nucleated cells or plasma in the blood may be obtained through a known method.
  • the plasma-derived material may be obtained, for example, by centrifugation at a temperature of about 0-10° C. for 1 to 20 minutes at a speed of 10,000 to 30,000 x g, preferably at a speed of 20,000 to 30,000 x g,
  • the present invention is not limited thereto.
  • the plasma-derived material obtained by the above method may be one in which 1 to 50 ⁇ g of plasma-derived material is obtained per 30 cc of blood, preferably 10 to 50 ⁇ g, 20 to 40 ⁇ g, more preferably 25 to 35 ⁇ g may be obtained, but is not limited thereto.
  • the material derived from the nucleated cells in the blood for example, a) using a blood cell calculator to recover 2 X 10 7 cells/ml of cells; b) centrifugation at a temperature of 0 to 4° C. for 1 to 10 minutes at a speed of 150 to 500, preferably 200 to 400 xg to prepare a cell pellet; c) resuspending the pellet in a buffer solution and homogenizing; d) centrifuging the homogenized composition at a temperature of about 0-10° C.
  • the substance derived from the nucleated cells in the blood obtained by the above method is 100 to 400 ⁇ g, preferably 200 to 300 ⁇ g, more preferably 230 to 280 ⁇ g per 2 X 10 7 peripheral blood mononuclear cells. may be, but is not limited thereto.
  • immunode refers to a cell that modulates immunity as a defense mechanism against invading pathogens, foreign substances, viruses, etc. or directly attacks pathogens, for example, NK cells, NKT cells, There are T cells, B cells, white blood cells (macrophages, neutrophils, eosinophils, basophils, dendritic cells, etc.).
  • the immune cell may be a specific type of immune cell, but may refer to a group including various types of immune cells.
  • PBMCs peripheral blood mononuclear cells
  • the immune cell includes a single immune cell and a plurality of immune cells.
  • peripheral blood mononuclear cell is a blood cell having a round nucleus, and in the peripheral blood mononuclear cell, B cells, T cells, macrophages, dendritic cells, DC) and immune cells such as natural killer cells (NK cells) are included.
  • Immune cells that directly eliminate cancer cells include natural killer cells and cytotoxic T lymphocytes (CTLs). cells or B cells.
  • CTLs cytotoxic T lymphocytes
  • helper T cells that secrete various cytokines, regulatory T cells, etc. are involved in the immune response together.
  • immune cells may be myeloid or lymphoid cells that can be differentiated from hematopoietic stem cells.
  • hematopoietic stem cell is also referred to as hematopoietic stem cell, and refers to a cell potentially differentiated into a major component of blood.
  • Hematopoietic stem cells are megakaryocytes, red blood cells, mast cells, basophils, neutrophils, eosinophils, dendritic cells, DC and macrophages, or lymphocytes of the myeloid lineage by various cytokines. It differentiates into cells such as (lymphoid) natural killer cells (NK cells), T cells (T cells or T lymphocytes), and B cells (B cells or B lymphocytes).
  • NK cells natural killer cells
  • T cells T cells or T lymphocytes
  • B cells B cells or B lymphocytes
  • the immune cells are monocytes, natural killer cells (NK cells), cytotoxic T cells (killer T cells), NK-T cells, T cells, B cells, neutrophils, eosinophils, basophils, macrophages And it may be at least one selected from the group consisting of dendritic cells, preferably the immune cells are monocytes, lymphocytes and dendritic cells, that is, monocytes, natural killer cells, cytotoxic T cells, NKT cells, T cells, B cells And it may be a peripheral blood mononuclear cell (PBMC) comprising at least one selected from the group consisting of dendritic cells.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cell
  • natural killer cells refers to innate immune cells that selectively show cytotoxicity to virus-infected cells or cancer cells. It has been reported that natural killer cells are effective in preventing the occurrence, proliferation, metastasis and recurrence of cancer.
  • T cell T cell or T lymphocyte
  • T lymphocyte refers to one of the lymphocytes responsible for antigen-specific adaptive immunity.
  • the T cells are classified into naive T cells that have not yet encountered antigens, effector T cells that have met antigens and mature (helper T cells, cytotoxic T cells, natural killer T cells) and memory T cells.
  • neutrophil is also referred to as neutrophil granulocyte, refers to white blood cells that occupy the largest proportion in mammals, and is known to play an important role in innate immunity.
  • eosinophil refers to granulocytes filled with eosinophilic granules that mainly act on parasites and viruses.
  • basophil refers to leukocytes having intracellular heparin and histamine-containing granules.
  • macrophage is also referred to as a phagocyte, and is one of the main cells responsible for innate immunity. Phagocytic action that absorbs and digests non-proteins present in a healthy body, such as cellular tissues, foreign substances, microorganisms, and cancer cells A type of white blood cell that does
  • dendritic cells are immune cells constituting the immune system of mammals, and refer to cells that process pathogenic substances and display them on the surface for other cells of the immune system.
  • the immune cell may be an immune cell that has been genetically modified or engineered by introducing a foreign gene or the like.
  • genetic modification or engineering includes artificially changing the composition or structure of a cell's genetic material, and may be to improve target specificity and/or homing specificity, but It is not limited.
  • the genetically modified or engineered immune cells are, for example, chimeric antigen receptor-T cells (CAR-T), chimeric antigen receptor-NK cells (CAR).
  • CAR-T chimeric antigen receptor-T cells
  • CAR chimeric antigen receptor-NK cells
  • -NK may be a T cell or NK cell containing a homing receptor, and may be a T cell or NK cell containing both a CAR and a homing receptor, but is not limited thereto.
  • chimeric antigen receptor-T cell or chimeric antigen receptor-NK cell (CAR-NK) refers to a chimeric antigen receptor It refers to T cells or NK cells engineered to effectively attack cancer cells by expressing them.
  • chimeric antigen receptor refers to a protein in which the cell membrane or intracellular signaling site of an activation protein of T cells or NK cells is fused with the antigen binding site of a cancer antigen-specific antibody.
  • immune cells comprising a CAR and/or homing receptor can be obtained by any method known in the art.
  • a method of introducing by transfection using a viral or non-viral vector may be used, but is not limited thereto.
  • the immune cells may be autoimmune cells.
  • immune cells comprising a CAR and/or homing receptor can be obtained by any method known in the art.
  • a method of introducing by transfection using a viral or non-viral vector may be used, but is not limited thereto.
  • the immune cells may be autoimmune cells.
  • autoimmune cell refers to immune cells of the same donor and recipient, and is distinguished from allogeneic immune cells. In the case of using autoimmune cells, transplant rejection due to an immune response can be avoided, but a decrease in the function (activity) of cells in patients with weakened immunity can be a problem.
  • composition of the present invention can increase or restore the activity of immune cells using a substance derived from nucleated cells or plasma in the blood, it is effectively It can be used to prevent or treat cancer.
  • the immune cells may be in a fresh state isolated from an individual, in a thawed state after freezing or in a cultured state.
  • freshness state refers to a state that has not been cultured or frozen after being obtained from an individual.
  • the cryopreserved immune cells may be obtained from the subject and then stored frozen, or may be obtained from the subject and then cryopreserved after culturing. In addition, it may be stored frozen after mixing the cell-derived material with the immune cells before freezing, or it may be stored frozen after mixing and culturing the cell-derived material with the immune cells before freezing.
  • the composition of the present invention increases cytotoxicity (cancer cell killing ability) due to the mixing of nucleated cells or plasma-derived substances in the blood even if the immune cells thawed after cryopreservation do not require a separate culture process, resulting in excellent cancer cells It has been proven that it has a killing effect.
  • the substance derived from the nucleated cells or plasma in the blood may increase the activity of the immune cells to increase cytotoxicity (killing ability).
  • a substance derived from nucleated cells or plasma in blood; and immune cells may be obtained from the same or different individuals, and preferably may be obtained from the same individual.
  • “individual” includes any human or non-human animal.
  • the "non-human animal” can be a vertebrate, such as non-human primates, sheep, dogs, and rodents, such as mice, rats and guinea pigs.
  • the subject may preferably be a human, and specifically may be a human having tumor cells.
  • the term “subject” may be used interchangeably with “subject” or “patient”.
  • the substance derived from nucleated cells or plasma in blood may be one isolated from immune cells, and more specifically, the substance derived from nucleated cells or plasma in blood is nucleated cells or plasma in blood obtained by separating from an individual. Some of it, for example, 1 to 50%, preferably 1 to 30%, more preferably 5 to 30% by weight, still more preferably 5 to 25% by weight relative to the whole is isolated from nucleated cells in plasma or blood it may have been
  • the immune cells may be isolated from an individual and then cultured.
  • a substance derived from nucleated cells in blood is isolated from some of the peripheral blood mononuclear cells obtained from a single individual.
  • the immune cells may be peripheral blood mononuclear cells other than the peripheral blood mononuclear cells from which the substance derived from the nucleated cells in the blood is separated.
  • immune cells containing a substance derived from plasma are isolated from plasma obtained from one individual, and immune cells are peripheral blood mononuclear cells obtained from the same individual from which the plasma was obtained. It may be a cell, but is not limited thereto.
  • a composition comprising a substance derived from nucleated cells in blood and immune cells contains 0.01 to 500 ⁇ g, 0.01 to 400 ⁇ g of a substance derived from nucleated cells in blood per 1x10 5 immune cells.
  • 0.01 to 300 ⁇ g, 0.01 to 200 ⁇ g, 0.01 to 100 ⁇ g, 0.01 to 50 ⁇ g, 0.01 to 40 ⁇ g, 0.01 to 35 ⁇ g, 0.1 to 35 ⁇ g or 0.1 to 30 ⁇ g may be prepared by mixing, but limited thereto it is not going to be
  • a composition comprising a plasma-derived substance and immune cells contains 0.01 to 500 ⁇ g, 0.01 to 400 ⁇ g, 0.01 to 300 ⁇ g, It may be prepared by mixing 0.01 to 200 ⁇ g, 0.01 to 100 ⁇ g, 0.01 to 50 ⁇ g or 0.01 to 30 ⁇ g, preferably 0.1 to 10 ⁇ g, 0.1 to 9 ⁇ g, 0.1 to 8 ⁇ g, 0.1 to 7 ⁇ g or It may be prepared by mixing 0.1 to 6 ⁇ g, more preferably 0.1 to 5 ⁇ g, 0.1 to 1 ⁇ g, or 0.1 to 0.5 ⁇ g, but is not limited thereto.
  • the composition comprises the steps of obtaining immune cells from an individual; separating and obtaining a substance from 1 to 50% by weight of the obtained immune cells; and mixing the material derived from the obtained immune cells and the remaining immune cells.
  • the method may further include culturing the obtained immune cells after the step of isolating and obtaining the immune cells from the individual.
  • the composition may be used to prevent or treat cancer.
  • the cancer is gastric cancer, liver cancer, lung cancer, colorectal cancer, breast cancer, prostate cancer, ovarian cancer, pancreatic cancer, cervical cancer, thyroid cancer, laryngeal cancer, acute myeloid leukemia, brain tumor, neuroblastoma, retinoblastoma, head and neck cancer, salivary gland cancer and lymphoma. It may be selected from the group.
  • the treatment of cancer in the present invention may be, for example, inhibiting the growth of the tumor by about 10% or more, about 20% or more, about 40% or more, about 60% or more, or about 80% or more compared to before treatment.
  • the composition may be used for the prevention or treatment of immune diseases, and the immune diseases may be selected from the group consisting of autoimmune diseases, infectious diseases, transplant rejection diseases and inflammatory diseases.
  • the autoimmune disease may be selected from the group consisting of, for example, multiple sclerosis, lupus, rheumatoid arthritis, Crohn's disease, and type 1 diabetes, but is not limited thereto.
  • the infectious disease may be selected from the group consisting of hepatitis B, hepatitis C, human papilloma virus (HPV) infection, cytomegalovirus infection, viral respiratory disease, and influenza.
  • HPV human papilloma virus
  • cytomegalovirus infection cytomegalovirus infection
  • viral respiratory disease and influenza.
  • present invention is not limited thereto.
