WO2021187911A1 - 제대혈 혈장 유래의 엑소좀 또는 이의 모방체 및 이의 약학적 용도 - Google Patents

제대혈 혈장 유래의 엑소좀 또는 이의 모방체 및 이의 약학적 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2021187911A1
WO2021187911A1 PCT/KR2021/003356 KR2021003356W WO2021187911A1 WO 2021187911 A1 WO2021187911 A1 WO 2021187911A1 KR 2021003356 W KR2021003356 W KR 2021003356W WO 2021187911 A1 WO2021187911 A1 WO 2021187911A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
cbpexo
cells
cord blood
protein
blood plasma
Prior art date
Application number
PCT/KR2021/003356
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
김태규
김수언
Original Assignee
가톨릭대학교 산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 가톨릭대학교 산학협력단 filed Critical 가톨릭대학교 산학협력단
Priority to US17/912,246 priority Critical patent/US20230218678A1/en
Priority to EP21772409.5A priority patent/EP4123019A4/en
Publication of WO2021187911A1 publication Critical patent/WO2021187911A1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/14—Blood; Artificial blood
    • A61K35/16—Blood plasma; Blood serum
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/48—Reproductive organs
    • A61K35/51—Umbilical cord; Umbilical cord blood; Umbilical stem cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • A61K38/17—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • A61K38/1703—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • A61K38/1709—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
    • A61P17/02—Drugs for dermatological disorders for treating wounds, ulcers, burns, scars, keloids, or the like
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • A61P37/06—Immunosuppressants, e.g. drugs for graft rejection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4702—Regulators; Modulating activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4728—Calcium binding proteins, e.g. calmodulin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/46—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates
    • C07K14/47—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals
    • C07K14/4701—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans from vertebrates from mammals not used
    • C07K14/4747—Apoptosis related proteins
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0603—Embryonic cells ; Embryoid bodies
    • C12N5/0605—Cells from extra-embryonic tissues, e.g. placenta, amnion, yolk sac, Wharton's jelly
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0684—Cells of the urinary tract or kidneys
    • C12N5/0686—Kidney cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6489—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12N9/6491—Matrix metalloproteases [MMP's], e.g. interstitial collagenase (3.4.24.7); Stromelysins (3.4.24.17; 3.2.1.22); Matrilysin (3.4.24.23)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
    • C12Y304/24—Metalloendopeptidases (3.4.24)
    • C12Y304/24035—Gelatinase B (3.4.24.35), i.e. matrix metalloprotease 9 or MMP9
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2509/00—Methods for the dissociation of cells, e.g. specific use of enzymes

