CN105580735A - 一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液及培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液及培养方法，所述培养液是由MS基础培养基、6-苄氨基嘌呤、6-糖基氨基嘌呤、萘乙酸、精胺、亚精胺、蔗糖组成，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为0.5~1.8？mg/L，所述6-糖基氨基嘌呤的浓度为0.3~1.0？mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.15~0.45？mg/L，所述精胺的浓度为1.0~4.5？mg/L，所述亚精胺的浓度为0.5~1.25？mg/L，所述蔗糖浓度为20~50g/L；培养液pH为5~6。使用本发明的培养液对虎杖愈伤组织进行培养，白藜芦醇的含量可达细胞干重的0.12~0.18%，具有提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇的含量的有益效果。

Description

一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液及培养方法

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液及培养方法。

技术背景

白藜芦醇（resveratrol，简称Res）是一种含有芪类结构的非黄酮多酚化合物，化学名称为3,4,5—三羟基二苯乙烯（亦称芪三酚），它广泛存在于虎杖、花生、葡萄、黎芦等多种天然植物或果实中，目前已在21个科31个属的72种植物中被发现，其中以虎杖根茎部位中含量最为丰富。

白藜芦醇具有抗癌、抗肿瘤、抗心血管疾病、抗炎、抗氧化等多种功能，被广泛应用于医药以及食品保健等行业中。在化妆品行业中，白藜芦醇则发挥其捕获自由基、抗氧化和抑制络氨酸酶活性的特性。市售的白黎芦醇主要从野生虎杖根茎中提取而得，但植物提取技术面临成本高、工艺复杂、得率低，植物资源有限等问题。此外，白黎芦醇是在植物受到异常刺激时才会产生的一种次生代谢产物，所以天然植物资源中白黎芦醇的含量极低，有限的天然植物资源根本无法满足日益增长的市场需求。

近年来，随着生物技术的迅猛发展，许多学者将研究目光转向于利用植物组织培养来获得高产量白藜芦醇。此法可大大加快植物细胞的生长，提高目标物质的含量，并且不受地理、季节和气候条件的限制，能节省野生植物和土地资源，具有生长周期短，经济效益显著等优点。现阶段的研究热点主要集中在解决愈伤组织诱导过程中出愈率不高这一问题上，而关于增加白藜芦醇产量的研究尚处起步阶段。诱导子是一类可以引起代谢途径改变或代谢强度改变的物质。文献表明，诱导子可诱发植物产生植物抗毒素，在植物次生代谢的调控及其细胞内信息传递等方面具有重要作用。但针对诱导虎杖愈伤组织产生白藜芦醇这方面的研究工作来说，已被证实有效的诱导子种类并不多，仅有紫外线、真菌诱导子、茉莉酸及其衍生物、水杨酸等少数几种。文涛等人研究了光照强度对虎杖愈上组织中白藜芦醇积累的影响，结果表明，弱光更利于白藜芦醇的生成，弱光培养的茎愈伤组织干样中白藜芦醇含量达到140.074μg/g；李卓玺选用黑曲霉与反-香豆酸对虎杖愈伤组织进行诱导，最优条件下，愈伤组织中白藜芦醇含量为264.58μg/g；杜坤玉则发现壳聚糖对白藜芦醇的合成有促进作用，当壳聚糖浓度为50mg/L时，愈伤组织中白藜芦醇含量最高，达到256.56μg/g。在现有报道中，经特定诱导子处理后白藜芦醇占愈伤组织细胞干重的0.01~0.03%，仍无法满足市场需求，因此，寻找一种高效的诱导子以提高白藜芦醇的含量成为亟待解决的问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液及培养方法。

一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液，其特征在于：在MS基础培养基中添加6-苄氨基嘌呤（6-BA）、6-糖基氨基嘌呤（KT）、萘乙酸（NAA）、精胺、亚精胺、蔗糖，添加后所述6-苄氨基嘌呤的浓度为0.5~1.8mg/L，所述6-糖基氨基嘌呤的浓度为0.3~1.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.15~0.45mg/L，所述精胺的浓度为1.0~4.5mg/L，所述亚精胺的浓度为0.5~1.25mg/L，所述蔗糖浓度为20~50g/L；培养液pH为5~6。