  • the inflammatory disease may be selected from the group consisting of asthma, sinusitis, atopic dermatitis, periodontitis and Behcet's disease, but is not limited thereto.
  • compositions of the present invention may be formulated so that a therapeutically effective amount of immune cells is administered to a subject.
  • pharmaceutically effective amount includes a therapeutically effective amount and a prophylactically effective amount.
  • therapeutically effective amount refers to a decrease in the severity of disease symptoms, an increase in the frequency and duration of disease symptom-free periods, or an increase in disease symptoms when the drug or therapeutic agent is used alone or in combination with other therapeutic agents. means any amount of a drug that can exhibit the prevention of damage or disorder.
  • prophylactically effective amount means any amount of a drug that inhibits the occurrence or recurrence of a disease in an individual at risk of developing a disease or in an individual at risk of suffering from recurrence of the disease.
  • the level of the effective amount depends on the subject type and severity, age, sex, drug activity, drug sensitivity, administration time, administration route and excretion rate, duration of treatment, factors including concurrent drugs, and other factors well known in the medical field. can be determined according to
  • administration refers to the physical introduction of a composition to a subject using any of a variety of methods and delivery systems known to those of ordinary skill in the art.
  • the route of administration for the composition of the present invention includes all routes of administration.
  • it may be parenteral administration, including, for example, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, spinal or other parenteral routes of administration, such as by injection or infusion, preferably by injection.
  • parenteral administration including, for example, intravenous, intramuscular, subcutaneous, intraperitoneal, spinal or other parenteral routes of administration, such as by injection or infusion, preferably by injection.
  • parenteral routes of administration such as by injection or infusion, preferably by injection.
  • It may be an administration route by the method, but is not limited thereto.
  • the number of administrations for the compositions of the present invention may be, for example, one, multiple, and/or one or more extended periods of time.
  • composition of the present invention may vary depending on the age, sex, and weight of the patient, and specifically, the composition of the present invention according to the degree of disease onset of an individual having cancer, and the dosage thereof may vary depending on the route of administration, the degree of disease, sex, body weight , may be increased or decreased according to the age, in particular, the degree of cancer incidence of the patient.
  • composition of the present invention may be administered as an individual therapeutic agent or in combination with other therapeutic agents.
  • the composition of the present invention and the other therapeutic agent may be administered sequentially or simultaneously.
  • the other therapeutic agent may be a drug such as a compound or protein that promotes cancer regression or further prevents tumor growth, and includes all other anticancer therapies other than drug therapy, such as radiation therapy.
  • the route of administration, administration timing, and dosage may be determined according to the type of disease, the disease state of the patient, the purpose of treatment or prevention, and other drugs or physiologically active substances used in combination.
  • the therapeutic agent that can be administered in combination with the composition of the present invention may be an anticancer agent or a therapeutic agent for an immune disease
  • the anticancer agent is imatinib (Imatinib), 5-FU (5-Florouracil), irinotecan (Irinotecan), Sunnyty Nib (Sunitinib), oxaliplatin (Oxaliplatin), paclitaxel (Paclitaxel), lapatinib (Lapatinib), trastuzumab (Herceptin), gefitinib (Gefitinib), erlotinib (Erlotinib), carboplatin (Carbocelltin), (Docetaxel), Everolimus, Sorafenib, carbonic anhydrase inhibitor, monocarboxylate transporter inhibitor, Pembrolizumab, Pembrolizumab; Atezolizumab, PD-1 anticancer drug, Nivolumab, PARP-1 inhibitor, PARP-2 inhibitor,
  • the therapeutic agent for immune disease may be a therapeutic agent for autoimmune disease, infectious disease or inflammatory disease, and the therapeutic agent for autoimmune disease is methotrexate (MTX), hydroxychloroquine, sulfasalzine, leflunomide. ), Infliximab, Adalimumab, Golimumab, Certolizumab pegol, Rituximab, Tocilizumab, Tofacitinib ( Tofacitinib), baricitinib, or etanercept (Etanercept), but is not limited thereto.
  • MTX methotrexate
  • hydroxychloroquine hydroxychloroquine
  • sulfasalzine leflunomide.
  • Infliximab Adalimumab, Golimumab, Certolizumab pegol, Rituximab, Tocilizumab, Tofacitinib ( Tofacitinib), barici
  • the therapeutic agents for infectious diseases include flu drugs (oseltamivir, zanamivir, peramivir, etc.), herpes drugs (acyclovir, valacyclovir, famciclovir, trifluridine, etc.), hepatitis B drugs (lamivudine, telbivudine, etc.) , clevudine, entecavir, adefovir, tenofovir, besifovir, etc.), hepatitis C drugs (ribavirin, dasabuvir, daclatasvir, asunaprevir, etc.), AIDS drugs (zidovudine, abacavir, ramivudine) , etravirine, nevirapine, rilpivirine, atazanavir, darunavir, nelfinavir, ritonavir, etc.) or other antiviral agents, but is not limited thereto.
  • flu drugs os
  • the therapeutic agent for inflammatory diseases may be steroid-based therapeutic agents such as glucocorticoids, non-steroidal therapeutic agents such as Aspirin, Ibuprofen, and Naproxen, and immune-specific anti-inflammatory drugs (imSAIDs), but is not limited thereto.
  • steroid-based therapeutic agents such as glucocorticoids
  • non-steroidal therapeutic agents such as Aspirin, Ibuprofen, and Naproxen
  • imSAIDs immune-specific anti-inflammatory drugs
  • composition of the present invention may serve to significantly increase the therapeutic effect of conventional therapeutic agents when administered in combination with an anticancer agent or a therapeutic agent for an immune disease.
  • composition of the present invention may further include suitable carriers, excipients and diluents commonly used in the preparation of pharmaceutical compositions.
  • the composition may further include a pharmaceutically acceptable additive.
  • the additive may include, for example, a surfactant, a stabilizer, or a solubilizing agent, but is not limited thereto.
  • the composition of the present invention may contain water for injection.
  • the water for injection means distilled water made to dissolve the solid injection or to dilute the water-soluble injection.
  • the present invention provides a method for preparing a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer or immune disease, comprising the steps of:
  • the present invention provides a method for preventing or treating cancer or immune disease, comprising administering the pharmaceutical composition of the present invention to an individual having cancer or immune disease.
  • each term has the same meaning as described in the pharmaceutical composition unless otherwise specified.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can increase the cytotoxicity (killing ability) possessed by immune cells by mixing substances and immune cells derived from nucleated cells or plasma in the blood, and further strengthen the immune system of the subject receiving it. Therefore, it has an excellent preventive or therapeutic effect on cancer or immune diseases.
  • the pharmaceutical composition of the present invention can strengthen the immune system itself of the subject, it can be effectively used to prevent cancer recurrence and to remove microscopic residual cancer.
  • the pharmaceutical composition of the present invention uses immune cells of the human body, it has fewer side effects and high safety, and has problems with existing chemotherapeutic agents, for example, decreased immune function due to immune cell death in chemical anticancer drugs, gastrointestinal disorders And side effects such as hair loss can be minimized.
  • a series of procedures of blood collection, increase in immune cell activity, and re-administration to the patient after visiting a patient can be performed within a short time, requiring a conventional culture period for activating immune cells. Convenience of the patient is increased compared to the previous treatment method.
  • the pharmaceutical composition of the present invention increases toxicity due to an increase in the activity of immune cells themselves, the number and dose of administration can be lowered, thereby obtaining convenience and cost reduction for patients.
  • CM plasma-derived material
  • 3 shows the results of analyzing the cytotoxicity to cancer cells (K562) of a composition in which plasma-derived substances are mixed by concentration.
  • FIG. 4 shows the results of analyzing the cytotoxicity to cancer cells (K562) according to the incubation time of a composition containing a plasma-derived material and immune cells.
  • the horizontal axis is CFSE-A
  • the vertical axis is PI-A
  • the upper left is R1
  • the upper right is R2
  • the lower left is R3
  • the lower right is R4,
  • the top graph of A is 0hr(Q4-R1 %Parent:0.00, Q4-R2 %Parent:6.46, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent:93.54), 24hr(Q4-R1, Q4-R2 % Parent 11.81, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent:88.19), 48hr(Q4-R1, Q4-R2 %Parent:22.14, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent: 77.86) ego,
  • the bottom graph of A is 0hr(Q4-R1 %Parent:0.00, Q4-R2 %Parent:6.62, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent:93.38), 24hr(Q4-R1, Q4-R2 % Parent 18.33, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent:81.67), 48hr(Q4-R1, Q4-R2 %Parent:45.47, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent: 54.53) to be.
  • FIG. 5 shows the results of analyzing the cytotoxicity to cancer cells (A549) according to the incubation time of a composition containing a plasma-derived material and immune cells.
  • the horizontal axis is CFSE-A
  • the vertical axis is PI-A
  • the upper left is R1
  • the upper right is R2
  • the lower left is R3
  • the lower right is R4,
  • the top graph of A is 0hr(Q4-R1 %Parent:0.00, Q4-R2 %Parent:8.83, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent:91.17), 24hr(Q4-R1, Q4-R2 % Parent 8.74, Q4-R3 %Parent:2.18, Q4-R4 %Parent:88.61), 48hr(Q4-R1, Q4-R2 %Parent:17.99, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent: 82.01) ego,
  • the bottom graph of A is 0hr(Q4-R1 %Parent:0.00, Q4-R2 %Parent:8.28, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent:91.72), 24hr(Q4-R1, Q4-R2 % Parent 9.02, Q4-R3 %Parent:1.35, Q4-R4 %Parent:89.40), 48hr(Q4-R1, Q4-R2 %Parent:25.26, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent: 74.74) to be.
  • CM nucleated cell-derived material
  • the upper left of each graph is R1, the upper right is R2, the lower left is R3, and the lower right is R4.
  • the graph on the left is Q6-R1 %Parent: 76.12, Q6-R2 %Parent: 3.45, Q6-R3 %Parent:12.65, Q6-R4: %Parent:7.78, and the graph on the right is Q7-R1 %Parent:0.60, Q7-R2 %Parent:68.94, Q7-R3: %Parent:4.86, Q7-R4: %Parent:25.60.
  • the left graph shows Q6-R1 %Parent:89.05, Q6-R2 %Parent:3.67, Q6-R3 %Parent:2.70, Q6-R4: %Parent:4.57
  • the right graph shows Q7-R1 %Parent:0.39, Q7-R2 %Parent:82.56, Q7-R3: %Parent:2.60, Q7-R4: %Parent:14.45.
  • the horizontal axis is FITC-A
  • the vertical axis is PE-A
  • the upper left is R1
  • the upper right is R2
  • the lower left is R3
  • the lower right is R4,
  • the top graph of A is 0hr (Q14-R1 %Parent:0.18, Q14-R2 %Parent:69.49, Q14-R3 %Parent:0.18, Q14-R4 %Parent:30.16), 24hr (Q15-R1 %Parent:0.00, Q15-R2 %Parent 76.50, Q15-R3 %Parent:0.00, Q15-R4 %Parent:23.50), 48hr (Q14-R1 %Parent:0.12, Q14-R2 %Parent:77.50, Q14-R3 %Parent:0.48, Q14-R4 %Parent: 21.90),
  • the bottom graph of A is 0hr (Q15-R1 %Parent:0.00, Q15-R2 %Parent:70.09, Q15-R3 %Parent:0.00, Q15-R4 %Parent:29.91), 24hr (Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent 77.62, Q14-R3 %Parent:0.00, Q14-R4 %Parent:22.38), 48hr (Q14-R1 %Parent:0.62, Q14-R2 %Parent:86.03, Q14-R3 %Parent:0.32, Q14-R4 %Parent: 13.03).
  • FIG. 10 shows the results of analyzing the cytotoxicity to cancer cells (A549) according to the incubation time of a composition containing a nucleated cell-derived material and immune cells in the blood.