Definitions

  • the present invention relates to umbilical cord blood plasma-derived exosomes or mimetics thereof and pharmaceutical uses thereof.
  • Human cord blood has been used as a source of hematopoietic stem cells for transplantation, but it contains a number of cells such as immune cells, mesenchymal stromal cells and endothelial precursor cells. Fetal immunity through the maternal immune system plays an important role in maintaining pregnancy. The immunological interaction between the fetus and the mother represents a two-way communication system that is regulated by the presentation of fetal antigens and/or recognition of these antigens by the maternal immune system and response thereto. Cells derived from human cord blood have specific immunomodulatory properties that contribute to the maintenance of pregnancy. Moreover, human umbilical cord blood is also a rich source of immunosuppressive cells such as regulatory T cells (Tregs) and monocyte-derived suppressor cells (MDSCs).
  • Tregs regulatory T cells
  • MDSCs monocyte-derived suppressor cells
  • Exosomes are small cell membrane vesicles that mount a unique subset of functional proteins and reflect their cell lineage. Since human cord blood-derived cells are selected and expanded ex vivo, exosomes derived from these cells can be efficiently isolated from the cell culture supernatant. Exosomes released from cells derived from human umbilical cord blood may induce the differentiation of circulating immunosuppressive cells such as Tregs and MDSCs, and thus may have an immunosuppressive effect. However, despite advances in the study of cells and exosomes derived from human cord blood, studies on exosomes derived from human cord blood plasma (CBPexo) are poor.
  • CBPexo human cord blood plasma
  • IL-2 and its receptor IL-2R
  • IL-2R are responsible for supporting the proliferation and survival of T cells and the differentiation of naive T cells.
  • the IL-2R alpha chain (IL-2R ⁇ /CD25) is an essential component of IL-2R.
  • IL-2Ra the surface expression of IL-2Ra in CD4 + T cells and the level of IL-2 in activated T cells are significantly reduced by MMP-9.
  • MMP-9 Inhibition of MMP activity by chemical inhibitors restores IL-2 production and partially restores T cell proliferation.
  • MMP-9 as well as CBP immunomodulators are found in CBPexo, and these exosomes will exhibit concentrated immunosuppressive activity.
  • wound healing requires several steps, such as fibroblast proliferation, collagen synthesis, deposition, angiogenesis, differentiation, and migration of immunosuppressive cells. . It is a highly planned process involving a well-organized series of cellular and molecular events such as hemostasis, inflammation, proliferation and remodeling. Several treatments have been proposed to promote wound healing, but optimal treatment strategies are still under development.
  • Human cord blood is an attractive source of stem cells for transplantable wound healing. Cord blood donors are pregnant women and there is no risk of disease as they collect cord blood through standardized procedures. However, the use of stem cells in therapy is limited by certain risks such as tumor formation, thrombosis and unwanted immune responses.
  • Exosome-based therapies have a relatively low risk compared to stem cell-based therapies. Therefore, it is suggested that exosome-based therapy is a promising wound healing approach, but there has been no study on the protein level of CBPexo for wound healing purposes until now. Previous studies have been limited to wound healing at the miRNA level.
  • Another object of the present invention is to provide an exosome mimic that mimics the proteomics profile of exosomes derived from human cord blood plasma and pharmaceutical uses thereof.
  • the present invention is galectin-3 (galectin-3), Matrix metalloproteinase (MMP-9), Heat shock protein 72 (HSP72), Prolactin-inducible protein (PIP), Protein S100-A7 (S100A7) ), Galectin-7 (GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1), Serpin B12 (SERPINB12), Lactotransferrin (LTF), Alpha-1-acid glycoprotein (ORM1), CD5 antigen-like (CD5L), Complement C4-B (C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1 (MASP1), Proteasome subunit alpha type-6 (PSMA6), Peroxiredoxin-1 (PRDX1), Neutrophil defensin 3 (DEFA3), CD44 antigen and Arginase-1 ( ARG1) provides a composition for immunosuppression or wound treatment comprising, as an active ingredient, an exosome derived from um
  • the present invention also provides a method for immunosuppression or wound treatment comprising administering to a subject an effective amount of the exosomes derived from cord blood plasma.
  • the present invention also provides galectin-3, Matrix metalloproteinase (MMP-9), Heat shock protein 72 (HSP72), Prolactin-inducible protein (PIP), Protein S100-A7 (S100A7), Galectin-7 ( GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1), Serpin B12 (SERPINB12), Lactotransferrin (LTF), Alpha-1-acid glycoprotein (ORM1), CD5 antigen-like (CD5L), Complement C4-B (C4B) ), Mannan-binding lectin serine protease 1 (MASP1), Proteasome subunit alpha type-6 (PSMA6), Peroxiredoxin-1 (PRDX1), Neutrophil defensin 3 (DEFA3), CD44 antigen and Arginase-1 (ARG1). It provides a medium composition for inhibiting differentiation of Th1 and Th17 cells comprising exosomes derived from cord blood plasma as an active ingredient, the expression of which is
  • the present invention also provides galectin-3, Matrix metalloproteinase (MMP-9), Heat shock protein 72 (HSP72), Prolactin-inducible protein (PIP), Protein S100-A7 (S100A7), Galectin-7 ( GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1), Serpin B12 (SERPINB12), Lactotransferrin (LTF), Alpha-1-acid glycoprotein (ORM1), CD5 antigen-like (CD5L), Complement C4-B (C4B) ), Mannan-binding lectin serine protease 1 (MASP1), Proteasome subunit alpha type-6 (PSMA6), Peroxiredoxin-1 (PRDX1), Neutrophil defensin 3 (DEFA3), CD44 antigen and Arginase-1 (ARG1).
  • MMP-9 Matrix metalloproteinase
  • HSP72 Heat shock protein 72
  • PIP Prolactin-inducible protein
  • a method for inhibiting differentiation of Th1 and Th17 cells in vitro comprising culturing in vitro exosomes derived from cord blood plasma and naive CD4 + T cells whose expression is higher than that of adult plasma-derived exosomes.
  • the present invention is also derived from HLA and MIC gene deficient cell lines, galectin-3, Matrix metalloproteinase (MMP-9), Heat shock protein 72 (HSP72), Prolactin-inducible protein (PIP), Protein S100 -A7 (S100A7), Galectin-7 (GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1), Serpin B12 (SERPINB12), Lactotransferrin (LTF), Alpha-1-acid glycoprotein (ORM1), CD5 antigen-like (CD5L), Complement C4-B (C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1 (MASP1), Proteasome subunit alpha type-6 (PSMA6), Peroxiredoxin-1 (PRDX1), Neutrophil defensin 3 (DEFA3), CD44 antigen and Provided is an umbilical cord blood plasma exosome mimic expressing one or more selected from the gene group consisting of Arginase-1 (ARG
  • the present invention also provides a composition for immunosuppression or wound treatment comprising the umbilical cord blood plasma exosome mimic.
  • the present invention also provides a method for immunosuppression or wound treatment comprising administering to a subject an effective amount of the umbilical cord blood plasma exosome mimic.
  • the present invention uses exosomes derived from human cord blood plasma for the improvement, prevention or treatment of various autoimmune diseases, and an exosome mimic that mimics the proteomics profile of the exosomes provides effective immunosuppression and wound healing effects.
  • 1A-D are diagrams showing the results of characterization of exosome membrane vesicles purified from human umbilical cord blood plasma.
  • (c) is the result of morphological characterization of CBPexo. Using electron microscopy, the morphological characteristics of CBPexo with a lipid bilayer structure and a size (50-130 nm) were confirmed. Scale bar represents 100 nm.
  • (d) is the result of analysis of the size and number of particles of CBPexo.
  • the size of the exosomes is 81 ⁇ 1.4 nm and the number of particles is 1.64 ⁇ 10 12 ⁇ 2.37 ⁇ 10 10 particles/mL.
  • 2A-C are diagrams showing molecular functions and biological processes associated with differentially expressed proteins.
  • 3A-D depict the mechanism of CBPexo mediated immunosuppression in CD3/CD28 DYNABEAD-stimulated human CD4+ and CD8+ T cells.
  • CBPexo induces apoptosis of CD4+ T cells activated by CD3/CD28 DYNABEAD.
  • CD4+ and CD+8 T cells were harvested after 156 hours and stained with annexin V-FITC, 7AAD, anti-CD4-APC and anti-CD8-V450 antibodies. Cells gated on CD4 are shown. Analysis data is analyzed using FlowJo v10. This experiment is independently repeated 5 times. Statistically significant difference (ANOVA test): *p ⁇ 0.1 **p ⁇ 0.05 ***p ⁇ 0.01.
  • 5a-e show the effect of CBPexo on the induction of differentiation of Treg cells and the functional upregulation of T cell inhibition.
  • 6a-b show the effect of CBPexo on the induction of MDSC differentiation.
  • Non-stimulated PBMCs are cultured in the absence (CTRL) or presence of CBPexo. Gating strategy: use physical parameters, namely forward scatter (FSC) and side scatter (SSC) to select monocytes (CD14+). MDSCs are differentiated by evaluating the expression of CD11b/CD33.
  • CBPexos promotes the immunosuppressive phenotype of MDSCs and stimulates the production of arginase 1, NOS2 and IDO.
  • Representative FACS histograms for intracellular staining of arginase 1, NOS2 and IDO and staining of CD14+/CD11b/CD33+ cells are shown.
  • 9A-E show mouse cross-reactivity of T cell inhibition and IL-2 downregulation by human CBPexo.
  • ELISPOT assay is performed on day 6 to quantify the levels of IL-2, IFN- ⁇ and IL-17 secreting T cells.
  • Mouse splenocytes were stimulated with CBPexo or ABPexo, and IL-2, IFN- ⁇ and IL-17 secreting T cell patterns were observed.
  • CBPexo significantly reduces human T cell proliferation through the production of IL-2, IFN- ⁇ and IL-6.
  • CBPexo not only cleaves IL-2Ra in human T cells, but also downregulates IL-2, IFN- ⁇ and IL-6 secretion associated with differentiation of Th17 and Th1 cells.
  • 10A-C show the pattern of changes in Treg and IL-2 levels in exosome-treated EAE mice.
  • EAE development is reduced in CBPexo treated EAE mice.
  • EAE was induced in a total of 15 C57BL/6 mice treated with MOG/CFA and PTx for immunization.
  • CBPexo and ABPexo were injected intravenously at a dose of 100 ⁇ g (black arrow) into 5 EAE mice twice on days 0 and 7, respectively.
  • the clinical score of EAE was observed for 30 days according to the following criteria.
  • Clinical score of diseased rats 0, no signs of disease; 1, shriveled tail; 2, saggy tail and partial hindlimb weakness; 3, complete hindlimb paralysis; 4, complete hindlimb and partial forelimb paralysis; 5, death.
  • FIG. 1 shows the detection result of MOG35-55 induced cytokine recall response in total splenocytes during acute EAE.
  • C57BL/6 mice were immunized with MOG33-55 in CFA and tested 22 days after immunization. All mice tested exhibit clinical symptoms of EAE.
  • the frequency of MOG peptide-specific IFN- ⁇ , IL-2 and IL-17 secreting cells was measured using ELISPOT assay to compare with EAE control group, CBPexo-treated EAE group and ABPexo-treated EAE group. Analyze MOG peptide-specific T cells during restimulation with MOG peptide (25 ⁇ g/mL).
  • FIG. 12a-b show the pattern of Treg changes in the spleen ( FIG. 12a ) and the thymus ( FIG. 12b ) of exosome-treated EAE mice.
  • the frequency of CD4+T gated MOG peptide-specific FOXP3+ cells is compared to EAE control, CBPexo-treated EAE and ABPexo-treated EAE groups using intracellular cytokine staining method.
  • FIG. 13 shows the MDSC population of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice treated with exosomes.
  • EAE experimental autoimmune encephalomyelitis
  • EAE 14 shows the ability of exosomes to migrate to the brain and spleen of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice. Whether exosomes stained with PKH-67 fluorescence were delivered to DAPI-stained tissues were compared in the EAE control group, CBPexo-treated EAE and ABPexo-treated EAE groups.
  • EAE 15 compares the pathological treatment effect of CBPexo in the brain of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE) mice in the EAE control group, CBPexo-treated EAE and ABPexo-treated EAE groups.
  • 16A-B are diagrams showing that CBPexo is internalized by fibroblasts and induces cell proliferation.
  • 17A-D are diagrams showing that CBPexo significantly increases the motility of HSF compared to ABPexo as shown by scratch wound analysis.
  • Apoptosis was assessed by annexin V/propidium iodide double staining. Cells were exposed to various conditions of MMC, PBS, ABPexo and CBPexo for 24 hours. The apoptosis rate was measured by flow cytometry. Statistical analysis of the total recorded apoptotic cells was performed and the results are shown as bar graphs.
  • 18A-B are diagrams showing enhanced endothelial angiogenesis and polarization of M2 M ⁇ by CBPexo.
  • CFU colony-forming unit
  • M1- and M2-polarized macrophages were generated from GM-CSF-treated primary monocytes stimulated with IL-4 with and without CBPexo.
  • the scatterplot represents the proportion of positive cells from three different donors (dots) with a horizontal line representing the mean value. *p ⁇ 0.05; **p ⁇ 0.01; ***p ⁇ 0.001.
  • 19a-h are diagrams showing the CBPexo mimic and its immunosuppressive effect.
  • H1ME-5 Shows the establishment of an HLA class I/MIC null HEK 293T (H1ME-5) cell line using the multiplex CRISPR/Cas9 system. H1ME-5 cells show no expression of MICA/B and HLA class I.
  • H1ME-5 cell line was established to generate exosomes having no wound healing effect.
  • the wound closure area of HSF was measured in the presence of CBPexo and H1ME-5-exo over 0-24 h.
  • Treatment concentrations of CBPexo and H1ME-5-exo were maintained at 100 ⁇ g/mL.
  • 20A-B are diagrams showing that artificial exosomes promote wound healing by expressing selected target molecules.
  • 21A-D are diagrams showing that artificial exosomes expressed in HSP72 and PIP show a concentration-dependent wound healing effect and a higher wound healing effect when the two proteins are M2 M ⁇ by HSP72/PIP-exo.
  • HSP72- and PIP-expressed exosomes exhibited wound healing effects in a concentration-dependent manner. When used together, HSP72 and PIP-exo showed similar wound healing effects as CBPexo. Exosomes that simultaneously express HSP72 and PIP show a wound healing effect similar to the case of using HSP72- and PIP-exo together.
  • 22A-B are diagrams showing enhanced endothelial cell angiogenesis and polarization of M2 M ⁇ by HSP72/PIP-exo.
  • M1 and M2 polarized macrophages were generated from GM-CSF treated primary mononuclear cells stimulated with IL-4 with or without CBPexo. Surface markers and cytokine expression.
  • the present invention is galectin-3, Matrix metalloproteinase (MMP-9), Heat shock protein 72 (HSP72), Prolactin-inducible protein (PIP), Protein S100-A7 (S100A7), Galectin-7 (GAL) -7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1), Serpin B12 (SERPINB12), Lactotransferrin (LTF), Alpha-1-acid glycoprotein (ORM1), CD5 antigen-like (CD5L), Complement C4-B (C4B) , Mannan-binding lectin serine protease 1 (MASP1), Proteasome subunit alpha type-6 (PSMA6), Peroxiredoxin-1 (PRDX1), Neutrophil defensin 3 (DEFA3), CD44 antigen and Arginase-1 (ARG1). It relates to a composition for immunosuppression or wound treatment comprising, as an active ingredient, exosomes derived from cord blood plasma, whose expression is
  • the present invention also provides a method for immunosuppression or wound treatment comprising administering to a subject an effective amount of the exosomes derived from cord blood plasma.
  • Cord blood plasma-derived exosomes (CBPexo) of the present invention contain more immunosuppression-related proteins than adult plasma-derived exosomes (ABPexo). It is caused by the period arrest.
  • CBPexo treatment increases the CD4+CD25+FOXP3+ Treg cell population and upregulates the function of polyclonal expanded Tregs. It is speculated that CBPexo arrests the cell cycle by cleaving CD25, which inhibits mTOR signaling downstream. Indeed, the secretion of IL-2 and the surface expression of IL-2R ⁇ in CBPexo-treated activated T cells were significantly reduced in CD4+ T cells.
  • Blockade of IL-2 signaling by CBPexo plays a pivotal role in the inhibition of proliferation of CD4+ and CD8+ T cells. Blockade of the IL-2 signaling pathway leads to suppression of the immune system and has therapeutic effects. IL-2/IL-2R interaction activates intracellular Ras/Raf/MARP, JAK/STAT and PI3K/AKT signaling pathways to promote growth, differentiation and survival of T cells.
  • MMP-9 of CBPexo is involved in the cleavage of CD25 expressed in T cells when it encounters cancer cells, and MMP-8 also induces the disruption of the extracellular domain, resulting in cleavage of surface molecules related to immune responses, resulting in immunomodulatory effects. indicates Cleavage of IL-2Ra is dependent on MMP-9.
  • the EAE mouse model is used comprehensively to investigate the role of Th cells in disease development. For example, we show that transplantation of myelin-specific CD4+Th1 cells into immature recipient mice promotes the induction of EAE. Similarly, IL-17 secreting T cells known as Th17 cells have also been reported to be a driving force in EAE development. In addition, EAE promotes disease initiation by lowering the frequency of Tregs and impairing their inhibitory function.
  • the CBPexo of the present invention can change the EAE development process and regulate the differentiation of antigen-specific CD4+ T cells by increasing Treg differentiation and decreasing Th1 and Th17 differentiation in vivo.
  • the exosome of the present invention inhibits T cell proliferation by 1) reducing IL-2 production by 1) MMP-9 expressed in the exosome degrades IL-2 receptor ⁇ (CD25) on the activated T cell surface. and 2) induce regulatory T cell (Treg cell) and monocyte-derived suppressor cell (MDSC) differentiation, and 3) inhibit the differentiation of Th1 and Th17 cells.
  • Treg cell regulatory T cell
  • MDSC monocyte-derived suppressor cell
  • wound healing requires several steps such as fibroblast proliferation, collagen synthesis, deposition, angiogenesis, differentiation and migration of immunosuppressive cells.
  • human fibroblasts which are major effector cells responsible for soft tissue wound healing, they migrate to human fibroblasts and are internalized into fibroblasts, thereby promoting the proliferation of fibroblasts. .
  • These effects are significantly increased compared to exosomes derived from adult human plasma.
  • the effect of the exosomes of the present invention appears similarly during wound healing.
  • secondary wound healing known as the proliferative phase
  • alternatively activated M2 M ⁇ can reduce inflammation and repair wounds by engaging in fibroblast proliferation and migration and angiogenesis.
  • the exosomes of the present invention also promote macrophage proliferation and induce differentiation of the pro-inflammatory M1 phenotype into the anti-inflammatory M2 phenotype.
  • the exosomes of the present invention were incubated with activated M1 M ⁇ , CD80 and CD86 in vitro, the expression of IL-12 was down-regulated, and CD163, CD206, and IL-10 expression was up-regulated, resulting in activated M1 M ⁇ . This indicates successful polarization to M2 M ⁇ through CBPexo-induced phenotypic switching. Therefore, the exosome of the present invention can be used as an active ingredient for wound treatment.
  • the term "cord blood plasma-derived exosome” or “CBPexo” is a cell membrane particle derived from cord blood plasma.
  • the exosome (exosome) has the same meaning as microvesicles, circulating microvesicles or microvesicles in the art, and refers to a fragment having a plasma membrane of 50 nm to 100 nm removed from the cell.
  • Microvesicles mediate the transport of mRNA, miRNA and proteins between cells and play an important role in intracellular interactions. Microvesicles represent a heterogeneous population depending on the cell from which it is derived, the number of cells, the size of the cells and the composition of the antigen.
  • the exosome of the present invention is galectin-3 (galectin-3), Matrix metalloproteinase (MMP-9), Heat shock protein 72 (HSP72), Prolactin-inducible protein (PIP), Protein S100-A7 (S100A7) ), Galectin-7 (GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1), Serpin B12 (SERPINB12), Lactotransferrin (LTF), Alpha-1-acid glycoprotein (ORM1), CD5 antigen-like (CD5L), Complement C4-B (C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1 (MASP1), Proteasome subunit alpha type-6 (PSMA6), Peroxiredoxin-1 (PRDX1), Neutrophil defensin 3 (DEFA3), CD44 antigen and Arginase-1 ( It is characterized in that the expression of the gene group consisting of ARG1) is higher than that of exosomes derived from MMP9
  • active ingredient refers to a component capable of exhibiting the desired activity by itself or in combination with a carrier having no activity by itself.
  • the term “immunosuppression” is meant to include improvement (relief of symptoms), treatment, prevention, suppression or delay of the onset of immune diseases caused by hyperimmune or abnormal immune responses.
  • the "immune disease” means graft-versus-host disease, autoimmune disease (rheumatoid arthritis, etc.), hyperproliferative skin disease (atopic dermatitis, contact dermatitis, etc.), chronic obstructive pulmonary disease (COPD), allergy
  • COPD chronic obstructive pulmonary disease
  • the meaning includes, but is not limited to, sexual asthma, bronchitis, allergic rhinitis, and autoimmune hepatitis.
  • the wound treatment may include improvement or treatment of wound healing, atopic dermatitis, systemic sclerosis, or myocardial infarction.
  • the myocardial infarction is a disease resulting from a blood circulation disorder caused by a wound in the heart blood vessel and the accumulation of waste in the wounded blood vessel site.
  • the exosome of the present invention can treat myocardial infarction through wound treatment. .
  • the subject may be a mammal such as a dog, cat, rat, mouse, or human, but is not limited thereto.
  • the present invention also provides galectin-3, Matrix metalloproteinase (MMP-9), Heat shock protein 72 (HSP72), Prolactin-inducible protein (PIP), Protein S100-A7 (S100A7), Galectin-7 ( GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1), Serpin B12 (SERPINB12), Lactotransferrin (LTF), Alpha-1-acid glycoprotein (ORM1), CD5 antigen-like (CD5L), Complement C4-B (C4B) ), Mannan-binding lectin serine protease 1 (MASP1), Proteasome subunit alpha type-6 (PSMA6), Peroxiredoxin-1 (PRDX1), Neutrophil defensin 3 (DEFA3), CD44 antigen and Arginase-1 (ARG1).
  • MMP-9 Matrix metalloproteinase
  • HSP72 Heat shock protein 72
  • PIP Prolactin-inducible protein
  • the present invention is galectin-3 (galectin-3), Matrix metalloproteinase (MMP-9), Heat shock protein 72 (HSP72), Prolactin-inducible protein (PIP), Protein S100-A7 (S100A7), Galectin-7 (GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1), Serpin B12 (SERPINB12), Lactotransferrin (LTF), Alpha-1-acid glycoprotein (ORM1), CD5 antigen-like (CD5L), Complement C4-B ( C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1 (MASP1), Proteasome subunit alpha type-6 (PSMA6), Peroxiredoxin-1 (PRDX1), Neutrophil defensin 3 (DEFA3), CD44 antigen and Arginase-1 (ARG1) Provided is a method for inhibiting differentiation of Th1 and Th17 cells in vitro, comprising culturing in vitro exosomes, compris
  • the term "medium” refers to a medium capable of inhibiting the differentiation of naive CD4 + T cells into Th1 and Th17 cells in vitro, and includes any medium used in the art suitable for cell culture. Depending on the type of cell, the medium and culture conditions can be selected.
  • the medium used for culture generally contains a carbon source, a nitrogen source, and a trace element component.
  • Such cell culture medium includes, for example, DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM (Minimal essential Medium), BME (Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, ⁇ MEM ( ⁇ Minimal essential Medium), GMEM ( Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium, etc., but are not limited thereto.
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle's Medium
  • MEM Minimal essential Medium
  • BME Base Medium Eagle
  • RPMI1640 F-10, F-12
  • ⁇ MEM ⁇ Minimal essential Medium
  • GMEM Glasgow's Minimal essential Medium
  • Iscove's Modified Dulbecco's Medium etc., but are not limited thereto.
  • the medium may contain antibiotics such as penicillin, streptomycin, and gentamicin.
  • the medium composition of the present invention can be used alone or in combination with other substances to form a microenvironment for culturing and inhibiting differentiation of Th1 and Th17 cells.
  • a differentiation inhibitory material may be additionally added as the other material, and any differentiation inhibitory material known in the art may be used as the differentiation inhibitory material. It may be added alone or in combination in various ways depending on the state.
  • Culturing conditions may be carried out at 35 to 37° C. with an aeration of 5 to 15% carbon dioxide in a CO 2 incubator, but is not particularly limited thereto.
  • the composition of the present invention is galectin-3 (galectin-3), Matrix metalloproteinase (MMP-9), Heat shock protein 72 (HSP72), Prolactin-inducible protein (PIP), Protein S100-A7 (S100A7), Galectin-7 (GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1), Serpin B12 (SERPINB12), Lactotransferrin (LTF), Alpha-1-acid glycoprotein (ORM1), CD5 antigen-like (CD5L), Complement C4-B ( C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1 (MASP1), Proteasome subunit alpha type-6 (PSMA6), Peroxiredoxin-1 (PRDX1), Neutrophil defensin 3 (DEFA3), CD44 antigen and Arginase-1 (ARG1) overexpressing Since it includes exosomes derived from cord blood plasma, the overlapping content will be omitted to avoid excessive complexity of the present specification
  • the present invention is also derived from HLA and MIC gene deficient cell lines, galectin-3, Matrix metalloproteinase (MMP-9), Heat shock protein 72 (HSP72), Prolactin-inducible protein (PIP), Protein S100 -A7 (S100A7), Galectin-7 (GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1 (LAMP1), Serpin B12 (SERPINB12), Lactotransferrin (LTF), Alpha-1-acid glycoprotein (ORM1), CD5 antigen-like (CD5L), Complement C4-B (C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1 (MASP1), Proteasome subunit alpha type-6 (PSMA6), Peroxiredoxin-1 (PRDX1), Neutrophil defensin 3 (DEFA3), CD44 antigen and It relates to an umbilical cord blood plasma exosome mimic expressing one or more selected from the gene group consisting of Arginase-1 (AR
  • the present inventors have identified GAL-3, MMP-9, HSP72, PIP, S100A7, GAL-7, LAMP1, SERPINB12, LTF, ORM1, CD5L, C4B associated with pharmaceutical uses in the proteomics profile of CBPexo, such as immunosuppression, wound healing, etc. , MASP1, PSMA6, PRDX1, DEFA3, CD44 antigen, ARG1, etc. were confirmed to be included.
  • immunosuppressive and wound healing proteins were added to the H1ME-5 (HLA class I and MIC-edited clone-5 cell line) cell line, which has no immunosuppressive effect and no wound healing ability.
  • exosome mimetics such as GAL-3 exo, GAL-7 exo, PIP exo, HSP72 exo, S100-A7 exo, HSP72 & PIP dual exo were separated and purified.
  • the term "umbilical cord blood plasma exosome mimic” refers to an exosome that mimics the proteomics profile of an exosome isolated from cord blood plasma, and in particular, a single or a plurality of proteins overexpressed in the exosome for a specific purpose. refers to an exosome derived from a cell line that has no immunosuppressive effect and no wound healing effect manufactured to be overexpressed using genetic recombination technology. Therefore, the umbilical cord blood plasma exosome mimic can be prepared by introducing a nucleic acid encoding an exosome protein into a cell line having no immunosuppressive effect and wound healing effect and separating it from the same. The nucleic acid is used in the broadest sense, and includes single-stranded (ss) DNA, double-stranded (ds) DNA, cDNA, (-)-RNA, (+)-RNA, dsRNA, and the like.
  • the size of the exosome mimic may have a diameter of 60 nm to 250 nm, or 70 nm to 230 nm.
  • a cell line deficient in HLA and MIC genes is used.
  • the CRISPR-Cas9 system to delete between exons 2 and 3 of each of HLAA-A, HLA-B, HLA-C and MICA/B
  • the HLAA-A, HLA-B, HLA-C and MICA/B genes H1ME-5 (Accession No.: KCTC 13602BP), which is a 293T cell line deficient in HLA and MICA/B completely removed from the pseudogenome, can be used.
  • GAL-3, MMP-9, HSP72, PIP, S100A7, GAL-7, LAMP1, SERPINB12, LTF, ORM1, CD5L, C4B, MASP1, PSMA6, PRDX1, DEFA3, CD44 antigen and ARG1 genes were added to the H1ME-5 cell line.
  • exosomes CBPexo mimic
  • the umbilical cord blood plasma exosome mimic of the present invention may express LAMP1, SERPINB12, LTF, ORM1, CD5L, C4B, MASP1, PSMA6, PRDX1, DEFA3, CD44 antigen and ARG1.
  • the umbilical cord blood plasma exosome mimetic of the present invention may express HSP72 and PIP alone or both.
  • the transfection includes microinjection, electroporation, DEAE-dextran treatment, lipofection, nanoparticle-mediated transfection, protein transduction domain mediated introduction, virus It can be delivered to cells by various methods in the art, such as, but not limited to -mediated gene delivery, and PEG-mediated transfection in protozoa.
  • vector refers to a nucleic acid molecule capable of carrying another nucleic acid to which it is linked.
  • plasmid refers to a circular double-stranded DNA loop into which additional DNA segments can be ligated.
  • viral vector that can ligate additional DNA segments into the viral genome.
  • Some vectors are capable of self-replication within a host cell when introduced into the host cell (eg, bacterial vectors having a bacterial origin of replication and episomal mammalian vectors).
  • Other vectors eg, non-episomal mammalian vectors
  • vectors are capable of directing the expression of genes to which they are operatively linked. Such vectors are referred to herein as "recombinant expression vectors" (or simply, “expression vectors”).
  • expression vectors useful for recombinant DNA IVT mRNA techniques are usually in the form of plasmids, since plasmids are the most commonly used type of vector, so “plasmid” and “vector” can be used interchangeably.
  • the present invention relates to viral vectors (e.g., adenoviral vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, herpes virus vectors, retroviral vectors, lentiviral vectors, baculovirus vectors) and IVT mRNAs that provide equivalent functions.
  • viral vectors e.g., adenoviral vectors, adeno-associated virus (AAV) vectors, herpes virus vectors, retroviral vectors, lentiviral vectors, baculovirus vectors
  • IVT mRNAs that provide equivalent functions.
  • Other types of expression vectors are also included.
  • a lentiviral vector can be used. Transformation includes any method of introducing a nucleic acid into an organism, cell, tissue or organ, and as is known in the art, it can be carried out by selecting the above-mentioned standard technique suitable for the host cell.
  • the present invention also relates to a composition for immunosuppression or wound treatment comprising the umbilical cord blood plasma exosome mimic.
  • the present invention provides a method for immunosuppression or wound treatment comprising administering to a subject an effective amount of the umbilical cord blood plasma exosome mimetic.
  • MMP-9-enhanced exosomes among CBPexo mimics are promising therapeutic molecules for T cell immunosuppression. These results indicate that several complex effects such as cleavage of CD25 by MMP, inhibition of IL-2 production, changes in cytokine secretion pattern, and proliferation of Treg cells are simultaneously associated with T cell differentiation and proliferation.
  • exosomes expressing HSP72 inhibit T cell proliferation, and HSP72 upregulates MMP-9.
  • the umbilical cord blood plasma exosome mimic of the present invention can be used as an active ingredient of the composition for immunosuppression.
