CN114369564B - 一种枳雀来源外泌体的制备方法和应用 - Google Patents

一种枳雀来源外泌体的制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种枳雀来源外泌体的制备方法和应用，涉及植物外泌体领域。制备方法包括：(1)将清洗后枳雀果实破碎并与缓冲溶液混合，加入0.05‑0.1wt％纤维素酶和0.1‑0.2wt％果胶酶进行酶解反应，酶解时间为8‑12h，获得酶解液；(2)将酶解液离心后收集上清液，再经过滤浓缩后得到浓缩液；(3)将浓缩液经Focurose 4FF凝胶层析色谱柱纯化后，洗脱收集样品峰得到枳雀来源外泌体。本申请采用纤维素酶和果胶酶对枳雀细胞的细胞壁进行水解，释放细胞间质的外泌体，过滤去除杂质有利于降低样品的粘稠度，采用Focurose 4FF凝胶层析色谱柱分离杂质，使样品纯度提高，避免了外泌体发生凝集的现象。

Description

一种枳雀来源外泌体的制备方法和应用
技术领域
本发明涉及植物外泌体领域，尤其涉及一种枳雀来源外泌体的制备方法和 应用。
背景技术
枳雀(拉丁名Citrus wilsonii):芸香科柑橘属，枳雀为多年生乔木，种 子成熟期为10-11月，主产中国陕南地区，生于海拔1100m以下地区，鲜果切 片晒干后可入药，用于治肝胃气滞、胸肋胀痛、脘腹痞满、呕吐噫气、痰多咳 嗽。近年来，研究人员对植物外泌体进行了研究，发现植物外泌体具有多种特 殊功效。如研究报道姜的外泌体样纳米颗粒(gingerexosome-like nanoparticles，GELN)可被肠道细菌摄取，易被乳杆菌吸收，所含的miRNA可直接调控特定细菌的基因表达和代谢物，从而影响菌群组成和宿主生理，增 强宿主肠道屏障功能来缓解小鼠的结肠炎。有研究结果表明，小麦外泌体对内 皮细胞、上皮细胞和真皮成纤维细胞具有惊人的促增殖和迁移作用，增加了内 皮细胞的管状结构形成，增强伤口愈合相关基因的表达，修饰协调血管的形成， 促进伤口愈合。目前枳雀来源的外泌体尚未见报道，而如何有效提取枳雀外泌体对其应用研究具有重要价值。
植物来源外泌体的提取方式主要通过植物组织匀浆破碎，超高速离心法等 过程提取。例如，在提取生姜类外泌时，将粗滤过的生姜汁在4℃下以10000g 离心1h，取上清液重复2-3次除去细胞碎片，再用100000g离心80min沉淀 得到生姜类外泌体。鱼腥草叶片来源类外泌体冻干粉采用鱼腥草叶片匀浆、离 心，超滤浓缩冻干制备而成。或者通过超高速离心方法提取干槐米、雪绒花愈 伤组织、滨海剌芹愈伤组织、海茴香愈伤组织中的外泌体。
但是目前最常用的超高速离心方法存在外泌体纯度不足，电镜鉴定时会发 现外泌体聚集成块，不利于后续实验。且枳雀果皮厚，果肉少，通过榨汁得到 的溶液粘稠不易于后续实验。这些方法都不适用于枳雀外泌体的提取，因此， 有必要开发一种针对枳雀来源外泌体的简洁、经济的制备技术。
发明内容
本发明提供了一种枳雀来源外泌体的制备方法和应用，以解决目前枳雀来 源外泌体提取过程存在的纯度不足、液体浓稠的技术问题。
为了解决上述技术问题，本发明目的之一提供了一种枳雀来源外泌体的制 备方法，包括以下步骤：
(1)将清洗后枳雀果实破碎并与缓冲溶液混合，加入0.05-0.1wt％纤维素 酶和0.1-0.2wt％果胶酶进行酶解反应，酶解时间为8-12h，获得酶解液；
(2)将酶解液离心后收集上清液，再经过滤浓缩后得到浓缩液；
(3)将浓缩液经Focurose 4FF凝胶层析色谱柱纯化后，洗脱收集样品峰得 到枳雀来源外泌体。
通过采用上述方案，由于枳雀果实的果皮厚果肉少的特点，采用纤维素酶 和果胶酶对枳雀细胞的细胞壁进行水解，控制纤维素酶和果胶酶的浓度可以保 证对枳雀细胞壁的完全水解，提高水解速率，缩短水解时间，释放细胞间质的 外泌体，通过超滤去除细胞组织，获得含外泌体的浓缩液，有利于降低外泌体 样品的粘稠度，采用Focurose 4FF凝胶层析色谱柱分离杂质，Focurose 4FF凝胶层析色谱柱的介质可以稳定结合外泌体分子，杂质分子在洗脱过程中分离，最 终通过高浓度的缓冲液洗脱Focurose 4FF凝胶层析色谱柱上结合的外泌体分子， 使样品纯度进一步提高，避免外泌体发生凝集现象。
作为优选方案，在步骤(2)离心过程中，将酶解液在3000rpm离心15-30min， 收集的上清液在9000-12000rpm离心15-30min，收集的上清液。