  • the horizontal axis is FITC-A
  • the vertical axis is PE-A
  • the upper left is R1
  • the upper right is R2
  • the lower left is R3
  • the lower right is R4,
  • the top graph of A is 0hr (Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent:19.63, Q14-R3 %Parent:0.02, Q14-R4 %Parent:80.34), 24hr (Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent 22.58, Q14-R3 %Parent:0.00, Q14-R4 %Parent:77.42), 48hr (Q14-R1 %Parent:0.08, Q14-R2 %Parent:23.98, Q14-R3 %Parent:0.08, Q14-R4 %Parent: 75.86),
  • the bottom graph of A is 0hr(Q15-R1 %Parent:0.00, Q15-R2 %Parent:20.85, Q15-R3 %Parent:0.00, Q15-R4 %Parent:79.15), 24hr(Q14-R1 %Parent:0.22, Q14-R2 %Parent 26.68, Q14-R3 %Parent:0.08, Q14-R4 %Parent:73.02), 48hr (Q15-R1 %Parent:0.00, Q15-R2 %Parent:29.92, Q15-R3 %Parent:0.00, Q15-R4 %Parent: 70.08).
  • FIG. 11 shows the results of analyzing the cytotoxicity to cancer cells (K562) after freezing and thawing a composition containing nucleated cells and immune cells in the blood.
  • the horizontal axis is FITC-A
  • the vertical axis is PE-A
  • the upper left is R1
  • the upper right is R2
  • the lower left is R3
  • the lower right is R4,
  • the top graph of A is 0hr (Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent:14.28, Q14-R3 %Parent:0.00, Q14-R4 %Parent:85.72), 24hr (Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent:30.77, Q14-R3 %Parent:0.00, Q14-R4 %Parent:69.23), 48hr (Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent:63.46, Q14-R3 %Parent:0.00 , Q14-R4 %Parent: 36.54),
  • the bottom graph of A is 0hr (Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent:19.12, Q14-R3 %Parent:0.00, Q14-R4 %Parent:80.88), 24hr (Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent:36.52, Q14-R3 %Parent:0.00, Q14-R4 %Parent:63.48), 48hr (Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent:73.77, Q14-R3 %Parent:0.00 , Q14-R4 %Parent: 26.23).
  • Ficoll-paque 15 to 25 ml of Ficoll-paque (GE healthcare, USA) was added to a 50 ml tube.
  • blood collected from humans was added in volumes of 1 to 2 times so as not to be mixed with Ficoll-paque to form two density gradient layers. Then, centrifugation was performed at 2,000 rpm for 20 minutes. After centrifugation, plasma (Plasma), peripheral blood mononuclear cells (PBMC), Ficoll-paque-containing granular leukocytes (Ficoll-paque+granulocyte) and red blood cells (RBC) Four density gradient layers formed in the order of were confirmed. Plasma and peripheral blood mononuclear cells in the formed density gradient layer were obtained by separating each into a new 50 ml tube.
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • Ficoll-paque+granulocyte Ficoll-paque+granulocyte
  • RBC red blood cells
  • the plasma obtained in Preparation Example 1 was bathed in a constant temperature water bath at 56° C. for 30 minutes, and then centrifuged at 1,500 rpm for 5 minutes to obtain a heat-treated plasma supernatant. Thereafter, the peripheral blood mononuclear cells obtained in Preparation Example 1 were cultured in a medium to which heat-treated plasma was added for 14 days at 37° C. and 5% CO 2 conditions.
  • the plasma obtained in Preparation Example 1 was centrifuged at a speed of 25,000 x g for 20 minutes at a temperature of about 4° C. to separate plasma-derived substances.
  • Ficoll-paque 15 to 25 ml of Ficoll-paque (GE healthcare, USA) was added to a 50 ml tube.
  • blood collected from human bone marrow was added in volumes of 1 to 2 times so as not to be mixed with Ficoll-paque to form two density gradient layers.
  • centrifugation was performed at 2,000 rpm for 20 minutes, and after centrifugation, plasma (Plasma), nucleated cells in the blood, granulocytes containing Ficoll-paque (Ficoll-paque+granulocyte) and red blood cells (RBC) were performed in the order of Four density gradient layers formed were confirmed. Plasma and blood nucleated cells in the formed density gradient layer were respectively separated and obtained in a new 50 ml tube.
  • Ficoll-paque 15 to 25 ml of Ficoll-paque (GE healthcare, USA) was added to a 50 ml tube.
  • blood collected from human umbilical cord blood was added in 1 to 2 volumes without mixing with Ficoll-paque to form two density gradient layers.
  • centrifugation was performed at 2,000 rpm for 20 minutes, and after centrifugation, plasma (Plasma), nucleated cells in the blood, granulocytes containing Ficoll-paque (Ficoll-paque+granulocyte) and red blood cells (RBC) were performed in the order of Four density gradient layers formed were confirmed. Plasma and blood nucleated cells in the formed density gradient layer were respectively separated and obtained in a new 50 ml tube.
  • Example 1 Preparation of a composition comprising plasma-derived material and immune cells (1)
  • Peripheral blood mononuclear cells as immune cells obtained in Preparation Example 1 were prepared using a hemocytometer to prepare 1 X 10 5 cells. Thereafter, the plasma-derived material separated in Preparation Example 4 was mixed at a concentration of 0.1 to 5 ⁇ g based on the prepared cells to prepare a composition including the plasma-derived material and immune cells.
  • Peripheral blood mononuclear cells as immune cells obtained in Preparation Example 1 were prepared using a hemocytometer to prepare 1 X 10 5 cells. Thereafter, a composition containing human plasma-derived material and immune cells was prepared by mixing the plasma-derived material isolated in Preparation Example 4 at a concentration of 0.1 to 5 ⁇ g based on the prepared cells, and stored frozen, and thawed after one month of freezing in the experiment. was used.
  • Example 3 Preparation of a composition comprising a substance derived from nucleated cells in blood and immune cells (1)
  • Peripheral blood mononuclear cells as immune cells obtained in Preparation Example 2 were prepared as 1 X 10 5 cells using a hemocytometer. Thereafter, 30 ⁇ g of the peripheral blood cell-derived material isolated in Preparation Example 3 was mixed based on the prepared cells to prepare a composition containing the nucleated cell-derived material and immune cells in the blood.
  • Example 4 Preparation of a composition comprising a substance derived from nucleated cells in blood and immune cells (2)
  • Peripheral blood mononuclear cells as immune cells obtained in Preparation Example 2 were prepared using a hemocytometer to prepare 1 X 10 5 cells. Then, based on the prepared cells, 30 ⁇ g of the peripheral blood cell-derived material isolated in Preparation Example 3 was mixed to prepare a composition containing the peripheral blood mononuclear cell-derived material and the peripheral blood mononuclear cell, and stored frozen, and stored frozen in the experiment for one month. It was then thawed and used.
  • the protein concentration was analyzed using a bicinchoninic acid (BCA) solution to confirm the concentration of plasma-derived substances, and the results are shown in FIG. 2 .
  • BCA bicinchoninic acid
  • plasma-derived substances were obtained at a concentration of about 30 ⁇ g by weight per 30 cc of blood.
  • Example 1 The composition of Example 1 was prepared in which the concentrations of plasma-derived substances were mixed at concentrations of 0.1, 0.3, 0.5, 1, 3, and 5 ⁇ g by weight, respectively.
  • the peripheral blood mononuclear cells of Preparation Example 1 in which plasma-derived substances were not mixed were used.
  • K562 (target cells) 1 X 10 5 cells and 1 X 10 6 cells were mixed, and then cultured in an incubator at 37° C., 5% CO 2 condition for 4 hours. .
  • apoptosis-specific staining reagent (7AAD, Invitrogen, USA) was added, and the degree of apoptosis of target cells was confirmed through flow cytometry, and the results are shown in FIG. 3 .
  • Example 1 The composition of Example 1 in which 0.3 ⁇ g of plasma-derived material was mixed was prepared by culturing up to 48 hours after preparation.
  • the peripheral blood mononuclear cells of Preparation Example 2 in which plasma-derived substances were not mixed were used.
  • GM130 Golgi marker
  • LAMP-1 Lisosome marker
  • PMP70 Peroxisome marker
  • KDEL ER marker
  • the protein concentration was analyzed using a bicinchoninic acid (BCA) solution, and the results are shown in FIG. 7 .
  • BCA bicinchoninic acid
  • the nucleated cell-derived material in the blood was obtained at a concentration of about 250 ⁇ g by weight per 2 ⁇ 10 7 cells.
  • the peripheral blood mononuclear cells obtained in Preparation Example 1 were prepared as 2 X 10 5 cells.
  • immune cell-specific surface antibodies CD3-FITC T cells
  • CD56-APC+CD16-PE NK cells
  • CD3-FITC+CD56- After the addition of APC (NKT cells), the reaction was carried out at a temperature of about 4° C. for 30 minutes. Thereafter, the reacted cells were washed twice with phosphate buffered saline, and then the fluorescence expression distribution of the specific surface antibody labeled on the immune cell surface was checked through flow cytometry, and the results are shown in FIG. 8 .
  • Example 3 The composition of Example 3 was prepared by mixing 30 ⁇ g of material isolated from peripheral blood mononuclear cells, and cultured for up to 48 hours.
  • the peripheral blood mononuclear cells of Preparation Example 2 without mixing with substances isolated from human peripheral blood mononuclear cells were used.
  • K562 (target cells) and A549 (target cells) 1 X 10 5 cells and 1 X 10 6 cells of the composition prepared above were mixed, followed by 37° C., 5% CO 2 conditions was incubated for 4 hours in an incubator of To analyze the degree of apoptosis of K562 (target cells) cells, apoptosis-specific staining reagent (7AAD, Invitrogen, USA) was added and the degree of apoptosis of target cells was confirmed through flow cytometry, and the results are shown in FIGS. 9 and 10 indicated.
  • Example 4 In order to check whether immune cells thawed after freezing and thawing maintain toxicity, the composition of Example 4 was prepared by mixing 30 ⁇ g of a material isolated from peripheral blood mononuclear cells, and culturing for 48 hours. In addition, as a comparative example, the peripheral blood mononuclear cells of Preparation Example 2 that were not mixed with the separated peripheral blood mononuclear cells were used after freezing and thawing.
  • K562 (target cells) 1 X 10 5 cells and 1 X 10 5 composition were mixed, and cultured at 37° C., 5% CO 2 condition in an incubator for 4 hours.
  • apoptosis-specific staining reagent (7AAD, Invitrogen, USA) was added and the degree of apoptosis of target cells was confirmed through flow cytometry, and the results are shown in FIG. 11 .

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Abstract

본 발명은 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질; 및 면역세포;를 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다. 본 발명의 약학조성물은 활성이 증가된 면역세포를 포함하고 있어 이를 공급받는 대상체의 면역체계를 강화시켜 우수한 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료효과를 나타낼 수 있다.

Description

혈액 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학조성물
본 발명은 혈액 유래 물질 및 및 면역세포를 포함하는 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
암(cancer) 또는 악성종양(malignant tumor)은 현대의 대표적인 난치성 질환 중 하나로 전세계적으로 매년 환자가 증가하고 있고 한국인에게도 단일질환으로는 가장 높은 사망률을 보이는, 사회적 경제적 부담을 유발하는 질환이다.
종래 암을 치료하기 위한 방법으로는 외과적 수술, 방사선 조사 또는 항암제의 투여가 있으며, 이러한 치료법들은 암을 치료하는 효과를 보일 수 있으나 세포독성에 따른 부작용, 면역력 저하로 인한 암의 재발 등의 많은 문제점이 있었다. 이에 최근 종래 사용되던 치료법의 한계를 극복 또는 보완할 수 있는 치료법 중 하나로 면역세포를 이용한 치료법이 연구되고 있다.
면역세포를 이용한 치료법은 인체 내에 존재하는 면역세포인 수지상세포, 자연살해세포, T 세포 등을 이용하여 체내 면역반응을 활성화시켜 질병을 치료하는 것이다. 즉, 면역세포가 보유하고 있는 암세포 등을 사멸시키는 면역시스템을 이용하여 면역기능을 강화해 인체의 자연치유력을 높이는 치료법이다.