  • the umbilical cord blood plasma exosome mimetic of the present invention significantly improves the migration of fibroblasts, and the wound healing effect of the exosome mimics simultaneously expressing HSP72 and PIP (HSP72 & PIP dual exo) is PIP exo and HSP72 It was higher in a concentration-dependent manner than exo alone, and was better than the simultaneous addition of PIP exo and HSP72 exo.
  • HSP72 & PIP dual exo showed better angiogenesis than PIP exo and HSP72 exo alone, and can improve wound healing and recovery by promoting the differentiation of M1 M ⁇ into M2 M ⁇ . Therefore, preferably, the exosome mimic that simultaneously expresses HSP72 and PIP, which mimics the cord blood plasma-derived exosome, can be used as an active ingredient for wound treatment.
  • the immunosuppression is for the improvement, prevention, or treatment of the above-mentioned immune diseases, and the overlapping contents related to the immune diseases are omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the wound treatment is for the improvement or treatment of the above-described wound treatment-related diseases, and the overlapping contents of the wound treatment-related diseases will be omitted in order to avoid excessive complexity of the present specification.
  • the subject may be a mammal such as a dog, cat, rat, mouse, or human, but is not limited thereto.
  • composition for immunosuppression or wound treatment of the present invention may include an active ingredient and an active or inactive pharmaceutically acceptable carrier constituting a composition suitable for diagnostic or therapeutic use in vitro, in vivo or ex vivo. have.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may include exosome mimetics and protein excipients including phosphate buffered saline solution, serum albumin such as human serum albumin (HSA), recombinant human albumin (rHA), gelatin, casein, and the like. any pharmaceutical carrier that is compatible with it. Examples of carriers, stabilizers and adjuvants can be found in Martin REMINGTON'S PHARM. SCI, 18 th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1995)) and the "PHYSICIAN'S DESK REFERENCE", 58nd Ed., Medical Economics, Montvale, NJ. (2004).
  • carrier may include buffers or pH adjusting agents, typically buffers are salts prepared from organic acids or bases.
  • Representative buffers include organic acid salts such as citric acid salt, ascorbic acid salt, gluconic acid salt, carbonic acid salt, tartaric acid salt, succinic acid salt, acetic acid salt or phthalic acid salt; tris, tromethamine hydrochloride or phosphate buffers.
  • organic acid salts such as citric acid salt, ascorbic acid salt, gluconic acid salt, carbonic acid salt, tartaric acid salt, succinic acid salt, acetic acid salt or phthalic acid salt; tris, tromethamine hydrochloride or phosphate buffers.
  • composition for immunosuppression or wound treatment of the present invention can be prepared in various suitable formulations.
  • Formulations and carriers suitable for parenteral administration such as, for example, intratumoral, intraarterial (in the joint), intravenous, intramuscular, intradermal, intraperitoneal, intranodal and subcutaneous routes include antioxidants, buffers, bacteriostatic agents. , and aqueous and non-aqueous sterile suspensions which may contain solutes which will render the formulation isotonic with the blood of the intended recipient, and suspending, solubilizing, thickening, stabilizing, and preservative agents.
  • Intravenous or intraperitoneal administration is the preferred method.
  • the dosage of cells administered to a subject is an amount effective to achieve a desired beneficial therapeutic response in the subject over time, or an amount effective to inhibit the growth of cells or an amount effective to inhibit infection.
  • it can be carried out in such a way that a blood sample is obtained from the subject prior to injection and stored for use in subsequent analysis and comparison.
  • at least about 10 4 to 10 6 and typically 1 ⁇ 10 8 to 1 ⁇ 10 10 cells may be infused intravenously or intraperitoneally into a 70 kg patient over approximately 60 to 120 minutes.
  • the exosomes of the present invention can be administered according to the LD-50 (or other toxicity measurement method) according to the type of cell and the side effect determined by the type of cell at various concentrations. administered in proportion. Administration may be administered at one time or in several divided doses.
  • the exosomes of the present invention can supplement treatment for other specific conditions using known conventional therapies including cytotoxic agents, nucleotide analogs and biological response modifiers. Similarly, biological response modifiers may optionally be added to treatment with the exosomes of the present invention.
  • Human peripheral blood mononuclear cells and human umbilical cord blood were provided by the Catholic Hematopoietic Stem Cell Bank after informed consent was obtained from a healthy donor or from a normal full-term pregnant woman. All experiments on human subjects were performed in accordance with the recommendations of the Declaration of Helsinki. The protocol was approved by the Animal Experimental Ethics Committee (IACUC) of the Catholic University of Korea. All subjects received written consent to donate samples in accordance with the Declaration of Helsinki.
  • IACUC Animal Experimental Ethics Committee
  • C57BL/6 mice were purchased from OrientBio, Inc. (Seoul, Korea) and maintained free of specific pathogens according to the guidelines of the Institute of Laboratory Animal Resources, The Catholic University of Korea, Korea. All animal experiments were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of the Catholic University of Korea, Korea. All animal experiments were performed according to the researcher's protocol previously approved by the Institutional Animal Care and Use Committee (Permission No. CUMC-2017-0273-05), Catholic University of Korea Medical School.
  • Human cord blood plasma was sequentially centrifuged at 400 g for 5 minutes and at 2,000 g for 10 minutes to remove cells and cell debris.
  • Cord blood plasma was then filtered through a 0.45- ⁇ m polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane (NalgeneTM Rochester, NY). Protein elution was checked by reading the absorbance of each fraction at 280 nm using a nanodrop spectrometer (Thermo Scientific, San Diego, CA).
  • CBP was ultracentrifuged at 100,000 g for 2 hours, and cord blood plasma pellets were used for comparative experiments. As a control, plasma from adult blood was isolated and the same exosome isolation procedure was followed.
  • Exo-Check Exosome Antibody Array System Biosciences, Palo Alto, CA
  • PE-conjugated anti-human CD9 e-Bioscience, San Diego, CA
  • anti-human CD63 BD Biosciences, San Jowe, CA
  • anti-human CD82 Biolegend, San Diego, CA
  • anti-human HSP70/HSP72 Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY
  • Tregs were purified from 1 UCB unit (The clergy Medicine Hematopoietic Stem Cell Bank) through positive selection using magnetic microbeads directly conjugated with anti-CD25 and a manual column (Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Germany).
  • CD25+ cells were cultured with a lentivirus-transduced K562 cell line (aAPC) expressing CD80, CD83, 4-1BBL and CD32 at a ratio of 2:1.
  • aAPCs were irradiated with 10000 cGY and incubated with 0.5 ⁇ g/mL of anti-CD3 (OKT3) and anti-CD28 (CD28.2; both BD Pharmingen, San Diego, CA).
  • Recombinant IL-2 300 IU/mL; Chiron, Emeryville, CA) was added every 3 days and maintained for the incubation period. Cells were cultured for 14 days and split every 3-4 days.
  • H1ME-5 cells (Null-293T (H1ME-5, accession number: KCTC 13602BP) were cultured in DMEM medium (Lonza) supplemented with 10% fetal bovine serum (FBS), 1% L-glutamine and 1% penicillin-streptomycin.
  • T2 cells were cultured in RPMI-1640 medium (Lonza) supplemented with 10% FBS, 1% L-glutamine and 1% penicillin-streptomycin.
  • H1ME-5 cells were seeded at 2 ⁇ 10 6 cells/10 mL in DMEM without antibiotics (Lonza). After 24 hours, four targets GAL-3 (SEQ ID NO: 5), MMP-9 (SEQ ID NO: 1), HSP72 (SEQ ID NO: 4) S100A7 (SEQ ID NO: 6), GAL-7 ( A mixture of six individual all-in-one plasmids specific for each of SEQ ID NO: 2), and PIP (SEQ ID NO: 3) (NCBI reference sequence; self-made using pCDH vector) was combined with Lipofectamine reagent ( Invitrogen, Carlsbad, CA) was used to transfect 293T cells. 48 hours after transfection, cells were analyzed by flow cytometry. After 6 days of transfection, cells positive for GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 and PIP were sorted using a Moflo XDP Cell Sorter (Beckman) and clones were established.
  • GAL-3 S
  • PBMC peripheral blood mononuclear cells
  • splenocytes 5 ⁇ 10 5
  • CBPexo or ABPexo was added simultaneously to the appropriate wells.
  • Cell proliferation was measured by 5,6-carboxyfluorescein diacetate-succinimidyl ester (CFSE) staining and flow cytometry.
  • CFSE 5,6-carboxyfluorescein diacetate-succinimidyl ester
  • splenocytes or PBMCs were incubated with 5 ⁇ M CFSE (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) in 1 mL of PBS at 37 °C for 10 min, followed by washing twice with ice-cold culture medium containing 10% FBS. did. Stained cells were stimulated with DYNABEAD as described above in the presence of CBPexo or ABPexo. After incubation for the indicated time, cells were acquired with a FACSCanto (Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg, Germany) and data were analyzed with Modfit LT 3.0 software (Verity Software House, Topsham, ME). At least three independent experiments were performed to verify the immunosuppressive effect of CBPexo on activated PBMCs or splenocytes from 10 healthy donors.
  • CFSE Molecular Probes, Eugene, OR, USA
  • Apoptotic cells were stained with Annexin V and analyzed according to the manufacturer's instructions. Briefly, 1 ⁇ 10 6 cells were resuspended in 1 mL of annexin binding buffer. 5 ⁇ l of a working solution of APC-Annexin V or FITC-Annexin V (BD Biosciences, San Jose, CA, USA) and 7AAD (BD Biosciences, Catalog # 551076, San Jose, CA) was added to 5 ⁇ 10 5 cells in 100 ⁇ l. and incubated at 37° C., 5% CO 2 for 15 minutes. Analysis data were analyzed using FlowJo v10.
  • PBMCs were stimulated with DNYNABEAD and incubated for 12-48 hours in 96-well flat-bottomed plates.
  • Cells were harvested, fixed in 70% ethanol, and the cell pellet was stained with a solution of propidium iodide (PI; Sigma) supplemented with RNase A in PBS.
  • PI propidium iodide
  • DNA content was measured by FACS Canto (Becton Dickinson) and analyzed using ModFITLT 4.0 software to measure sub-G1, G1, S and G2 phases of the cell cycle.
  • GM6001 (Calbiochem, San Diego, USA) was added to CBPexo and incubated at 21° C. for 2 hours. GM6001 pretreated CBPexo was used for further experiments as indicated.
  • ELISPOT analysis was performed according to the manufacturer's protocol. Briefly, monoclonal antibodies specific for human IL-2 (Catalog #551076, BD Biosciences), IFN- ⁇ (Catalog #551083, BD Biosciences), IL-17 (Catalog #SEL421, R&D Systems) were microplate (Millipore, Billerica, MA). For in vitro experiments, cells cultured for 6 days were washed 3 times with medium, resuspended in 1 mL of medium before proceeding with ELISPOT analysis, and incubated overnight. For ex vivo experiments, MOG33-55 was added to 96-well microplates at a concentration of 1 ⁇ 10 6 cells/well in medium.
  • Microplates were incubated at 37° C., in a CO 2 incubator for 20 hours. The microplate was then washed 4 times with wash buffer. The wells were then filled with 100 ⁇ l/well of biotinylated polyclonal anti-mouse IL-2, IFN- ⁇ and IL-17. Plates were incubated at 21° C. for 2 hours, washed with buffer, and then incubated for 1 hour at ambient temperature in the presence of 100 ⁇ l/well of streptavidin-horseradish peroxidase (HRP). Unbound enzyme was then removed by washing and enzyme substrate solution was added. After the spot developed, distilled water was added to stop the reaction. The plate was inverted and dried overnight protected from light. The number of spots corresponding to IL-2, IFN- ⁇ , IL-17 secreting cells was determined using an automatic AID-ELISPOT reader (AID Diagnostika GmbH, Strassberg, Germany).
  • CBA Human and Mouse Cytometric Bead Array
  • 50 ⁇ l of assay beads, 50 ⁇ l of detection reagent and 50 ⁇ l of study sample or standard were successively added to each sample tube and incubated at 21° C. for 3 hours in the dark. Next, the samples were washed with 1 mL of wash buffer and centrifuged at 500 ⁇ g for 5 minutes. After discarding the supernatant, the pellet was resuspended in 300 ⁇ l of buffer and analyzed by flow cytometry on the same day.
  • CFA complete Freund's adjuvant
  • PTx pertussis toxin
  • HSF Human dermal fibroblasts
  • Gibco BRL Grand Island, USA
  • exosomes were labeled with a red fluorescent dye (PKH26; Sigma), HSF was stained with a green fluorescent dye (PKH67; Sigma), and incubated at 37 °C for 3 hours.
  • the umbilical cord blood team at the Catholic Hematopoietic Stem Cell Bank evaluated current laboratory practice for CFU when performed on fresh samples using human cord blood.
  • the experiment was designed to evaluate the differentiation of hematopoietic progenitor cells in UCB.
  • CFU-C analysis was performed using MethoCult H4435 Enriched medium (STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada). Briefly, 1 ⁇ 10 5 cells/mL of cells were plated in two wells (1 mL/well) in a 24-well plate, placed in an incubator, and maintained at 37° C., 5% CO 2 and >85% humidity. Colonies were defined as aggregation of >40 cells. Clusters consisted of 4-40 cells.
  • CFU-E colony-forming unit-erythroids
  • BFU-E burst-forming unit-erythroids
  • CFU-G/M CFU-granulocyte/macrophage
  • CFU-G/M CFU-granulocyte/macrophage
  • CFU-G/M CFU-granulocyte/macrophage
  • CFU-G/M CFU-granulocyte/macrophage
  • cluster-G/M were counted after 14 days. Colony numbers were reported as the average of two wells adjusted to 10 5 plated mononuclear cells.
  • Single cell suspensions were prepared by treating fibroblasts with 0.125% trypsin. 5000 cells per 180 ⁇ l medium were seeded in 96-well plates and incubated for 24 h. In culture for 24 h, fibroblasts were treated with mitomycin C (MMC) at a concentration of 10 ⁇ g/mL. There are four well groups: two experimental groups of fibroblasts treated with PBS or MMC alone as controls, and two experimental groups of fibroblasts treated with MMC and CBP or ABP exosomes.
  • MMC mitomycin C
  • Undiluted basement membrane matrix 250 ⁇ l; Matrigel, BD Biosciences was added to each well of a 24-well plate and incubated at 37° C. for 30 minutes to solidify.
  • HUVECs (1 ⁇ 10 5 ) were plated into each matrigel-coated well containing different types of exosomes (CBP EXO , HSP72 EXO , PIP EXO ) and incubated at 37° C., 5% CO 2 for 12 h. After removal of the medium, 4% paraformaldehyde (PFA) was added to fix it, the cells were visualized using a light microscope, and the formation of vasculature was calculated using ImageJ software.
  • CBP EXO CBP EXO
  • HSP72 EXO HSP72 EXO
  • PIP EXO 5% CO 2
  • M1 activation cells were maintained with 40 ng/mL IFN- ⁇ (Peprotech) for 2 days, and for M2 activation, cells were treated with 20 ng/mL IL-4 (Peprotech) for 2 days.
  • CBPexo contains the typical exosome marker proteins CD9, CD63, CD82 and HSP72. These markers were absent in the bead-only control ( FIG. 1A ).
  • the purity of these exosomes was assayed for exosomal antibodies, including the well-characterized exosomal protein markers CD81, ICAM, CD63, ALIX, TSG101, EpCAM and FLOT-1, as well as the cis-Golgi marker GM130 to monitor cell contamination. confirmed using the kit.
  • the Exo Anibody Array Kit consists of a positive (+) control, a standard exosomal protein, and a negative (-) control, a blank.
  • Liquid chromatography and tandem mass spectrometry (LC-MS/MS) analysis identified 150 proteins in CBPexo and 214 proteins in ABPexo, each with at least two mapping peptides per sequence. Of the 150 proteins of CBPexo, 11 proteins were divided into two subgroups (4 immunomodulatory proteins or 7 unrelated immunomodulatory proteins), whereas 19 immunomodulatory proteins were differentially expressed (Fig. 2a). Functional classification of ABPexo and CBPexo was performed using the ExoCarta databse (table on the right of Fig. 2a). The functional classification of ABPexo and CBPexo and further comparisons between them highlighted five different biological processes and molecular functions.
  • CBPexo appears to be associated with arginase activity, heat shock protein binding, S100 protein binding and hyaluronic acid binding to a higher degree than ABPexo (Fig. 2c).
  • proteomics analysis of CBPexo indicates that exosomal proteins are associated with immunosuppression and wound healing.
  • Table 1 lists the immunomodulation-related proteins in CBPexo.
  • rapamycin and cyclosporine inhibited immunosuppression in a concentration-dependent manner ( FIGS. 3A and 3B ).
  • the focus was mainly on the immunosuppression mechanism mediated by direct contact between CBPexo and immune cells.
  • DYNABEAD anti-CD3/CD28 activated PBMCs were cultured with CBPexo or ABPexo to determine whether CBPexo had a potent immunosuppressive effect on activated immune cells.
  • the immunosuppressive effect of CBPexo was investigated by CD4+ and CD8+ T cell proliferation.
  • FIGS. 3A and 3B As analyzed by CFSE dilution analysis, ABPexo did not, but CBPexo did not inhibit CD4+ and CD8+ T cell proliferation ( FIGS. 3A and 3B ).
  • PBMCs were activated by DYNABEAD in the presence of exosomes.
  • Apoptosis of T cells was measured at 156 hours by flow cytometry.
  • Annexin V and 7AAD double negative staining indicates live cells
  • 7AAD and Annexin V positive staining indicates dead and apoptotic cells, respectively.
  • the apoptosis rate in the CBPexo treatment group was increased compared to the ABPexo treatment group.
  • the exosome-treated group did not show any difference in the initial apoptosis period.
  • CD8+ T cell apoptosis there was no difference between the CBPexo-treated group and the control group.
  • cell cycle analysis was performed by measuring the DNA content of each cell group by flow cytometry after PI staining.
  • PBMCs were stimulated with DYNABEAD in the presence of CBPexo or ABPexo, incubated for 156 h, and then stained with PI.
  • CBPexo was co-cultured with cord blood-derived CD25+ cells, and the cells were incubated for 21 days prior to detection of CD4+/CD25+/FoxP3+ and CD127 low cells.
  • Cells were effectively expanded by the combination of artificial antigen presenting cells and anti-CD3/CD28 and IL-2 (Fig. 5b).
  • Treg and CBPexo-Treg cells were generated from the same 1 unit of umbilical cord blood, and increased 16.32-fold in CBPexo-Treg on day 17 after culture ( FIG. 5c ). Foxp3 expression increased expanded cord blood CD25+ cells in CBPexo-induced Tregs compared to their expression in nTregs.
  • CBPexo induces Foxp3 upregulation 21 days after Treg differentiation (Fig. 5d).
  • CBPexo-derived Tregs were potent in almost all Treg:PBMC ratios tested. Inhibition of >50% was observed at a Tregs:PBMC ratio of 1:4, demonstrating the strong inhibitory ability of CBPexo-induced Tregs ( FIG. 5E ). Therefore, CBPexo can directly suppress the immunity of T cells, but it can also induce the differentiation of Tregs at an early stage and participate in the improvement of the function of cord blood Treg cells.
  • CD25 is proteolytically cleaved by MMP-9 and shows an immunosuppressive effect on T cells. These zinc-dependent endopeptidases are essential factors for cell invasion through the extracellular matrix.
  • MMP-9 proteolytically cleaved by MMP-9 and shows an immunosuppressive effect on T cells. These zinc-dependent endopeptidases are essential factors for cell invasion through the extracellular matrix.
  • MMPs and TIMPs were assayed in CBPexo using a human MMP antibody assay.
  • CBPexo significantly contained high concentrations of MMP9 and MMP8.
  • CBPexo cleaves membrane-bound IL-2R ⁇ (CD25) by MMP9 and inhibits the proliferation of activated T lymphocytes.
  • CBPexo and GM6001 inhibitors of various MMPs, including MMP-1, -2, -3, -8 and -9, were incubated for 2 h prior to incubation with human T cells. did.
  • Human CD4 + T cells cultured with GM6001-treated CBPexo restored cell proliferation (Fig. 7b).
  • CD4+ and CD8+ T cells cultured with the MMP inhibitor GM6001 (10 ⁇ g/mL)-treated CBPexo showed recovery of CD25 expression, but there was no difference in the activation marker CD69 ( FIG. 8 ).
  • MMP-9 is mainly associated with the immunosuppression of CBPexo induced by inhibition of CD25 by MMP-9.
  • CBPexo showed a strong immunosuppressive effect on mouse splenocytes and human PBMC.
  • the immunosuppressive effect of CBPexo was tested by DYNABEAD-stimulated mouse CD4+ and CD8+ T cell proliferation.
  • CBPexo inhibited CD4+ and CD8+ T cell proliferation, but not ABPexo, as analyzed by CFSE dilution assay ( FIGS. 9A-B ).
  • Human CBPexo exhibited mouse cross-reactivity of proliferative T cell inhibition. Therefore, these results indicate that CBPexo is applicable to EAE, an animal model of autoimmune disease.
  • Cells (1 ⁇ 10 5 cells/well in 96-well culture plates) were cultured for 6 days with anti-CD3/CD28 to allow T cells to expand and respond to CBPexo. Cells in each well were washed and left to be used for ELISPOT analysis.
  • the clinical score of the CBPexo-treated EAE group was significantly lower than that of the ABPexo-treated EAE group and the EAE control group.
  • MOG peptide-specific IL-2 cells were significantly reduced in the CBPeox-treated EAE group, but there was no difference in the cells secreting IFN- ⁇ and IL-17, similar to the in vitro analysis results (Fig. 10b).
  • Donor CD4+ T cells differentiate from each other into Th1, Th2 and Th17 cells, which mediate the balance of EAE and Th subsets, playing an important role in regulating the T cell immune response. Therefore, their ability to reduce Th1, Th2 and Th17 cell-associated cytokines by CBPexo was further investigated. To confirm this, cytokine levels were evaluated using Th1, Th2 and Th17 cytometric bead assays. As a result of evaluating the concentration of the secreted protein, CBPexo administration induced a decrease in the levels of IFN- ⁇ , IL-2, IL-6, IL-17 and IL-4 compared to the EAE group ( FIG. 10c ).
  • Intracellular staining was performed to compare the cytokine profiles of Th1, Th2, Th17 and IL-2 in the EAE model. As a result, the ratio of IL-2 was reduced two-fold, and IFN- ⁇ and IL-17 were decreased by 1-4% in the CBPexo-treated group compared to the ABPexo-treated group ( FIG. 11 ). These results demonstrate that CBPexo administration modulates IL-2 signaling and induces mutual regulation of Th1 and Th17 cell differentiation to have a protective effect against EAE.
  • CD4+CD25+FOXP3+ Treg cells The frequency of CD4+CD25+FOXP3+ Treg cells was measured, and the untreated control (negative control), EAE control (positive control), CBPexo-treated EAE group and ABPexo-treated EAE group were compared.
  • CBPexo or ABPexo labeled with PKH67 was injected into the tail vein of EAE mice.
  • the EAE model can be localized to the brain or co-occurring throughout the body. Therefore, the cell nucleus of the brain, which is the most important organ in disease development, and the spleen tissue, which is the most important lymph organ acting on the whole body, were stained with DAPI, and CBPexo labeled with PKH67 was detected in both the spleen and brain tissue (FIG. 14).
  • CBPexo were labeled using red fluorescent dye (PKH26) and incubated with green fluorescent dye-labeled (PKH67) HSF. Then, fluorescence microscopy of PKH26-labeled CBPexo distributed around PKH67-labeled HSF was performed (FIG. 14a). These fluorescently labeled exosomes were distributed around green-labeled HSF cells after 12 hours of incubation ( FIG. 16A ). Red-labeled CBPexo migrated significantly to HSF during incubation for 0-24 h (Fig. 16b).
  • CBPexo can migrate and internalize in fibroblasts in vitro to promote proliferation. Furthermore, we observed that these exosomes are essential mediators of plasma function and can be used as novel therapeutic nanoparticle delivery systems for wound healing.
  • CBPexo a necessary condition for exosome protein delivery, could be internalized in HSF.
  • CBPexo was incubated with HSF for 7 days until confluence was reached.
  • a scratch wound assay was performed to evaluate whether CBPexo affects fibroblast migration.
  • the wound area containing fibroblasts was scraped and these fibroblasts were cultured for 24 hours with or without CBPexo, and then the wound area was evaluated.
  • the results of this analysis showed that CBPexo significantly increased the migration of fibroblasts compared to the control group and the ABPexo group (FIG. 17a).
  • the carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE) assay showed that the proliferative response of fibroblasts when CBPexo or ABPexo was treated was similar to that observed in the wound-closure assay (Fig. 15c). Therefore, in order to measure the main mechanism during migration stimulation and HSF proliferation, the test was performed after pretreatment of HSF with MMC used as an anti-proliferative agent.As a result, although the proliferation of fibroblasts is inhibited by MMC, CBPexo It was confirmed that the proliferation was increased in the group added with ABPexo compared to other controls treated with ABPexo (Fig. 17c) In addition, in the group added with CBPexo, even though the proliferation ability was inhibited by MMC, apoptosis was reduced compared to the control group. (Fig. 17d).
  • CBPexo can stimulate HSF migration and promote fibroblast proliferation during wound healing.
  • Fibroblasts are the major effector cells responsible for soft tissue wound healing, and their proliferation and migration are essential for wound healing, wound contraction, collagen synthesis and tissue remodeling.
  • CBPexo can significantly improve proliferation and migration of fibroblasts compared to ABPexo by migrating and internalizing them in fibroblasts.
  • M2 M ⁇ can reduce inflammation and repair wounds by engaging in fibroblast proliferation and migration and angiogenesis.
  • CBPexo contains colony-forming unit-granulocytes, -erythrocytes, -monocytes, and -megakaryocytes (CFU-GEMMs); and increased the number of CFUgranulocytes, -monocytes (CFU-GMs), and CFU-monocytes (CFU-Ms) associated with macrophage differentiation (FIG. 18b).
  • CBPexo promoted macrophage proliferation and induced differentiation of the pro-inflammatory M1 phenotype into the anti-inflammatory M2 phenotype.
  • exosome proteins (PIP, HSP72, GAL-7, GAL-3 and S100-A7) are associated with immune regulation and wound healing.
  • MICA induces natural killer cell proliferation, and MHC-I deficiency jeopardizes immune activation.
  • MHC and MICA/B induce endothelial cell proliferation and affect wound healing effects. Therefore, by silencing MHC and MICA/B using the CRISPR/cas9 system, cells without immune-activating effect can be created.
  • HEK 293T cells have several advantages, including high transfection efficiency and homologous haploids of HLA class I (A*02:01, B*07:02 and C*07:02) and MICA/B.
  • HLA class I and MICA/B genes For complete removal of HLA class I and MICA/B genes, seven plasmids encoding Cas9 proteins and gRNAs targeting exons 2 and 3 of HLAA-A, HLA-B, HLA-C and MICA/B genes was used (see Hong, CH, et al., J Immunother, 2017. 40(6): p. 201-210). These H1ME-5 cells exhibiting a lack of expression of HLA class I and MICA/B were analyzed by flow cytometry ( FIG. 19 , encoding GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 and PIP genes). Transduced with lentivirus 6 days after transduction, GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 and PIP-positive cells were sorted.
  • the size distribution of the exosomes released from H1ME-5 was characterized using DLS, and the observed particle size of the exosomes was 145.61 ⁇ 75.89 nm ( FIG. 19b ).
  • H1ME-5 cells are stable in producing CBPexo mimics because exosomes derived from H1ME-5 cells do not have an immunosuppressive effect.
  • H1ME-5 cells are suitable for producing artificial exosomes because exosomes derived from H1ME-5 cells have no wound healing effect ( FIGS. 19c and d ).
  • H1ME-5 cells More than 90% of H1ME-5 cells expressed GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 and PIP by flow cytometry ( FIG. 19E ).
  • exosomes derived from this cell line expressed target molecules GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 and PIP (FIG. 19f).
  • HSF was stimulated with artificial exosomes expressing specific target proteins.
  • a series of in vitro functional assays were performed by treating these HSFs with CBPexo or artificial exosomes at the same concentration. Scratch wound analysis was performed according to the method of Example 1 to evaluate the effect of CBpeox or artificial exosomes on HSF migration.
  • HSP72-exo and PIP-exo significantly improved the migration of HSF as measured by migration region (Fig. 20a).
  • the target proteins only PIPexo promoted fibroblast proliferation (Fig. 20b).
  • Exosomes expressing GAL-7, GAL-3 and S100-A7 did not show wound healing effects and did not proliferate fibroblasts.
  • Example 1 6 days after transduction, cells expressing PIP and HSP72 were simultaneously selected and cultured using a MoFlo XDP cell sorter (FIG. 21a).
  • HSP72-exo and PIP-exo were added together, the wound healing effect was similar to that of CBPexo and was higher than that of exosomes expressing only PIP or HSP72.
  • These exosomes showed wound healing effects in a concentration-dependent manner ( FIG. 21b ).
  • exosomes simultaneously expressing HSP72 and PIP showed a better wound healing effect than that observed when HSP72-exo and PIP-exo were simultaneously added ( FIG. 21c ).
  • Fibroblasts were labeled with CFSE, used as a control, and cultured for 24 hours. After incubation, cells were harvested and analyzed via flow cytometry. Cell division was identified as having CFSE fluorescence sequentially split in half and equally spaced peaks on a logarithmic scale. These peaks indicated the number of cleavage cycles. Similar wound closure results were obtained using the CFSE method, and the proliferation rate of normal HSF was confirmed with various types of artificial exosomes ( FIG. 21D ).
  • HSP72 and PIP were produced, and they were added together or added in a concentration-dependent manner to confirm their wound healing effect.
  • HSP72 and PIP were the most effective proteins (among those expressed by CBPexo) in promoting wound healing.
  • Exosomes contain a variety of signaling molecules that represent their parental cells. To study the polarization factors in different exosome compositions including proteins, nucleic acids, lipids and metabolites, we focused on the CBPexo cargo protein present in abundant content. In addition, in order to measure the effect of artificial exosomes on human umbilical vein endothelial cells (HUVEC), angiogenesis assay was performed according to the method of Example 1 above. First, compared with those cultured without exosomes, HSP72-exo and PIP-exo increased the number of nodes and total vessel length in the network structure, indicating the pro-angiogenic ability of artificial exosomes. Representative images of HUVEC angiogenesis for each group are shown in Figure 22A.
  • HUVECs cultured with HSP72/PIPexo showed better angiogenesis capacity compared to those cultured with other exosomes (Fig. 22a).
  • HSP72/PIPexo showed better angiogenesis capacity compared to those cultured with other exosomes (Fig. 22a).
  • the differentiation of M1 M ⁇ into M2 M ⁇ was promoted by HSP72/PIP protein ( FIG. 22b ).
  • artificial exosomes expressing HSP72 and PIP can improve wound healing and recovery by enhancing angiogenesis.
  • the present invention demonstrates that artificial exosomes expressing HSP72 and PIP can promote skin wound healing by inducing a direct in situ conversion of classically activated M1 M ⁇ to a polarized M2-like phenotype. was first proven.
  • the present invention can be applied to the field of manufacturing medicines for the treatment of autoimmune diseases or wounds.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Reproductive Health (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Transplantation (AREA)
  • Gynecology & Obstetrics (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)