作为优选方案，在步骤(2)过滤浓缩过程中，将所述上清液经0.22μm板 式过滤器过滤，经再切向流超滤系统浓缩过滤，超滤膜截留分子量为100-300KDa， 浓缩比例为10-100倍，得到浓缩液。
通过采用上述方案，枳雀细胞经过酶解处理后，外泌体得以释放，在初次 离心过程中沉淀大部分的细胞组织，二次离心过程中沉淀细胞器官、线粒体等 杂质，通过分批次沉淀，提高纯度，经过滤浓缩后，可以得到含有外泌体的浓 缩液，澄清度较高。
作为优选方案，在步骤(3)中，所述凝胶层析色谱柱介质为交联4～6％的 琼脂糖或45-165μm干粒径的葡聚糖。
作为优选方案，在步骤(1)中，所述缓冲溶液为20-50mMol磷酸二氢钾、 20-50mMolNaCl和20-50mMolKCl，pH4.0-5.0，所述缓冲溶液与枳雀果实的质量 比为4：1。
作为优选方案，在步骤(3)中，纯化的洗脱缓冲液为20-50mM Na2HPO4、 20-50mMNaH2PO4、pH6.0-6.5。
作为优选方案，在步骤(1)中，酶解温度为20-30℃。
为了解决上述技术问题，本发明目的之二提供了一种枳雀来源外泌体在细 胞组织修复和细胞抗氧化产品中的应用。
相比于现有技术，本发明实施例具有如下有益效果：
1、本申请采用纤维素酶和果胶酶对枳雀细胞的细胞壁进行水解，释放细胞 间质的外泌体，通过超滤去除细胞组织，获得含外泌体的浓缩液，有利于降低 外泌体样品的粘稠度，采用Focurose 4FF凝胶层析色谱柱分离杂质，使样品纯度进一步提高，避免了外泌体发生凝集的现象。
2、枳雀细胞经过酶解处理后，外泌体得以释放，在初次离心过程中沉淀大 部分的细胞组织，二次离心过程中沉淀细胞器官、线粒体等杂质，通过分批次 沉淀，提高纯度，经过滤浓缩后，可以得到含有外泌体的浓缩液，澄清度较高。
附图说明
图1-为本发明实施例一中步骤(2)浓缩后枳雀来源外泌体的TEM表征结 果；
图2-为本发明实施例一中步骤(3)纯化后枳雀来源外泌体的TEM表征结 果；
图3-为本发明实施例一中步骤(3)纯化后枳雀来源外泌体的DLS表征结 果；
图4-为本发明效果例二中实施例一获得的枳雀来源外泌体的划痕修复能力 试验结果；
图5-为本发明效果例三中实施例一获得的枳雀来源外泌体不同浓度对细胞 增殖效果的统计结果；
图6-为本发明效果例二中实施例一获得的枳雀来源外泌体对细胞MDA含量 的影响的试验结果；
图7-为本发明效果例二中实施例一获得的枳雀来源外泌体对细胞CAT含量 的影响的试验结果；
图8-为本发明效果例二中实施例一获得的枳雀来源外泌体对细胞GSH-PX含 量的影响的试验结果；
图9-为本发明效果例二中实施例一获得的枳雀来源外泌体对细胞SOD含量 的影响的试验结果。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清 楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造 性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例一
一种枳雀来源外泌体的提取制备方法，包括以下步骤：
(1)取500g新鲜枳雀果实，清水洗净，将枳雀果实切成小碎片，按1:4比 例将枳雀果实与缓冲液混合，经榨汁机粉碎，加入0.1wt％纤维素酶和0.2wt％果 胶酶，在20℃进行酶解8h；
其中，缓冲液可以为20-50mM磷酸二氢钾、20-50mMNaCl和20-50mMKCl， pH4.0-5.0，在本实施例中，缓冲液为50mMol磷酸二氢钾、50mMolNaCl和 50mMolKCl，pH5.0；
(2)将枳雀果实酶解液，经3000rpm离心15-30min，在本实施例中，离 心时间为15min，收集上清液，进一步将收集的上清液再离心，9000-12000rpm 离心15-30min，在本实施例中，9000rpm离心30min，收集的上清液经0.22μm 板式过滤器过滤，经再切向流超滤系统浓缩过滤，超滤膜截留分子量为300KDa， 浓缩比例为100倍，得到浓缩液；
(3)将浓缩液经Focurose4FF凝胶层析色谱柱，凝胶层析色谱柱介质为交 联4～6％的琼脂糖，上样量为柱体积0.5～5％，通过缓冲液洗脱，流速为10cm/h， 收集样品峰，即为提纯后的枳雀外泌体；
其中，缓冲溶液为20-50mMol Na2HPO4、20-50mMol NaH2PO4、pH6.0-6.5。
实施例二
一种枳雀来源外泌体的提取制备方法，包括以下步骤：