이러한 면역세포를 이용한 치료제들은 일반적으로 환자로부터 면역세포를 분리하고 생체 외에서 배양 및 증식하여 면역세포의 활성을 높인 후 환자의 체내로 다시 주입하는 방법을 이용한다. 그러나, 이러한 방법은 면역세포의 활성이 질병을 치료하기에 충분하지 않거나, 환자가 병원을 다회 방문해야 하므로 편의성이 떨어지고, 특히 건강이 악화된 상태의 환자에게는 배양에 소요되는 기간이 부담스러울 수 있다는 문제가 있다.
따라서, 면역세포의 활성을 증가시켜 면역세포가 보유한 암세포에 대한 독성을 증가시키고, 면역체계를 강화시킬 수 있으면서도, 단기간 내에 면역세포를 인체에 적용할 수 있어 치료에 유용하게 사용할 수 있는 기술의 연구가 필요하다.
본 발명자들은 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질을 면역세포에 혼합하는 경우, 면역세포가 보유한 암세포에 대한 독성을 증가시킬 수 있고, 이를 공급받는 대상체의 면역체계를 강화시켜 우수한 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료효과를 가진다는 점을 입증하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명은 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질; 및 면역세포;를 포함하는 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물에 관한 것이다.
본 발명의 상기 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명은 암 또는 면역과 관련된 질병을 보유하고 있는 개체에 본 발명의 약학조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 면역질환 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어들에 대해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다. 또한, 문맥상 특별히 정의하지 않은 경우라면, 단수는 복수를 포함하며, 복수는 단수를 포함한다.
본 명세서에 있어서, 항목은 명세서 기재의 편의성을 위해 임의로 나누어 놓은 것일 뿐, 어느 한 항목에 대한 내용이 해당 항목에 종속된다고 해석되어서는 안된다.
본 발명은 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질; 및 면역세포;를 포함하는 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물을 제공한다.
본 발명에서 “유핵세포”는 핵, 즉, 염색체 DNA를 포함하는 기관을 지니는 세포를 의미한다. 본 발명에서 상기 혈액 내 유핵세포는 적혈구가 비포함된 것을 의미할 수 있으며, 상기 “적혈구가 비포함된”은 적혈구가 약 50%, 55,%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95% 이상 포함되지 않은(제거된) 것을 의미한다.
본 발명에서 "혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질"은 혈액 내 유핵세포 또는 혈장에 존재했었으나, 분리된 상태의 물질을 의미하며, 면역세포와 혼합될 경우 면역세포의 활성 증가를 통해 면역세포가 보유한 암 세포 등에 대한 독성(또는 세포살상능)을 증가 또는 회복시키고, 면역체계를 강화시켜 암 또는 면역질환 예방 또는 치료효과를 증가시킬 수 있는 물질을 의미한다. 본 명세서에서 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질은, 혈액 내 유핵세포로부터 유래된(분리된) 물질 또는 혈장으로부터 유래된(분리된) 물질을 의미하며, 혈액 내 유핵세포 유래(분리) 물질 또는 혈장 유래(분리) 물질로도 표현된다.
본 발명에서 상기 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질은 동물의 혈액으로부터 유래된 유핵세포 또는 혈장으로부터 분리된 것일 수 있으며, 상기 동물은 바람직하게는 포유동물일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있다.
후술하는 실험예에서, 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질을 면역세포에 혼합하는 경우, 암세포 사멸능을 증가시키는 등 면역세포의 활성을 증가시킬 수 있다는 점을 확인하여, 본 발명의 조성물이 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용으로 유용하게 사용될 수 있다는 점을 입증하였다.
본 발명에서 상기 혈액 내 유핵세포 또는 혈장은 골수, 제대혈액 및 말초혈액으로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상에서 분리된 것일 수 있으며, 바람직하게는 제대혈액 또는 말초혈액에서 분리된 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 혈액 내 유핵세포는 말초혈액단핵세포(PBMC)일 수 있다.
본 발명에서 "말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)"는 둥근 핵을 가진 혈액세포로, 림프구, 단핵구 등으로 구성되어 있는 것을 의미한다. 상기 말초혈액단핵세포는 예를 들어, 혈액으로부터 피콜(Ficoll)과 원심분리를 이용하여 분리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질은 세포 밖 소포체(extracellular vesicle), 세포소기관(subcellular organelle) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명에서 "세포 밖 소포체(extracellular vesicle)"는 세포에서 유래된, 세포 밖으로 방출된 막으로 둘러싸인 다양한 크기의 소포체을 의미하며, 상기 세포 밖 소포체는 내부에 단백질, 지질, 여러 종류의 RNA(mRNA, microRNA, tRNA, rRNA), DNA 등을 내재하고 있다. 상기 세포 밖 소포체는 유래된 세포의 종류에 따라 덱소솜(dexosome), 온코솜(oncosome), 프로타솜(prostasome) 등으로 분류되며, 세포의 생성 방법에 따라 미세소포(microvesicle), 엑토솜(extosome), 엑소솜(exsosome), 세포자멸체(apoptotic body) 등으로 분류된다.
상기 세포 밖 소포체는 나노미터 또는 마이크로미터 사이즈의 크기(직경)를 갖는 것일 수 있으며, 구체적으로 1 내지 1000 nm, 20 내지 1000 nm, 20 내지 100 nm 또는 50 내지 100 nm일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 세포 밖 소포체는 미세소포, 엑토솜, 엑소솜 및 세포자멸체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 구체적으로 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 분리된 미세소포, 엑토솜, 엑소솜 및 세포자멸체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 세포 밖 소포체는 RNA, DNA, 성장인자 및 세포소기관으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 함유하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "세포소기관(subcellular organelle)"은 세포를 구성하는 특수한 기능을 지닌 기관을 의미한다.
상기 세포소기관은 나노미터 또는 마이크로미터 사이즈의 크기(직경)를 갖는 것일 수 있으며, 구체적으로, 0.1 내지 100 ㎛, 0.1 내지 50 ㎛, 0.1 내지 25 ㎛, 0.1 내지 15 ㎛, 0.1 내지 10 ㎛, 0.1 내지 5 ㎛, 또는 0.1 내지 3 ㎛ 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 세포소기관은 예를 들어, 세포핵(cell nucleus), 핵막(nuclear membrane), 세포질(cytoplasm), 세포막(cell membrane), 세포 기질(cytosol), 미토콘드리아(mitochondria), 리소좀(lysosome), 소포체(endoplasmic reticulum, ER), 골지체(golgi apparatus), 퍼옥시좀(peroxisome) 등 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 세포소기관은 골지, 리소좀, 퍼옥시좀, 소포체 및 미토콘드리아로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으며, 바람직하게는 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 분리(유래)된 골지, 리소좀, 퍼옥시좀, 소포체 및 미토콘드리아를 포함하는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 세포소기관은 정상적으로 기능하는 것 및 기능이 결여(저하)된 것을 모두 포함하는 것일 수 있다. 즉, 분리된 세포소기관의 일부는 기능이 결여(저하)된 것을 포함할 수 있다.
본 발명에서 “정상적으로 기능”한다는 것은 해당 세포소기관이 보유한 고유의 기능을 발휘할 수 있는 것을 의미한다. 또한, 본 발명에서 "기능이 결여(저하)“되었다는 것은 고유의 기능이 발휘되지 않거나 저하된 것을 의미히며, “기능이 손상된”과 상호교환적으로 사용될 수 있고, 상기 기능이 결여(저하)된 세포소기관은 기능적으로 정상인 세포소기관 대비 90%, 85%, 80%, 75%, 70%, 65%, 60%, 55% 또는 50% 미만의 기능성을 나타내는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 혈장으로부터 유래된 물질은 셀-프리(cell-free)인 것일 수 있다.
본 발명에서 “셀-프리(cell-free)”는 인체 내에서 세포의 파괴로 인해 세포 밖으로 유출되거나 또는 비-파괴 세포로부터 유리되어 세포 밖으로 나온 물질이 혈액의 액체 성분인 혈장 내에서 순환하고 있는 상태를 의미한다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 혈장으로부터 유래된 물질은 혈장 내에서 순환하고 있는 셀-프리 미세소포, 셀-프리 엑토솜, 셀-프리 엑소솜, 셀-프리 세포자멸체, 셀-프리 세포소기관 및 혈소판에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 상기 혈장으로부터 유래된 물질은 혈장 내에서 순환하고 있는 셀-프리 골지, 셀-프리 리소좀, 셀-프리 퍼옥시좀, 셀-프리 소포체 및 셀-프리 미토콘드리아로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질을 분리하는 방법은 당업계에서 통상적으로 사용되는 방법을 사용할 수 있다. 예를 들어, 원심분리를 통해 물질을 분리하는 방법을 사용할 수 있으며, 원심분리 전 배양하는 단계 및/또는 세포를 파쇄하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질은 신선한 상태, 동결보관 후 해동한 상태 또는 배양된 상태의 혈액 내 유핵세포 또는 혈장에서 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "신선한 상태"는 개체로부터 수득된 후 배양이나 동결보관 과정을 거치지 않은 상태를 의미한다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 혈장으로부터 유래된 물질은 신선한 상태의 혈장에서 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 상기 혈액 내 유핵세포로부터 유래된 물질은 골수, 제대혈액 또는 말초혈액에서 분리된 유핵세포를 배양한 후, 분리된 것일 수 있으며, 본 발명의 일 실시예에 따르면, 상기 혈액 내 유핵세포로부터 유래된 물질은 배양된 상태의 말초혈액단핵세포(PBMC)에서 분리된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명에서 상기 배양의 기간은 7일, 8일, 9일, 10일, 11일, 12일, 13일 또는 14일 이상일 수 있으며, 본 발명의 실시예들에 따르면, 7일 내지 30일, 구체적으로 7일 내지 20일, 10일 내지 20일, 더욱 구체적으로 약 14일의 기간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질은 공지된 방법을 통해 수득된 것일 수 있다.
상기 혈장으로부터 유래된 물질은 예를 들면, 약 0~10℃의 온도에서 1~20분 동안 10,000 내지 30,000 x g의 속도로, 바람직하게는 20,000 내지 30,000 x g의 속도로 원심분리하여 수득할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 방법으로 수득된 혈장으로부터 유래된 물질은 혈액 30 cc 당 혈장 유래 물질이 1 내지 50 ㎍ 수득되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 10 내지 50 ㎍, 20 내지 40 ㎍, 더욱 바람직하게는 25 내지 35 ㎍ 수득되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 혈액 내 유핵세포로부터 유래된 물질은 예를 들면, a) 혈구 계산기를 이용하여 2 X 107 cells/ml의 세포를 회수하는 단계; b) 0 내지 4℃의 온도에서 1 내지 10분 동안 150 내지 500, 바람직하게는 200 내지 400 x g의 속도로 원심분리를 수행하여 세포 펠렛을 제조하는 단계; c) 상기 펠렛을 버퍼용액에 재현탁하고 균질화하는 단계; d) 균질화된 조성물을 약 0~10℃의 온도에서 1 내지 20분 동안 1,500 내지 30,000 x g, 바람직하게는 10,000 내지 25,000 x g의 속도로 원심분리한 후, 상청액을 수득하는 단계; 및 e) 상기 상청액을 약 0~10℃의 온도에서 1 내지 20분 동안 10,000 내지 30,000 x g의 속도로 원심분리하는 단계;를 포함하는 방법에 의해 수득되는 것일 수 있다. 또한, 상기 방법으로 수득된 혈액 내 유핵세포로부터 유래된 물질은 말초혈액단핵세포 2 X 107 세포 당 100 내지 400 ㎍, 바람직하게는 200 내지 300 ㎍, 더욱 바람직하게는 230 내지 280 ㎍로 수득되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "면역세포(immunocyte)"는 외부에서 침입한 병원균, 이물질, 바이러스 등에 대해 방어기작으로 면역력을 조절하거나 병원균 등을 직접 공격하는 세포를 의미하며, 예를 들어, NK 세포, NKT 세포, T 세포, B 세포, 백혈구(대식세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 수지상세포 등) 등이 있다.