Abstract

본 발명은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀 또는 이의 모방체 및 이의 약학적 용도에 관한 것으로, 보다 상세하게는, 본 발명은 인간 제대혈 혈장 유래의 엑소좀 또는 상기 제대혈 혈장 유래 엑소좀의 프로테오믹스 프로파일을 모방하는 엑소좀 모방체를 다양한 자가면역질환 또는 상처치료의 개선, 예방 또는 치료에 사용하는 용도를 제공한다.

Description

제대혈 혈장 유래의 엑소좀 또는 이의 모방체 및 이의 약학적 용도
본 발명은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀 또는 이의 모방체 및 이의 약학적 용도에 관한 것이다.
인간 제대혈은 이식을 위한 조혈줄기세포의 소스로 사용되어 왔으나 면역세포, 중간엽 기질 세포 및 내피 전구체 세포 등의 다수의 세포들을 함께 포함하고 있다. 모체의 면역 시스템을 통한 태아의 면역 내성은 임신 유지에 중요한 역할을 담당한다. 태아와 모체 간의 면역학적 상호작용은 태아 항원의 제시 및/또는 모체 면역 시스템에 의한 이들 항원의 인지 및 이에 대한 반응에 의해 조절되는 양방향 커뮤니케이션 시스템을 나타낸다. 인간 제대혈 유래의 세포는 임신 유지에 기여하는 특정한 면역조절 특성들을 가지고 있다. 더욱이, 인간 제대혈은 또한 조절성 T 세포(Tregs) 및 단핵구-유래의 억제세포(MDSCs)와 같은 면역억제세포의 풍부한 소스이다.
엑소좀은 기능성 단백질의 독특한 서브세트를 탑재하여 그들의 세포 혈통을 반영하는 작은 세포막 베지클이다. 인간 제대혈 유래의 세포는 엑스 비보에서 선별 및 확장되므로, 이들 세포 유래의 엑소좀은 세포 배양 상등액에서 효율적으로 분리될 수 있다. 인간 제대혈 유래의 세포에서 방출된 엑소좀은 그들은 Tregs 및 MDSCs와 같은 순환성 면역억제세포의 분화를 유도할 수 있어 면역억제 효과를 가질 수 있다. 그러나, 인간 제대혈 유래의 세포 및 엑소좀에 대한 연구에서의 발전에도 불구하고, 인간 제대혈 혈장 유래의 엑소좀(CBPexo)에 대한 연구는 빈약하다. CBPexo에 대한 프로테오믹스 연구 결과 엑소좀의 단백질은 T-세포 증식, 분화 및 음성적 조절; 막 투과성; 상처-치유; 아르기나아제 활성; 및 효소 조절 활성과 연관이 있었다. 인간 제대혈 유래의 세포외에도, 인간 제대혈 혈장 역시 다양한 면역조절 인자들을 포함하고 있어 IL-2 신호전달을 억제하여 T-세포 증식을 억제함에 있어 역할을 담당하고 있다. IL-2 및 이의 수용체인 IL-2R은 T 세포의 증식 및 생존 및 나이브 T 세포의 분화를 지원하는데 역할을 담당하고 있다. IL-2R 알파 체인(IL-2Rα/CD25)은 IL-2R의 필수 성분이다. 더욱이, CD4+T 세포에서의 IL-2Rα의 표면 발현 및 활성화 T 세포에서의 IL-2의 수준은 MMP-9에 의해 유의적으로 감소된다. 화학적 억제제에 의한 MMP 활성 억제는 IL-2 생산을 회복시키고, T 세포 증식을 부분적으로 회복시킨다. MMP-9 뿐만 아니라 CBP 면역조절인자들이 CBPexo에서 발견되며, 이들 엑소좀은 집중된 면역억제력을 나타낼 것이다.
한편, 우발적인 외상 후 골절과 연관된 것과 같은 피부 및 연 조직 손상이 일반적이지만, 상처치료는 몇 가지 단계, 예컨대 섬유아세포 증식, 콜라겐 합성, 침착, 혈관형성, 분화 및 면역억제세포의 이동을 요구한다. 그것은 지혈, 염증, 증식 및 리모델링과 같은 잘-편성된 일련의 세포 및 분자 사건들과 관련된 고도로 계획된 공정이다. 몇 가지 치료는 상처치료를 촉진하는 것으로 제안되어 왔으나, 최적 치료 전략은 여전히 개발 중에 있다. 인간 제대혈은 이식 가능한 상처치료를 위한 줄기세포의 매력적인 공급원이다. 제대혈 도너는 임산부이며 그들은 표준화된 절차를 통해 제대혈을 수집하므로 어떠한 질병 위험도 없다. 그러나, 치료 시 줄기세포의 이용은 종양 형성, 혈전증 및 원치않는 면역 반응과 같은 특정 위험으로 인해 제한된다. 엑소좀-기반 치료는 줄기세포-기반 치료법과 비교하여 상대적으로 위험이 낮다. 따라서, 엑소좀-기반 치료법이 전도유망한 상처치료 접근법임을 제안하나 현재까지 상처치료 목적을 위한 CBPexo의 단백질 수준에 대한 연구가 없었다. 이전의 연구들은 miRNA 수준에서의 상처치료로 제한되었다.
본 발명의 목적은 성인 혈장 유래의 엑소좀과 비교하여 인간 제대혈 혈장 유래의 엑소좀의 프로테오믹스 프로파일을 규명함으로써 이의 약학적 용도를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 인간 제대혈 혈장 유래의 엑소좀의 프로테오믹스 프로파일을 모방하는 엑소좀 모방체 및 이의 약학적 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 면역억제 또는 상처치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 유효량의 상기 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역억제 또는 상처치료 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 Th1 및 Th17 세포의 분화 억제용 배지 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀과 나이브 CD4+T 세포를 인 비트로 배양하는 단계를 포함하는 인 비트로에서 Th1 및 Th17 세포의 분화 억제 방법을 제공한다.
본 발명은 또한 HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주에서 유래하고, 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군에서 선택된 하나 이상을 발현하는 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 제공한다.
본 발명은 또한 상기 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 포함하는 면역억제 또는 상처치료용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한 상기 유효량의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역억제 또는 상처치료 방법을 제공한다.
본 발명은 인간 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 다양한 자가면역질환의 개선, 예방 또는 치료에 사용하며, 상기 엑소좀의 프로테오믹스 프로파일을 모방하는 엑소좀 모방체는 효과적인 면역억제 및 상처치료 효과를 제공한다.
도 1a-d는 인간 제대혈 혈장에서 정제된 엑소좀 막 베지클의 특성 규명 결과를 나타내는 도면이다.
(a) 다양한 엑소좀 특이 마커 항체가 코팅된 라텍스 비드에 결합된 CBPexo를 플로우 사이토메트리로 분석한 결과이다. 비교를 위해 완전 엑소좀 제제로 코팅된 라텍스 비드를 포함한다. 플롯은 상응하는 비드 단독 대조군에 대한 엑소좀 특이 항체들(CD9, CD63, CD82 및 HSP72)로부터 유래된 강도를 나타낸다.
(b)는 CBPexo 용해물의 도트 블롯 분석 결과이다. 대응하는 도트는 엑소좀 항체 어레이 키트를 사용하여 평가되었다. 엑소좀 특이 항체 스팟은 다양한 강도의 신호를 제공한다. 제시된 값은 3회의 독립적인 실험에서 얻은 값의 평균을 나타낸다. 오차 막대 = 평균의 표준 오차 (SEM). "블랭크"는 음성 대조군을 나타내며, φ로 나타내고, GM130은 세포 부스러기를 나타낸다. 평균 강도는 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 분석된다.
(c)는 CBPexo의 형태적 특성 분석 결과이다. 전자현미경을 이용하여 CBPexo는 지질 이중층 구조로 구성되어있고 크기는 (50-130 nm)인 형태적 특성을 확인하였다. 스케일 바는 100 nm를 나타낸다.
(d)는 CBPexo의 크기와 파티클 수 분석 결과이다. 엑소좀의 크기는 81 ± 1.4 nm 이고 파티클 수는 1.64Х10 12 ± 2.37Х10 10 particles/mL 이다.
도 2a-c는 차등적으로 발현된 단백질과 관련된 분자적 기능 및 생물학적 과정을 나타내는 도면이다.
(a) 질량 분석법으로 스크리닝된 엑소좀에서 혈장 유래의 엑소좀 및 다양한 면역억제분자의 프로테오믹스 분석 결과이다(ExoCarta 및 Mascot v2.3.01로 질량 분석 데이터 검사).
(b) ExoCarta 데이터베이스와 SBC 분석 시스템을 사용한 인간 CBPexo 및 ABPexo의 다양한 생물학적 기능의 프로테오믹스 분석 결과이다.
(c) ExoCarta 데이터베이스 및 SBC 분석 시스템을 사용하여 스크리닝된 인간 CBPexo 및 ABPexo의 프로테오믹스 분석 결과 및 면역억제분자의 다양한 분자적 기능을 나타낸다. 레드 박스는 기능적 분류 결과로서 CBPexo의 더 높은 연관성을 나타낸다.
도 3a-d는 CD3/CD28 DYNABEAD-자극된 인간 CD4+ 및 CD8+ T 세포에서 CBPexo 매개된 면역억제 메카니즘을 도시한 것이다.
(a) CBPexo가 CD4+ 및 CD8+ T 세포 자극을 억제함을 입증하는 대표 실험 데이터이다. CFSE-표지된 T 세포의 강도는 플로우 사이토메트리에 의해 얻고, ModFit LT 3.0 소프트웨어로 추가 분석한다.
(b) 인간 PBMC를 CBPexo 또는 ABPexo 하에서 CD3/CD28 DYNABEAD를 이용하여 농도 의존적으로 활성화시킨다. 라파마이신 및 시클로스포린은 면역억제제로 잘 알려져 있어 표준 양성 대조군으로 사용한다. CFSE-표지된 T 세포의 강도는 플로우 사이토메트리에 의해 얻고, ModFit LT 3.0 소프트웨어로 추가 분석한다. 모든 실험은 CBPexo의 5종의 상이한 배취를 이용하여 5회 이상 반복한다(혈장 엑소좀의 1 배취=제대혈 10 유닛의 합). 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01. 활성화된 PBMC는 양성 대조군=φ를 나타낸다.
(c) 아넥신 V-FITC 및 7AAD의 대표 실험 데이터는 인간 PBMC가 CBPexo 또는 ABPexo 하에서 CD3/CD28 DYNABEAD로 활성화됨을 도시한다.
(d) CBPexo는 CD3/CD28 DYNABEAD에 의해 활성화된 CD4+T 세포의 세포사멸을 유도한다. CD4+ 및 CD+8 T 세포는 156시간 후에 채취하고 아넥신 V-FITC, 7AAD, 항-CD4-APC 및 항-CD8-V450 항체로 염색한다. CD4상에 게이트된 세포를 도시한다. 분석 데이터는 FlowJo v10을 사용하여 분석한다. 이 실험은 5회 독립적으로 반복한다. 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01.
도 4는 CBPexo에 의해 유도된 CD4+T 세포에서의 G0/G1 세포주기 정지 효과를 나타낸 것이다. 실험은 독립적으로 3번 반복되며, 일원 분산 분석(one-way ANOVA)을 사용하여 그룹 간의 유의성을 계산한다 : * p <0.1 ** p <0.05 *** p <0.01.
도 5a-e는 CBPexo에 의한 Treg 세포의 분화 유도 및 T 세포 억제의 기능적 상향조절에 대한 효과를 나타낸다.
(a) CBPexo 하에서 PBMC의 CD4+CD25+ 및 FOXP3+의 발현을 나타낸 것이다. 이 실험은 3회 독립적으로 반복되며, 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험)는 *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01이다.
(b) 제대혈 CD25+ 세포로부터 조절성 T 세포 확장 또는 분화를 도시한다.
(c) CBPexo가 있거나 없이 사이토카인, aAPC 및 항체 조합에 의해한 동일한 1 유닛 제대혈 CD25+ 세포의 배수 확장을 나타낸다.
(d) 항-CD3/CD28, IL-2 칵테일에 따라 소팅된 제대혈 CD25+ 세포의 확장 및 CBPexo가 있거나 없이 Treg의 분화를 나타낸다. 제대혈 단핵세포(CB-MNC)는 음성 대조군으로 사용한다.
(e) DYNABEAD 자극 후 PBMC에서 CBPexo-유도된 Treg 및 nTreg의 억제 기능의 비교를 나타낸다. 억제 기능은 CFSE 희석에 의해 평가한다. 3회 독립 실험으로부터 얻은 플로우 사이토메트리 데이터는 PBMC에서 CBPexo에 의해 유도된 Treg 및 nTreg에 의해 매개된 T 세포 증식의 비율로서 직선으로 요약된다. 데이터는 평균±표준편차로 나타낸다. 통계적으로 유의한 차이(Two-way ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01(n=4).
도 6a-b는 MDSC 분화 유도에 대한 CBPexo의 효과를 나타낸다.
(a) 비-자극 PBMCs는 CBPexo의 부재(CTRL) 또는 존재 하에서 배양된다. 게이팅 전략 : 단핵구(CD14+)를 선택하기 위해 물리적 매개 변수, 즉 전방 산란(FSC) 및 측방 산란(SSC)을 사용한다. CD11b/CD33의 발현을 평가하여 MDSC를 구분한다.
(b) PBMC 집단에서 CBPexos는 MDSC의 면역 억제 표현형을 촉진하고 아르기나제 1, NOS2 및 IDO의 생성을 자극한다. 아르기나제 1, NOS2 및 IDO의 세포 내 염색 및 CD14+/CD11b/CD33+ 세포의 염색에 대한 대표적인 FACS 히스토그램이 제시되어있다.
도 7a-b는 특정 MMP에 의한 T 세포 면역억제 유도에 대한 CBPexo의 효과를 나타낸다.
(a) 300㎍의 CBPexo 또는 ABPexo 용해물의 MMP 및 TIMP 항체 분석 결과를 나타낸다. 상등하는 도트는 엑소좀 항체 분석 키트를 사용하여 평가한다. 다양한 강도의 신호를 제공하는 MMP 및 TIMP 항체 스팟은 ImageJ 소프트웨어로 계산한다. 이 실험은 3회 독립적으로 반복한다.
(b) MMP 억제를 통한 CBPexo-매개된 억제는 T 세포 증식의 부분적인 회복을 유도한다. T 세포는 CBPexo 하에서 DYNABEAD로 자극되고 나서 156시간째에 CFSE 분석을 통한 비교 전에 GM6001이 처리되거나 그렇지 않는다. CFSE-표지된 세포는 FACSCanto에 의해 얻으며, 세포는 CD4+ 이벤트에서 게이팅된다. 각 제너레이션에서 세포의 비율은 ModFit LT4.0 소프트웨어를 사용하여 계산한다. 이 실험은 6회 독립적으로 반복한다. 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01.
도 8은 MMP 억제제인 GM6001 처리된 CBPexo에 의한 CD4+T 세포에서의 활성화 마커 CD25 및 CD69의 발현 효과를 나타낸 것이다.
도 9a-e는 인간 CBPexo에 의한 T 세포 억제 및 IL-2 하향조절의 마우스 교차-반응성을 나타낸다.
(a) CBPexo의 면역억제효과는 DYNABEAD-자극된 마우스 CD4+T 세포 증식에 의해 시험된다. 이 실험은 5회 독립적으로 반복한다. 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01.
(b) CBPexo의 면역억제효과는 DYNABEAD-자극된 마우스 CD8+T 세포 증식에 의해 시험된다. 이 실험은 5회 독립적으로 반복한다. 통계적으로 유의한 차이(ANOVA 시험): *p <0.1 **p <0.05 ***p <0.01.
(c) IL-2, IFN-γ 및 IL-17 분비 T 세포의 수준을 정량하기 위해 6일째에 ELISPOT 분석을 수행한다. 마우스 비장세포는 CBPexo 또는 ABPexo로 자극하고, IL-2, IFN-γ 및 IL-17 분비 T 세포 패턴을 관찰한다.
(d) CBPexo는 IL-2, IFN-γ 및 IL-6의 생산을 통해 인간 T 세포 증식을 유의적으로 감소시킨다. CBPexo는 인간 T 세포에서 IL-2Rα를 절단할뿐만 아니라 Th17 및 Th1 세포의 분화와 연관된 IL-2, IFN-γ 및 IL-6 분비를 하향조절한다. 이들 데이터는 사이토카인 생산이 CBPexo에 의해 억제되어 T 세포 분화능을 폐지한다. 채취된 배양 상등애게서 156시간째에 사이토카인 수준을 인간 사이토메트릭 비드 어레이를 이용하여 분석한다. 이 실험은 3회 독립적으로 반복한다.
(e) 사이토카인 수준에서의 변화는 마우스 사이토메트릭 비드 어레이를 이용하여 관찰한다. 그 결과, CBPexo는 인간 T 세포에서 IL-2의 분비를 하향조절할뿐만 아니라 마우스에서 IL-2를 감소시킨다. 이 실험은 3회 독립적으로 반복한다.
도 10a-c는 엑소좀 처리된 EAE 마우스에서 Treg 및 IL-2 수준의 변화 패턴을 나타낸다.
(a) EAE 발달은 CBPexo 처리된 EAE 마우스에 감소한다. EAE는 면역화를 위해 MOG/CFA 및 PTx가 함께 처리된 총 15마리의 C57BL/6 마우스에서 유도된다. CBPexo와 ABPexo를 0일 및 7일에 2회씩 EAE 마우스 5마리에 100㎍ 용량(검은색 화살표)으로 정맥주사한다. EAE의 임상 점수는 다음 기준에 따라 30일 동안 관찰되었다. 병에 걸린 쥐의 임상 점수: 0, 질병의 징후 없음; 1, 축쳐진 꼬리; 2, 축쳐진 꼬리 및 부분적인 뒷다리 약함; 3, 완전한 뒷다리 마비; 4, 완전한 뒷다리 및 부분적인 앞다리 마비; 5, 사망. 마우스는 EAE 유도 후 임상 점수를 분석하기 위해 상이한 그룹으로 배당한다: EAE 마우스(n=5) 대 CBPexo 또는 ABPexo 주사된 EAE 마우스(n=5). EAE는 양성 대조군=φ을 나타낸다.
(b) 급성 EAE 동안 전체 비장세포에서 MOG35-55 유도된 사이토카인 리콜 반응의 검출 결과를 나타낸다. C57BL/6 마우스를 CFA에서 MOG33-55로 면역화하고 면역화 22일 후에 시험하였다. 시험한 모든 마우스는 EAE의 임상 증상을 나타낸다. MOG 펩타이드 특이적인 IFN-γ, IL-2 및 IL-17 분비 세포의 빈도를 EAE 대조군, CBPexo 처리 EAE 군 및 ABPexo 처리 EAE군과 비교하기 위해 ELISPOT 분석을 이용하여 측정한다. MOG 펩타이드(25㎍/mL)로 재자극하는 동안 MOG 펩타이드-특이적인 T 세포를 분석한다.
(c) MOG33-55 펩타이드의 존재 또는 부재 하에서 Th1, Th2 및 Th17 특이 사이토카인 게이팅된 CD4+T 세포를 세포내 사이토카인 염색을 이용하여 측정하고 EAE 대조군, CBPexo 주사된 EAE 군 및 ABPexo 주사된 EAE 군과 비교한 결과를 나타낸다(n=4).
도 11은 EAE 모델의 비장세포에서 MOG35-55-유도된 사이토카인 재반응의 검출 결과를 나타낸 것이다.
도 12a-b는 엑소좀 처리 EAE 마우스의 비장(도 12a)과 흉선(도 12b)에서의 Treg 변화 양상을 나타낸다. CD4+T 게이팅된 MOG 펩타이드-특이적 FOXP3+ 세포의 빈도를 세포 내 사이토카인 염색 방법을 이용하여 EAE 대조군, CBPexo-처리 EAE 및 ABPexo-처리 EAE 군을 비교한다.
도 13은 엑소좀으로 치료한 실험적 자가 면역 뇌척수염(EAE) 마우스의 MDSC 집단을 나타낸다. CD11b + Gr1 + 세포 및 CD11b + NOS2 + 게이트 세포의 빈도를 건강한 대조군, EAE 대조군, CBPexo 주사 EAE 및 ABPexo 주사 EAE 군에서의 MDSC 집단의 빈도와 비교하여 결정한다.
도 14는 실험적 자가 면역 뇌척수염(EAE) 마우스의 뇌와 비장으로의 엑소좀의 이동능력을 나타낸다. DAPI로 염색된 조직에 PKH-67 형광염색을 한 엑소좀이 전달되었는지 EAE 대조군, CBPexo-처리 EAE 및 ABPexo-처리 EAE 군에서 비교한다.
도 15는 실험적 자가 면역 뇌척수염(EAE) 마우스의 뇌에서의 CBPexo에 의한 병리학적 치료효과를 EAE 대조군, CBPexo-처리 EAE 및 ABPexo-처리 EAE 군에서 비교한다.
도 16a-b는 CBPexo가 섬유아세포에 의해 내재화되며, 세포 증식을 유도함을 나타내는 도면이다.
(a) 적색 표지된 CBPexo(100 ㎍/mL)는 HSF에서 3-24시간에 걸쳐 유의하게 발현되었다. 적색 표지된 엑소좀은 녹색 표지된 HSF 세포 상에서 보인다.
(b) 적색 표지된 CBPexo는 HSF 상에서 0-24시간에 걸쳐 유의적으로 발현되었다.
도 17a-d는 스크레치 상처 분석에 의해 도시된 바와 같이 CBPexo가 ABPexo와 비교하여 HSF의 운동성을 유의적으로 증가시킴을 나타내는 도면이다.
(a) CBPexo 또는 ABPeox의 유무에 따른 상처 봉합 시 HSF 영역을 나타낸다. 이 측정은 0-24시간에 걸쳐 시행되었다. 큰 영역의 섬유아세포는 CBPex가 첨가된 경우 24시간째에 완전히 봉합되었다. 이때, CBPexo 및 ABPexo의 농도는 100 ㎍/mL이었다.
(b) 스크레치 상처 분석 결과를 이용한 CBPexo 및 ABPexo의 통계 분석을 나타낸다. 이 분석은 CBPexo가 ABPexo보다 훨씬 더 높은 상처치료 효과를 나타냄을 보여준다.
(c) CFSE-표지된 섬유아세포의 플로우 사이토메트리이다. 24시간 동안 MMC, PBS, ABPexo 및 CBPexo의 다양한 조합이 처리된 섬유아세포의 증식율은 ModFitLT 4.1 소프트웨어를 이용하여 측정되었다.
(d) 세포사멸은 아넥신 V/프로피디움 아이오다이드 이중 염색으로 평가되었다. 세포를 24시간 동안 MMC, PBS, ABPexo 및 CBPexo의 다양한 조건에 노출시켰다. 세포사멸율은 플로우 사이토메트리를 통해 측정되었다. 총 기록된 세포사멸 세포의 통계 분석이 수행되었고, 결과는 막대 그래프로 도시된다.
도 18a-b는 CBPexo에 의한 M2 Mφ의 향상된 내피세포 맥관 형성 및 분극화를 나타내는 도면이다.
(a) 20 ㎍/mL의 CBPexo가 있거나 없는(대조군) HUVEC 상등액을 이용하여 24시간 후에 얻은 마트리젤에서 인 비트로 HUVEC 맥관 형성의 대표 사진도이다(10배 확대). 음성 대조군은 배지 또는 ABPexo 단독에서 얻었다.
(b) CBPexo 처리 24시간 및 72시간 후 제대혈 단핵세포를 이용한 콜로니-형성 단위(CFU) 분석 결과이다. 막대는 2개의 도너 샘플에서 CFU 수±SD를 나타낸다. 이들 값은 3회 실험 진행 후 얻었다. 콜로니는 광학 현미경을 이용하여 CFU-erythroid(CFU-E), burst-forming unit-erythroid(BFU-E), CFU-GM, CFUgranulocyte(CFU-G), CFU-M 및 CFU-GEMM로 분화되었다. 통계적 의의는 *p < 0.05, **p < 0.01, ***p < 0.001 및 ****p < 0.0001에서 확립되었다.
(c) M1 및 M2 분극 마커에서 CBPexo의 효과를 나타낸다. M1- 및 M2-분극화된 대식세포는 CBPexo의 유무에 따라 IL-4로 자극된 GM-CSF 처리된 프라이머리 단핵구로부터 생성되었다. 표면 마커 및 사이토카인 발현: CD80, CD86, CD206, IL-12 및 IL-10 표면 수준은 플로우 사이토메트리를 이용하여 비교되었다. 산점도는 평균값을 나타내는 수평선과 함께 3개의 상이한 도너(도트)로부터 양성 세포의 비율을 나타낸다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
도 19a-h는 CBPexo 모방체 및 이의 면역억제효과를 나타내는 도면이다.
(a) 멀티플렉스 CRISPR/Cas9 시스템을 이용한 HLA 클래스 I/MIC null HEK 293T(H1ME-5) 세포주의 확립을 나타낸다. H1ME-5 세포는 MICA/B 및 HLA 클래스 I의 발현을 나타내지 않는다.
(b) H1ME-5에서 방출된 엑소좀의 크기 분포를 나타낸다. CBPexo는 145.61 ± 75.89 nm의 크기를 갖는다.
(c) H1ME-5 세포주를 확립하여 상처치료 효과가 없는 엑소좀을 생성하였다. 0-24h에 걸쳐 CBPexo 및 H1ME-5-exo의 존재에서 HSF의 상처 봉합 영역을 측정하였다. CBPexo 및 H1ME-5-exo의 처리 농도는 100 ㎍/mL에서 유지되었다.
(d) 스크레치 상처 분석 결과의 통계 분석을 나타낸다.
(e) H1ME-5 세포에 형질도입된 CBPexo에 포함된 GAL-3, MMP-8, MMP-9, PIP, S100A7, GAL-7 및 HSP72의 발현을 나타낸다. 형질도입 후 6일째에, 각 분자에 대해 양성인 세포를 MoFlo XDP Cell Sorter를 사용하여 소팅한다.
(f) GAL-3, MMP-8, MMP-9, PIP, S100A7, GAL-7 및 HSP72 항체로 코팅된 라텍스 비드에 결합된 CBPexo 또는 CBPexo 모방체를 플로우 사이토메트리에 의해 분석한다. 상응하는 비드 단독 대조군과 GAL-3, MMP-8, MMP-9, PIP, S100A7, GAL-7 및 HSP72 항체에서 유래한 강도를 비교한다.