一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养方法，其特征在于采用以下步骤：

A、虎杖愈伤组织的诱导：选择虎杖茎段为外植体，在培养基中暗光（0lx）培养25天，诱导出愈伤组织，每20天继代一次，继代培养3次；所述培养基为MS基础培养基中添加6-苄氨基嘌呤、6-糖基氨基嘌呤、萘乙酸、精胺、亚精胺、蔗糖而成，所述培养基中6-苄氨基嘌呤浓度为1.0mg/L，6-糖基氨基嘌呤浓度为0.5mg/L，萘乙酸浓度为0.2mg/L，蔗糖浓度为30g/L，琼脂浓度为8g/L，培养基pH5.8，培养温度25±1^oC；

B、愈伤组织悬浮扩大培养及次生代谢产物白藜芦醇的诱导：以步骤A中获得的生长旺盛、疏松、易散的愈伤组织为悬浮培养体系的种子细胞，将其接种在一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液中进行悬浮扩大培养，接种量为60~110g/L，g/L=愈伤组织鲜重/培养基体积，得到含有愈伤组织的培养液；所述一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液是含有0.5~1.8mg/L6-苄氨基嘌呤、0.3~1.0mg/L6-糖基氨基嘌呤、0.15~0.45mg/L萘乙酸、1.0~4.5mg/L精胺、0.5~1.25mg/L亚精胺、20~50g/L蔗糖的MS培养液，培养液pH为5~6；对所得含有愈伤组织的培养液进行诱导悬浮培养，诱导悬浮培养的条件为：振荡培养，摇床转速90~130rpm，光照强度1280~1760lx，光照时间12~16h/day，培养温度25±1^oC，培养过程中每天向培养液中充入清洁无菌空气一次；每12~16天继代培养一次，继代培养2~4次后将继代周期缩短至6~10天，缩短继代周期后继续培养3~5代；在诱导悬浮培养继代周期的第4~8天，继代周期缩短后则在第2~5天时加入甲瓦龙酸内酯，甲瓦龙酸内酯在培养液中的终浓度为50~120mg/L，诱导悬浮培养结束后得到白藜芦醇含量高的虎杖愈伤组织细胞。

经过测定，由本发明培养液及培养方法培养的虎杖愈伤组织细胞，与现有培养基相比，在相同培养周期内，白藜芦醇的含量可达细胞干重的0.12~0.18%，与目前已报道的植物组织培养方式相比，含量提升4~18倍，本发明具有提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇的含量的有益效果。

本发明提供一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液及培养方法。本发明的优点为：1）在次生代谢产物积累过程即悬浮细胞培养阶段的特定时期，加入非生物诱导子甲瓦龙酸内酯进行诱导，可增强白藜芦醇在植物细胞中合成的关键酶——苯丙氨酸裂解酶（PAL）的活性，从而刺激白藜芦醇的生成和不断积累；2）培养液中精胺、亚精胺的加入可促进虎杖细胞的增殖，延长细胞的指数生长期与直线生长期，与现有培养基相比，在相同培养周期内，细胞生物量（每单位体积培养基的细胞干重，g/L）增加62%~88%，从而进一步提高白藜芦醇的产量。本发明方法具有操作简单、高效天然、快速稳定、经济环保等优点。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步说明，但本发明并不局限于以下实施例。

实施例1：

一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养方法，采用以下步骤：

A、外植体材料选取与预处理：选择苗龄为一周左右生长茁壮的虎杖茎段为外植体。先将虎杖的茎剪成5~10cm的茎段，流水冲洗2~3h，将茎放置到已灭菌的超净工作台上，用无菌水浸泡10min，然后用75%乙醇—水溶液浸泡消毒30s，无菌水冲洗2~3次，再用10%NaClO溶液消毒5min，最后用无菌水浸泡材料3次，时间分别为10min，5min，3min，放在无菌滤纸上晾干；用刀切除茎段两端的旧切面，剪成0.5×0.5cm左右的小段备用；

B、虎杖愈伤组织的诱导：将步骤A中已消毒的外植体接入固体培养基，培养基组成为MS培养基+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKT+0.2mg/LNAA，30g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH5.8，温度25±1^oC，在暗光（0lx）下培养25天，诱导出愈伤组织；选择质地疏松、颜色淡黄的新鲜愈伤组织进行继代培养，每20天继代一次，在相同固体培养基上继代培养3次；

C、愈伤组织悬浮扩大培养：与次生代谢产物白藜芦醇的诱导：以步骤B中继代3次后获得的生长旺盛、疏松、易散的愈伤组织为悬浮培养体系的种子细胞，将其接种在悬浮细胞培养液中（配方见附表2），接种量为65g/L，g/L=愈伤组织鲜重/培养基体积；将接种完成的悬浮细胞培养基进行悬浮振荡培养，摇床转速90rpm，光照强度1340lx，光照时间16h/day，培养温度25±1^oC，培养过程中每天向培养液中充入清洁无菌空气一次。每14天继代培养一次，并在悬浮培养周期的第4天于悬浮细胞培养液中加入甲瓦龙酸内酯，使其终浓度为75mg/L，继代培养2次后将继代周期缩短至8天，继续培养4代，此时甲瓦龙酸内酯的加入时间为培养周期的第3天。悬浮细胞培养液即为可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液。

