CN108815113A - 一种高含量白藜芦醇植物提取物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种高含量白藜芦醇决明子提取物的制备方法，包括以下步骤：A、挑选颗粒饱满完整、色泽鲜艳有光泽的决明子，消毒后接种于决明子愈伤组织诱导培养基，诱导出决明子愈伤组织；B、制备高产白藜芦醇决明子干细胞培养液；C、选取步骤A所得的决明子愈伤组织作为种子，装入高产白藜芦醇决明子干细胞培养液中悬浮培养，得决明子干细胞固体粉末；D、将步骤C获得的决明子干细胞固体粉进行破壁处理；E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:（2‑3）混合，过滤，冷冻结晶，分离出柱型结晶，得高含量白藜芦醇决明子提取物。本发明具有所得白藜芦醇决明子提取物得率高，白藜芦醇决明子提取物中白藜芦醇含量高的优点。

Description

一种高含量白藜芦醇植物提取物的制备方法
技术领域
本发明涉及植物干细胞培养技术领域，具体涉及一种高含量白藜芦醇植物提取物的制备方法。
背景技术
白藜芦醇(resveratrol：trans-3，5，4’-trihydroxystilbene)是一种芪类化合物(stilbenes)，简写为Res，存在于一些药用植物和食用植物中，如决明、藜芦、虎杖、葡萄、花生。
白藜芦醇(Res)既是肿瘤疾病的化学预防剂，也是对降低血小板聚集，预防、治疗动脉粥样硬化，心脑血管疾病的化学预防剂，抑制血小板非正常凝聚，预防心肌硬塞、脑栓塞，对缺氧心脏有保护作用，对烧伤或失血性休克引起的心输出量下降有效恢复，并能够扩张动脉血管及改善微循环。除此之外，白藜芦醇(Res)也是一种抗自由基、抗氧化剂，与之相关的功能如下：1、延缓衰老；2、阻止低密度脂蛋白的氧化，具有潜在的防治心血管疾病(动脉粥样硬化和冠心病、缺血性心脏病、高血脂症等)的作用；3、影响脂类及花生四烯酸代谢；4、抗血栓、抗血小板聚集5、抗炎、抗过敏作用。
近年来，白藜芦醇(Res)提取物的原料来源是虎杖等植物，这些植物随着白藜芦醇(Res)市场紧俏，虎杖原料的消耗量越来越大，其植物资源日渐匮乏，原料价格逐步攀升，最终使得白藜芦醇(Res)的生产成本也大大提高。为此，从决明子有关成分中制备白藜芦醇(Res)提取物成为了材料稳定、性价比高的有效途径。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种高含量白藜芦醇决明子提取物的制备方法。该方法获得的决明子干细胞固体粉末中白藜芦醇决明子提取物含量较高，白藜芦醇决明子提取物得率高，白藜芦醇决明子提取物中白藜芦醇的含量高的优点。
解决上述技术问题的具体技术方案如下：
一种高含量白藜芦醇决明子提取物的制备方法，包括如下步骤：
A、挑选颗粒饱满完整、色泽鲜艳有光泽的决明子，先流水冲洗1-3遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数70-75％的乙醇消毒30-35s，然后用0.1％HgCl2溶液消毒5-10min，再用无菌水冲洗5-8次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将决明子切成小段，接种于决明子愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到初级培养决明子愈伤组织；将得到的初级培养决明子愈伤组织再转接至决明子愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，得到增殖后的决明子愈伤组织；
B、制备高产白藜芦醇决明子干细胞培养液：按质量比称取40-60％MS培养基、15-30％卡拉胶、2.5-5.5％2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-4.2％蔗糖、0.05-0.2％吲哚丁酸、0.05-0.35％N6-呋喃甲基腺嘌呤、0.04-0.1％二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75-82℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；
C、选取步骤A所得的决明子愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5％的比例,装入含250mL高产白藜芦醇决明子干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在100-120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1000-1500lx，每天光照8小时，培养10-12天得到乳白色团簇即决明子干细胞，收获乳白色团簇，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得决明子干细胞固体粉末；
D、按质量比1:(1-3)将步骤C获得的决明子干细胞固体粉末与山梨醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；
E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:(2-3)混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，得高含量白藜芦醇决明子提取物。
优选的，所述步骤A中决明子愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖20-25g/L、琼脂3-6g/L、聚乙烯吡咯烷酮1.0-3.0g/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5-3.5mg/L、a-萘乙酸0.1-0.5mg/L，pH值5.8。
优选的，所述步骤A中诱导培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养25-35天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行。