(g) CBPexo 및 MMP-9이 강화된 CBPexo 모방체가 T 세포 자극을 억제함을 입증하는 대표 실험 데이터를 나타낸다. CFSE-표지된 T 세포의 강도는 플로우 사이토메트리에 의해 얻고, ModFit LT4.0 소프트웨어를 사용하여 추가로 분석한다. CBPexo, CBPexo 모방체 및 H1ME-5 엑소좀의 농도는 10㎍/well이다.
(h) CBPexo, CBPexo 모방체 및 H1ME-5 엑소좀의 통계치는 CFSE 증식 분석에서 얻은 결과를 이용하여 분석된다.
도 20a-b는 인공 엑소좀이 선택된 타겟 분자들을 발현하여 상처치료를 촉진함을 나타내는 도면이다.
(a) 상처치료 효과는 CBPeox가 첨가되는 경우 증가하였다. CBPexo에서 중요한 역할을 담당하는 GAL-3, GAL-7, PIP, HSP72 및 S100-A7를 발현하는 엑소좀은 섬유아세포의 조절을 유도하였다. HSP72- 또는 PIP-발현된 엑소좀은 GAL-3, GAL-7 및 S100-A7에 의해 발현된 것들과는 달리 상처치료 효과를 나타낸다. 스크래치 상처 분석은 3회 수행되었고, 통계 분석은 GraphPad 7.0 소프트웨어를 사용하여 수행되었다.
(b) HSP72, PIP, GAL-3, GAL-7, 및 S100-A7에서 발현된 엑소좀은 섬유아세포 증식을 향상시켰다. 이들 중 PIP-exo는 최대 섬유아세포 증식을 나타냈다.
도 21a-d는 HSP72 및 PIP에서 발현된 인공 엑소좀이 농도의존적 상처치료 및 두 단백질이 HSP72/PIP-exo에 의해 M2 Mφ인 경우 더 높은 상처치료 효과를 나타냄을 도시하는 도면이다.
(a) 형질도입 후 6일에, PIP 및 HSP72를 동시에 발현하는 세포를 MoFlo XDP cell sorter를 이용하여 소팅하고, 단일 세포로 배양하여 PIP 및 HSP72를 갖는 클론을 얻었다.
(b) HSP72- 및 PIP-발현된 엑소좀은 농도 의존적 방식으로 상처치료 효과를 나타냈다. 함께 사용되는 경우 HSP72 및 PIP-exo는 CBPexo와 유사한 상처치료 효과를 나타냈다. HSP72 및 PIP를 동시에 발현하는 엑소좀은 HSP72- 및 PIP-exo를 함께 사용하는 경우와 유사한 상처치료 효과를 나타낸다.
(c) HSP72 및 PIP를 발현하는 엑소좀의 조합은 CBPexo와 유사한 상처치료 효과를 나타낸다. HSP72 및 PIP를 발현하는 엑소좀의 조합은 HSP72 및 PIP를 각각 사용하는 경우보다 더 유의한 효과를 보여주었다. CFSE 증식 분석의 통계 분석(ANOVA test): *p < 0.1, **p < 0.05, ***p < 0.01 및 ****p < 0.001.
(d) CFSE-표지된 섬유아세포의 플로우 사이토메트리. 24시간 동안 CBPexo 및 인공 엑소좀이 처리된 섬유아세포의 증식율은 ModFitLT 4.1 소프트웨어를 이용하여 측정되었다.
도 22a-b는 HSP72/PIP-exo에 의한 증강된 내피세포 맥관 형성 및 M2 Mφ의 분극화를 나타내는 도면이다.
(a) 20 ㎍/mL의 CBPexo가 있거나 없는(대조군) HUVEC 상등액을 이용하여 24시간 이후에 얻은 마트리젤에서 인 비트로 HUVEC 맥관 형성의 대표 사진도이다(10배 확대). 음성 대조군은 배지 또는 ABPexo 만 포함한다.
(b) M1 및 M2 분극화 마커에 대한 CBPexo의 효과. M1 및 M2 분극화된 대식세포는 CBPexo가 있거나 없이 IL-4로 자극된 GM-CSF 처리된 프라이머리 단핵세포로부터 생성되었다. 표면 마커 및 사이토카인 발현. CD80, CD86 및 IL-10 발현의 플로우 사이토메트리 분석. 산점도는 각 그룹에 대한 평균값을 나타내는 수평선과 함께 3개의 상이한 도너(도트)로부터 양성 세포의 비율을 나타낸다. *p < 0.05; **p < 0.01; ***p < 0.001.
이하, 본 발명의 구성을 구체적으로 설명한다.
본 발명은 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 면역억제 또는 상처치료용 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한 유효량의 상기 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역억제 또는 상처치료 방법을 제공한다.
본 발명의 제대혈 혈장 유래의 엑소좀(CBPexo)은 성인 혈장 유래의 엑소좀(ABPexo)에 비해 면역억제-관련 단백질을 더 많이 포함하는데, CBPexo에서 인자들에 의한 T 세포 증식 억제는 세포사멸 및 세포주기 어레스트에서 기인한다. 또한, CBPexo 처리 시 CD4+CD25+FOXP3+ Treg 세포 집단이 증가하며 다클론성 확장된 Treg의 기능을 상향조절한다. CBPexo는 mTOR 신호전달의 다운스트림을 억제하는 CD25를 절단하여 세포주기를 어레스트시키는 것으로 추측된다. 실제로, CBPexo 처리된 활성화 T 세포에서 IL-2의 분비 및 IL-2Rα의 표면 발현은 CD4+T 세포에서 유의적으로 감소되었다. CBPexo에 의한 IL-2 신호전달의 차단은 CD4+ 및 CD8+T 세포의 증식 억제에 중추적인 역할을 담당한다. IL-2 신호전달 경로의 차단은 면역시스템의 억제를 유도하고, 치료 효과를 나타낸다. IL-2/IL-2R 상호작용은 세포내 Ras/Raf/MARP, JAK/STAT 및 PI3K/AKT 신호전달 경로를 활성화시켜 T 세포의 성장, 분화 및 생존을 촉진한다.
또한, CBPexo의 MMP-9는 암세포와 만날 때 T 세포에서 발현되는 CD25의 절단에 관여하고, MMP-8 역시 세포외 도메인의 붕괴를 유도하여 면역 반응과 연관된 표면 분자의 절단을 초래하여 면역조절 효과를 나타낸다. IL-2Rα의 절단은 MMP-9에 의존한다.
인간 CBPexo를 마우스 모델에 적용한 경우, 인 비트로에서 마우스 T 세포에서 면역억제효과가 관찰되어 인간 CBPexo의 마우스 교차-반응성을 확인할 수 있다.
또한, EAE 마우스 모델은 질환 발달 시 Th 세포의 역할을 조사하는데 포괄적으로 이용된다. 예를 들어, 마이엘린 특이적인 CD4+Th1 세포를 미성숙 수혜자 마우스에 이식하면 EAE의 유도가 촉진됨을 보여준다. 유사하게, Th17 세포로 알려진 IL-17 분비 T 세포 역시 EAE 발달에 추진력이 된다고 보고된바 있다. 또한, EAE는 Treg의 빈도를 낮추고 그들의 억제 기능을 손상시켜 질병의 개시를 촉진한다. 본 발명의 CBPexo는 인 비보에서 Treg 분화를 증가시키고 Th1 및 Th17 분화를 감소시켜 EAE 발달 과정을 바꾸고 항원 특이적인 CD4+T 세포의 분화를 조절할 수 있다.
상술한 바와 같이, 본 발명의 엑소좀은 1) 엑소좀에서 발현되는 MMP-9이 활성화 T 세포 표면의 IL-2 수용체 α(CD25)를 분해하여 IL-2 생산을 감소시킴으로써 T 세포 증식을 억제하고, 2) 조절성 T 세포(Treg 세포) 및 단핵구-유래 억제 세포(MDSC) 분화를 유도하며, 및 3) Th1 및 Th17 세포의 분화를 억제하는 특징을 가진다.
뿐만 아니라, 상처치료는 섬유아세포 증식, 콜라겐 합성, 침착, 혈관형성, 분화 및 면역억제세포의 이동 등의 몇 가지 단계가 요구된다. 본 발명의 엑소좀은 인 비트로에서 섬유아세포는 연조직 상처치료를 담당하는 주요 효과기 세포인 인간 섬유아세포와 함께 인큐베이션할 경우 인간 섬유아세포로 이동하여 섬유아세포 내로 내재화됨으로써 섬유아세포의 증식을 촉진할 수 있다. 이러한 효과는 성인 인간 혈장 유래의 엑소좀에 비해 유의적으로 증가한다. 본 발명의 엑소좀의 효과는 상처치료 동안에도 유사하게 나타난다. 증식기로 알려진 2차 상처치료 동안, 대안으로 활성화된 M2 Mφ이 섬유아세포의 증식 및 이동 및 혈관형성에 관여함으로써 염증을 줄이고 상처를 복구할 수 있다. 본 발명의 엑소좀 역시 대식세포 증식을 촉진하고 전염증성 M1 표현형을 항-염증성 M2 표현형으로의 분화를 유도한다. 인 비트로에서 본 발명의 엑소좀과 활성화된 M1 Mφ, CD80 및 CD86을 인큐베이션하는 경우, IL-12의 발현은 하향조절되고, CD163, CD206, 및 IL-10 발현은 상향조절되어 활성화된 M1 Mφ이 CBPexo-유도된 표현형 전환을 통해 M2 Mφ로 성공적으로 분극화됨을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 엑소좀은 상처치료에 유효성분으로 사용할 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "제대혈 혈장 유래의 엑소좀 (exosome)" 또는 "CBPexo"은 제대혈 혈장에서 유래된 세포막 입자이다. 상기 엑소좀(exosome)은 당업계에서, 미세소포체, 순환 미세소포체 또는 미세소낭과 동일한 의미를 갖으며, 세포로부터 탈락된 50 ㎚ 내지 100 ㎚의 원형질막을 갖는 프래그먼트를 말한다. 미세소포체는 세포 간의 mRNA, miRNA 및 단백질을 운송을 매개하고 세포 내의 상호 작용에 중요한 역할을 한다. 미세소포체는 유래한 세포, 세포의 수, 세포의 크기 및 항원의 구성에 따라 비균질한 집단을 나타낸다. 바람직하게는, 본 발명의 엑소좀은 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 것을 특징으로 한다.
본 명세서에서 "유효성분"이란 단독으로 목적하는 활성을 나타내거나 또는 그 자체는 활성이 없는 담체와 함께 활성을 나타낼 수 있는 성분을 의미한다.
또한, 본 명세서에서, "면역억제"란 과면역 반응 또는 비정상적 면역 반응으로 인한 면역질환의 개선(증상의 경감), 치료, 그러한 질환의 예방, 발병 억제 또는 지연을 포함하는 의미이다. 상기 "면역질환"이란 이식편대숙주질환, 자가면역질환(류마티스 관절염 등), 과증식성 피부질환(아토피성 피부염, 접촉성 피부염 등), 만성 폐색성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 알레르기성 천식, 기관지염(bronchitis), 알레르기성 비염, 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis)을 포함하는 의미이나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 상처치료는 상처치료(wound healing), 아토피(Atopic dermatitis), 전신피부경화증(Systemic sclerosis) 또는 심근경색(Myocardiac infarction) 등의 개선 또는 치료를 포함할 수 있다. 상기 심근경색은 심장 혈관에 상처가 생기고, 상처를 입은 혈관부위에 노폐물이 축적되며, 이로 인해 발생하는 혈액순환장애로부터 발생하는 질환으로 본 발명의 엑소좀은 상처치료를 통해 심근경색을 치료할 수 있다.
본 발명의 면역억제 또는 상처치료 방법에 있어서, 상기 대상체는 개, 고양이, 랫트, 마우스, 인간 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.
본 발명은 또한 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 Th1 및 Th17 세포의 분화 억제용 배지 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀과 나이브 CD4+T 세포를 인 비트로 배양하는 단계를 포함하는 인 비트로에서 Th1 및 Th17 세포의 분화 억제 방법을 제공한다.
본 명세서에서 "배지"는 인 비트로에서 나이브 CD4+T 세포의 Th1 및 Th17 세포로의 분화를 억제할 수 있는 배지를 의미하고, 세포 배양에 적절한 당 분야에서 사용되는 통상의 배지를 모두 포함한다. 세포의 종류에 따라 배지와 배양 조건을 선택할 수 있다. 배양에 사용되는 배지는 일반적으로 탄소원, 질소원 및 미량원소 성분을 포함한다. 이런 세포 배양 배지에는 예들 들어, DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium), MEM(Minimal essential Medium), BME(Basal Medium Eagle), RPMI1640, F-10, F-12, αMEM(α Minimal essential Medium), GMEM(Glasgow's Minimal essential Medium), Iscove's Modified Dulbecco's Medium 등이 있으나, 이로 제한되지 않는다.
또한, 상기 배지는 페니실린(penicillin), 스트렙토마이신(streptomycin), 겐타마이신(gentamicin) 등의 항생제를 포함할 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 단독으로 또는 다른 물질들과 조합하여 Th1 및 Th17 세포의 배양 및 분화 억제를 위한 미세환경 조성에 이용될 수 있다.
본 발명의 배지 조성물은 상기 다른 물질로서 분화 억제 물질을 추가적으로 첨가할 수 있으며, 상기 분화 억제 물질은 당업계에 공지된 어떠한 분화 억제 물질도 이용될 수 있으며, 분화를 억제하고자 하는 Th1 및 Th17 세포의 상태에 따라 다양하게 단독 또는 조합하여 첨가될 수 있다.
배양 조건은 CO 2 배양기에서, 5 내지 15%의 이산화탄소의 통기량으로 35 내지 37℃에서 수행할 수 있으나, 이에 특별히 제한하는 것은 아니다.
본 발명의 조성물은 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)를 과발현하는 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 포함하므로, 이와 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명은 또한 HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주에서 유래하고, 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군에서 선택된 하나 이상을 발현하는 제대혈 혈장 엑소좀 모방체에 관한 것이다.
본 발명자들은 CBPexo의 프로테오믹스 프로파일에서 약학적 용도, 예컨대, 면역억제, 상처치료 등과 연관된 GAL-3, MMP-9, HSP72, PIP, S100A7, GAL-7, LAMP1, SERPINB12, LTF, ORM1, CD5L, C4B, MASP1, PSMA6, PRDX1, DEFA3, CD44 antigen, ARG1 등이 포함되어 있음을 확인하였다. 그러나, 제대혈 혈장으로부터 충분한 엑소좀을 분리하기 어려우므로 면역억제효과가 없으면서 상처치료 능력을 갖는 않는 H1ME-5(HLA 클래스 I 및 MIC 편집 클론-5 세포주) 세포주에 면역억제, 상처치료와 연관된 단백질을 코딩하는 핵산을 단독 또는 2종 이상 도입하고, 이로부터 엑소좀을 분리 정제하였다. 본 발명의 일 구체예에 따르면, 그러한 단백질로 GAL-3, GAL-7, PIP, HSP72 및 S100-A7를 선정하여 엑소좀 모방체, 예컨대, GAL-3 exo, GAL-7 exo, PIP exo, HSP72 exo, S100-A7 exo, HSP72 & PIP dual exo를 분리 정제하였다.
따라서, 본 명세서에서, 용어 "제대혈 혈장 엑소좀 모방체"는 제대혈 혈장에서 분리한 엑소좀의 프로테오믹스 프로파일을 모방하는 엑소좀을 지칭하며, 특히 특정한 목적으로 상기 엑소좀에서 과발현되는 단독 또는 복수의 단백질을 유전자 재조합 기술을 이용하여 과발현되도록 제조된 면역억제효과 및 상처치료 효과가 없는 세포주 유래의 엑소좀을 지칭한다. 따라서, 상기 제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 엑소좀 단백질을 코딩하는 핵산을 면역억제효과 및 상처치료 효과가 없는 세포주에 도입하여 이로부터 분리하여 제조될 수 있다. 상기 핵산은 가장 광의적인 의미로 사용되며, 단일가닥(ss) DNA, 이중가닥(ds) DNA, cDNA, (-)-RNA, (+)-RNA, dsRNA 등을 포괄한다.
상기 엑소좀 모방체의 크기는 60 nm 내지 250 nm, 또는 70 nm 내지 230 nm의 직경을 가질 수 있다.
상기 면역억제효과가 없는 세포주로 HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주를 사용한다. 예컨대, CRISPR-Cas9 시스템을 이용하여 HLAA-A, HLA-B, HLA-C 및 MICA/B 각각의 엑손 2와 3 사이를 결실시켜 HLAA-A, HLA-B, HLA-C 및 MICA/B 유전자가 유전체 상에서 완전히 제거된 HLA 및 MICA/B 결핍 293T 세포주인 H1ME-5(기탁번호: KCTC 13602BP)를 사용할 수 있다.
상기 H1ME-5 세포주에 GAL-3, MMP-9, HSP72, PIP, S100A7, GAL-7, LAMP1, SERPINB12, LTF, ORM1, CD5L, C4B, MASP1, PSMA6, PRDX1, DEFA3, CD44 antigen 및 ARG1 유전자를 발현하는 벡터로 트랜스펙션시키고, GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 및 PIP 유전자를 단독 또는 2종 이상 발현하는 H1ME-5 세포주를 선별한 후 엑소좀(CBPexo 모방체)을 분리한다.
따라서, 바람직하게는, 본 발명의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 LAMP1, SERPINB12, LTF, ORM1, CD5L, C4B, MASP1, PSMA6, PRDX1, DEFA3, CD44 antigen 및 ARG1를 발현하는 것일 수 있다.
또는, 본 발명의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 HSP72 및 PIP를 단독 또는 둘 다 발현하는 것일 수 있다.
상기 트랜스펙션은 미세주입법(microinjection), 전기천공법(electroporation), DEAE-덱스트란 처리(DEAE-dextran treatment), 리포펙션(lipofection), 나노파티클-매개 형질주입, 단백질 전달 도메인 매개 도입, 바이러스-매개 유전자 전달, 및 원생동물에서 PEG-매개 트랜스펙션 등과 같은 당업계의 다양한 방법에 의해 세포로 전달될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 명세서에서, 용어 "벡터"는 자신에게 연결된 다른 핵산을 운반할 수 있는 핵산 분자를 말한다. 벡터의 한 유형으로 "플라스미드"가 있는데, 플라스미드란 추가의 DNA 분절을 결찰시킬 수 있는 원형의 이중 가닥 DNA 루프를 말한다. 벡터의 또 다른 유형으로는 추가적인 DNA 분절을 바이러스 게놈으로 결찰시킬 수 있는 바이러스 벡터가 있다. 일부 벡터는 숙주세포로 도입될 때 이 숙주세포 내에서 자가 복제할 수 있다(예를 들어, 박테리아 복제 기점을 갖는 박테리아 벡터 및 에피솜 포유동물 벡터). 다른 벡터(예를 들어, 비에피솜 포유동물 벡터)는 숙주세포로 도입될 때 숙주세포의 게놈으로 통합되어, 숙주 게놈과 함께 복제될 수 있다. 또한, 일부 벡터는 이들이 작동 가능하게 연결되어 있는 유전자의 발현을 지시할 수 있다. 본 명세서에서 이러한 벡터를 "재조합 발현 벡터"(또는 간단히, "발현 벡터")라 한다. 일반적으로, 재조합 DNA IVT mRNA 기법에 유용한 발현 벡터는 대개 플라스미드의 형태로 플라스미드가 가장 일반적으로 사용되는 벡터 유형이기 때문에, "플라스미드"와 "벡터"는 서로 교환하여 사용될 수 있다. 그러나 본 발명은 동등한 기능을 제공하는 바이러스 벡터(예를 들어, 아데노바이러스 벡터, 아데노-관련 바이러스(AAV) 벡터, 헤르페스 바이러스 벡터, 레트로바이러스 벡터, 렌티바이러스 벡터, 바큘로바이러스 벡터)와 IVT mRNA와 같은 다른 형태의 발현 벡터도 포함한다. 바람직하게는, 렌티바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 형질전환은 핵산을 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주세포에 따라 적합한 상술한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다.
본 발명은 또한 상기의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 포함하는 면역억제 또는 상처치료용 조성물에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 유효량의 상기 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역억제 또는 상처치료 방법을 제공한다.
본 발명의 일 구체예에 따르면, CBPexo 모방체 중 MMP-9이 강화된 엑소좀이 T 세포 면역억제를 위한 전도유망한 치료 분자임을 나타낸다. 이들 결과는 MMP에 의한 CD25의 절단, IL-2 생산 억제, 사이토카인 분비 패턴에서의 변화, Treg 세포의 증식과 같은 몇몇 복합 효과들이 T 세포 분화 및 증식과 동시에 연관됨을 나타낸다. 또한, HSP72를 발현하는 엑소좀은 T 세포 증식을 억제하고, HSP72는 MMP-9를 상향조절하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 본 발명의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 면역억제용 조성물의 유효성분으로 사용될 수 있다.
또한, 본 발명의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 섬유아세포의 이동을 유의적으로 개선하며, HSP72 및 PIP를 동시에 발현하는 엑소좀(HSP72 & PIP dual exo) 모방체의 상처치료 효과는 PIP exo 및 HSP72 exo 단독보다 농도 의존적으로 더 높았으며, PIP exo 및 HSP72 exo를 동시에 첨가하는 것보다 더 좋았다. 또한, HSP72 & PIP dual exo는 PIP exo 및 HSP72 exo 단독보다 혈관형성이 더 우수하였고, M1 Mφ의 M2 Mφ로의 분화를 촉진함으로써 상처치료 및 회복을 개선할 수 있다. 따라서, 바람직하게는, 상기 제대혈 혈장 유래 엑소좀을 모방하는 HSP72 및 PIP를 동시에 발현하는 엑소좀 모방체는 상처치료를 위한 유효성분으로 사용할 수 있다.
상기 면역억제는 상술한 면역질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 것으로, 면역질환과 관련된 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
상기 상처치료는 상술한 상처치료 관련 질환의 개선 또는 치료를 위한 것으로, 상처치료 관련 질환에 대한 중복된 내용은 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.
본 발명의 면역억제 또는 상처치료 방법에 있어서, 상기 대상체는 개, 고양이, 랫트, 마우스, 인간 등의 포유동물일 수 있으나, 이에 제한하지는 않는다.
한편, 본 발명의 면역억제 또는 상처치료용 조성물은 인 비트로, 인 비보 또는 엑스 비보에서 진단적 또는 치료적 용도에 적합한 조성물을 이루는 활성성분 및 활성 또는 무활성 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있다.
상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충화된 염수 용액, 인간 혈청 알부민(HSA) 등의 혈청 알부민, 재조합 인간 알부민(rHA), 젤라틴, 카세인 등을 포함하는 단백질 부형제와 같이, 엑소좀 모방체와 혼용가능한 임의의 약학적 담체를 포함한다. 담체, 안정화제 및 보강제의 예는, Martin REMINGTON'S PHARM. SCI, 18 th Ed.(Mack Publ. Co., Easton (1995)) 및 the "PHYSICIAN'S DESK REFERENCE", 58nd Ed., Medical Economics, Montvale, NJ. (2004)를 참조한다. 용어 "담체"는 완충액 또는 pH 조정제를 포함할 수 있으며, 전형적으로 완충액은 유기산 또는 염기로부터 제조된 염이다. 대표적인 완충액으로는 시트르산의 염, 아스코르브산의 염, 글루콘산의 염, 카본산의 염, 타르타르산의 염, 숙신산의 염, 아세트산의 염 또는 프탈산의 염 등의 유기산 염; 트리스, 트로메타민 하이드로클로라이드 또는 포스페이트 완충액을 포함한다. 추가적인 담체로, 폴리비닐피롤리돈, 피콜(폴리머 당), 덱스트레이트(예, 사이클로덱스트린, 예컨대 2-하이드록시프로필-쿼드러셔(quadrature), -사이클로덱스트린), 폴리에틸렌 글리콜, 항산화제, 항-대전제, 계면활성제(예, "TWEEN 20" 및 "TWEEN 80" 등의 폴리소르베이트), 지질(예, 인지질, 지방산), 스테로이드(예, 콜레스테롤) 및 킬레이트제(예, EDTA) 등의 폴리머성 부형제/첨가제를 포함한다. 빙결 방지제 또는 강하제도 포함될 수 있다.