培养结束后，用高效液相色谱（HPLC）测定白藜芦醇含量，结果表明白藜芦醇含量占细胞干重的0.172%。

实施例2：

一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养方法，采用以下步骤：

A、外植体材料选取与预处理：选择苗龄为一周左右生长茁壮的虎杖茎段为外植体。先将虎杖的茎剪成5~10cm的茎段，流水冲洗2~3h，将茎放置到已灭菌的超净工作台上，用无菌水浸泡10min，然后用75%乙醇—水溶液浸泡消毒30s，无菌水冲洗2~3次，再用10%NaClO溶液消毒5min，最后用无菌水浸泡材料3次，时间分别为10min，5min，3min，放在无菌滤纸上晾干；用刀切除茎段两端的旧切面，剪成0.5×0.5cm左右的小段备用；

B、虎杖愈伤组织的诱导：将步骤A中已消毒的外植体接入固体培养基，培养基组成为MS培养基+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKT+0.2mg/LNAA，30g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH5.8，温度25±1^oC，在暗光（0lx）下培养25天，诱导出愈伤组织。选择质地疏松、颜色淡黄的新鲜愈伤组织进行继代培养，每20天继代一次，在相同固体培养基上继代培养3次；

C、愈伤组织悬浮扩大培养与次生代谢产物白藜芦醇的诱导：以步骤B中继代3次后获得的生长旺盛、疏松、易散的愈伤组织为悬浮培养体系的种子细胞，将其接种在悬浮细胞培养液中（配方见附表3），接种量为80g/L（愈伤组织鲜重/培养基体积）。将接种完成的悬浮细胞培养基进行悬浮振荡培养，摇床转速100rpm，光照强度1560lx，光照时间14h/day，培养温度25±1^oC，培养过程中每天向培养液中充入清洁无菌空气一次。每14天继代培养一次，并在悬浮培养周期的第6天于悬浮细胞培养液中加入甲瓦龙酸内酯，使其终浓度为50mg/L，继代培养3次后将继代周期缩短至6天，继续培养3代，此时甲瓦龙酸内酯的加入时间为培养周期的第2天。悬浮细胞培养液即为可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液。

培养结束后，用高效液相色谱（HPLC）测定白藜芦醇含量，结果表明白藜芦醇含量占细胞干重的0.161%。

实施例3:

一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养方法，采用以下步骤：

A、外植体材料选取与预处理：

选择苗龄为一周左右生长茁壮的虎杖茎段为外植体。先将虎杖的茎剪成5~10cm的茎段，流水冲洗2~3h，将茎放置到已灭菌的超净工作台上，用无菌水浸泡10min，然后用75%乙醇—水溶液浸泡消毒30s，无菌水冲洗2~3次，再用10%NaClO溶液消毒5min，最后用无菌水浸泡材料3次，时间分别为10min，5min，3min，放在无菌滤纸上晾干；用刀切除茎段两端的旧切面，剪成0.5×0.5cm左右的小段备用；

B、虎杖愈伤组织的诱导：将步骤A中已消毒的外植体接入固体培养基，培养基组成为MS培养基+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKT+0.2mg/LNAA，30g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH5.8，温度25±1^oC，在暗光（0lx）下培养25天，诱导出愈伤组织。选择质地疏松、颜色淡黄的新鲜愈伤组织进行继代培养，每20天继代一次，在相同固体培养基上继代培养3次；

C、愈伤组织悬浮扩大培养与次生代谢产物白藜芦醇的诱导：以步骤B中继代3次后获得的生长旺盛、疏松、易散的愈伤组织为悬浮培养体系的种子细胞，将其接种在悬浮细胞培养液中（配方见附表4），接种量为95g/L（愈伤组织鲜重/培养基体积）。将接种完成的悬浮细胞培养基进行悬浮振荡培养，摇床转速115rpm，光照强度1680lx，光照时间13h/day，培养温度25±1^oC，培养过程中每天向培养液中充入清洁无菌空气一次。每12天继代培养一次，并在悬浮培养周期的第7天于悬浮细胞培养液中加入甲瓦龙酸内酯，使其终浓度为100mg/L，继代培养4次后将继代周期缩短至8天，继续培养3代，此时甲瓦龙酸内酯的加入时间为培养周期的第4天。悬浮细胞培养液即为可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液。