优选的，所述步骤A中继代培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养55-65天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行。
本发明所得高含量白藜芦醇决明子提取物在化妆品中应用，具有美白功效。
本发明提供一种化妆水，包括如下重量百分比的组分：上述白藜芦醇决明子提取物0.1-5％、海藻糖0.1-1％、1,2-戊二醇1-3％、甘油聚丙烯酸酯0.1-2％、藻酸钠0.1-0.5％、丝氨酸0.1-1％、出芽短梗酶多糖0.1-2％、甘油1-5％、尿素0.1-3％、辛甘醇0.1-0.3％、水余量。
本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种高含量白藜芦醇决明子干细胞培养技术，可进行大规模培养获取大量的原材料，采用反相HPLC法测定，白藜芦醇决明子提取物的含量可达决明子干细胞干重的8.5-10.5％，白藜芦醇决明子提取物得率可达7.0-9.5％，白藜芦醇决明子提取物中白藜芦醇的含量大于95％。本发明制备的高含量白藜芦醇决明子提取物可用于制备食品、保健品、化妆品以及药品。
本发明通过采用特定的高产白藜芦醇决明子干细胞培养液，用植物干细胞培养的方法获取富含白藜芦醇的决明子干细胞，培养周期短，可进行大规范生产，所得决明子干细胞固体粉末中白藜芦醇的含量高；白藜芦醇决明子提取物的含量可达决明子干细胞干重的8.5-10.5％，白藜芦醇决明子提取物得率可达7.0-9.5％，白藜芦醇决明子提取物中白藜芦醇的含量大于95％。
本发明所得高含量白藜芦醇决明子提取物应用在化妆品中，具有美白保湿功效。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述，但本发明的实施方式不限于此，对于未特别注明的工艺参数或条件，可参照常规技术进行。
本发明所述MS培养基采用生产商Sigma-Aldrich，型号M5519。
实施例1
一种高含量白藜芦醇决明子提取物的制备方法，包括如下步骤：
A、挑选颗粒饱满完整、色泽鲜艳有光泽的决明子，先流水冲洗1遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数75％的乙醇消毒30s，然后用0.1％HgCl2溶液消毒5min，再用无菌水冲洗8次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将决明子切成小段，接种于决明子愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60％，先暗培养两周，再光培养35天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到初级培养决明子愈伤组织；将得到的初级培养决明子愈伤组织再转接至决明子愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60％，先暗培养两周，再光培养65天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到增殖后的决明子愈伤组织；所述决明子愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖25g/L、琼脂3g/L、聚乙烯吡咯烷酮3.0g/L、6-苄氨基腺嘌呤3.5mg/L、a-萘乙酸0.1mg/L，pH值5.8；
B、制备高产白藜芦醇决明子干细胞培养液：按质量比称取60％MS培养基、15％卡拉胶、5.5％2,4-二氯苯氧乙酸、1.5％蔗糖、0.2％吲哚丁酸、0.35％N6-呋喃甲基腺嘌呤、0.04％二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至82℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；
C、选取步骤A所得的决明子愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5％的比例,装入含250mL高产白藜芦醇决明子干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在100rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1500lx，每天光照8小时，培养12天得到乳白色团簇即决明子干细胞，收获乳白色团簇的重量为60g，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得决明子干细胞固体粉末的净重量为15g，采用反相HPLC测定固体粉末中白藜芦醇的含量为8.5％；
D、按质量比1:3将步骤C获得的决明子干细胞固体粉末与山梨醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；
E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:2混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，获得结晶的白藜芦醇纯度为95.5％,从决明子细胞干燥后的固体粉末中制备的高含量白藜芦醇决明子提取物的收率为77％。
实施例2
一种高含量白藜芦醇决明子提取物的制备方法，包括如下步骤：