(1)取500g新鲜枳雀果实，清水洗净，将枳雀果实切成小碎片，按1:4比 例将枳雀果实与缓冲液混合，经榨汁机粉碎，加入0.05wt％纤维素酶和0.1wt％ 果胶酶，在30℃进行酶解12h；
其中，缓冲液可以为20-50mM磷酸二氢钾、20-50mMNaCl和20-50mMKCl， pH4.0-5.0，在本实施例中，缓冲液为20mMol磷酸二氢钾、20mMolNaCl和 20mMolKCl，pH4.0；
(2)将枳雀果实酶解液，经3000rpm离心30min，收集上清液，进一步将 收集的上清液再离心，12000rpm离心15min，收集的上清液经0.22μm板式 过滤器过滤，经再切向流超滤系统浓缩过滤，超滤膜截留分子量为100KDa，浓 缩比例为10倍，得到浓缩液；
(3)将浓缩后的上清液经Focurose 4FF凝胶层析色谱柱，凝胶层析色谱 柱的介质为45-165μm干粒径的葡聚糖，上样量为柱体积0.5～5％，通过缓冲液 洗脱，流速为10cm/h，收集样品峰，即为提纯后的枳雀外泌体；
其中，缓冲溶液为20-50mMol Na2HPO4、20-50mMol NaH2PO4、pH6.0-6.5。
对比例一
一种枳雀来源外泌体的提取制备方法，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺 参数均与实施例一相同，不同的地方在于：在步骤(1)中，纤维素酶的添加量 为0.5wt％，果胶酶的添加量为0.4wt％，酶解温度为30℃，酶解时间为12h，最 终未收集到外泌体。
对比例二
一种枳雀来源外泌体的提取制备方法，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺 参数均与实施例一相同，不同的地方在于：在步骤(3)中，Focurose 4FF凝 胶层析色谱柱采用QFocurose 6XL，最终未收集到枳雀外泌体。
对比例三
一种枳雀来源外泌体的提取制备方法，各步骤及各步骤使用的试剂、工艺 参数均与实施例一相同，不同的地方在于：在步骤(3)中，Focurose 4FF凝 胶层析色谱柱采用CMFocurose 6XL，最终未收集到枳雀外泌体。
效果例一
枳雀来源外泌体的表征：
1、TEM表征外泌体：将实施例一步骤(2)获得浓缩后外泌体和步骤(3) 获得纯化后的外泌体取出10μL。吸取样品10μL滴加于铜网上沉淀1min， 滤纸吸去浮液，将醋酸双氧铀10μL滴加于铜网上沉淀1min，滤纸吸去浮液； 常温干燥数分钟；在100kv进行电镜检测成像。观察实施例一步骤(2)获得浓 缩后外泌体透射电镜成像结果如图1所示，溶液中存在大量杂质，未能很好的观测到外泌体；观察实施例一步骤(3)获得纯化后的外泌体透射电镜成像结果 如图2所示，外泌体结构完整，呈椭圆形双层膜状结构。
2、DLS方法表征外泌体：取出实施例一储存的外泌体，解冻后稀释到2mL， 放入检测槽，进行检测外泌体Zeta电位和粒径，检测结果如图3所示，粒径分 布都集中50-100nm左右。
效果例二
枳雀来源的外泌体细胞划痕修复检测，包括以下步骤：
(1)通过人皮肤成纤维细胞划痕试验检测了实施例一获得的枳雀果外泌体 对划痕修复的作用，将人皮肤成纤维细胞以2*105个/ml的细胞密度接种于6孔 板中，在培养箱中培养24h；
(2)用枪头笔直地划一条横线，用PBS洗细胞3次，去掉划下的细胞，加 入无血清培养基；
(3)分别设立空白对照组和枳雀外泌体测试组，枳雀外泌体测试组中枳雀 外泌体浓度为0.1μg/ul，放入37℃，5％CO2培养箱，培养24h时间点观察拍 照。
结果如图4所示，枳雀外泌体与阴性空白对照组相比，0.1μg/ul枳雀外泌 体具有较好的划痕修复能力。
效果例三
枳雀来源的外泌体促进细胞增殖的试验，包括以下步骤：
(1)CCK-8实验检测细胞增殖情况，将状态良好的人永生化表皮细胞 HaCaT均匀铺到96孔板中，待细胞贴壁之后，分别在孔里加入浓度为0、 0.0625μg/μL、0.125μg/μL、0.25μg/μL、0.5μg/μL、1μg/μL实施例一中枳雀愈伤 组织来源的外泌体，浓度0设立为空白对照组；
(2)培养48h后加入10μL CCK8试剂，37℃孵育2h后用酶标仪检测450 nm波长处的吸光度。
实验结果如图5所示，枳雀愈伤组织外泌体处理后的人永生化表皮细胞增 殖速度与空白对照组相比具有显著性差异，枳雀愈伤组织外泌体确实能显著促 进表皮细胞的增殖。
效果例四