培养结束后，用高效液相色谱（HPLC）测定白藜芦醇含量，结果表明白藜芦醇含量占细胞干重的0.154%。

实施例4:

一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养方法，采用以下步骤：

A、外植体材料选取与预处理：选择苗龄为一周左右生长茁壮的虎杖茎段为外植体。先将虎杖的茎剪成5~10cm的茎段，流水冲洗2~3h，将茎放置到已灭菌的超净工作台上，用无菌水浸泡10min，然后用75%乙醇—水溶液浸泡消毒30s，无菌水冲洗2~3次，再用10%NaClO溶液消毒5min，最后用无菌水浸泡材料3次，时间分别为10min，5min，3min，放在无菌滤纸上晾干；用刀切除茎段两端的旧切面，剪成0.5×0.5cm左右的小段备用；

B、虎杖愈伤组织的诱导：将步骤A中已消毒的外植体接入MS培养基，培养基组成为MS培养基+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKT+0.2mg/LNAA，30g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH5.8，温度25±1^oC，在暗光（0lx）下培养25天，诱导出愈伤组织。选择质地疏松、颜色淡黄的新鲜愈伤组织进行继代培养，每20天继代一次，在相同固体培养基上继代培养3次；

C、愈伤组织悬浮扩大培养与次生代谢产物白藜芦醇的诱导：以步骤B中继代3次后获得的生长旺盛、疏松、易散的愈伤组织为悬浮培养体系的种子细胞，将其接种在悬浮细胞培养液中（配方见附表5），接种量为110g/L（愈伤组织鲜重/培养基体积）。将接种完成的悬浮细胞培养基进行悬浮振荡培养，摇床转速130rpm，光照强度1760lx，光照时间12h/day，培养温度25±1^oC，培养过程中每天向培养液中充入清洁无菌空气一次。每16天继代培养一次，并在悬浮培养周期的第5天于悬浮细胞培养液中加入甲瓦龙酸内酯，使其终浓度为120mg/L，继代培养2次后将继代周期缩短至9天，继续培养5代，此时甲瓦龙酸内酯的加入时间为培养周期的第5天。悬浮细胞培养液即为可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液。

培养结束后，用高效液相色谱（HPLC）测定白藜芦醇含量，结果表明白藜芦醇含量占细胞干重的0.148%。

实施例5:

一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养方法，采用以下步骤：

A、外植体材料选取与预处理：选择苗龄为一周左右生长茁壮的虎杖茎段为外植体。先将虎杖的茎剪成5~10cm的茎段，流水冲洗2~3h，将茎放置到已灭菌的超净工作台上，用无菌水浸泡10min，然后用75%乙醇—水溶液浸泡消毒30s，无菌水冲洗2~3次，再用10%NaClO溶液消毒5min，最后用无菌水浸泡材料3次，时间分别为10min，5min，3min，放在无菌滤纸上晾干；用刀切除茎段两端的旧切面，剪成0.5×0.5cm左右的小段备用；

B、虎杖愈伤组织的诱导：将步骤A中已消毒的外植体接入MS培养基，培养基组成为MS培养基+1.0mg/L6-BA+0.5mg/LKT+0.2mg/LNAA，30g/L蔗糖，8g/L琼脂，pH5.8，温度25±1^oC，在暗光（0lx）下培养25天，诱导出愈伤组织。选择质地疏松、颜色淡黄的新鲜愈伤组织进行继代培养，每20天继代一次，在相同固体培养基上继代培养3次；

C、愈伤组织悬浮扩大培养与次生代谢产物白藜芦醇的诱导：以步骤B中继代3次后获得的生长旺盛、疏松、易散的愈伤组织为悬浮培养体系的种子细胞，将其接种在悬浮细胞培养液中（配方见附表6），接种量为70g/L（愈伤组织鲜重/培养基体积）。将接种完成的悬浮细胞培养基进行悬浮振荡培养，摇床转速105rpm，光照强度1500lx，光照时间15h/day，培养温度25±1^oC，培养过程中每天向培养液中充入清洁无菌空气一次。每12天继代培养一次，并在悬浮培养周期的第8天于悬浮细胞培养液中加入甲瓦龙酸内酯，使其终浓度为120mg/L，继代培养4次后将继代周期缩短至6天，继续培养5代，此时甲瓦龙酸内酯的加入时间为培养周期的第3天。悬浮细胞培养液即为可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液。