본 발명의 면역억제 또는 상처치료용 조성물은 다양한 적정 제형으로 제조될 수 있다. 예를 들면, 종양내, 동맥내(관절에서), 정맥내, 근육내, 피내, 복강내, 결절내(intranodal) 및 피하 경로와 같은 비경구 투여에 적합한 제형과 담체는 항산화제, 완충액, 정균제, 및 제형을 목적하는 수용자의 혈액과 등장으로 만들어 줄 용질, 및 현탁제, 용해제, 증점제, 안정화제, 및 방부제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성의 멸균 현탁액을 포함한다. 정맥내 또는 복강 투여가 바람직한 방법이다. 개체에게 투여된 세포의 투여량은 시간의 경과에 따라 개체에서 목적하는 유익한 치료적 반응을 달성하기에 유효한 양, 또는 세포의 성장 억제에 유효한 양 또는 감염의 억제에 유효한 양이다. 예컨대, 주입 전에 개체로부터 혈액시료를 수득한 후 보관하여 후속적인 분석 및 비교에 사용하는 방식으로 실시될 수 있다. 일반적으로, 적어도 약 10 4 내지 10 6 및 전형적으로 1×10 8 내지 1×10 10개의 세포를 70 kg의 환자에게 대략 60분 내지 120분에 걸쳐 정맥내 또는 복강내로 주입할 수 있다. 투여의 경우, 개체의 전반적 건강상태 및 체중을 고려하면서, 본 발명의 엑소좀을 세포의 유형에 따른 LD-50(또는 기타 독성 측정 방법) 및 다양한 농도에서의 세포의 유형에 따른 부작용에 의해 결정된 비율로 투여한다. 투여는 한번에 또는 여러 회 나누어 투여할 수 있다. 본 발명의 엑소좀은 세포독성제, 뉴클레오타이드 유사체 및 생물학적 반응 변형제를 포함하는 공지된 통상의 치료법을 사용하여 다른 특정 증상에 대한 치료를 보충할 수 있다. 유사하게, 생물학적 반응 변형제는 본 발명의 엑소좀에 의한 치료에 선택적으로 추가될 수 있다.
이하, 본 발명에 따르는 실시예 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하나, 본 발명의 범위가 하기 제시된 실시예에 의해 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 제대혈 혈장 유래 엑소좀의 제조 및 특성 규명
1. 샘플 제조
인간 말초혈액단핵구와 인간 제대혈(UCB)은 건강한 기증자 또는 정상적인 만삭의 임산부에게서 서면 동의서를 받은 후 카톨릭 조혈줄기세포은행(Catholic Hematopoietic Stem Cell Bank)에서 제공받았다. 모든 인간 피험자에 관한 실험은 헬싱키 선언의 권고에 따라 수행하였다. 프로토콜은 가톨릭대학교의 동물실험윤리위원회(IACUC)에 의해 승인되었다. 모든 피험자는 헬싱키 선언에 따라 샘플 기증에 대한 서면 동의를 받았다.
2. 마우스
OrientBio, Inc.(Seoul, Korea)에서 C57BL/6 마우스를 구입하여 한국 가톨릭대학교 실험 동물 자원 연구소의 지침에 따라 특정 병원균이 없는 상태로 유지하였다. 모든 동물 실험은 한국 가톨릭대학교의 동물 실험 및 사용 위원회(Institutional Animal Care and Use Committee)의 승인을 받았다. 모든 동물 실험은 한국 카톨릭대학교 의과 대학 기관 동물 관리 및 이용 위원회(허가 번호 CUMC-2017-0273-05)가 사전에 승인한 연구자의 프로토콜에 따라 수행되었다.
3. 엑소좀 분리
인간 제대혈 혈장을 순차적으로 400g에서 5분간, 2,000g에서 10분간 원심분리하여 세포 및 세포 찌꺼기를 제거하였다. 그런 다음 제대혈 혈장을 0.45-㎛ 폴리비닐리덴 플루오라이드(PVDF) 멤브레인(Nalgene™ Rochester, NY)으로 여과하였다. 단백질 용출은 나노드롭 분광기(Thermo Scientific, San Diego, CA)을 사용하여 280nm에서 각 분획의 흡광도를 판독하여 검사하였다. CBP를 100,000g에서 2시간 동안 초원심분리하고, 제대혈 혈장 펠렛을 비교 실험에 사용하였다. 대조군으로 성인 혈액의 혈장을 분리하고 동일한 엑소좀 분리 절차를 따랐다. 모든 분획물은 4℃에서 보관하고 인 비트로 실험을 위해 24시간 이내에 사용하거나 -80℃에서 동결시켰다. CBPexos는 배치(batch) 당 총 10명의 건강한 기증자로부터 CBP 샘플을 지속적으로 수집하여 얻었다. Exo-Check Exosome Antibody Array(System Biosciences, Palo Alto, CA) 또는 PE-컨쥬게이트 된 항-인간 CD9(e-Bioscience, San Diego, CA), 항-인간 CD63(BD Biosciences, San Jowe, CA), 또는 항-인간 CD82(Biolegend, San Diego, CA), 또는 항-인간 HSP70/HSP72(Enzo Life Sciences, Farmingdale, NY) FACS 항체를 이용하여 가 배치에 대해 엑소좀의 특성 분석을 수행하였다. 배치 간 엑소좀의 특성 차이는 없었다.
4. 인간 제대혈 Treg 확장
Tregs는 항-CD25가 직접적으로 컨쥬게이트 된 자성 마이크로비드 및 매뉴얼 컬럼(Miltenyi, Bergisch-Gladbach, Germany)을 이용하여 포지티브 선별을 통해 1 UCB 유닛(The Catholic Hematopoietic Stem Cell Bank)으로부터 정제되었다. CD25+ 세포를 CD80, CD83, 4-1BBL 및 CD32를 발현하는 렌티바이러스-형질도입된 K562 세포주(aAPC)와 2:1의 비율로 배양하였다. aAPC에 10000cGY를 조사하고, 0.5㎍/mL의 항-CD3(OKT3) 및 항-CD28(CD28.2; 둘 다 BD Pharmingen, San Diego, CA)과 인큐베이션 하였다. 재조합 IL-2(300 IU/mL; Chiron, Emeryville, CA)를 3일 마다 첨가하고 배양 기간 동안 유지하였다. 세포를 14일 동안 배양하고 3-4일마다 나누었다.
5. LC-MS/MS 분석
분해된 샘플 절반에 대해 ThermoFisher Q Exactive HF 질량 분석기에 연결된 Waters NanoAcquity HPLC 시스템을 사용하여 나노 LC-MS/MS를 통해 분석하였다. 트랩핑 컬럼에 펩타이드를 로딩하고, 75㎛ 분석 컬럼에서 2-h 역상 구배를 이용하여 350nL/min로 용출하였다: 두 컬럼은 Luna C18 resin(Phenomenex)으로 패킹되었다. 질량 분석기는 MS 및 MS/MS 각각에 대해 60,000 FWHM 및 17,500 FWHM에서 작동하는 Orbitrap을 사용하여 데이터-의존 방식으로 작동되었다. MS/MS을 위해 15종의 가장 풍부한 이온들을 선별하였다. Mascot DAT 파일은 Scaffold(Proteome Software)로 분석되어 샘플당 미상 리스트를 검증, 필터링 및 생성하였다. 데이터는 1% 단백질 및 펩타이드 FDR에서 필터링되었으며, 단백질당 적어도 2개의 특정 단백질이 필요하였다.
6. CBPexo 모방체 제조
H1ME-5 세포(Null-293T(H1ME-5, 기탁번호: KCTC 13602BP)를 10% 소 태아 혈청(FBS), 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 DMEM 배지(Lonza)에서 배양하였다. T2 세포를 10% FBS, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린-스트렙토마이신이 보충된 RPMI-1640 배지(Lonza)에서 배양하였다.
H1ME-5 세포를 항생제가 없는 DMEM(Lonza)에서 2×10 6 cells/10 mL로 씨딩하였다. 24시간 후, 4개의 타겟 GAL-3(SEQ ID NO: 5), MMP-9(SEQ ID NO: 1), HSP72(SEQ ID NO: 4) S100A7(SEQ ID NO: 6), GAL-7(SEQ ID NO: 2), 및 PIP(SEQ ID NO: 3)(NCBI reference sequence; pCDH 벡터를 이용하여 자체 제작) 각각에 대해 특이적인 6종의 개별 올-인-원 플라스미드의 혼합물을 Lipofectamine 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA)을 사용하여 293T 세포에 트랜스펙션 시켰다. 트랜스펙션 48시간 후, 플로우 사이토메트리로 세포를 분석하였다. 트랜스펙션 6일 후에 GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 및 PIP에 대해 양성인 세포를 Moflo XDP Cell Sorter(Beckman)를 사용하여 소팅하고, 클론을 확립하였다.
7. 증식 분석
배양 배지 중 말초혈액단핵구(PBMC) 또는 비장 세포(5Х10 5)를 항-CD3/CD28 DYNABEAD(Invitrogen, Oslo, Norway)가 첨가된 96-웰 조직 배양 플레이트에 씨딩하였다. CBPexo 또는 ABPexo를 적당한 웰에 동시에 첨가하였다. 세포 증식은 5,6-carboxyfluorescein diacetate-succinimidyl ester(CFSE) 염색법과 플로우 사이토메트리를 통해 측정하였다. 간단히 말해서 5Х10 5 비장 세포 또는 PBMC를 37℃에서 10분간 PBS 1mL에 포함된 5μM의 CFSE(Molecular Probes, Eugene, OR, USA)와 함께 인큐베이션한 후 얼음처럼 차가운 10% FBS 함유 배양배지로 2회 세척하였다. 염색된 세포를 CBPexo 또는 ABPexo의 존재 하에서 상기 기술한 대로 DYNABEAD로 자극하였다. 표시된 시간 동안 인큐베이션한 후, 세포를 FACSCanto(Becton Dickinson Biosciences, Heidelberg, Germany)로 습득하고 Modfit LT 3.0 소프트웨어(Verity Software House, Topsham, ME)로 데이터를 분석하였다. 적어도 3회 독립 실험을 수행하여 10명의 건강한 기증자로부터 활성화 PBMC 또는 비장세포에서 CBPexo의 면역억제 효과를 검증하였다.
8. 세포사멸 분석 및 세포주기 분석
세포사멸 세포를 아넥신 V로 염색하고 제조업체의 설명서에 따라 분석하였다. 간략하게, 1Х10 6 세포를 아넥신 결합 버퍼 1mL에 재현탁시켰다. APC-아넥신 V 또는 FITC-아넥신 V(BD Biosciences, San Jose, CA, USA) 및 7AAD(BD Biosciences, Catalog # 551076, 미국 캘리포니아 산호세 소재)의 워킹 용액 5㎕를 100㎕ 중의 5Х10 5 세포에 넣고 37℃, 5% CO 2에서 15분간 배양하였다. 분석 데이터는 FlowJo v10를 사용하여 분석하였다.
PBMC는 DNYNABEAD로 자극하고, 96-웰의 편평한 바닥의 플레으트에서 12-48시간 동안 인큐베이션 하였다. 세포를 수확하고, 70% 에탄올에서 고정하고, 세포 펠렛은 PBS 중의 RNase A가 보충된 프로피디움 아이오다이드(PI; Sigma) 용액으로 염색하였다. DNA 함량은 FACS Canto(Becton Dickinson)으로 측정하고 ModFITLT 4.0 소프트웨어를 이용하여 분석하여 세포주기의 sub-G1, G1, S 및 G2기를 측정하였다.
9. 프로테아제 억제
프로테아제 활성을 억제하기 위해, 10㎍/mL의 MMP 저해제 GM6001(Calbiochem, San Diego, USA)을 CBPexo에 첨가하고 21℃에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. GM6001 전처리된 CBPexo는 지시된 대로 추가 실험을 위해 사용되었다.
10. ELISPOT 분석
제조업체의 프로토콜에 따라 ELISPOT 분석을 수행하였다. 간단히 말해, 인간 IL-2(Catalog # 551076, BD Biosciences), IFN-γ(Catalog # 551083, BD Biosciences), IL-17(Catalog # SEL421, R&D Systems)에 특이적인 단클론 항체를 마이크로플레이트(Millipore, Billerica, MA) 에 코팅하였다. 인 비트로 실험을 위해, 6일 동안 배양된 세포를 배지로 3번 세척하고 ELISPOT 분석을 진행하기 전에 1mL의 배지로 재현탁하고 밤새도록 인큐베이션 하였다. 엑스 비보 실험을 위해, MOG33-55를 배지 중 1Х10 6 세포/웰의 농도로 96-웰 마이크로플레이트에 첨가하였다. 마이크로플레이트를 37℃, CO 2 인큐베이터에서 20시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 마이크로플레이트를 세척 버퍼로 4회 세척하였다. 이어서, 웰을 100㎕/웰의 비오티닐화 다클론 항-마우스 IL-2, IFN-γ 및 IL-17로 채웠다. 플레이트를 21℃에서 2시간 동안 인큐베이션 하고, 버퍼로 세척한 다음, 100㎕/웰의 스트렙타비딘-호스래디쉬 퍼옥시다아제(HRP)의 존재하에 주위 온도에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이어서, 결합되지 않은 효소를 세척을 통해 제거하고 효소 기질 용액을 첨가하였다. 스폿이 전개된 후, 증류수를 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 거꾸로 뒤집어 밤새 빛으로부터 보호한채 건조시켰다. IL-2, IFN-γ, IL-17 분비 세포에 상응하는 스팟의 수를 자동 AID-ELISPOT 판독기(AID Diagnostika GmbH, Strassberg, Germany)를 사용하여 측정하였다.
11. 사이토메트릭 비드 어레이(CBA) 인간 및 마우스 Th1/Th2/Th17 사이토카인 키트를 이용한 Th1, Th2 및 Th17 사이토카인의 평가
인간 및 마우스 사이토메트릭 비드 어레이(CBA) Th1/Th2/Th17 사이토카인 키트는 BD Biosciences(Catalog #560484 및 #560485)에서 구입하였다. 50㎕의 분석 비드, 50㎕의 검출 시약 및 50㎕의 연구 샘플 또는 표준물질을 연속적으로 각 샘플 튜브에 첨가하고 21℃에서 3시간 동안 어둠 속에서 인큐베이션하였다. 다음으로, 샘플을 1mL의 세척 버퍼로 세척하고, 500Хg에서 5분 동안 원심분리하였다. 상층액을 버린 후, 펠렛을 300㎕의 버퍼에 재현탁하고 같은 날 플로우 사이토메트리로 분석하였다.
12. EAE 유도 및 엑소좀 투여
뇌수막염은 이전에 설명한 대로(McCarthy, D.P. et al. Methods Mol Biol, 2012. 900: p.381-401) 백일해 독소(PTx)를 가진 완전 Freund's adjuvant(CFA)에서 MOG35-55 펩타이드를 사용하여 마우스에서 유도되었다(조건 당 n=5). EAE 증상이 나타난 후, 실험 간섭 이전에 동등하게 가중치가 적용된 평균 질병 점수를 얻기 위해 두명의 독립적인 연구자가 마우스를 매일 채점하고, 층화하고, 별도의 시험 그룹에 배정하였다(0, 질병의 징후 없음; 1, 축쳐진 꼬리; 2, 축쳐진 꼬리 및 부분적인 뒷다리 약함; 3, 완전한 뒷다리 마비; 4, 완전한 뒷다리 및 부분적인 앞다리 마비; 5, 사망). 엑소좀은 마우스 당 100㎍/100㎕로 "도전 상태"에서 매주 간격으로 주입되었다.
13. 세포 배양
인간 피부 섬유아세포(HSF, 가톨릭 조혈모세포 은행)를 10% FBS가 보충된 고-포도당 Dulbecco's modified Eagle medium(Gibco BRL, Grand Island, USA)에서 배양하였다. 세포는 37℃, 5% CO 2의 가습 환경 하에서 유지하였다.
14. 엑소좀 이동 효율
섬유아세포 및 내피세포로의 CBPexo 이동을 측정하기 위해, 적색 형광 염료(PKH26; Sigma)로 엑소좀을 표지하고 녹색 형광 염료(PKH67; Sigma)로 HSF를 염색하여 37℃에서 3시간 동안 인큐베이션 하였다.
15. 콜로니-형성 단위(Colony-forming unit(CFU)) 분석
가톨릭 조혈모세포 은행의 제대혈 팀은 인간 제대혈을 이용하여 신선한 샘플에서 수행하는 경우 CFU에 대한 현 실험실 관행을 평가하였다. 실험은 UCB에서 조혈 전구 세포의 분화를 평가하도록 설계되었다. CFU-C 분석은 MethoCult쪠 H4435 Enriched medium(STEMCELL Technologies, Vancouver, Canada)를 사용하여 수행되었다. 간단히 말해, 1Х10 5 cells/mL의 세포를 24-웰 플레이트 내 2개의 웰(1 mL/well)에 플레이팅하고, 인큐베이터에 정치하여 37 ℃, 5% CO 2 및 >85% 습도에서 유지하였다. 콜로니는 >40 세포의 응집으로 정의하였다. 클러스터는 4-40 세포로 구성되었다. 도립 현미경을 이용하여 colony-forming unit-erythroids(CFU-E)는 7일 후에 계수하고, burst-forming unit-erythroids(BFU-E)는 14일 후에 계수하였다. CFU-granulocyte/macrophage(CFU-G/M) 및 cluster-G/M은 14일 후에 계수하였다. 콜로니 수는 10 5 플레이트된 단핵 세포에 조정된 2개의 웰의 평균으로서 보고되었다.
16. 이동 분석
스크래치 상처 분석을 위해, 5Х10 5 cells/well(그룹 당 3반복)를 12-웰 플레이트에 플레이팅하고 컨플루언스에 도달할 때까지 인큐베이션 하였다. 팁을 이용하여 단일층을 흠집을 내고 무혈청 배지로 세척하여 탈착된 세포를 제거하였다. 이어서 세포를 CBPexo(100 ㎍/well) 및 GAL-3-, GAL-7-, PIP-, HSP72-, S100-A7-발현 엑소좀이 보충되거나 그렇지 않은 완전 배지에서 배양하였다. HSF는 상처 후 0 h, 12 h, 및/또는 24 h에 사진을 찍었다. 상처의 봉합 영역은 이동 영역으로 계산되었다(㎛ 2). 이동 수준은 Lionheart FX(BioTek Instruments, Inc) 하에서 관찰되었다.
17. 섬유아세포의 마이토마이신 C 처리
단일 세포 현탁액은 섬유아세포에 0.125% 트립신을 처리하여 제조되었다. 180 ㎕ 배지 당 5000 세포를 96-웰 플레이트에 씨딩하고, 24h 동안 인큐베이션 하였다. 24h 동안 배양에서, 섬유아세포는 10 ㎍/mL의 농도의 마이토마이신 C(MMC)가 처리되었다. 4개의 웰 그룹이 있다: 대조군으로서 PBS 또는 MMC 단독 처리된 섬유아세포의 2개의 실험군, MMC 및 CBP 또는 ABP 엑소좀이 처리된 섬유아세포의 2개의 실험군.
18. 맥관 형성 분석
희석되지 않은 기저막 매트릭스(250 ㎕; Matrigel, BD Biosciences)를 24-웰 플레이트의 각 웰에 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션 하여 응고시켰다. HUVECs(1Х10 5)을 상이한 유형의 엑소좀(CBP EXO, HSP72 EXO, PIP EXO)을 포함하는 각 마트리젤-코팅된 웰에 플레이팅하고 나서, 37℃, 5% CO 2에서 12h 동안 인큐베이션하였다. 배지를 제거한 후, 4% 파라포름알데히드(PFA)를 첨가하여 고정시키고, 세포는 광학 현미경을 사용하여 시각화하였으며, 맥관 구조의 형성은 ImageJ 소프트웨어를 사용하여 계산되었다.
19. 대식세포 분화
M1 활성화를 위해, 세포를 40 ng/mL IFN-γ(Peprotech)와 함께 2일 동안 유지시키고, M2 활성화를 위해, 세포에 20 ng/mL IL-4(Peprotech)로 2일 동안 처리하였다.
20. 통계 분석
모든 실험은 그룹당 적어도 3반복으로 수행하였고, 인 비트로 실험은 최소 3회 반복하였다. 데이터는 이들 실험의 대표값이며, 평균 ± 표준편차(SEM)로 도시하였다. 데이터는 Prism 버전 7.0(GraphPad, San Diego, CA)을 사용하여 통계적 유의성을 분석하였다. 복수의 그룹의 평균은 일원 분산 분석(ANOVA)로 비교되었다. 독립-샘플 t-test는 두 개의 상이한 그룹의 평균을 비교하는데 사용되었다. 통계 분석은 GraphPad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하였고, P < 0.05는 통계적으로 유의한 것으로 간주되었다.
(1) 제대혈 혈장 유래 엑소좀의 분자적 특성
플로우 사이토메트리를 이용하여 CBPexo는 전형적인 엑소좀 마커 단백질 CD9, CD63, CD82 및 HSP72를 포함함을 확인하였다. 이들 마커는 비드-단독 대조군에는 없었다(도 1a). 또한, 이들 엑소좀의 순도는 잘 특성화 된 엑소좀 단백질 마커 CD81, ICAM, CD63, ALIX, TSG101, EpCAM 및 FLOT-1뿐만 아니라 세포 오염을 모니터링하기 위한 cis-Golgi 마커 GM130을 포함하는 엑소좀 항체 분석 키트를 사용하여 확인되었다. Exo Anibody Array Kit는 양성(+) 대조군으로 표준 엑소좀 단백질 및 음성(-) 대조군은 블랭크로 구성된다. ImageJ 소프트웨어로 Exo Anibody Array Kit를 사용하여 농도 측정 분석에서 얻은 결과를 그래픽으로 표현하여 특정 엑소좀 마커의 양성 발현을 나타내었다. CBPexo는 FLOT1, ICAM, ALIX, CD81, TSG101, EpCAM 및 ANXA5에 대해 매우 양성이었지만 CD63의 발현은 낮았다. 분리된 엑소좀에는 GM130에 대한 음성 염색으로 입증된 바와 같이 세포 파편 및 다른 오염물이 없었다(도 1b).
(2) 인간 CBPexo 및 ABPexo의 프로테오믹스 프로파일 비교
액체 크로마토그래피 및 탠덤 질량분석(LC-MS/MS) 분석 결과 CBPexo에서 150개의 단백질, ABPexo에서 214개의 단백질이 동정되었으며, 서열당 적어도 2개의 매핑 펩타이드를 가지고 있다. CBPexo의 150개 단백질 중 11개의 단백질은 2개의 하위 그룹(4개는 면역 조절 단백질 또는 7개는 면역 조절 단백질과 관련이 없음)으로 나뉘는 반면, 19개의 면역 조절 단백질이 차등적으로 발현되었다(도 2a). ExoCarta databse를 사용하여 ABPexo 및 CBPexo의 기능적 분류를 수행하였다(도 2a의 우측 표). ABPexo 및 CBPexo의 기능적 분류와 그들 간의 추가적인 비교로 5개의 상이한 생물학적 과정 및 분자적 기능을 강조하였다. 그들 중 일부는 IL-6의 음성 조절, 세포 분화, 세포 증식의 음성 조절, 트랜스멤브레인 트랜스포트 및 상처 치유와 같이 특정 경로 내에서만 전적으로 발견된다(도 2b). ABPexo 및 CBPexo의 분자 기능에 초점을 맞추어, 메탈로엔도펩티다아제 활성과 관련된 흥미로운 기능을 발견하였다. CBPexo는 ABPexo보다 더 높은 정도로 아르기나아제 활성, 열 충격 단백질 결합, S100 단백질 결합 및 히알루론산 결합과 연관된 것으로 보인다(도 2c). 그리하여, CBPexo의 프로테오믹스 분석은 엑소좀 단백질이 면역억제 및 상처 치유와 연관됨을 나타낸다. 표 1은 CBPexo 중의 면역 조절 관련 단백질 목록을 나열한 것이다.
Figure PCTKR2021003356-appb-img-000001
(3) 인간 T-세포 증식 반응에 대한 CBPexo의 억제 효과
양성 대조군으로서 라파마이신 및 시클로스포린은 농도 의존적으로 면역억제를 억제하였다(도 3a 및 도 3b). 본 실험예에서는 주로 CBPexo 및 면역세포 간의 직접 접촉에 의해 매개된 면역억제 메커니즘에 초점을 맞추었다. 이를 해결하기 위해, DYNABEAD 항-CD3/CD28 활성화된 PBMC를 CBPexo 또는 ABPexo와 함께 배양하여 CBPexo가 활성화된 면역세포에 대해 강력한 면역억제 효과를 갖는지 여부를 측정하였다. CBPexo의 면역억제 효과는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식에 의해 조사되었다.
CFSE 희석 분석에 의해 분석된 바와 같이, ABPexo는 그렇지 않지만 CBPexo는 CD4+ 및 CD8+ T 세포 증식을 억제하지 않았다(도 3a 및 도 3b).
억제 효과의 근본적인 메커니즘을 기술하기 위해 아넥신 V 및 7AAD로 CBPexo 또는 ABPexo 처리된 군에서 세포사멸 세포의 비율과 플로우 사이토메트리 분석을 조사하였다. 또한, CBPexo가 활성화 T 세포의 세포사멸에 영향을 줄 수 있는지를 확인하였다.