본 발명에서 면역세포는 특정한 한 종류의 면역세포일 수 있으나, 다양한 종류의 면역세포들을 포함하고 있는 집단을 의미할 수 있다. 예를 들어, B 세포, T 세포, 대식세포, 수지상 세포, 자연살해세포 등의 면역세포를 포함하고 있는 집단인 말초혈액단핵세포(PBMC)를 포함한다. 또한, 면역세포는 단일의 면역세포 및 복수의 면역세포를 포함한다.
본 발명에서 "말초혈액단핵세포(peripheral blood mononuclear cell, PBMC)"는 둥근 핵을 가진 혈액세포로, 상기 말초혈액단핵세포 안에는 B 세포, T 세포, 대식세포(macrophage), 수지상 세포(dendritic cell, DC), 자연살해세포(natural killer cell, NK cell) 등의 면역세포들이 포함되어 있다. 암세포를 직접 제거하는 면역세포로는 자연살해세포 및 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte, CTL) 등이 있으며, 이들 효력세포(effector cell)에게 항원을 제시해 주는 항원제시세포(antigen presenting cell)로는 수지상세포나 B 세포가 있다. 그밖에 각종 사이토카인(cytokine)을 분비하는 보조 T 세포(helper T cell), 조절 T 세포(regulatory T cell) 등이 면역반응에 함께 관여하게 된다.
본 발명에서 면역세포는 조혈모세포로부터 분화될 수 있는 골수계통(myeloid) 또는 림프계통(lymphoid) 세포일 수 있다.
본 발명에서 "조혈모세포(hematopoietic stem cell, HSC)"는 조혈줄기세포라고도 지칭되며, 혈액의 주요 구성성분으로 잠재적 분화 가능한 세포를 의미한다. 조혈모세포는 각종 사이토카인에 의해 골수(myeloid)계통의 거핵구, 적혈구, 비만세포(mast cell), 호염기성구, 호중구, 호산구, 수지상 세포(dendritic cell, DC) 및 대식세포(Macrophage), 또는 림프(lymphoid)계통의 자연살해세포(natural killer cell, NK cell), T 세포(T cell 또는 T lymphocyte) 및 B 세포(B cell 또는 B lymphocyte) 등의 세포로 분화한다.
본 발명에서 상기 면역세포는 단핵구(monocyte), 자연살해세포(NK cell), 세포독성 T 세포(killer T cell), NK-T 세포, T 세포, B 세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 대식세포 및 수지상세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상일 수 있으며, 바람직하게는 상기 면역세포는 단핵구, 림프구 및 수지상세포, 즉, 단핵구, 자연살해세포, 세포독성 T 세포, NKT 세포, T 세포, B 세포 및 수지상세포로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 말초혈액단핵세포(PBMC)일 수 있다.
본 발명에서 "자연살해세포(NK cell)"는 바이러스 감염세포 또는 암세포에 선택적으로 세포독성을 보이는 선천면역세포를 의미한다. 자연살해세포는 암의 발생, 증식, 전이 및 재발을 막는데 효과적이라는 사실이 보고된 바 있다.
본 발명에서 "T 세포(T cell 또는 T lymphocyte)"는 T 림프구로도 지칭되며, 항원 특이적인 적응 면역을 주관하는 림프구 중 하나를 의미한다. 상기 T 세포는 아직 항원을 만나지 못한 미접촉 T 세포, 항원을 만나 성숙한 효과 T 세포(보조 T 세포, 세포독성 T 세포, 자연살상 T 세포) 및 기억 T 세포로 분류된다.
본 발명에서 "호중구"는 호중성 과립구(neutrophil granulocyte)로도 지칭되며, 포유류에서 가장 많은 비율을 차지하는 백혈구를 의미하며, 선천면역에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 알려져 있다.
본 발명에서 "호산구(eosinophil)"는 주로 기생충, 바이러스에 작용하는 호산성 과립이 차있는 과립구를 의미한다.
본 발명에서 "호염기구(basophil)"는 세포 내 헤파린과 히스타민을 함유한 과립을 가진 백혈구를 의미한다.
본 발명에서 "대식세포(macrophage)"는 탐식세포로도 지칭되며 선천면역을 담당하는 주요 세포 중 하나로 세포 조직이나 이물질, 미생물, 암세포 등 건강한 몸에 존재하는 단백질이 아닌 것을 흡수하고 소화시키는 식세포 작용을 하는 백혈구의 한 유형을 의미한다.
본 발명에서 "수지상세포(dendritic cell)"는 포유류의 면역계를 구성하는 면역 세포로 병원균 물질을 처리하여 면역계의 다른 세포를 위해 표면에 표시하는 기능을 수행하는 세포를 의미한다.
본 발명에서 상기 면역세포는 외래 유전자 등이 도입되어 유전적으로 변형(modification) 또는 조작(engineering)된 면역세포일 수 있다.
본 발명에서 "유전적으로 변형(modification) 또는 조작(engineering)"은 세포의 유전물질 구성 또는 구조를 인위적으로 변경하는 것을 포함하며, 표적 특이성 및/또는 호밍(homing) 특이성을 향상시키는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전적으로 변형 또는 조작된 면역세포는 예를 들어, 키메릭 항원 수용체-T 세포(Chimeric antigen receptor-T cell, CAR-T), 키메릭 항원 수용체-NK세포(Chimeric antigen receptor-NK cell, CAR-NK)일 수 있으며, 호밍 수용체를 포함하는 T 세포 또는 NK 세포일 수 있으며, CAR 및 호밍 수용체를 모두 포함하는 T 세포 또는 NK 세포일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 "키메릭 항원 수용체-T 세포(Chimeric antigen receptor-T cell, CAR-T) 또는 키메릭 항원 수용체-NK 세포(Chimeric antigen receptor-NK cell, CAR-NK)"는 키메릭 항원 수용체를 발현시켜 암세포를 효과적으로 공격할 수 있도록 엔지니어링된 T 세포 또는 NK 세포를 의미한다.
본 발명에서 "키메릭 항원 수용체(Chimeric antigen receptor, CAR)"는 T 세포 또는 NK 세포의 활성화 단백질의 세포막 혹은 세포내 신호전달부위를 암 항원 특이적 항체의 항원결합부위와 융합시킨 단백질을 의미한다.
본 발명에서 CAR 및/또는 호밍 수용체를 포함하는 면역세포는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 바이러스 또는 비바이러스 벡터를 이용하여 형질주입에 의해 도입시키는 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 면역세포는 자가 면역세포일 수 있다.
본 발명에서 CAR 및/또는 호밍 수용체를 포함하는 면역세포는 당업계에 공지된 임의의 방법에 의해 수득될 수 있다. 예를 들면, 바이러스 또는 비바이러스 벡터를 이용하여 형질주입에 의해 도입시키는 방법을 사용할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 면역세포는 자가 면역세포일 수 있다.
본 발명에서 "자가 면역세포"는 기증자 및 수혜자가 동일한 면역세포를 의미하며, 동종 면역세포와 구별된다. 자가 면역세포를 사용하는 경우, 면역반응에 의한 이식거부반응을 피할 수 있으나 면역력이 떨어진 환자의 세포의 기능(활성) 저하가 문제가 될 수 있다.
본 발명의 조성물은 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질을 사용하여 면역세포의 활성을 증가 또는 회복시킬 수 있으므로, 환자로부터 수득된 면역세포의 기능을 활성화시키기 위한 별도의 배양과정을 거치지 않더라도 효과적으로 암 예방 또는 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 면역세포는 개체로부터 분리한 신선한 상태, 동결보관 후 해동한 상태 또는 배양된 상태일 수 있다.
본 발명에서 "신선한 상태"는 개체로부터 수득된 후 배양이나 동결보관 과정을 거치지 않은 상태를 의미한다.
본 발명에서 동결보관된 면역세포는 개체로부터 수득된 후 동결보관된 것일 수 있으며, 개체로부터 수득된 후 배양하는 단계를 거친 후 동결보관된 것일 수 있다. 또한, 동결보관 전 세포 유래 물질을 면역세포에 혼합한 후에 동결보관된 것일 수 있으며, 동결보관 전 세포 유래 물질을 면역세포에 혼합하고 배양한 후에 동결보관된 것일 수 있다.
후술하는 실험예에서 본 발명의 조성물은 동결보관 후 해동된 면역세포가 별도의 배양과정이 없어도 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질의 혼합으로 인해 세포독성(암세포 살상능)이 증가되어 우수한 암세포 사멸효과를 가진다는 점을 입증하였다.
본 발명에서 상기 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질은 상기 면역세포의 활성을 증가시켜 세포독성(살상능)을 증가시키는 것일 수 있다.
본 발명에서 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질; 및 면역세포;는 동일 또는 상이한 개체로부터 수득된 것일 수 있으며, 바람직하게는 동일한 개체로부터 수득된 것일 수 있다.
본 발명에서 "개체"는 임의의 인간, 비인간 동물을 포함한다. 상기 "비인간 동물"은 척추동물, 예컨대 비인간 영장류, 양, 개, 및 설치류, 예컨대 마우스, 래트 및 기니피그일 수 있다. 상기 개체는 바람직하게 인간일 수 있으며, 구체적으로 종양세포를 보유하고 있는 인간일 수 있다. 본 명세서에서 용어 "개체"는 "대상체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질은 면역세포로부터 분리된 것일 수 있으며, 보다 구체적으로 상기 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질은 개체로부터 분리되어 수득된 혈액 내 유핵세포 또는 혈장 중 일부, 예를 들어, 전체 대비 1 내지 50%, 바람직하게는 1 내지 30%, 더욱 바람직하게는 5 내지 30 중량%, 더더욱 바람직하게는 5 내지 25 중량%의 혈장 또는 혈액 내 유핵세포로부터 분리된 것일 수 있다. 상기 면역세포는 개체로부터 분리되어 수득된 후 배양된 것일 수 있다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 혈액 내 유핵세포로부터 유래된 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물에 있어서 혈액 내 유핵세포로부터 유래된 물질은 하나의 개체로부터 수득된 말초혈액단핵세포 중 일부로부터 분리된 것이고, 면역세포는 상기 혈액 내 유핵세포로부터 유래된 물질이 분리된 말초혈액단핵세포를 제외한 나머지 말초혈액단핵세포일 수 있다. 또한, 본 발명의 실시예들에 따르면, 혈장으로부터 유래된 물질을 포함하는 면역세포는 하나의 개체로부터 수득된 혈장에서 분리된 것이고, 면역세포는 상기 혈장을 수득한 동일한 개체로부터 수득된 말초혈액단핵세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 혈액 내 유핵세포로부터 유래된 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물은 면역세포 1x105의 세포 당 혈액 내 유핵세포로부터 유래된 물질을 0.01 내지 500 ㎍, 0.01 내지 400 ㎍, 0.01 내지 300 ㎍, 0.01 내지 200 ㎍, 0.01 내지 100 ㎍, 0.01 내지 50 ㎍, 0.01 내지 40 ㎍, 0.01 내지 35 ㎍, 0.1 내지 35 ㎍ 또는 0.1 내지 30 ㎍ 혼합하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 실시예들에 따르면, 혈장으로부터 유래된 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물은 면역세포 1x105의 세포 당 혈장으로부터 유래된 물질을 0.01 내지 500 ㎍, 0.01 내지 400 ㎍, 0.01 내지 300 ㎍, 0.01 내지 200 ㎍, 0.01 내지 100 ㎍, 0.01 내지 50 ㎍ 또는 0.01 내지 30 ㎍ 혼합하여 제조된 것일 수 있으며, 바람직하게는 0.1 내지 10 ㎍, 0.1 내지 9 ㎍, 0.1 내지 8 ㎍, 0.1 내지 7 ㎍ 또는 0.1 내지 6 ㎍ 혼합하여 제조된 것일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 0.1 내지 5 ㎍, 0.1 내지 1 ㎍, 0.1 내지 0.5 ㎍ 혼합하여 제조된 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 상기 조성물은, 개체로부터 면역세포를 수득하는 단계; 상기 수득된 면역세포 중 1 내지 50 중량%의 면역세포로부터 물질을 분리하여 수득하는 단계; 및 상기 수득된 면역세포로부터 유래된 물질 및 나머지 면역세포를 혼합하는 단계;를 포함하는 방법에 의해 제조된 것일 수 있다. 또한, 개체로부터 면역세포를 분리하여 수득하는 단계 이후 수득된 면역세포를 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 암을 예방 또는 치료하기 위해 사용될 수 있다. 상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
본 발명에서 암의 치료는 예를 들면 치료 전 대비 종양의 성장을 약 10% 이상, 약 20% 이상, 약 40% 이상, 약 60% 이상, 또는 약 80% 이상 억제하는 것일 수 있다.
