CN115161256B - 一种虎杖悬浮细胞、其外泌体及其制备方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物外泌体技术领域，公开了一种虎杖悬浮细胞、其外泌体及其制备方法和应用。本发明首次以虎杖愈伤组织为原材料，通过独特的培养方式，并利用凝胶层析色谱柱分离技术，成功获得虎杖外泌体。本发明所获得虎杖外泌体具有较好的细胞修复能力，可促进细胞划痕修复和细胞增殖，适用于需要具有细胞修复能力的药品、医美产品或护肤品中。

Description

一种虎杖悬浮细胞、其外泌体及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及植物外泌体技术领域，具体涉及一种虎杖悬浮细胞、其外泌体及其制备方法和应用。
背景技术
植物外泌体具有多种特殊功效。如姜的外泌体样纳米颗粒(ginger exosome-likenanoparticles，GELN)可被肠道细菌摄取，易被乳杆菌吸收，所含的miRNA可直接调控特定细菌的基因表达和代谢物，从而影响菌群组成和宿主生理，增强宿主肠道屏障功能来缓解小鼠的结肠炎。Sahin等人的研究结果表明，小麦外泌体对内皮细胞、上皮细胞和真皮成纤维细胞具有促增殖和迁移作用，增加了内皮细胞的管状结构形成，增强伤口愈合相关基因的表达，修饰协调血管的形成，促进伤口愈合。防风草来源的外泌体在抗氧化、抗炎、促进细胞增殖和迁移等方面均具有显著作用。
目前，植物来源外泌体的提取方式主要通过植物组织匀浆破碎，超高速离心法等过程提取。例如，在提取生姜类外泌体时，将粗滤过的生姜汁在低温条件下以高速离心，取上清液重复多次除去细胞碎片，再超高速离心沉淀得到生姜类外泌体。鱼腥草叶片来源类外泌体冻干粉采用鱼腥草叶片匀浆、离心，超滤浓缩冻干制备而成。如中国发明专利文献CN202010037118.7公开了一种植物来源外泌体及其制备方法和应用，其通过超高速离心方法提取了干槐米中的外泌体。中国发明专利文献CN202110131924.5通过超高速离心的方法提取了雪绒花愈伤组织、滨海剌芹愈伤组织、海茴香愈伤组织中的外泌体。
然而，超高速离心方法在植物外泌体的制备时存在如下问题：(1)因植物破碎液中存在大量的杂质干扰，且植物破碎液极易氧化，在氧化过程中会伴随着颜色变化及沉淀产生，超速离心提取时会产生干扰，且易产生杂质，外泌体纯度低。(2)超速离心设备昂贵，且分离效率低。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种虎杖悬浮细胞、其外泌体及其制备方法和应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种虎杖悬浮细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)取虎杖叶片，清洗、消毒，裁成小块，放置于固体诱导培养基中培养，得愈伤组织；
(2)取所述愈伤组织裁成小块，放入液体诱导培养基中培养，过滤去除聚集成团组织，即得悬浮细胞滤液；
(3)将所述悬浮细胞滤液接种至悬浮培养基中继代培养，即得虎杖悬浮细胞；
所述悬浮培养基为含有1.0mg/L-3.0mg/L2,4-D、0.5mg/L-2mg/L KT的液体MS培养基。
作为本发明所述虎杖悬浮细胞的制备方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，所述培养的条件为25℃±2℃、黑暗环境；培养时间为3-4周。
作为本发明所述虎杖悬浮细胞的制备方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，所述诱导培养基为含有20g/L-40g/L蔗糖、1.0mg/L-3.0mg/L 2,4-D、0.5mg/L-2mg/L KT、0.5mg/L-1.0mg/L 6-BA的MS培养基；所述MS培养基的pH值为5.6-6.0；所述培养的条件为25℃±2℃、黑暗环境；培养时间为3周-4周；转速为120rpm-150rpm。