A、挑选颗粒饱满完整、色泽鲜艳有光泽的决明子，先流水冲洗3遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数70％的乙醇消毒35s，然后用0.1％HgCl2溶液消毒10min，再用无菌水冲洗5次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将决明子切成小段，接种于决明子愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度70％，先暗培养两周，再光培养25天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到初级培养决明子愈伤组织；将得到的初级培养决明子愈伤组织再转接至决明子愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度70％，先暗培养两周，再光培养55天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到增殖后的决明子愈伤组织；所述决明子愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖20g/L、琼脂6g/L、聚乙烯吡咯烷酮1.0g/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5mg/L、a-萘乙酸0.5mg/L，pH值5.8；
B、制备高产白藜芦醇决明子干细胞培养液：按质量比称取40％MS培养基、30％卡拉胶、2.5％2,4-二氯苯氧乙酸、4.2％蔗糖、0.05％吲哚丁酸、0.05％N6-呋喃甲基腺嘌呤、0.1％二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；
C、选取步骤A所得的决明子愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5％的比例,装入含250mL高产白藜芦醇决明子干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1000lx，每天光照8小时，培养10天得到乳白色团簇即决明子干细胞，收获乳白色团簇的重量为75g，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得决明子干细胞固体粉末的净重量为12g，采用反相HPLC测定固体粉末中白藜芦醇的含量为10.5％；
D、按质量比1:1将步骤C获得的决明子干细胞固体粉末与山梨醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；
E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:3混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，获得结晶的白藜芦醇纯度为95.1％,从决明子细胞干燥后的固体粉末中制备的高含量白藜芦醇决明子提取物的收率为78％。
实施例3
一种高含量白藜芦醇决明子提取物的制备方法，包括如下步骤：
A、挑选颗粒饱满完整、色泽鲜艳有光泽的决明子，先流水冲洗2遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数70％的乙醇消毒32s，然后用0.1％HgCl2溶液消毒8min，再用无菌水冲洗7次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将决明子切成小段，接种于决明子愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度65％，先暗培养两周，再光培养30天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到初级培养决明子愈伤组织；将得到的初级培养决明子愈伤组织再转接至决明子愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度65％，先暗培养两周，再光培养60天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到增殖后的决明子愈伤组织；所述决明子愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖23g/L、琼脂4g/L、聚乙烯吡咯烷酮2g/L、6-苄氨基腺嘌呤2mg/L、a-萘乙酸0.3mg/L，pH值5.8；
B、制备高产白藜芦醇决明子干细胞培养液：按质量比称取50％MS培养基、25％卡拉胶、3％2,4-二氯苯氧乙酸、3％蔗糖、0.1％吲哚丁酸、0.2％N6-呋喃甲基腺嘌呤、0.06％二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至80℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；
C、选取步骤A所得的决明子愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5％的比例,装入含250mL高产白藜芦醇决明子干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在110rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1300lx，每天光照8小时，培养11天得到乳白色团簇即决明子干细胞，收获乳白色团簇的重量为70g，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得决明子干细胞固体粉末的净重量为10g，采用反相HPLC测定固体粉末中白藜芦醇的含量为9.5％；
D、按质量比1:2将步骤C获得的决明子干细胞固体粉末与山梨醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；
E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:3混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，获得结晶的白藜芦醇纯度为96.5％,从决明子细胞干燥后的固体粉末中制备的高含量白藜芦醇决明子提取物的收率为83％。
实施例4
一种高含量白藜芦醇决明子提取物的制备方法，包括如下步骤：