본 발명에서 상기 조성물은 면역질환의 예방 또는 치료를 위해 사용될 수 있으며, 상기 면역질환은 자가면역질환, 감염성질환, 이식거부 질환 및 염증질환으로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있다.
상기 자가면역질환은 예를 들어, 다발성 경화증, 루푸스, 류마티스관절염, 크론병 및 1형 당뇨병으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 감염성질환은 B형 간염, C형 간염, 인간 파필로마 바이러스(human papilloma virus: HPV) 감염, 사이토메갈로바이러스(cytomegalovirus) 감염, 바이러스성 호흡기 질환, 및 인플루엔자로 구성된 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 염증질환은 천식, 축농증, 아토피, 치주염 및 베체트병으로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 치료적 유효량의 면역세포가 대상체에 투여되도록 제형화될 수 있다.
본 발명에서 "약학적 유효량"은 치료 유효량 및 예방 유효량을 포함한다.
본 발명에서 "치료적 유효량"은 약물 또는 치료제가 단독으로 또는 다른 치료제와 조합되어 사용되는 경우에, 질환 증상의 중증도 감소, 질환 증상이 없는 기간의 빈도 및 지속기간의 증가, 또는 질환 고통으로 인한 손상 또는 장애의 방지를 나타낼 수 있는 약물의 임의의 양을 의미한다.
본 발명에서 "예방 유효량"은 질환 발생 위험이 있는 개체 또는 질환의 재발로 인해 고통받을 위험이 있는 개체에서 질환의 발생 또는 재발을 억제하는 약물의 임의의 양을 의미한다. 유효량의 수준은 개체 종류 및 중증도, 연령, 성별, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소 등에 따라 결정될 수 있다.
본 발명에서 "투여"는 관련 기술분야의 통상의 기술자에게 공지된 다양한 방법 및 전달 시스템 중 임의의 것을 사용하여 조성물을 개체에게 물리적으로 도입하는 것을 지칭한다.
본 발명의 조성물을 위한 투여 경로는 모든 투여 경로를 포함한다. 바람직하게는, 비경구 투여일 수 있으며, 예를 들어 정맥내, 근육내, 피하, 복강내, 척수 또는 다른 비경구 투여 경로, 예컨대 주사 또는 주입에 의한 투여 경로를 포함하며, 바람직하게는 주사에 의한 투여 경로일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물을 위한 투여 횟수는 예를 들어 1회, 복수 회, 및/또는 하나 이상의 연장된 기간에 걸쳐 수행될 수 있다.
본 발명의 조성물은 환자의 나이, 성별, 체중에 따라 달라질 수 있으며, 구체적으로 암을 갖는 개체의 질환 발병 정도에 따라 본 발명의 조성물 또한, 그 투여량은 투여 경로, 질병의 정도, 성별, 체중, 나이, 특히 환자가 갖는 암의 발병 정도 등에 따라 증감될 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 다른 치료제와 병용하여 투여되는 경우, 본 발명의 조성물과 다른 치료제는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다. 상기 다른 치료제는 암의 퇴행을 촉진하거나 또는 추가로 종양 성장을 방지하는 화합물, 단백질 등의 약물일 수 있으며, 또한, 방사선 치료 등 약물 요법 이외의 기타 항암 요법을 모두 포함한다. 상기 병용 투여되는 치료제는 병용 투여의 경로, 투여시기, 및 투여용량은 질병의 종류, 환자의 질병 상태, 치료 또는 예방의 목적, 및 병용되는 다른 약물 혹은 생리학적 활성물질에 따라 결정될 수 있다.
본 발명의 조성물과 병용 투여될 수 있는 치료제는 항암제 또는 면역질환 치료제일 수 있으며, 예를 들어, 상기 항암제는 이매티닙(Imatinib), 5-FU(5-Florouracil), 이리노테칸(Irinotecan), 서니티닙(Sunitinib), 옥살리플라틴(Oxaliplatin), 파클리탁셀(Paclitaxel), 라파티닙(Lapatinib), 트라스트주맵(Trastuzumab, Herceptin), 제피티닙(Gefitinib), 에를로티닙(Erlotinib), 카보플라틴(Carboplatin), 도세탁셀(Docetaxel), 에버롤리무스(Everolimus), 소라페닙(Sorafenib), 카르보닉 언하이드라제(carbonic anhydrase) 억제제, 모노카르복실레이트 트랜스포터(monocarboxylate transporter) 억제제, 펌브로 펨브롤리주맙(Pembrolizumab), 아테졸리주맙(Atezolizumab), PD-1계열 항암제, 니볼루맙(Nivolumab), PARP-1 억제제, PARP-2 억제제, 올라파립(Olaparib), 루카파립(Rucaparib), 니카파립(Niraparib), 베바시주맙(Bevacizumab) 또는 VEGF 억제제일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 면역질환 치료제는 자가면역질환, 감염성질환 또는 염증성질환 치료제일 수 있으며, 상기 자가면역질환 치료제는 메토트렉세이트(Methotrexate, MTX), 히드록시클로로퀸(hydroxychloroquine), 설파살라진(Sulfasalzine), 레플루노마이드(Leflunomide), 인플릭시맙(Infliximab), 아달리무맙(Adalimumab), 골리무맙(Golimumab), 세토리주맙 페골(Certolizumab pegol), 리툭시맙(Rituximab), 토실리주맙(Tocilizumab), 토파시티닙(Tofacitinib), 바리시티닙(Baricitinib), 또는 에타너셉트(Etanercept)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 감염성질환 치료제는 독감 치료제(오셀타미비르, 자나미비르, 페라미비르 등), 헤르페스 치료제(아시클로버, 발라시클로비르, 팜시클로비르, 트리플루리딘 등), B형 간염 치료제(라미부딘, 텔비부딘, 클레부딘, 엔테카비르, 아데포비어, 테노포비르, 베시포비르 등), C형 간염 치료제(리바비린, 다사부비르, 다클라타스비르, 아수나프레비르 등), 에이즈 치료제(지도부딘, 아바카비르, 라미부딘, 에트라비린 네비라핀, 릴피비린, 아타자나비어, 다루나비르, 넬피나비르, 리토나비르 등) 또는 기타 항바이러스제일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 염증질환 치료제는 글루코코르티코이드 등의 스테로이드계 치료제, 아스피린(Aspirin), 이부프로펜(Ibuprofen) 나프록센(Naproxen) 등의 비스테로이드성 치료제, 면역 특이 소염 제재(imSAIDs)일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 항암제 또는 면역질환 치료제와 병용투여 되어 종래 치료제의 치료 효과를 현저히 증가시키는 역할을 할 수 있다.
본 발명의 조성물은 약학조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
본 발명에서 조성물은 약학적으로 허용 가능한 첨가제를 더 포함할 수 있다. 상기 첨가제는 예를 들어, 계면활성제, 안정화제 또는 용해보조제 등을 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 주사용수를 포함할 수 있다. 상기 주사용수는 고형주사제의 용해나 수용성 주사제를 희석하기 위하여 만들어진 증류수를 의미한다.
본 발명은 하기 단계를 포함하는 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물의 제조방법을 제공한다:
S1) 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질을 수득하는 단계; 및
S2) 상기 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질을 면역세포와 혼합하는 단계.
본 발명은 암 또는 면역 질환을 보유하고 있는 개체에 본 발명의 약학조성물을 투여하는 단계를 포함하는 암 또는 면역질환 예방 또는 치료방법을 제공한다.
본 발명에 따른 약학조성물의 제조방법 및 암 또는 면역질환 예방 또는 치료방법에서 각 용어는 특별히 언급하지 않는 한 상기 약학조성물에서 기술한 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명의 약학조성물은 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질 및 면역세포를 혼합하여 면역세포가 보유한 세포독성(살상능)을 증가시킬 수 있고, 나아가 이를 공급받는 대상체의 면역체계를 강화시킬 수 있으므로 우수한 암 또는 면역질환의 예방 또는 치료효과를 가진다.
또한, 본 발명의 약학조성물은 대상체의 면역체계 자체를 강화시킬 수 있으므로 암 재발방지 및 미세 잔존암의 제거에 효과적으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 약학조성물은 인체의 면역세포를 이용하므로 부작용이 적고 안전성이 높으며, 기존의 화학치료제들이 가지던 문제점, 예를 들면 화학항암제에서 나타나는 면역세포 사멸로 인한 면역기능의 저하, 위장관 장애 및 탈모 등의 부작용도 최소화할 수 있다.
또한, 본 발명의 약학조성물을 이용하는 경우, 환자 내원 후 혈액채취, 면역세포의 활성 증가 및 환자에게 다시 투여하는 일련의 과정들이 단시간 내 이루어 질 수 있어, 종래의 면역세포 활성화를 위해 배양기간이 요구되었던 치료방법 대비 환자의 편의성이 증가된다.
또한, 본 발명의 약학조성물은 면역세포 자체의 활성 증가로 인한 독성을 증가시키는 것이므로 투여 횟수 및 용량을 낮출 수 있어 환자들의 편의성 및 비용절감 효과까지 얻을 수 있다.
도 1은 혈장 유래 물질의 특정 표면 마커 확인한 결과이다.
도 2는 혈장 유래 물질(CM) 농도를 확인한 결과이다.
도 3은 혈장 유래 물질을 농도별로 혼합한 조성물의 암세포(K562)에 대한 세포독성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
도 4은 혈장 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물의 배양시간에 따른 암세포(K562)에 대한 세포독성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
A의 그래프에서 가로축은 CFSE-A, 세로축은 PI-A이고, 좌측 상단은 R1, 우측 상단은 R2, 좌측 하단은 R3, 우측 하단은 R4이며,
A의 상단 그래프는 0hr(Q4-R1 %Parent:0.00, Q4-R2 %Parent:6.46, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent:93.54), 24hr(Q4-R1, Q4-R2 %Parent 11.81, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent:88.19), 48hr(Q4-R1, Q4-R2 %Parent:22.14, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent: 77.86)이고,
A의 하단 그래프는 0hr(Q4-R1 %Parent:0.00, Q4-R2 %Parent:6.62, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent:93.38), 24hr(Q4-R1, Q4-R2 %Parent 18.33, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent:81.67), 48hr(Q4-R1, Q4-R2 %Parent:45.47, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent: 54.53)이다.
도 5은 혈장 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물의 배양시간에 따른 암세포(A549)에 대한 세포독성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
A의 그래프에서 가로축은 CFSE-A, 세로축은 PI-A이고, 좌측 상단은 R1, 우측 상단은 R2, 좌측 하단은 R3, 우측 하단은 R4이며,
A의 상단 그래프는 0hr(Q4-R1 %Parent:0.00, Q4-R2 %Parent:8.83, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent:91.17), 24hr(Q4-R1, Q4-R2 %Parent 8.74, Q4-R3 %Parent:2.18, Q4-R4 %Parent:88.61), 48hr(Q4-R1, Q4-R2 %Parent:17.99, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent: 82.01)이고,
A의 하단 그래프는 0hr(Q4-R1 %Parent:0.00, Q4-R2 %Parent:8.28, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent:91.72), 24hr(Q4-R1, Q4-R2 %Parent 9.02, Q4-R3 %Parent:1.35, Q4-R4 %Parent:89.40), 48hr(Q4-R1, Q4-R2 %Parent:25.26, Q4-R3 %Parent:0.00, Q4-R4 %Parent: 74.74)이다.
도 6은 혈액 내 유핵세포 유래 물질(CM)을 확인한 결과이다.