枳雀来源的外泌体的抗氧化作用试验：采用H2O2损伤细胞模型，通过人 皮肤成纤维细胞检测细胞增殖、细胞活性氧簇(ROS)、丙二醛(MDA)、超氧 化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-PX)等 研究了实施例一枳雀外泌体抗氧化作用，具体方法如下：
(1)将人皮肤成纤维细胞以2*105个/ml的细胞密度接种于6孔板中，在 培养箱中培养24h；
(2)设立A：空白对照组、B：H2O2组、C：H2O2加Vc组(Vc浓度为200 mg/L)、D：H2O2加1μg/ml枳雀愈伤组织外泌体试验组，其中H2O2浓度为 300μmol/L，5％CO2、37℃条件下培养12h。
(3)吸去培养基，用PBS漂洗2遍，消化细胞，离心去上清，加入300μL 双蒸水，冰浴下使用细胞超声波破碎仪破碎细胞，离心取上清，按MDA、SOD、 CAT和GSH-PX试剂盒说明书步骤进行测定。
结果如图6-9所示，结果显示1μg/ml枳雀愈伤组织外泌体可有效降低H2O2 导致的成纤维细胞MDA含量升高，相比200mg/LVc效果更好；同时1μg/ml 枳雀愈伤组织外泌体也可修复H2O2导致的成纤维细胞SOD、CAT和GSH-PX 活性的降低，表明1μg/ml枳雀愈伤组织外泌体具有较好的细胞抗氧化作用。
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进 一步的详细说明，应当理解，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用 于限定本发明的保护范围。特别指出，对于本领域技术人员来说，凡在本发明 的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明 的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种枳雀来源外泌体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将清洗后枳雀果实破碎并与缓冲溶液混合，加入0.05-0.1wt％纤维素酶和0.1-0.2wt％果胶酶进行酶解反应，酶解时间为8-12h，获得酶解液；
(2)将酶解液离心后收集上清液，再经过滤浓缩后得到浓缩液；
(3)将浓缩液经Focurose 4FF凝胶层析色谱柱纯化后，洗脱收集样品峰得到枳雀来源外泌体。
2.如权利要求1所述的一种枳雀来源外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤(2)离心过程中，将酶解液在3000rpm离心15-30min，收集的上清液在9000-12000rpm离心15-30min，收集的上清液。
3.如权利要求2所述的一种枳雀来源外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤(2)过滤浓缩过程中，将所述上清液经0.22μm板式过滤器过滤，再经切向流超滤系统浓缩过滤，超滤膜截留分子量为100-300KDa，浓缩比例为10-100倍，得到浓缩液。
4.如权利要求1所述的一种枳雀来源外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述凝胶层析色谱柱介质为交联4～6％的琼脂糖或45-165μm干粒径的葡聚糖。
5.如权利要求1所述的一种枳雀来源外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述缓冲溶液为20-50mMol磷酸二氢钾、20-50mMol NaCl和20-50mMol KCl，pH4.0-5.0，所述缓冲溶液与枳雀果实的质量比为4：1。
6.如权利要求1所述的一种枳雀来源外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤(3)中，纯化的洗脱缓冲液为20-50mM Na2HPO4、20-50mM NaH2PO4、pH6.0-6.5。
7.如权利要求1所述的一种枳雀来源外泌体的制备方法，其特征在于，在步骤(1)中，酶解温度为20-30℃。
8.一种如权利要求1-7任一所述的枳雀来源外泌体在制备促细胞增殖和细胞抗氧化产品中的应用。
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