作为本发明所述虎杖悬浮细胞的制备方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，所述接种的接种量为0.5％-1.5％；所述MS培养基的pH值为5.6-6.0；所述培养的条件为25℃±2℃、黑暗环境；培养时间为1-2周；转速为100rpm-120rpm。
优选的，所述小块的大小为(0.4cm-0.6cm)×(0.4cm-0.6cm)。
第二方面，本发明提供一种虎杖悬浮细胞的扩大培养方法，包括以下步骤：
(1)取所制备的虎杖悬浮细胞接种所述悬浮培养基中扩大培养；
(2)培养至4天-6天时，流加补料，所述补料为碳源、氮源、微量元素；
(3)培养至7天-8天时，加入0.08％-0.4％H2O2；
(4)继续培养15天-20天，即成。
作为本发明所述虎杖悬浮细胞扩大培养方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，所述接种的接种量为1％-10％；所述培养的条件为25℃±2℃，转速为100rpm-300rpm。
作为本发明所述虎杖悬浮细胞扩大培养方法的优选实施方式，所述步骤(2)中，所述碳源为50％葡萄糖溶液；所述氮源为10g/L NH4NO3；所述微量元素为1.0g H3BO3、2.0gMnSO4·4H2O、0.5g ZnSO4·7H2O、0.03g Na2MoO4·2H2O、1mg CuSO4·5H2O、1mg CoCl2·6H2O；所述补料采用阶段补料方式，每22h-26h补料一次，每次补料量逐级增加，初始补料量为培养体积的0.8％-1.2％。
第三方面，本发明提供一种由上述方法制备或培养的虎杖悬浮细胞。
第四方面，本发明提供一种虎杖外泌体的提取方法，包括以下步骤：
(1)取所述虎杖悬浮细胞，离心收集上清液；再次离心收集上清液；
(2)0.22μm滤膜过滤所述上清液，得滤液；
(3)取所述滤液经超滤膜包和/或中空纤维超滤膜处理，得浓缩滤液；
(4)将所述浓缩滤液经凝胶层析色谱柱处理，收集样品峰，即得。
作为本发明所述的虎杖外泌体的提取方法的优选实施方式，所述步骤(1)中，所述离心的转速为3000rpm-4000rpm，时间为30min-60min；所述再次离心的转速为9000-12000rpm，时间为30min-60min。
作为本发明所述的虎杖外泌体的提取方法的优选实施方式，所述步骤(3)中，所述超滤膜包和中空纤维超滤膜截留分子量为100KDa-700KDa，优选的，为100KDa，或300KDa，或500KDa，或700KDa。
作为本发明所述的虎杖外泌体的提取方法的优选实施方式，所述步骤(4)中，所述凝胶层析色谱柱介质为交联4～6％的琼脂糖或45μm-165μm干粒径的葡聚糖；所用缓冲溶液为20mM-50mM Na2HPO4、0.15M-2M NaCl pH7.0-7.2，上样量为柱体积0.5％～5％，通过缓冲液洗脱；流速为10cm/h-250cm/h。
第五方面，本发明提供一种由上述方法提取的虎杖外泌体。
第六方面，本发明将上述制备方法、上述培养方法、上述虎杖悬浮细胞、上述提取方法、上述虎杖外泌体在制备细胞修复产品中的应用。
作为本发明所述应用的优选实施方式，所述产品为药物或者化妆品。
进一步的，所述化妆品是医美用品、护肤品或美容产品。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明首次以虎杖愈伤组织为原材料，通过独特的培养方式，并利用凝胶层析色谱柱分离技术，成功获得虎杖外泌体。本发明所获得虎杖外泌体具有较好的细胞修复能力，可促进细胞划痕修复和细胞增殖，适用于需要具有细胞修复能力的药品、医美产品或护肤品中。
附图说明
图1为不同悬浮培养基制备的悬浮细胞数量统计图；
图2为虎杖外泌体电镜图；
图3为虎杖外泌体粒径测量统计图；
图4为虎杖外泌体的总蛋白浓度统计图之一；
图5为虎杖外泌体的总蛋白浓度统计图之二；
图6为虎杖外泌体的总蛋白浓度统计图之三；
图7为虎杖外泌体RNA浓度测定统计图；
图8为虎杖外泌体细胞划痕修复实验结果图；
图9为虎杖外泌体细胞增殖实验结果图。
具体实施方式
为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