도 7는 혈액 내 유핵세포 유래 물질의 농도를 확인한 결과이다.
도 8은 혈액 내 유핵세포를 체외 배양한 후 면역세포의 구성 비율을 나타낸 것이다.
각 그래프의 좌측 상단은 R1, 우측 상단은 R2, 좌측 하단은 R3, 우측 하단은 R4이다.
Day0에서 좌측 그래프는 Q6-R1 %Parent: 6.21, Q6-R2 %Parent: 2.91, Q6-R3 %Parent:44.79, Q6-R4: %Parent: 46.08 이고, 우측 그래프는 Q7-R1 %Parent: 2.39, Q7-R2 %Parent: 5.40, Q7-R3: %Parent:88.77, Q7-R4: %Parent: 3.43 이다.
Day7에서 좌측 그래프는 Q6-R1 %Parent: 76.12, Q6-R2 %Parent: 3.45, Q6-R3 %Parent:12.65, Q6-R4: %Parent:7.78 이고, 우측 그래프는 Q7-R1 %Parent:0.60, Q7-R2 %Parent:68.94, Q7-R3: %Parent:4.86, Q7-R4: %Parent:25.60 이다.
Day14에서 좌측 그래프는 Q6-R1 %Parent:89.05, Q6-R2 %Parent:3.67, Q6-R3 %Parent:2.70, Q6-R4: %Parent:4.57이고, 우측 그래프는 Q7-R1 %Parent:0.39, Q7-R2 %Parent:82.56, Q7-R3: %Parent:2.60, Q7-R4: %Parent:14.45 이다.
도 9는 혈액 내 유핵세포 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물의 배양시간에 따른 암세포(K562)에 대한 세포독성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
A의 그래프에서 가로축은 FITC-A, 세로축은 PE-A이고, 좌측 상단은 R1, 우측 상단은 R2, 좌측 하단은 R3, 우측 하단은 R4이며,
A의 상단 그래프는 0hr(Q14-R1 %Parent:0.18, Q14-R2 %Parent:69.49, Q14-R3 %Parent:0.18, Q14-R4 %Parent:30.16), 24hr(Q15-R1 %Parent:0.00, Q15-R2 %Parent 76.50, Q15-R3 %Parent:0.00, Q15-R4 %Parent:23.50), 48hr(Q14-R1 %Parent:0.12, Q14-R2 %Parent:77.50, Q14-R3 %Parent:0.48, Q14-R4 %Parent: 21.90)이고,
A의 하단 그래프는 0hr(Q15-R1 %Parent:0.00, Q15-R2 %Parent:70.09, Q15-R3 %Parent:0.00, Q15-R4 %Parent:29.91), 24hr(Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent 77.62, Q14-R3 %Parent:0.00, Q14-R4 %Parent:22.38), 48hr(Q14-R1 %Parent:0.62, Q14-R2 %Parent:86.03, Q14-R3 %Parent:0.32, Q14-R4 %Parent: 13.03)이다.
도 10은 혈액 내 유핵세포 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물의 배양시간에 따른 암세포(A549)에 대한 세포독성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
A의 그래프에서 가로축은 FITC-A, 세로축은 PE-A이고, 좌측 상단은 R1, 우측 상단은 R2, 좌측 하단은 R3, 우측 하단은 R4이며,
A의 상단 그래프는 0hr(Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent:19.63, Q14-R3 %Parent:0.02, Q14-R4 %Parent:80.34), 24hr(Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent 22.58, Q14-R3 %Parent:0.00, Q14-R4 %Parent:77.42), 48hr(Q14-R1 %Parent:0.08, Q14-R2 %Parent:23.98, Q14-R3 %Parent:0.08, Q14-R4 %Parent: 75.86)이고,
A의 하단 그래프는 0hr(Q15-R1 %Parent:0.00, Q15-R2 %Parent:20.85, Q15-R3 %Parent:0.00, Q15-R4 %Parent:79.15), 24hr(Q14-R1 %Parent:0.22, Q14-R2 %Parent 26.68, Q14-R3 %Parent:0.08, Q14-R4 %Parent:73.02), 48hr(Q15-R1 %Parent:0.00, Q15-R2 %Parent:29.92, Q15-R3 %Parent:0.00, Q15-R4 %Parent: 70.08)이다.
도 11은 혈액 내 유핵세포 및 면역세포를 포함하는 조성물을 동결 및 해동한 후 암세포(K562)에 대한 세포독성을 분석한 결과를 나타낸 것이다.
A의 그래프에서 가로축은 FITC-A, 세로축은 PE-A이고, 좌측 상단은 R1, 우측 상단은 R2, 좌측 하단은 R3, 우측 하단은 R4이며,
A의 상단 그래프는 0hr(Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent:14.28, Q14-R3 %Parent:0.00, Q14-R4 %Parent:85.72), 24hr(Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent:30.77, Q14-R3 %Parent:0.00, Q14-R4 %Parent:69.23), 48hr(Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent:63.46, Q14-R3 %Parent:0.00, Q14-R4 %Parent: 36.54)이고,
A의 하단 그래프는 0hr(Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent:19.12, Q14-R3 %Parent:0.00, Q14-R4 %Parent:80.88), 24hr(Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent:36.52, Q14-R3 %Parent:0.00, Q14-R4 %Parent:63.48), 48hr(Q14-R1 %Parent:0.00, Q14-R2 %Parent:73.77, Q14-R3 %Parent:0.00, Q14-R4 %Parent: 26.23)이다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다. 또한, 본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어들에 대해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다.
제조예 1. 혈장 및 혈액 내 유핵세포의 분리
50 ml 튜브에 15 내지 25 ml의 Ficoll-paque (GE healthcare, USA)를 첨가하였다. 첨가된 Ficoll-paque 용액 위로 인간에서 채혈한 혈액을 1 내지 2 배수의 부피로 Ficoll-paque와 섞이지 않게 첨가하여 2개의 밀도구배층을 형성시켰다. 이후 2,000 rpm에서 20분 동안 원심분리를 수행하였으며, 원심분리 후 혈장(Plasma), 말초혈액단핵세포(PBMC), Ficoll-paque가 함유된 과립성 백혈구(Ficoll-paque+granulocyte) 및 적혈구(RBC)의 순서로 형성된 4개의 밀도구배층을 확인하였다. 상기 형성된 밀도구배층에서 혈장과 말초혈액단핵세포를 각각 새로운 50 ml 튜브에 분리하여 수득하였다.
제조예 2. 혈액 내 유핵세포 배양
말초혈액단핵세포를 배양하기 위해 제조예 1에서 수득한 혈장을 56℃ 온도 조건의 항온수조에서 30분 동안 중탕한 후, 1,500 rpm 조건으로 5분 동안 원심분리하여 열처리된 혈장 상청액을 수득하였다. 이후, 열처리된 혈장을 첨가한 배지에 14일 동안 상기 제조예 1에서 수득한 말초혈액단핵세포를 37℃, 5% CO2 조건에서 배양하였다.
제조예 3. 혈액 내 유핵세포 유래 물질의 분리
제조예 2에서 수득한 말초혈액단핵세포로부터 혈액 내 유핵세포 유래 물질을 추출하기 위하여, 혈구계산기를 이용하여 약 2 X 107 cells/ml의 세포를 회수하였다. 이후, 상기 세포를 약 4℃의 온도에서 5분 동안 300 x g의 속도로 원심분리를 수행하여 세포 펠렛을 제작하였다. 상기 펠렛은 버퍼용액에 재현탁 시킨 후 26게이지 바늘의 주사기를 이용하여 균질화 하였다. 균질화된 조성물을 약 4℃의 온도에서 5분 동안 1,500 x g의 속도로 원심분리한 후 상청액을 수득하였다. 이후, 상기 상청액은 약 4℃의 온도에서 10분 동안 20,000 x g의 속도로 원심분리하여 혈액 내 유핵세포 유래 물질을 분리하였다.
제조예 4. 혈장 유래 물질의 분리
제조예 1에서 수득한 혈장은 약 4℃의 온도에서 20분 동안 25,000 x g의 속도로 원심분리하여 혈장 유래 물질을 분리하였다.
제조예 5. 혈장 및 혈액 내 유핵세포의 분리
50 ml 튜브에 15 내지 25 ml의 Ficoll-paque (GE healthcare, USA)를 첨가하였다. 첨가된 Ficoll-paque 용액 위로 인간 골수에서 채혈한 혈액을 1 내지 2 배수의 부피로 Ficoll-paque와 섞이지 않게 첨가하여 2개의 밀도구배층을 형성시켰다. 이후 2,000 rpm에서 20분 동안 원심분리를 수행하였으며, 원심분리 후 혈장(Plasma), 혈액 내 유핵세포, Ficoll-paque가 함유된 과립성 백혈구(Ficoll-paque+granulocyte) 및 적혈구(RBC)의 순서로 형성된 4개의 밀도구배층을 확인하였다. 상기 형성된 밀도구배층에서 혈장과 혈액 내 유핵세포를 각각 새로운 50 ml 튜브에 분리하여 수득하였다.
제조예 6. 혈장 및 혈액 내 유핵세포의 분리
50 ml 튜브에 15 내지 25 ml의 Ficoll-paque (GE healthcare, USA)를 첨가하였다. 첨가된 Ficoll-paque 용액 위로 인간 제대혈에서 채혈한 혈액을 1 내지 2 배수의 부피로 Ficoll-paque와 섞이지 않게 첨가하여 2개의 밀도구배층을 형성시켰다. 이후 2,000 rpm에서 20분 동안 원심분리를 수행하였으며, 원심분리 후 혈장(Plasma), 혈액 내 유핵세포, Ficoll-paque가 함유된 과립성 백혈구(Ficoll-paque+granulocyte) 및 적혈구(RBC)의 순서로 형성된 4개의 밀도구배층을 확인하였다. 상기 형성된 밀도구배층에서 혈장과 혈액 내 유핵세포를 각각 새로운 50 ml 튜브에 분리하여 수득하였다.
실시예 1. 혈장 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물 제조 (1)
제조예 1에서 수득한 면역세포로서의 말초혈액단핵세포는 혈구계산기를 이용하여 1 X 105 세포를 준비하였다. 이후, 준비된 세포 기준으로 제조예 4에서 분리한 혈장 유래 물질을 0.1 내지 5 ㎍ 농도로 혼합하여 혈장 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물을 제조하였다.
실시예 2. 혈장 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물 제조 (2)
제조예 1에서 수득한 면역세포로서의 말초혈액단핵세포는 혈구계산기를 이용하여 1 X 105 세포를 준비하였다. 이후, 준비된 세포 기준으로 제조예 4에서 분리한 혈장 유래 물질을 0.1 내지 5 ㎍ 농도로 혼합하여 인간 혈장 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물을 제조하고, 동결보관하고, 실험에는 동결보관 한달 후 해동하여 사용하였다.
실시예 3. 혈액 내 유핵세포 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물 제조 (1)
제조예 2에서 수득한 면역세포로서의 말초혈액단핵세포는 혈구계산기를 이용하여 1 X 105 세포를 준비하였다. 이후, 준비된 세포 기준으로 제조예 3에서 분리한 말초혈액세포 유래 물질을 30 ㎍ 혼합하여 혈액 내 유핵세포 유래 물질 및 면역세포을 포함하는 조성물을 제조하였다.
실시예 4. 혈액 내 유핵세포 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물 제조 (2)
제조예 2에서 수득한 면역세포로서의 말초혈액단핵세포를 혈구계산기를 이용하여 1 X 105 세포를 준비하였다. 이후, 준비된 세포 기준으로 제조예 3에서 분리한 말초혈액세포 유래 물질을 30 ㎍ 혼합하여 말초혈액단핵세포 유래 물질 및 말초혈액단핵세포를 포함하는 조성물을 제조하고, 동결보관하고, 실험에는 동결보관 한달 후 해동하여 사용하였다.