그 결과, PBMC는 엑소좀의 존재에서 DYNABEAD에 의해 활성화되었다. T 세포의 세포사멸은 플로우 사이토메트리에 의해 156시간째에 측정되었다. 아넥신 V 및 7AAD 이중 네거티브 염색은 살아있는 세포를 나타내고, 7AAD 및 아넥신 V 포지티브 염색은 각각 죽은 세포 및 세포사멸 세포를 나타낸다. 결과적으로, CBPexo 처리군에서 세포사멸 비율은 ABPexo 처리군과 비교하여 증가하였다. 그러나, 양성 대조군과 비교하여, 초기 세포사멸 시기에서 엑소좀 처리군은 어떠한 차이도 보이지 않았다. 게다가, CD8+ T 세포 세포사멸을 비교하였을 때, CBPexo 처리군과 대조군 간의 차이는 없었다. 이들 결과는 CBPexo가 처리된 PBMC 내에서 CD4+ T 세포의 세포사멸이 증가하나, CD8+ T 세포에 대한 유의한 효과는 없음을 보여준다(도 3c 및 도 3d).
상기 결과로부터, 증식 반응의 감소는 세포주기 어레스트의 유도로 인한 것일 수 있다고 가정하였다. 따라서, PI 염색 후 플로우 사이토메트리에 의해 각 세포군의 DNA 함량을 측정하여 세포주기 분석을 수행하였다. CBPexo 또는 ABPexo의 존재하에서 PBMC를 DYNABEAD로 자극하고, 156시간 동안 인큐베이션한 후, PI로 염색하였다.
세포사멸을 보이는 G0/G1기의 세포 비율이 대조군보다 CBPexo 처리군에서 더 높았으나, 이 차이는 유의적이지 않았다. 더욱이, sub-G2/M 및 S기의 세포의 빈도는 156시간에서 대조군보다 CBPexo 처리군에서 더 높았다(도 4). 이들 결과는 CBPexo는 세포사멸과 함께 G0/G1 세포주기 어레스트를 유도하여 T 세포 증식을 감소시킴을 시사한다.
(4) CBPexo에 의한 인 비트로에서 면역억제성 세포 분화의 유도 효과
상기 결과로부터, 전체 PBMC 집단 내의 T 세포에서 관찰된 CBPexo의 억제 효과가 면역억제세포의 유도로 인한 것일 수 있다고 가정하였다. 실험 결과, CBPexo와의 인큐베이션은 2일째에 자극된 PBMC 내 CD4+/CD25+/FoxP3+ 세포의 비율을 증가시켰다(도 5a). 그러나, CD4+ T 세포의 비율을 기초로 게이팅된 CD25+ 세포는 6일째에 CBPexo의 존재에서 유의적으로 하향조절되어, IL-2 수용체 알파 체인, CD25를 하향조절하는 인자가 CBPexo에 존재함을 나타낸다; 본 발명자들은 MMP9 또는 MMP2가 이러한 역할을 담당함을 이전 레퍼런스를 통해 보여준 바 있다.
조절성 T 세포와 연관된 CBPexo의 효과를 더 시험하기 위해, CBPexo를 제대혈 유래의 CD25+ 세포와 공배양하고, 세포는 CD4+/CD25+/FoxP3+ 및 CD127 low 세포의 검출 전에 21일 동안 인큐베이션 하였다. 세포는 인공항원제시세포와 항-CD3/CD28 및 IL-2의 조합에 의해 효과적으로 확장되었다(도 5b). Treg 및 CBPexo-Treg 세포는 제대혈의 동일한 1 유닛에서 생성되며, 배양 후 17일에 CBPexo-Treg에서 16.32배 증가하였다(도 5c). Foxp3 발현은 nTregs에서의 그것의 발현과 비교하여 CBPexo-유도된 Treg에서 확장된 제대혈 CD25+ 세포를 증가시켰다. 그러나, CBPexo와 Treg 배양 후 21일째에 CD25 및 CD127의 발현에서의 차이는 없었다. 그리하여, CBPexo는 Treg 분화 후 21일째에 Foxp3 상향조절을 유도한다(도 5d). CBPexo를 통한 신호전달이 nTregs의 억제 특성들을 향상시키는지를 조사하기 위해, CFSE 염색을 이용하여 nTregs 및 CBPexo 유도된 Tregs 간의 면역억제 차이를 시험하였다. 게다가, CBPexo 유도된 Tregs는 시험된 거의 모든 Treg:PBMC 비율에서 강력하였다. >50%의 억제가 1:4의 Tregs:PBMC 비율에서 관찰되어, CBPexo-유도된 Tregs의 강한 억제능력을 입증한다(도 5e). 그러므로, CBPexo는 직접적으로 T 세포의 면역을 억제할 수 있으나, 초기 단계에서 Tregs의 분화 역시 유도하고 제대혈 Treg 세포의 기능성 개선에 참여할 수 있다.
PBMC 집단 내 이들 억제성 단핵구의 표현형의 특성규명을 위해, CBPexo로 24시간 처리한 세포를 염색하여 CD33, CD11b 및 CD14를 평가하였다(도 6a). 그 결과, CBPexo는 MDSC의 집단인 CD33+CD11b+CD14+ 세포에서 아르기나아제-1, NOS2 및 IDO의 발현을 촉진하였다(도 6b). 이들 결과는, CBPexo가 직접적으로 면역억제에 참여할뿐만 아니라 면역억제세포를 유도함을 나타낸다.
(5) CBPexo에서 발현된 MMP의 억제에 의한 T 세포 증식의 회복
T 세포 증식을 억제할 수 있는 CBPexo 내 인자들을 동정하고자 하였다. CD25는 MMP-9에 의해 단백질분해로 절단되며, T 세포에 대한 면역억제효과를 보여준다. 이들 징크-의존적 엔도펩티데이즈는 세포외 기질을 통한 세포 침입을 위한 필수 인자들이다. CBPexo에서 MMP의 존재를 측정하기 위해, 인간 MMP 항체 분석을 이용하여 CBPexo에서 다양한 MMP 및 TIMP를 분석하였다.
도 7a에 도시된 바와 같이, MMP 억제 분자인 TIMP1 및 TIMP2의 발현에도 불구하고, CBPexo는 고농도의 MMP9 및 MMP8을 유의적으로 포함하였다. 그리하여, CBPexo는 MMP9에 의해 막-결합 IL-2Rα(CD25)를 절단하고, 활성화 T 림프구의 증식을 억제함을 추측하였다. MMP가 면역억제에 관여하는지를 추가적으로 확인하기 위해, 인간 T 세포와 인큐베이션 하기 전에 CBPexo와 MMP-1, -2, -3, -8 및 -9를 포함하여 다양한 MMP의 억제제인 GM6001과 2시간 동안 인큐베이션 하였다. GM6001-처리된 CBPexo와 배양된 인간 CD4+T 세포는 세포의 증식을 회복하였다(도 7b).
또한, MMP 억제제인 GM6001(10㎍/mL)-처리된 CBPexo와 배양된 CD4+ 및 CD8+T 세포는 CD25 발현의 회복을 보였으나, 활성화 마커인 CD69에서의 차이는 없었다(도 8). 이들 결과는 MMP-9이 주로 MMP-9에 의한 CD25의 억제에 의해 유발되는 CBPexo의 면역억제와 연관이 있음을 나타낸다.
(6) 마우스 시스템에서 CBPexo의 면역억제 기능 확인
CBPexo는 마우스 비장세포 및 인간 PBMC에 대한 강력한 면역억제효과를 나타냈다. CBPexo의 면역억제효과는 DYNABEAD-자극된 마우스 CD4+ 및 CD8+T 세포 증식에 의해 시험되었다. CFSE 희석 분석에 의해 분석된 바와 같이 CBPexo는 CD4+ 및 CD8+T 세포 증식을 억제하나, ABPexo는 그렇지 않았다(도 9a-b). 인간 CBPexo는 증식성 T 세포 억제의 마우스 교차-반응성을 나타냈다. 따라서, 이들 결과는 CBPexo가 자가면역질환의 동물 모델인 EAE에 적용가능함을 나타낸다.
(7) IL-2 신호전달 및 Th1 및 Th2 세포-관련 사이토카인 조절에 대한 CBPexo의 효과
CBPexo에 대해 T 세포가 확장 및 반응하도록 항-CD3/CD28과 함께 세포(96-웰 배양 플레이트에서 1Х10 5 cells/well)를 6일 동안 배양하였다. 각 웰 내 세포를 세척하고 그대로 둔 후 ELISPOT 분석에 사용하였다.
그 결과, CBPexo와 공배양하였을 때, IL-2 및 IFN-γ-분비 세포의 집단이 현저히 감소하였으나, L-17 분비 세포는 대조군, CBPexo 처리군 및 ABPexo 처리군 간에 차이가 없었다(도 9c). CBPexo는 IL-2 및 IFN-γ 분비 세포를 억제하여 면역억제 기능을 나타냈다.
사이토카인 분비를 평가하기 위해, 사이토메트릭 비드 분석을 사용하여 IL-2, IFN-γ 및 IL-6의 수준을 평가하였다. 그 결과, CBPexo는 Th1 및 Th17 세포의 분화 및 자가면역질환의 발생과 연관된 인간 IL-2, IFN-γ 및 IL-6을 하향조절하였다(도 9d). 그러나, 배양 상등액의 평가 결과, 마우스 T 세포에서 CBPexo와 배양될 때 IL-2의 농도 만 유의적으로 감소하였다(도 9e). 이들 데이터는 CBPexo에 의한 IL-2 생산의 억제가 인간 및 마우스 둘 다에서 T 세포 억제의 중요한 메커니즘임을 나타낸다.
(8) IL-2 사이토카인 수준 조절 및 EAE 증상을 완화하기 위한 Th1 및 Th17 세포 분화의 상호 조절 유도에 대한 CBPexo의 효과
도 10a에 도시된 바와 같이, CBPexo-처리된 EAE 군의 임상 점수는 ABPexo-처리된 EAE 군 및 EAE 대조군 보다 유의적으로 더 낮았다. 이들 결과는 CBPexo가 자가면역 증상을 완화할 수 있음을 보여준다. CBPexo가 헬퍼 T 세포에서 면역조절 기능을 가지는 지를 확인하기 위해 ELISPOT 분석에 의해 비장세포에서 사이토카인의 발현 수준을 측정하였다. MOG 펩타이드-특이 IFN-γ, IL-2 및 IL-17를 분비하는 세포의 빈도는 ELISPOT 분석에 의해 EAE 대조군, CBPexo-처리 EAE 군 및 ABPexo-처리 EAE 군 중에서 비교하여 측정하였다.
그 결과, MOG 펩타이드-특이 IL-2 세포는 CBPeox-처리 EAE 군에서 유의적으로 감소되었으나, IFN-γ 및 IL-17를 분비하는 세포에서의 차이는 없었고, 인 비트로 분석 결과와 유사하였다(도 10b).
도너 CD4+T 세포는 T 세포 면역 반응을 조절하는데 중요한 역할을 담당하면서 EAE 및 Th 서브세트의 균형을 매개하는 Th1, Th2 및 Th17 세포로 서로 분화한다. 따라서, CBPexo에 의해 Th1, Th2 및 Th17 세포 관련 사이토카인을 감소시키는 그들의 능력을 추가로 조사하였다. 이를 확인하기 위해, Th1, Th2 및 Th17 사이토메트릭 비드 분석을 이용하여 사이토카인 수준을 평가하였다. 분비된 단백질의 농도 평가 결과, CBPexo 투여는 EAE 군과 비교하여 IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-17 및 IL-4의 수준에서의 감소를 유발하였다(도 10c).
EAE 모델에서 Th1, Th2, Th17 및 IL-2의 사이토카인 프로파일을 비교하기 위해 세포내 염색을 수행하였다. 그 결과, IL-2의 비율은 2배 감소하였고, IFN-γ 및 IL-17은 ABPexo-처리군과 비교하여 CBPexo 처리군에서 1-4% 감소하였다(도 11). 이들 결과는 CBPexo 투여가 IL-2 신호전달을 조절하고, Th1 및 Th17 세포 분화의 상호 조절을 유도하여 EAE에 대해 보호 효과를 가짐을 입증하는 것이다.
(9) EAE 모델에서 면역 조절 세포 분화 유도에 대한 CBPexo의 효과
CD4+CD25+FOXP3+ Treg 세포의 빈도를 측정하고, 미처리 대조군(음성 대조군), EAE 대조군(양성 대조군), CBPexo-처리 EAE 군 및 ABPexo-처리 EAE 군을 비교하였다.
그 결과, Treg 집단이 대조군과 비교하여 CBPexo-처리 EAE 군에서 증가하였다(도 12a-b). 이들 결과는 CBPexo가 IL-2 신호전달을 억제할뿐만 아니라 인 비보에서 CD4+CD25+FOXP3+ Treg 집단을 증가시켜 그들의 면역억제 효과를 나타냄을 입증하는 것이다. CD11b+Gr-1+ 세포(마우스 MDSC)의 표현형은 CBPexo-주사된 마우스에서 EAE 질병 진행 동안 확장되었다(도 13). CBPexo 주사된 EAE 마우스의 비장세포에서 강화 및 축적된 MDSC는 조절 역할을 담당한다.
(10) EAE 모델에서 국소 및 전신적으로 작용하는 CBPexo의 효과
국소 또는 전신적으로 작용하는 CBPexo의 효과를 확인하기 위해 PKH67로 표지된 CBPexo 또는 ABPexo를 EAE 마우스의 꼬리 정맥에 주입하였다. EAE 모델은 뇌에 국소적으로 또는 전신에 동시다발적으로 발병할 수 있다. 따라서, 질환 발생에 있어 가장 중요한 기관인 뇌와 전신에 작용하는 가장 중요한 림프기관인 비장 조직의 세포 핵을 DAPI로 염색하였고 PKH67 표지된 CBPexo는 비장과 뇌 조직 모두에서 검출되었다 (도 14).
조직 병리학 검사를 검사를 통해 CBPexo 또는 ABPexo를 처리한 EAE 마우스와 EAE 마우스, 그리고 정상 마우스의 뇌에서 세포 침윤 수와 염증세포 면적을 비교한 결과, CBPexo 투여군에서 세포침윤과 염증세포의 면적이 감소되었다 (도 15).
(11) CBPexo의 이동 및 섬유아세포 증식에 대한 효과
상처치료 동안 그들의 재생 효과를 확인하기 위해 CBPexo는 적색 형광 염료(PKH26)를 사용하여 표지되었고, 녹색 형광 염료-표지된(PKH67) HSF와 함께 인큐베이션 하였다. 이어서, PKH67-표지된 HSF 주변에 분포한 PKH26-표지된 CBPexo의 형광 현미경 검사를 수행하였다(도 14a). 이들 형광 표지된 엑소좀은 인큐베이션 12시간 후 녹색-표지된 HSF 세포 주변에 분포하였다(도 16a). 적색 표지된 CBPexo는 0-24시간 동안 인큐베이션 하는 동안 HSF로 유의적으로 이동하였다(도 16b).
세포 증식에 대한 CBPexo의 효과는 스크래치 분석 및 CFSE 증식 분석을 통해 확인되었다. 도 15에 도시된 바와 같이, 인 비트로에서 CBPexo가 이동하고 섬유아세포 내에 내재화되어 증식을 촉진할 수 있음을 입증하였다. 게다가, 이들 엑소좀은 혈장 기능의 필수 매개자이며, 상처치료를 위한 새로운 치료적 나노입자 전달 시스템으로 사용될 수 있음을 관찰하였다.
(12) CBPexo의 상처치료 효과
엑소좀 단백질 전달을 위한 필요 조건인 CBPexo가 HSF 내에 내재화될 수 있는지를 측정하였다. CBPexo는 컨플루언스에 도달할 때 까지 7일 동안 HSF와 함께 인큐베이션 하였다. 이어서, 상처치료를 위한 섬유아세포 이동에 대한 CBPexo 및 ABPexo의 기능적 효과를 시험하고자 하였다. CBPexo가 섬유아세포 이동에 영향을 주는지를 평가하기 위해 스크래치 상처 분석을 수행하였다. 이를 위해 섬유아세포를 포함하는 상처 영역을 흠집을 내고 CBPexo가 있거나 없이 이들 섬유아세포를 24시간 동안 배양하고, 이어서, 상처 영역을 평가하였다. 이 분석 결과는 CBPexo가 대조군 및 ABPexo 그룹과 비교하여 섬유아세포의 이동을 유의적으로 증가시킴을 나타냈다(도 17a).
게다가, CBPexo가 처리 시간 대에 섬유아세포 이동을 증가시키는지를 통계적으로 분석하였다(도 17b).
카르복시플루오레신 석시니미딜 에스테르(carboxyfluorescein succinimidyl ester(CFSE) 분석 결과, CBPexo 또는 ABPexo가 처리된 경우 섬유아세포의 증식 반응은 상처-봉합 분석에서 관찰된 것과 유사함을 보여주었다(도 15c). 추가로, 이동 자극 및 HSF 증식 동안 주요 메커니즘을 측정하기 위해, HSF에 항-증식제로 사용되는 MMC로 전처리한 후 시험을 수행하였다. 결과적으로, 섬유아세포의 증식은 MMC에 의해 억제됨에도 불구하고, CBPexo가 첨가된 그룹에서 ABPexo가 처리된 다른 대조군과 비교하여 증식은 증가됨을 확인하였다(도 17c). 게다가, CBPexo가 첨가된 그룹에서, 증식능이 MMC에 의해 억제되더라도 세포사멸은 대조군과 비교하여 감소되었다(도 17d).
이들 결과는 상처치료 동안 CBPexo가 HSF 이동 자극 및 섬유아세포의 증식을 촉진할 수 있음을 입증하였다. 섬유아세포는 연조직 상처치료를 담당하는 주요 효과기 세포이며, 그들의 증식 및 이동은 상처치료, 상처 수축, 콜라겐 합성 및 조직 리모델링에 필수적이다. 이 결과는 이들 CBPexo가 이동하여 섬유아세포 내에 내재화됨으로써 CBPexo는 ABPexo와 비교하여 섬유아세포의 증식 및 이동을 유의적으로 향상시킬 수 있음을 보여주었다.
(13) CBPexo에 의한 향상된 내피세포 맥관 형성 및 M2 Mφ의 분극화
증식기로 알려진 2차 상처치료 동안, 대안으로 활성화된 M2 Mφ이 섬유아세포의 증식 및 이동 및 혈관형성에 관여함으로써 염증을 줄이고 상처를 복구할 수 있다.
도 18a는 각 그룹에 대한 HUVEC 맥관 형성의 대표 이미지를 도시한다. 따라서, 혈관형성을 상향조절하는 CBPexo의 능력을 평가하였다. CBPexo는 colony-forming unit-granulocytes, -erythrocytes, -monocytes, 및 -megakaryocytes(CFU-GEMMs); 및 대식세포 분화와 관련된 CFUgranulocytes, -monocytes(CFU-GMs), 및 CFU-monocytes(CFU-Ms)의 수를 증가시켰다(도 18b). CBPexo는 대식세포 증식을 촉진하고 전염증성 M1 표현형을 항-염증성 M2 표현형으로의 분화를 유도하였다. CBPexo가 첨가되고 고전적으로 활성화된 M1 Mφ, CD80 및 CD86과 인큐베이션되는 경우, IL-12 발현은 강하게 하향조절되는 반면, CD163, CD206, 및 IL-10 발현은 상향조절되었다(도 18c). 이들 결과는 고전적으로 활성화된 M1 Mφ이 CBPexo-유도된 표현형 전환을 통해 M2 Mφ로 성공적으로 분극화되었음을 제안한다.
<실시예 2> 인공 엑소좀(엑소좀 모방체)의 제조 및 면역억제효과
CBPexo의 프로테오믹스 분석 결과 엑소좀 단백질(PIP, HSP72, GAL-7, GAL-3 및 S100-A7)이 면역 조절 및 상처치료와 연관되어 있음을 확인하였다. MICA는 자연 살해 세포 증식을 유도하고, MHC-I 결핍은 면역 활성화를 위태롭게한다. 또한, MHC 및 MICA/B는 내피세포 증식을 유도하고 상처치료 효과에 영향을 미친다. 그러므로, MHC 및 MICA/B를 CRISPR/cas9 시스템을 이용하여 침묵시킴으로써 면역-활성화 효과가 없는 세포를 만들 수 있다. HEK 293T 세포는 높은 트랜스펙션 효율 및 HLA 클래스 I(A*02:01, B*07:02 및 C*07:02) 및 MICA/B의 상동의 반수체를 포함하여 몇가지 장점을 가지고 있다. HLA 클래스 I 및 MICA/B 유전자의 완전 제거를 위해, HLAA-A, HLA-B, HLA-C 및 MICA/B 유전자의 엑손 2 및 3을 표적으로 하는 Cas9 단백질 및 gRNA를 인코딩하는 7종의 플라스미드를 사용하였다(Hong, C.H., et al., J Immunother, 2017. 40(6): p. 201-210 참조). HLA 클래스 I 및 MICA/B의 발현 결핍을 나타내는 이들 H1ME-5 세포는 플로우 사이토메트리에 의해 분석되며(도 19, GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 및 PIP 유전자를 인코딩하는 렌티바이러스로 형질도입되었다. 형질도입 6일 후, GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 및 PIP-양성 세포를 소팅하였다.
H1ME-5에서 방출된 엑소좀의 크기 분포는 DLS를 이용하여 특성규명하였고, 관찰된 엑소좀의 입자 크기는 145.61±75.89 nm 였다(도 19b).
H1ME-5 세포는 H1ME-5 세포 유래의 엑소좀이 면역억제효과를 가지지 않으므로 CBPexo 모방체를 생산하는데 안정하다. 또한, H1ME-5 세포는 H1ME-5 세포에서 유래된 엑소좀이 상처치료 효과가 없기 때문에 인공 엑소좀을 생산하는데 적당하다(도 19c 및 d).
플로우 사이토메트리에 의해 90% 이상의 H1ME-5 세포가 GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 및 PIP를 발현하였다(도 19e). 또한, 이 세포주에서 유래된 엑소좀은 목적 분자인 GAL-3, MMP-9, HSP72, S100A7, GAL-7 및 PIP를 발현하였다(도 19f).
다양한 CBPexo 모방체 중, MMP-9 및 HSP72를 발현하는 엑소좀이 유의한 면역억제효과를 보였으며 MMP-9과 HSP72를 발현하는 엑소좀을 각각 절반의 농도로 섞어서 넣어 줬을 때 면역억제의 상승효과를 나타냈다(도 19g-h). HSP72는 MMP-9의 생산을 증가시킨다. 따라서, 이들 데이터는 MMP-9이 CBPexo에서 존재하는 다양한 면역억제 분자 중 중요한 역할을 담당함을 나타낸다.
<실시예 3> 인공 엑소좀(엑소좀 모방체)의 상처 치유 효과
CBPexo의 이전 프로테오믹스 분석 결과는 표 2에 요약된다. CBPexo에서 단백질의 차등 발현 수준은 표 2에서 유색으로 강조하였다. 적색은 상처치료에 유의적으로 영향을 주는 CBPexo 단백질이고, 청색은 상처치료 효과가 없는 단백질이다.
PIP, HSP72, GAL-7, GAL-3 및 S100-A7의 역할을 확인하기 위해 HSF는 특정 타겟 단백질을 발현하는 인공 엑소좀으로 자극되었다. 섬유아세포 증식에 대한 이들 단백질의 효과를 평가하기 위해, CBPexo 또는 인공 엑소좀을 같은 농도로 이들 HSF에 처리함으로써 일련의 인 비트로 기능 분석을 수행하였다. 상기 실시예 1의 방법에 따라 스크래치 상처 분석을 수행하여 HSF 이동에 대한 CBPeox 또는 인공 엑소좀의 효과를 평가하였다. HSP72-exo 및 PIP-exo는 이동 영역에 의해 측정된 바와 같이 HSF의 이동을 유의적으로 개선하였다(도 20a). 타겟 단백질 중에서, PIPexo 만이 섬유아세포 증식을 촉진하였다(도 20b). GAL-7, GAL-3 및 S100-A7을 발현하는 엑소좀은 상처치료 효과를 보이지 않았을 뿐만 아니라 섬유아세포를 증식하지도 않았다.
Figure PCTKR2021003356-appb-img-000002
<실시예 4> HSP72 및 PIP를 동시 발현하는 엑소좀의 섬유아세포 증식 및 이동에 대한 효과
상기 실시예 1의 방법에 따라, 형질도입후 6일에, MoFlo XDP 세포 소터를 사용하여 PIP 및 HSP72를 발현하는 세포를 동시에 선별하고, 배양하였다(도 21a). HSP72-exo 및 PIP-exo를 함께 첨가한 경우, 상처치료 효과는 CBPexo과 유사하고, PIP 또는 HSP72만 발현하는 엑소좀보다 더 높았다. 이들 엑소좀은 농도 의존적 방식으로 상처치료 효과를 보여주었다(도 21b). 게다가, HSP72 및 PIP를 동시에 발현하는 엑소좀은 HSP72-exo 및 PIP-exo를 동시에 첨가한 경우 관찰된 것보다 더 좋은 상처치료 효과를 보여주었다(도 21c). 섬유아세포는 CFSE로 표지되어 대조군으로 사용되었고, 24시간 동안 배양되었다. 배양 후, 세포를 수확하고, 플로우 사이토메트리를 통해 분석되었다. 세포 분열은 CFSE 형광이 순차적으로 반으로 나뉘고, 로그 스케일 상에 동일한 간격의 피크를 가지는 것으로 규명되었다. 이들 피크는 분열 사이클 수를 나타냈다. 유사한 상처 봉합 결과는 CFSE 방법을 이용하여 얻었으며, 다양한 유형의 인공 엑소좀으로 정상 HSF의 증식율을 확인하였다(도 21d).
HSP72 및 PIP를 발현하는 엑소좀을 생산하였고, 그들은 함께 첨가하거나 농도 의존적 방식으로 첨가하여 그들의 상처치료 효과를 확인하였다. 그 결과, HSP72 및 PIP는 상처치료를 촉진하는데 있어서 가장 효과적인 단백질이었다(CBPexo에 의해 발현된 것들 중에서).
<실시예 5> 인공 엑소좀에서 HSP72/PIP의 기능의 확인
엑소좀은 그들의 부모 세포를 나타내는 다양한 신호전달 분자를 포함한다. 단백질, 핵산, 지질 및 대사체를 포함하는 상이한 엑소좀 조성에서 분극화 인자를 연구하기 위해, 풍부한 함량으로 존재하는 CBPexo 카고 단백질에 초점을 맞추었다. 추가로, 인간 탯줄 정맥 내피 세포(HUVEC)에 대한 인공 엑소좀의 효과를 측정하기 위해, 상기 실시예 1의 방법에 따라 맥관 형성 분석을 수행하였다. 우선, 엑소좀이 없이 배양된 것들과 비교하여 HSP72-exo 및 PIP-exo는 네트워크 구조에서 노드의 수 및 총 맥관 길이를 증가시켰고, 이는 인공 엑소좀의 전-혈관형성 능력을 나타내는 것이다. 각 그룹에 대한 HUVEC 맥관 형성의 대표 이미지는 도 22a에 도시된다. 추가 분석 결과, HSP72/PIPexo과 배양된 HUVEC은 다른 엑소좀과 배양된 것들과 비교하여 더 나은 혈관 형성 능력을 나타냈다(도 22a). 추가로, 상이한 유형의 엑소좀 성분 중, M1 Mφ의 M2 Mφ로의 분화는 HSP72/PIP 단백질에 의해 촉진됨을 확인하였다(도 22b).
상기 결과로부터 HSP72 및 PIP를 발현하는 인공 엑소좀은 혈관형성을 향상시킴으로써 상처치료 및 회복을 개선할 수 있다. 우리가 알기로는, 본 발명은 HSP72 및 PIP를 발현하는 인공 엑소좀이 고전적으로 활성화된 M1 Mφ를 분극화된 M2-유사 표현형으로의 인 시츄 직접 전환을 유도함으로써 피부 상처 회복을 촉진할 수 있음을 최초로 입증하였다.
본 발명은 자가면역질환 또는 상처치료용 의약 제조 분야에 적용할 수 있다.