培养结束后，用高效液相色谱（HPLC）测定白藜芦醇含量，结果表明白藜芦醇含量占细胞干重的0.135%。

表1.MS培养基的基本组成

表2.实施例1的悬浮细胞培养液配方

成分	含量（mg/L）	成分	含量（mg/L）
				MS培养基	见附表1	精胺	1.0
6-BA	0.5	亚精胺	0.5
				KT	0.3	蔗糖	40
NAA	0.15	pH	5.2

表3.实施例2的悬浮细胞培养液配方

成分	含量（mg/L）	成分	含量（mg/L）
				MS培养基	见附表1	精胺	2.4
6-BA	0.8	亚精胺	0.75
				KT	0.5	蔗糖	40
NAA	0.3	pH	5.4

表4.实施例3的悬浮细胞培养液配方

成分	含量（mg/L）	成分	含量（mg/L）
				MS培养基	见附表1	精胺	3.8
6-BA	1.2	亚精胺	0.75
				KT	0.75	蔗糖	50
NAA	0.35	pH	5.4

表5.实施例4的悬浮细胞培养液配方

成分	含量（mg/L）	成分	含量（mg/L）
				MS培养基	见附表1	精胺	1.8
6-BA	1.65	亚精胺	1.10
				KT	0.90	蔗糖	30
NAA	0.40	pH	6.0

表6.实施例5的悬浮细胞培养液配方

成分	含量（mg/L）	成分	含量（mg/L）
				MS培养基	见附表1	精胺	4.5
6-BA	1.8	亚精胺	1.25
				KT	1.0	蔗糖	20
NAA	0.45	pH	5.8

Claims (2)

1.一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液，其特征在于：在MS基础培养基中添加6-苄氨基嘌呤、6-糖基氨基嘌呤、萘乙酸、精胺、亚精胺、蔗糖，添加后，所述6-苄氨基嘌呤的浓度为0.5~1.8mg/L，所述6-糖基氨基嘌呤的浓度为0.3~1.0mg/L，所述萘乙酸的浓度为0.15~0.45mg/L，所述精胺的浓度为1.0~4.5mg/L，所述亚精胺的浓度为0.5~1.25mg/L，所述蔗糖浓度为20~50g/L；培养液pH为5~6。

2.一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养方法，其特征在于采用以下步骤：

A、虎杖愈伤组织的诱导：选择虎杖茎段为外植体，在培养基中暗光（0lx）培养25天，诱导出愈伤组织，每20天继代一次，继代培养3次；所述培养基为MS基础培养基中添加6-苄氨基嘌呤、6-糖基氨基嘌呤、萘乙酸、精胺、亚精胺、蔗糖而成，所述培养基中6-苄氨基嘌呤浓度为1.0mg/L，6-糖基氨基嘌呤浓度为0.5mg/L，萘乙酸浓度为0.2mg/L，蔗糖浓度为30g/L，琼脂浓度为8g/L，培养基pH5.8，培养温度25±1^oC；

B、愈伤组织悬浮扩大培养及次生代谢产物白藜芦醇的诱导：以步骤A中获得的生长旺盛、疏松、易散的愈伤组织为悬浮培养体系的种子细胞，将其接种在一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液中进行悬浮扩大培养，接种量为60~110g/L，g/L=愈伤组织鲜重/培养基体积，得到含有愈伤组织的培养液；所述一种可提高虎杖愈伤组织中白藜芦醇含量的培养液是含有0.5~1.8mg/L6-苄氨基嘌呤、0.3~1.0mg/L6-糖基氨基嘌呤、0.15~0.45mg/L萘乙酸、1.0~4.5mg/L精胺、0.5~1.25mg/L亚精胺、20~50g/L蔗糖的MS培养液，培养液pH为5~6；对所得含有愈伤组织的培养液进行诱导悬浮培养，诱导悬浮培养的条件为：振荡培养，摇床转速90~130rpm，光照强度1280~1760lx，光照时间12~16h/day，培养温度25±1^oC，培养过程中每天向培养液中充入清洁无菌空气一次；每12~16天继代培养一次，继代培养2~4次后将继代周期缩短至6~10天，缩短继代周期后继续培养3~5代；在诱导悬浮培养继代周期的第4~8天，继代周期缩短后则在第2~5天时加入甲瓦龙酸内酯，甲瓦龙酸内酯在培养液中的终浓度为50~120mg/L，诱导悬浮培养结束后得到白藜芦醇含量高的虎杖愈伤组织细胞。