실험예 1. 혈장 유래 물질 확인 및 농도 분석
제조예 4에서 수득한 혈장 유래 물질을 확인하기 위해 세포소기관 마커인 KDEL(ER 마커) 및 COX IV(Mitochondria 마커) 항체를 이용하여 유세포분석기를 통해 존재 여부를 확인하였으며, 결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 대비군인 비염색(Unstain)군에 비해 오른쪽으로 이동한 결과를 통해 혈장 유래 물질의 존재 여부를 확인하였다.
또한, 혈장 유래 물질의 농도를 확인하기 위해 Bicinchoninic acid (BCA) 용액을 이용하여 단백질 농도를 분석하였으며, 결과는 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 혈액 30 cc 당 혈장 유래 물질을 약 30 ㎍의 중량의 농도로 수득하였다.
실험예 2. 혈장 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물의 독성 확인 (1)
혈장 유래 물질의 농도를 각각 0.1, 0.3, 0.5, 1, 3 및 5 ㎍의 중량의 농도로 혼합한 실시예 1의 조성물을 제조하였다. 또한, 비교예로서 혈장 유래 물질을 혼합하지 않은 제조예 1의 말초혈액단핵세포를 사용하였다.
녹색형광이 표지된(CSFE, Invitrogen, USA) K562(표적세포) 1 X 105 세포와 1 X 106 세포의 성물을 혼합한 뒤 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. K562(표적세포)세포의 사멸 정도를 분석하기 위해 사멸세포 특이적 염색시약(7AAD, Invitrogen, USA)을 첨가한 뒤 유세포분석기를 통해 표적세포의 사멸정도를 확인하였으며, 결과는 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 혈장 유래 물질이 포함되지 않은 조성물을 처리한 군에서 약 5.7%의 표적세포가 사멸되었고, 혈장 유래 물질이 포함된 조성물을 처리한 군에서는 최대 12.12%의 표적세포가 사멸되는 것을 확인하였다.
실험예 3. 혈장 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물의 독성 확인 (2)
혈장 유래 물질을 0.3 ㎍ 혼합한 실시예 1의 조성물을 제조 후 48시간까지 배양하여 준비하였다. 또한, 비교예로서 혈장 유래 물질을 혼합하지 않은 제조예 2의 말초혈액단핵세포를 사용하였다.
녹색형광이 표지된(CSFE, Invitrogen, USA) K562(표적세포) 및 A549(표적세포) 1 X 105 세포와 1 X 106 세포의 조성물을 혼합한 뒤 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. 표적세포의 사멸 정도를 분석하기 위해 사멸세포 특이적 염색시약(7AAD, Invitrogen, USA)을 첨가한 뒤 유세포분석기를 통해 표적세포의 사멸 정도를 확인하였으며, 결과는 도 4 및 5에 나타내었다.
도 4(a 및 b)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 48시간에서 혈장 유래 물질이 포함되지 않은 조성물을 처리한 군에서 약 22.14%의 표적세포가 사멸되었고, 혈장 유래 물질이 포함된 실시예 1의 조성물을 처리한 군에서는 약 45.47%의 표적세포가 사멸된 것을 확인하여 혈장 유래 물질이 면역세포의 독성을 증가시킬 수 있으며, 시간 경과에 따라 독성이 증가함을 확인하였다.
또한, 도 5(a 및 b)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 48시간에서 혈장 유래 물질이 포함되지 않은 조성물을 처리한 군에서 약 17.99%의 표적세포가 사멸되었고, 혈장 유래 물질이 포함된 실시예 1의 조성물을 처리한 군에서는 약 25.26%의 표적세포가 사멸된 것을 확인하여 혈장 유래 물질이 면역세포의 독성을 증가시킬 수 있으며, 시간 경과에 따라 독성이 증가함을 확인하였다.
실험예 4. 혈액 내 유핵세포 유래 물질 확인 및 농도 분석
제조예 3에서 분리된 혈액 내 유핵세포 유래 물질의 존재 여부를 확인하기 위해 세포소기관의 마커인 GM130(Golgi 마커), LAMP-1(Lysosome 마커), PMP70(Peroxisome 마커), KDEL(ER 마커) 및 COX IV(Mitochondria 마커) 항체를 이용하여 웨스턴블랏을 통해 혈액 내 유핵세포 유래 물질의 존재 여부를 확인하였으며, 결과는 도 6에 나타내었다.
또한, 분리된 혈액 내 유핵세포 유래 물질의 농도를 확인하기 위해 Bicinchoninic acid (BCA) 용액을 이용하여 단백질 농도를 분석하였으며, 결과는 도 7에 나타내었다.
도 7에 나타낸 바와 같이, 세포 2 x 107 세포 당 혈액 내 유핵세포 유래 물질이 약 250 ㎍의 중량의 농도로 수득하였다.
실험예 5. 혈액 내 유핵세포 유래 물질에 존재하는 면역세포의 구성 확인
제조예 1에서 수득한 말초혈액단핵세포를 2 X 105 세포로 준비하였다. 준비된 세포에 존재하는 T, NK 및 NKT 세포의 분포를 확인하기 위해 면역세포 특이적 표면항체인 CD3-FITC(T 세포), CD56-APC+CD16-PE(NK세포) 및 CD3-FITC+CD56-APC(NKT 세포)를 첨가한 뒤 약 4℃의 온도에서 30분 동안 반응시켰다. 이후, 상기 반응된 세포는 인산염 완충 생리식염수를 이용하여 2회 세척한 뒤 유세포분석기를 통해 면역세포 표면에 표지된 특이적 표면항체의 형광 발현 분포를 확인하였으며, 결과는 도 8에 나타내었다.
실험예 6. 혈액 내 유핵세포 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물의 독성 확인 (1)
말초혈액단핵세포에서 분리한 물질을 30 ㎍ 혼합한 실시예 3의 조성물을 제조하고, 48시간까지 배양하여 준비하였다. 또한, 비교예로서 인간 말초혈액단핵세포에서 분리한 물질을 혼합하지 않은 제조예 2의 말초혈액단핵세포를 사용하였다.
녹색형광이 표지된(CSFE, Invitrogen, USA) K562(표적세포) 및 A549(표적세포) 1 X 105 세포와 상기 제조된 조성물 1 X 106 세포를 혼합한 뒤 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. K562(표적세포)세포의 사멸 정도를 분석하기 위해 사멸세포 특이적 염색시약(7AAD, Invitrogen, USA)을 첨가한 뒤 유세포분석기를 통해 표적세포의 사멸 정도를 확인하였으며, 결과는 도 9 및 10에 나타내었다.
도 9(a 및 b)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 48시간에서 말초혈액단핵세포에서 분리한 물질을 혼합하지 않은 조성물을 처리한 군에서 약 77.8%의 표적세포가 사멸되었고, 말초혈액단핵세포에서 분리한 물질을 혼합한 실시예 3의 조성물을 처리한 군에서는 약 86%의 표적세포가 사멸된 것을 확인하여 혈액 내 유핵세포 유래 물질이 면역세포의 독성을 증가시킬 수 있고, 시간에 따라 독성이 증가함을 확인하였다.
또한, 도 10(a 및 b)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 48시간에서 말초혈액단핵세포에서 분리한 물질을 혼합하지 않은 조성물을 처리한 군에서 약 23.9%의 표적세포가 사멸되었고, 말초혈액단핵세포에서 분리한 물질을 혼합한 실시예 3의 조성물을 처리한 군에서는 약 29.9%의 표적세포가 사멸된 것을 확인하여 혈액 내 유핵세포 유래 물질이 면역세포의 독성을 증가시킬 수 있고, 시간에 따라 독성이 증가함을 확인하였다.
실험예 7. 혈액 내 유핵세포 유래 물질 및 면역세포를 포함하는 조성물의 독성 확인 (2)
동결 후 해동한 면역세포가 독성을 유지하는지 여부를 확인하기 위해 말초혈액단핵세포에서 분리한 물질을 30 ㎍ 혼합한 실시예 4의 조성물을 제조하고 48시간 동안 배양하여 준비였다. 또한, 비교예로서 말초혈액단핵세포 분리한 물질을 혼합하지 않은 제조예 2의 말초혈액단핵세포를 동결 후 해동하여 사용하였다.
녹색형광이 표지된(CSFE, Invitrogen, USA) K562(표적세포) 1 X 105 세포와 1 X 105 조성물을 혼합하고, 37℃, 5% CO2 조건의 배양기에서 4시간 동안 배양하였다. K562(표적세포)세포의 사멸 정도를 분석하기 위해 사멸세포 특이적 염색시약(7AAD, Invitrogen, USA)을 첨가한 뒤 유세포분석기를 통해 표적세포의 사멸 정도를 확인하였으며, 결과는 도 11에 나타내었다.
도 11(a 및 b)에서 확인할 수 있는 바와 같이, 48시간에서 말초혈액단핵세포에서 분리한 물질을 혼합하지 않은 조성물를 처리한 군에서 약 63.4%의 표적세포가 사멸되었고, 말초혈액단핵세포에서 분리한 물질을 혼합한 실시예 4의 조성물을 처리한 군에서는 약 73.7%의 표적세포가 사멸된 것을 확인하여 면역세포를 동결 후 해동하는 경우에도 독성이 유지될 수 있고, 시간에 따라 독성이 증가함을 확인하였다.

Claims (18)

  1. 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질; 및
    면역세포;를 포함하는 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 혈액 내 유핵세포 또는 혈장은 골수, 제대혈액 또는 말초혈액에서 분리된 것인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질은 세포 밖 소포체(extracellular vesicle), 세포소기관(subcellular organelle) 또는 이들의 혼합물을 포함하는 것인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  4. 제3항에 있어서,
    상기 세포 밖 소포체는 미세소포, 엑토솜, 엑소솜 및 세포자멸체로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 세포 밖 소포체(extracellular vesicle)는 RNA, DNA, 성장인자 및 세포소기관으로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 함유하는 것인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  6. 제3항에 있어서,
    상기 세포소기관은 골지, 리소좀, 퍼옥시좀, 소포체 및 미토콘드리아로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상을 포함하는 것인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 혈장으로부터 유래된 물질은 셀-프리(cell-free)인 것인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 혈장으로부터 유래된 물질은 신선한 상태의 혈장에서 분리된 것인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  9. 제1항에 있어서,
    상기 혈액 내 유핵세포로부터 유래된 물질은 골수, 제대혈액 또는 말초혈액에서 분리된 유핵세포를 배양한 후, 분리된 것인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포는 단핵구, 자연살해세포, 세포독성 T 세포(killer T cell), NK-T 세포, T 세포, B 세포, 호중구, 호산구, 호염기구, 대식세포 및 수지상세포로 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  11. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포는 외래 유전자가 도입되어 유전적으로 변형(modification) 또는 조작(engineering)된 면역세포인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  12. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포는 단핵구, 자연살해세포, 세포독성 T 세포, NKT 세포, T 세포, B 세포 및 수지상세포로 구성된 군에서 선택되는 하나 이상을 포함하는 말초혈액단핵세포(PBMC)인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  13. 제1항에 있어서,
    상기 면역세포는 혈액에서 분리한 신선한 상태, 동결보관 후 해동한 상태 또는 배양된 상태인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  14. 제1항에 있어서,
    상기 혈액 내 유핵세포 또는 혈장으로부터 유래된 물질은 상기 면역세포의 활성을 증가시켜 세포독성을 증가시키는 것인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  15. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 면역세포 1 X 105 세포 당 혈장으로부터 유래된 물질을 0.1 내지 10 ㎍ 혼합하여 제조된 것인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  16. 제1항에 있어서,
    상기 조성물은 상기 면역세포 1 X 105 세포 당 혈액 내 유핵세포로부터 유래된 물질을 0.1 내지 50 ㎍ 혼합하여 제조된 것인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  17. 제1항에 있어서,
    상기 암은 위암, 간암, 폐암, 대장암, 유방암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 자궁경부암, 갑상선암, 후두암, 급성 골수성 백혈병, 뇌종양, 신경모세포종, 망막 모세포종, 두경부암, 침샘암 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
  18. 제1항에 있어서,
    상기 면역질환은 자가면역질환, 감염성질환, 이식거부 질환 및 염증질환으로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나인 암 또는 면역질환 예방 또는 치료용 약학조성물.
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