A、挑选颗粒饱满完整、色泽鲜艳有光泽的决明子，先流水冲洗2遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数75％的乙醇消毒34s，然后用0.1％HgCl2溶液消毒7min，再用无菌水冲洗6次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将决明子切成小段，接种于决明子愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60％，先暗培养两周，再光培养33天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到初级培养决明子愈伤组织；将得到的初级培养决明子愈伤组织再转接至决明子愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度65％，先暗培养两周，再光培养65天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行，得到增殖后的决明子愈伤组织；所述决明子愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖22g/L、琼脂5g/L、聚乙烯吡咯烷酮1.5g/L、6-苄氨基腺嘌呤2.5mg/L、a-萘乙酸0.2mg/L，pH值5.8；
B、制备高产白藜芦醇决明子干细胞培养液：按质量比称取45％MS培养基、20％卡拉胶、4％2,4-二氯苯氧乙酸、3.5％蔗糖、0.15％吲哚丁酸、0.25％N6-呋喃甲基腺嘌呤、0.08％二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至78℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；
C、选取步骤A所得的决明子愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5％的比例,装入含250mL高产白藜芦醇决明子干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在100rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1200lx，每天光照8小时，培养12天得到乳白色团簇即决明子干细胞，收获乳白色团簇的重量为65g，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得决明子干细胞固体粉末的净重量为9g，采用反相HPLC测定固体粉末中白藜芦醇的含量为8.5％；
D、按质量比1:1将步骤C获得的决明子干细胞固体粉末与山梨醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；
E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:2混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，获得结晶的白藜芦醇纯度为96.2％,从决明子细胞干燥后的固体粉末中制备的高含量白藜芦醇决明子提取物的收率为80％。
实施例5
一种化妆水，包括如下重量百分比的组分：实施例1制备得的白藜芦醇决明子提取物5％、海藻糖1％、1,2-戊二醇3％、甘油聚丙烯酸酯0.1％、藻酸钠0.1％、丝氨酸1％、出芽短梗酶多糖0.1％、甘油5％、尿素0.1％、辛甘醇0.3％、水余量。
实施例6
一种化妆水，包括如下重量百分比的组分：实施例2制备得的白藜芦醇决明子提取物0.1％、海藻糖0.1％、1,2-戊二醇1％、甘油聚丙烯酸酯2％、藻酸钠0.5％、丝氨酸0.1％、出芽短梗酶多糖2％、甘油1％、尿素3％、辛甘醇0.1％、水余量。
实施例7
一种化妆水，包括如下重量百分比的组分：实施例3制备得的白藜芦醇决明子提取物3％、海藻糖0.5％、1,2-戊二醇2％、甘油聚丙烯酸酯1％、藻酸钠0.3％、丝氨酸0.5％、出芽短梗酶多糖1％、甘油3％、尿素2％、辛甘醇0.2％、水余量。
实施例8
一种化妆水，包括如下重量百分比的组分：实施例4制备得的白藜芦醇决明子提取物2％、海藻糖0.3％、1,2-戊二醇1.5％、甘油聚丙烯酸酯0.7％、藻酸钠0.4％、丝氨酸0.8％、出芽短梗酶多糖1.5％、甘油4％、尿素0.5％、辛甘醇0.2％、水余量。
试验例1本发明化妆水的美白效果
1、实验对象
选年龄段在20-50岁的女性志愿者250名。主要症状：脸部有黄褐斑、肤色暗沉。志愿者随即分为5组，每组50人。
2、实验方法
试验组：每日早晚洁面后，将实施例5-8化妆水、对比例化妆水(添加3％熊果苷样品的相同基质的样品)涂于脸部，轻轻拍打至吸收。试验期一个月。
测定受试部位前2-3天不能使用任何产品(化妆品或外用药品)。试验前，受试者需要统一清洁脸部，用干的面巾纸擦拭干净。清洁后在受试者脸部做好测量区域标记。正式测试前应该在符合标准的房间内静坐至少30min，呈测试状态放置，保持放松。
实验中脸部标记4×4cm2试验区域，可同时标记多个区域，区域间隔2cm。使用皮肤黑色素和血红素测试仪进行受试区域和对照区域的测量，每个区域依照平行测定5次。先测量各测试区域的空白值，然后按2.0±0.1mg样品/cm2的用量，使用乳胶指套将试样均匀涂布于试验区内。涂抹1周、2周、3周、4周后分别测量受试区域和空白区域的皮肤黑色素含量。同一个志愿者的测试由同一个人员完成。
3、评价标准
(1)、皮肤黑色素和血红素测试仪测量皮肤黑色素含量。
(2)、通过患者自述感受，及电脑比对皮肤纹理图鉴定肤色美白程度及色斑淡化程度。
有效：肤色提亮，色斑颜色减淡。
无效：肤色及色斑与实验前无任何变化。
4、实验结果
通过皮肤黑色素和血红素测试仪测量皮肤黑色素含量结果见表1所示。
表1实施例和对比例的平均黑色素含量
从表1可以看出，使用实施例5-8和对比例的化妆水后，皮肤黑色素含量均随着时间的增长而减少，但使用实施例5-8的化妆水比对比例化妆水皮肤黑色素含量减少得更快。说明本发明制备的白藜芦醇决明子提取物的美白性能优于熊果苷。
对实施例5-8制得的化妆水进行保湿功效测试
本测试使用德国CK公司的Corneometer测试，恒温恒湿房间条件为25℃，50％相对湿度，志愿者120人，平均分为6个小组，每组20人，分别涂抹空白样品、0.5％透明质酸钠(山东福瑞达公司,平均分子量为130万)及实施例5-8制备高含量白藜芦醇决明子提取物的化妆水。