虎杖(Reynoutria japonica Houtt.)，蓼科，属多年生草本植物。根状茎粗壮，叶宽卵形或卵状椭圆形，近革质，托叶鞘膜质，圆锥花序，花单性，雌雄异株，腋生；苞片漏斗状，花被淡绿色，瘦果卵形。根状茎多供药用，有活血、散瘀、通经、镇咳等功效。
实施例1：一种虎杖悬浮细胞的制备方法
该虎杖悬浮细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)取生长2-4周幼嫩的虎杖叶片，用自来水冲洗2小时，75％酒精消毒90s，0.1％HgCl2消毒10min，灭菌水清洗5-6次，裁剪成0.5cm×0.5cm的正方形小块，平整的放置在固体诱导培养基中，25℃、黑暗条件下培养4周，得到愈伤组织。
所述诱导培养基为含有20g/L蔗糖、1.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、0.5mg/LKT(激动素)、0.5mg/L 6-BA(6-苄氨基腺嘌呤)的MS培养基(pH5.8)。
(2)取得到的愈伤组织裁剪成0.5cm×0.5cm的正方形小块，放入液体诱导培养基中，在温度25℃±2℃、转数120-150rpm、黑暗条件下培养4周，过滤，去掉聚集成团组织，收获悬浮细胞，得虎杖悬浮细胞。
(3)按1％的接种量，将虎杖悬浮细胞接种至悬浮培养基中，在温度25℃±2℃、转数100-120rpm、黑暗条件下培养2周，得悬浮细胞种子。
所述悬浮培养基为含有1.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、0.5mg/L KT(激动素)的液体MS培养基(pH5.8)。
对比例1：一种虎杖悬浮细胞的制备方法
与实施例1不同之处在于：
在步骤(3)中，按1％的接种量，将虎杖悬浮细胞接种至液体MS培养基(pH5.8)中。
对比例2：一种虎杖悬浮细胞的制备方法
与实施例1不同之处在于：
在步骤(3)中，按1％的接种量，将虎杖悬浮细胞接种至含有1.0mg/L2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)的液体MS培养基(pH5.8)中。
对比例3：一种虎杖悬浮细胞的制备方法
与实施例1不同之处在于：
在步骤(3)中，按1％的接种量，将虎杖悬浮细胞接种至含有0.5mg/L KT(激动素)的液体MS培养基(pH5.8)中。
检测例1：
通过血球计数板计算实施例1、对比例1-3所制备悬浮细胞数量。
结果如图1所示，实施例1制备的悬浮细胞高达2.1×107个/mL，而无论步骤(3)中直接接种到液体MS培养中，还是接种至仅含有1.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)或0.5KT(激动素)的液体MS培养基(pH5.8)中，均不能得到大量悬浮细胞。
实施例2：虎杖悬浮细胞的扩大培养
该扩大培养的方法包括以下步骤：
(1)按10％的接种量，将实施例1制备的虎杖悬浮细胞接种至含有1.0mg/L 2,4-D(2,4-二氯苯氧乙酸)、0.5mg/L KT(激动素)的液体MS培养基(pH5.8)中培养，初始搅拌速度为100rpm/min，根据溶解氧含量，调节搅拌速度；
(2)培养至4-6天时，开始流加补充碳源(50％葡萄糖溶液)，氮源(10g//L NH4NO3)，微量元素(1.0g H3BO3、2.0g MnSO4·4H2O、0.5g ZnSO4·7H2O、0.03g Na2MoO4·2H2O、1mgCuSO4·5H2O、1mg CoCl2·6H2O)。采用阶段补料方式，每24h补料一次，每次补料量逐级增加，初始补料量为培养体积的1％；
(3)培养至7-8天时，加入0.1％H2O2，刺激悬浮细胞分泌外泌体；
(4)继续培养15天，即成。
培养过程中，培养温度为26℃。
对比例4：虎杖悬浮细胞的扩大培养
与实施例2不同之处在于：
在步骤(3)中，未加入H2O2。
对比例5：虎杖悬浮细胞的扩大培养
与实施例2不同之处在于：
在步骤(3)中，加入0.05％H2O2。
对比例6：虎杖悬浮细胞的扩大培养
与实施例2不同之处在于：
在步骤(3)中，未加入0.5％H2O2。
实施例3：虎杖外泌体的提取
该虎杖外泌体的提取方法包括以下步骤：