Claims (18)

  1. 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 면역억제 또는 상처치료용 조성물.
  2. 제1항에 있어서,
    면역억제는 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 과증식성 피부질환, 만성 폐색성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 알레르기성 천식, 기관지염(bronchitis), 알레르기성 비염 및 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis) 중에서 선택된 면역질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 것인, 면역억제 또는 상처치료용 조성물.
  3. 제1항에 있어서,
    상처치료는 상처치료(wound healing), 아토피(Atopic dermatitis), 전신피부경화증(Systemic sclerosis) 및 심근경색(Myocardiac infarction) 중에서 선택된 질환의 개선 또는 치료를 위한 것인, 면역억제 또는 상처치료용 조성물.
  4. 유효량의 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역억제 또는 상처치료 방법.
  5. 제4항에 있어서,
    면역억제는 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 과증식성 피부질환, 만성 폐색성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 알레르기성 천식, 기관지염(bronchitis), 알레르기성 비염 및 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis) 중에서 선택된 면역질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 것인, 면역억제 또는 상처치료 방법.
  6. 제4항에 있어서,
    상처치료는 상처치료(wound healing), 아토피(Atopic dermatitis), 전신피부경화증(Systemic sclerosis) 및 심근경색(Myocardiac infarction) 중에서 선택된 질환의 개선 또는 치료를 위한 것인, 면역억제 또는 상처치료 방법.
  7. 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 Th1 및 Th17 세포의 분화 억제용 배지 조성물.
  8. 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 발현이 성인 혈장 유래의 엑소좀에 비해 높은 제대혈 혈장 유래의 엑소좀과 나이브 CD4+T 세포를 인 비트로 배양하는 단계를 포함하는 인 비트로에서 Th1 및 Th17 세포의 분화 억제 방법.
  9. HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주에서 유래하고, 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군에서 선택된 하나 이상을 발현하는 제대혈 혈장 엑소좀 모방체.
  10. 제9항에 있어서,
    제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군을 발현하는 것인, 제대혈 혈장 엑소좀 모방체.
  11. 제9항에 있어서,
    제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 갈렉틴-3(galectin-3), Matrix metalloproteinase(MMP-9), Heat shock protein 72(HSP72), Prolactin-inducible protein(PIP), Protein S100-A7(S100A7), Galectin-7(GAL-7), Lysosome-associated membrane glycoprotein 1(LAMP1), Serpin B12(SERPINB12), Lactotransferrin(LTF), Alpha-1-acid glycoprotein(ORM1), CD5 antigen-like(CD5L), Complement C4-B(C4B), Mannan-binding lectin serine protease 1(MASP1), Proteasome subunit alpha type-6(PSMA6), Peroxiredoxin-1(PRDX1), Neutrophil defensin 3(DEFA3), CD44 antigen 및 Arginase-1(ARG1)로 이루어진 유전자군의 코딩 핵산을 HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주에 도입하고, 상기 세포주로부터 분리 정제한 것인, 제대혈 혈장 엑소좀 모방체.
  12. 제11항에 있어서,
    HLA 및 MIC 유전자 결핍 세포주는 H1ME-5(기탁번호: KCTC 13602BP)인, 제대혈 혈장 엑소좀 모방체.
  13. 제9항에 있어서,
    제대혈 혈장 엑소좀 모방체는 Heat shock protein 72(HSP72) 및 Prolactin-inducible protein(PIP)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 발현하는 것인, 제대혈 혈장 엑소좀 모방체.
  14. 제9항의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 포함하는 면역억제 또는 상처치료용 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    면역억제는 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 과증식성 피부질환, 만성 폐색성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 알레르기성 천식, 기관지염(bronchitis), 알레르기성 비염 및 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis) 중에서 선택된 면역질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 것인, 면역억제 또는 상처치료용 조성물.
  16. 유효량의 제9항의 제대혈 혈장 엑소좀 모방체를 대상체에게 투여하는 단계를 포함하는 면역억제 또는 상처치료 방법.
  17. 제16항에 있어서,
    면역억제는 이식편대숙주질환, 자가면역질환, 과증식성 피부질환, 만성 폐색성 호흡기 질환(chronic obstructive pulmonary disease; COPD), 알레르기성 천식, 기관지염(bronchitis), 알레르기성 비염 및 자가면역성 간염(autoimmune hepatitis) 중에서 선택된 면역질환의 개선, 예방 또는 치료를 위한 것인, 면역억제방법.
  18. 제16항에 있어서,
    상처치료는 상처치료, 아토피(Atopic dermatitis), 전신피부경화증(Systemic sclerosis) 및 심근경색(Myocardiac infarction) 중에서 선택된 질환의 개선 또는 치료를 위한 것인, 면역억제 또는 상처치료 방법.
PCT/KR2021/003356 2020-03-18 2021-03-18 제대혈 혈장 유래의 엑소좀 또는 이의 모방체 및 이의 약학적 용도 WO2021187911A1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US17/912,246 US20230218678A1 (en) 2020-03-18 2021-03-18 Cord blood plasma-derived exosome or mimetic thereof and pharmaceutical use thereof
EP21772409.5A EP4123019A4 (en) 2020-03-18 2021-03-18 EXOSOME OR MIMETIC FROM UMBILICAL CORD BLOOD PLASMA AND PHARMACEUTICAL USE THEREOF

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR10-2020-0033254 2020-03-18
KR20200033254 2020-03-18
KR10-2021-0013569 2021-01-29
KR20210013569 2021-01-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2021187911A1 true WO2021187911A1 (ko) 2021-09-23

Family

ID=77771455

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2021/003356 WO2021187911A1 (ko) 2020-03-18 2021-03-18 제대혈 혈장 유래의 엑소좀 또는 이의 모방체 및 이의 약학적 용도

Country Status (4)

Country Link
US (1) US20230218678A1 (ko)
EP (1) EP4123019A4 (ko)
KR (1) KR102615824B1 (ko)
WO (1) WO2021187911A1 (ko)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114369564A (zh) * 2021-12-21 2022-04-19 广州远想生物科技股份有限公司 一种枳雀来源外泌体的制备方法和应用

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160063489A (ko) * 2014-11-26 2016-06-07 가톨릭관동대학교산학협력단 중간엽줄기세포 유래 미세소포체를 포함하는 발모촉진 또는 창상 치료용 약제학적 조성물
KR20180123106A (ko) * 2016-03-24 2018-11-14 스템랩, 에스에이 조직 회복을 위한 제대혈 파생 엑소좀의 이용
US20190307686A1 (en) * 2017-11-16 2019-10-10 Celularity, Inc. Cultivation of placenta to isolate exosomes
WO2019198077A1 (en) * 2018-04-10 2019-10-17 Brainstorm Cell Therapeutics Ltd. Cell-type specific exosomes and use thereof

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018101782A1 (ko) * 2016-12-02 2018-06-07 가톨릭대학교 산학협력단 T 세포 자극용 엑소좀 및 이의 약제학적 용도
KR102096461B1 (ko) * 2017-04-14 2020-04-02 서울대학교 산학협력단 EID3 또는 EID3를 발현하는 MSC-엑소좀을 포함하는 Th17 세포의 분화 또는 활성 감소 방법
JP7360704B2 (ja) * 2017-05-05 2023-10-13 カプリコール，インコーポレイテッド 細胞外小胞を用いた全身移植片対宿主病を治療する方法
KR101985941B1 (ko) * 2017-05-31 2019-06-04 충북대학교 산학협력단 줄기세포로부터 엑소좀 분비를 촉진시키는 방법 및 줄기세포 유래 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 기능성 화장료 조성물
EP3860626A2 (en) * 2018-10-04 2021-08-11 Exogenus Therapeutics, SA Compositions comprising small extracellular vesicles derived from umbilical cord blood mononuclear cells with anti-inflammatory and immunomodulatory properties and process for obtaining them
KR102560588B1 (ko) * 2020-03-18 2023-07-28 가톨릭대학교 산학협력단 멀티플렉스 ＣＲＩＳＰＲ―ｃａｓ９ 시스템을 이용한 ＨＬＡ 클래스 Ｉ 및 ＭＩＣＡ／ＭＩＣＢ 유전자 결핍 세포주 및 이의 용도

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160063489A (ko) * 2014-11-26 2016-06-07 가톨릭관동대학교산학협력단 중간엽줄기세포 유래 미세소포체를 포함하는 발모촉진 또는 창상 치료용 약제학적 조성물
KR20180123106A (ko) * 2016-03-24 2018-11-14 스템랩, 에스에이 조직 회복을 위한 제대혈 파생 엑소좀의 이용
US20190307686A1 (en) * 2017-11-16 2019-10-10 Celularity, Inc. Cultivation of placenta to isolate exosomes
WO2019198077A1 (en) * 2018-04-10 2019-10-17 Brainstorm Cell Therapeutics Ltd. Cell-type specific exosomes and use thereof

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
HONG, C.H. ET AL., J IMMUNOTHER, vol. 40, no. 6, 2017, pages 201 - 210
KIM SUEON, MAENG JI-YOUNG, HYUN SEUNG-JOO, SOHN HYUN-JUNG, KIM SU-YEON, HONG CHEOL-HWA, KIM TAI-GYU: "Extracellular vesicles from human umbilical cord blood plasma modulate interleukin-2 signaling of T cells to ameliorate experimental autoimmune encephalomyelitis", THERANOSTICS, vol. 10, no. 11, 2020604, AU, pages 5011, XP055851640, ISSN: 1838-7640, DOI: 10.7150/thno.42742 *
MARTIN: "REMINGTON'S PHARM. SCI", 1995, MACK PUBL. CO.
MCCARTHY, D.P. ET AL., METHODS MOL BIOL, vol. 900, 2012, pages 381 - 401
See also references of EP4123019A4
YIN HU, SHAN-SHAN RAO, ZHEN-XING WANG, JIA CAO, YI-JUAN TAN, JUAN LUO, HONG-MING LI, WEI-SHE ZHANG, CHUN-YUAN CHEN, HUI XIE: "Exosomes from human umbilical cord blood accelerate cutaneous wound healing through miR-21-3p-mediated promotion of angiogenesis and fibroblast function", THERANOSTICS, vol. 8, no. 1, 1 January 2018 (2018-01-01), AU, pages 169 - 184, XP055634747, ISSN: 1838-7640, DOI: 10.7150/thno.21234 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN114369564A (zh) * 2021-12-21 2022-04-19 广州远想生物科技股份有限公司 一种枳雀来源外泌体的制备方法和应用
CN114369564B (zh) * 2021-12-21 2023-09-19 广州远想生物科技股份有限公司 一种枳雀来源外泌体的制备方法和应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP4123019A4 (en) 2024-04-17
EP4123019A1 (en) 2023-01-25
KR102615824B1 (ko) 2023-12-21
US20230218678A1 (en) 2023-07-13
KR20210117216A (ko) 2021-09-28

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Liu et al. Interaction of microglia and astrocytes in the neurovascular unit
Griesenauer et al. The ST2/IL-33 axis in immune cells during inflammatory diseases
Zi et al. Involvement of cystatin C in immunity and apoptosis
Yan et al. Immunomodulation of mesenchymal stromal cells on regulatory T cells and its possible mechanism
WO2012026712A2 (ko) Ｎｏｄ２의 아고니스트를 처리한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물
WO2018074758A2 (ko) 면역질환 치료를 위한 고효능 줄기세포 선별방법
WO2016209021A1 (ko) 자연살해세포의 증식 방법 및 자연살해세포 증식용 조성물
WO2016048107A1 (ko) 인터페론-감마 또는 인터류킨-1베타를 처리한 줄기세포 또는 그 배양물을 포함하는 면역질환 또는 염증질환의 예방 또는 치료용 약학조성물
WO2019103541A1 (ko) 그래핀 나노구조체를 포함하는 항염증용 조성물
WO2019198995A1 (ko) 엑소좀 기반의 면역세포의 교차분화 방법
WO2019117633A1 (ko) 아토피성 피부염, 탈모, 상처 또는 피부 주름의 개선용 화장료 조성물 및 약학 조성물
WO2021187911A1 (ko) 제대혈 혈장 유래의 엑소좀 또는 이의 모방체 및 이의 약학적 용도
CA2817538A1 (en) Immunomodulatory methods and systems for treatment and/or prevention of aneurysms
WO2017146538A1 (ko) 조절 t 세포 매개성 질환의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
Moravej et al. Mesenchymal stem cells increase skin graft survival time and up-regulate PD-L1 expression in splenocytes of mice
WO2021158091A2 (ko) 케모카인 억제제, 콜로니 자극 인자 억제제 및 면역항암제를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 조성물 및 병용 요법
WO2020091463A1 (ko) 분리된 미토콘드리아를 포함하는 건병증 예방 또는 치료용 약학 조성물
WO2016117960A1 (ko) 면역질환 치료 효능을 갖는 grim19이 과발현된 중간엽줄기세포 및 이의 용도
Tu et al. Human olfactory ensheathing cell-derived extracellular cesicles: miRNA profile and neuroprotective effect
Zegallai et al. Tafazzin deficiency in mouse mesenchymal stem cells promote reprogramming of activated B lymphocytes toward immunosuppressive phenotypes
KR102530161B1 (ko) 제대혈 혈장 유래의 엑소좀 또는 이의 모방체 및 이의 면역억제 용도
Todosenko et al. The pathogenic subpopulation of Th17 cells in obesity
WO2015023147A1 (ko) mTOR/STAT3 신호억제제 처리된 면역조절능을 갖는 간엽 줄기세포 및 이를 포함하는 면역질환의 예방 또는 치료용 세포치료제 조성물
WO2013162330A1 (ko) 키메라 중간엽 줄기세포군, 그의 제조방법 및 편도줄기세포를 이용하여 부갑상선 호르몬을 생산하는 방법
WO2020032782A1 (ko) 암항원 특이적 cd8+ t 세포의 제조 및 동결보존 방법

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 21772409

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

ENP Entry into the national phase

Ref document number: 2021772409

Country of ref document: EP

Effective date: 20221018