1)受试者需要使用指定的洁面乳清洗双手前臂内侧，清洁后在受试者双手前臂内侧做好测量区域标记。正式测试前应该在恒温恒湿房间内静坐20min，前臂暴露。
2)使用Corneometer对受试者左右手臂内侧指定区域进行测量和记录。
3)先测量各测试区域的初始值，求平均值，然后将试样均匀涂布于测试区域内。
4)用Corneometer分别在样品使用后2小时、4小时、6小时、8小时进行测量受试区域和空白对照区域的皮肤水合状态值，求平均值。测试由同一个测量人员完成。
皮肤水分含量随时间延长变化情况，实验结果见表2(表中数字为实测的皮肤水合状态值)
表2
标注：样品A为未添加任何提取物的相同基质的空白样品；样品B为添加0.5％透明质酸钠样品的相同基质的样品；样品C为实施例5制备的样品；样品D为实施例6制备的样品；样品E为实施例7制备的样品；样品F为实施例8制备的样品；
从上表可以看出，涂抹实施例5-8制备高含量白藜芦醇决明子提取物的样品C在使用后2小时、4小时、6小时、8小时后皮肤水分含量均高于添加0.5％透明质酸钠样品的相同基质的样品B,说明本发明制备的白藜芦醇决明子提取物的保湿性能优于透明质酸钠。
以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做任何形式上的限制，故凡未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims (7)

1.一种高含量白藜芦醇决明子提取物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
A、挑选颗粒饱满完整、色泽鲜艳有光泽的决明子，先流水冲洗1-3遍去除杂质、灰尘后，晾干表面水分，经过体积分数70-75%的乙醇消毒30-35s，然后用0.1%HgCl2 溶液消毒5-10min，再用无菌水冲洗5-8次，放在无菌滤纸上晾干；在无菌条件下用剪刀将决明子切成小段，接种于决明子愈伤组织诱导培养基上进行诱导培养，得到初级培养决明子愈伤组织；将得到的初级培养决明子愈伤组织再转接至决明子愈伤组织诱导培养基进行继代培养两次，得到增殖后的决明子愈伤组织；
B、制备高产白藜芦醇决明子干细胞培养液：按质量比称取40-60% MS培养基、15-30%卡拉胶、2.5-5.5% 2,4-二氯苯氧乙酸、1.5-4.2%蔗糖、0.05-0.2%吲哚丁酸、0.05-0.35% N6-呋喃甲基腺嘌呤、0.04-0.1%二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75-82℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量PBS缓冲液，调节溶液的PH至6.2-6.7；
C、选取步骤A所得的决明子愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例,装入含250mL高产白藜芦醇决明子干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在100-120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1000-1500lx，每天光照8小时，培养10-12天得到乳白色团簇即决明子干细胞，收获乳白色团簇，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得决明子干细胞固体粉末；
D、 按质量比1:（1-3）将步骤C获得的决明子干细胞固体粉末与山梨醇混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；
E、 将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:（2-3）混合，依次通过10微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，得高含量白藜芦醇决明子提取物。
2.根据权利要求1所述的高含量白藜芦醇决明子提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中决明子愈伤组织诱导培养基是以MS培养基为基础培养基，并添加蔗糖20-25g/L、琼脂3-6g/L、聚乙烯吡咯烷酮1.0-3.0g/L、6-苄氨基腺嘌呤1.5-3.5mg/L、a-萘乙酸0.1-0.5mg/L，pH值5.8。
3.根据权利要求1所述的高含量白藜芦醇决明子提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中诱导培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养25-35天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行。
4.根据权利要求1所述的高含量白藜芦醇决明子提取物的制备方法，其特征在于，所述步骤A中继代培养的培养条件为：培养温度(25±1)℃、湿度60-70％，先暗培养两周，再光培养55-65天，光培养按光照强度1000lx下16h、暗条件下8h交替进行。
5.权利要求1所述的高含量白藜芦醇决明子提取物的制备方法，其特征在于：所得高含量白藜芦醇决明子提取物可以添加至化妆品，使得化妆品具有美白和保湿功效。
6.根据权利要求5所述的高含量白藜芦醇决明子提取物的制备方法，其特征在于，所述化妆品为化妆水。
7.根据权利要求6所述的高含量白藜芦醇决明子提取物的制备方法，其特征在于，所述化妆水包括如下重量百分比的组分：权利要求1-4任一项制得的白藜芦醇决明子提取物0.1-5%、海藻糖0.1-1%、1,2-戊二醇1-3%、甘油聚丙烯酸酯0.1-2%、藻酸钠0.1-0.5%、丝氨酸0.1-1%、透明质酸钠0.01-0.1%、出芽短梗酶多糖0.1-2%、甘油1-5%、尿素0.1-3%、辛甘醇0.1-0.3%、水余量。
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