(1)取实施例2扩大培养的虎杖细胞悬浮培养液，3000rpm离心30min，收集上清液；
(2)将收集的上清液在9000rpm，离心30min，再次收集上清液；
(3)将再次收集的上清液经0.22μm板式过滤器过滤，得滤液；再将滤液经切向流超滤系统浓缩过滤，得浓缩滤液，超滤膜截留分子量为300KDa；
(4)将浓缩滤液经凝胶层析色谱柱处理，收集样品峰。即为提纯后的虎杖愈伤组织外泌体，冷冻储存。
其中，所述凝胶层析色谱柱介质为交联4％的琼脂糖，所用缓冲溶液为20mMNa2HPO4、0.15M NaCl pH7.0，上样量为柱体积0.5％～5％，通过缓冲液洗脱；流速为10～250cm/h。
对比例7：虎杖外泌体的提取
与实施例3不同之处在于：
在步骤(4)中，所用层析填料为Q Focurose 6XL(含有葡聚糖的高度交联6％的琼脂糖)。
对比例8：虎杖外泌体的提取
与实施例3不同之处在于：
在步骤(4)中，所用层析填料为CM Focurose 6XL(含有葡聚糖的高度交联6％的琼脂糖)。
对比例9：虎杖外泌体的提取
与实施例3不同之处在于：
在步骤(4)中，所用层析填料为所用层析填料为Focudex G-50(含有葡聚糖的高度交联6％的琼脂糖)。
对比例10：虎杖外泌体的提取
与实施例3不同之处在于：
在步骤(4)中，所述缓冲溶液为20mM柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液(pH6.0)
对比例11：虎杖外泌体的提取
与实施例3不同之处在于：
在步骤(4)中，所述缓冲溶液为20mM Tris-HCl缓冲液(pH8.0)。
检测例2：
(1)TEM表征外泌体
取实施例3提取的外泌体，解冻后取少量外泌体滴加到铜网上，再用醋酸双氧铀负染，用去离子水洗涤铜网两次，晾干，100kv进行电镜检测成像，获取的虎杖外泌体形态和大小。
结果如图2所示，获取的虎杖外泌体具有双层膜结构，直径在100nm左右，符合外泌体的形态特征。
(2)外泌体粒径测量
将实施例3提取的虎杖外泌体取出10μL稀释到30μL。先用标准品进行粒径分析仪(Zetasizer Nano ZS)仪器性能测试合格后进行虎杖外泌体样品上样。
如图3所示，所提取的外泌体粒径主要分布在50nm-100nm，平均粒径为68.57nm。
(3)外泌体总蛋白浓度定量检测
采用实施例3的提取方法分别提取对比例4-6扩大培养的悬浮细胞中的外泌体。
通过BCA蛋白浓度测定试剂盒(Solarbio，货号：PC0020)检测总蛋白含量，根据说明书制作标准曲线，外泌体总蛋白经酶标仪上在OD562nm处检测吸光值。分别检测是实施例3提取的外泌体、采用实施例3的提取方法分别提取对比例4-6扩大培养的悬浮细胞中的外泌体、对比例7-11提取的外泌体的总蛋白含量。
结果如图4、图5、图6所示，实施例2的添加0.1％H2O2进行刺激，提取的虎杖外泌体的总蛋白浓度最高，为0.212ug/ul。表明0.1％H2O2可有效增加虎杖外泌体产量。实施例3中选用的层析填料和层析溶液，产量最高。
(4)外泌体RNA浓度测定
采用实施例3的提取方法分别提取对比例4-6扩大培养的悬浮细胞中的外泌体。
通过外泌体RNA提取试剂盒(Norgen Biotek，NGB-58000)分别提取虎杖外泌体RNA。将提取好的RNA各取出1μL进行染色，并在Quantus Fluorometer上测定RNA浓度。分别检测是实施例3提取的外泌体、采用实施例3的提取方法分别提取对比例4-6扩大培养的悬浮细胞中的外泌体的RNA浓度。
结果如图7所示，实施例2的添加0.1％H2O2进行刺激，提取的虎杖外泌体的总RNA含量最高。
试验例1：细胞划痕修复实验
取实施例3提取的虎杖外泌体进行细胞划痕修复实验，通过人皮肤成纤维细胞划痕试验检测了虎杖愈伤组织外泌体对划痕修复的作用。
将人皮肤成纤维细胞以2×105个/ml的细胞密度接种于6孔板中，在培养箱中培养24h。用枪头笔直的划一条横线，用PBS洗细胞3次，去掉划下的细胞，加入无血清培养基。
分别设立空白对照组、虎杖外泌体测试组，虎杖外泌体浓度为1ug/ml。放入37℃、5％CO2培养箱培养，在0h，24h时间点观察拍照。
结果如图8所示，虎杖外泌体测试组与空白对照组相比，1ug/ml虎杖外泌体具有明显的划痕修复能力。
试验例2：细胞增殖实验
取实施例3提取的虎杖外泌体进行细胞增殖CCK-8实验检测细胞增殖情况。
将状态良好的人永生化表皮细胞HaCaT均匀铺到96孔板中，待细胞贴壁之后，分别在孔里加入0、0.0625μg/μl、0.125μg/μl、0.25μg/μl、0.5μg/μl、1μg/μl实施例3提取的虎杖外泌体。空白对照组无处理。48h后加入10μL CCK8试剂，37℃孵育2h后用酶标仪检测450nm波长处的吸光度。
结果如图9所示，虎杖外泌体处理后的人永生化表皮细胞增殖速度与空白对照组的人永生化表皮细胞增殖速度有显著性差异，虎杖愈伤组织外泌体能显著促进表皮细胞的增殖,虎杖外泌体的浓度为0.0625μg/μl、0.125μg/μl、0.25μg/μl、0.5μg/μl时，促进表皮细胞增殖的效果随着外泌体浓度的增加而增强，当虎杖外泌体的浓度为1μg/μl时，促进表皮细胞增殖的效果略逊于0.5μg/μl的虎杖外泌体，即0.5μg/μl的虎杖外泌体促人永生化表皮细胞增殖效果最佳。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims (6)

1.一种虎杖悬浮细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取虎杖叶片，清洗、消毒，裁成小块，放置于固体诱导培养基中培养，得愈伤组织；
(2)取所述愈伤组织裁成小块，放入液体诱导培养基中培养，过滤去除聚集成团组织，即得悬浮细胞滤液；
所述诱导培养基为含有20g/L-40g/L蔗糖、1.0mg/L-3.0mg/L 2,4-D、0.5mg/L-2mg/LKT、0.5mg/L-1.0mg/L 6-BA的MS培养基；所述MS培养基的pH值为5.6-6.0；所述培养的条件为25℃±2℃、黑暗环境；培养时间为3周-4周；
(3)将所述悬浮细胞滤液接种至悬浮培养基中继代培养，即得虎杖悬浮细胞；
所述悬浮培养基为含有1.0mg/L-3.0mg/L2,4-D、0.5mg/L-2mg/L KT的液体MS培养基。
2.一种虎杖悬浮细胞的扩大培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取权利要求1所制备的虎杖悬浮细胞接种所述悬浮培养基中扩大培养；
(2)培养至4天-6天时，流加补料，所述补料为碳源、氮源、微量元素；
(3)培养至7天-8天时，加入0.08％-0.4％H2O2；
(4)继续培养15天-20天，即成。
3.根据权利要求2所述虎杖悬浮细胞的扩大培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中，所述碳源为50％葡萄糖溶液；所述氮源为10g/L NH4NO3；所述微量元素为1.0g H3BO3、2.0gMnSO4·4H2O、0.5g ZnSO4·7H2O、0.03gNa2MoO4·2H2O、1mg CuSO4·5H2O、1mg CoCl2·6H2O。
4.一种由权利要求1所述制备方法、由权利要求2或3所述培养方法所制备或培养的虎杖悬浮细胞。
5.一种虎杖外泌体的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取权利要求4所述虎杖悬浮细胞，离心收集上清液；再次离心收集上清液；
(2)0.22μm滤膜过滤所述上清液，得滤液；
(3)取所述滤液经超滤膜包和/或中空纤维超滤膜处理，得浓缩滤液；
所述超滤膜包和/或中空纤维超滤膜的截留分子量为100KDa-700 KDa；
(4)将所述浓缩滤液经凝胶层析色谱柱处理，收集样品峰，即得；
所述凝胶层析色谱柱介质为交联4％-6％的琼脂糖；所用缓冲溶液为20mM-50mMNa2HPO4、0.15M-2M NaCl，pH7.0-7.2；上样量为柱体积0.5％～5％，流速为10cm/h-250cm/h。
6.权利要求4所述虎杖悬浮细胞、权利要求5所述提取方法提取的虎杖外泌体在制备细胞增殖产品中的应用。
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