CN104983638A - 一种高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：A、摘取茶树上的绿茶嫩芽，消毒后接种于MS培养基，诱导出茶叶愈伤组织；B、制备高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液；C、选取步骤A所得乳白色的茶叶愈伤组织作为种子，装入高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液中悬浮培养，得茶叶干细胞固体粉末；D、将步骤C获得的茶叶干细胞固体粉进行破壁匀浆处理；D、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:2混合，过滤，冷冻结晶，分理出柱型结晶，得高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物。本发明具有所得γ-氨基丁酸茶叶提取物得率高，γ-氨基丁酸茶叶提取物中γ-氨基丁酸的含量高的优点。

Description

一种高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的制备方法

技术领域

本发明涉及植物干细胞培养技术领域，特别涉及一种高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的制备方法。

技术背景

γ-氨基丁酸(Gamma Aminobutyric Acid，GABA)是一种非蛋白质氨基酸，在医药行业主要应用其降血压、抗惊厥、镇痛和改善记忆的功效。在化妆品行业中，γ-氨基丁酸表现出优异的保湿和抗皱功效，广泛用于各种保湿或抗皱化妆品中。

将茶鲜叶经过一定时间的厌氧处理会产生γ-氨基丁酸，茶叶中γ-氨基丁酸是由L-谷氨酸在L-谷氨酸脱羧酶的催化作用下脱酸形成。目前国内外均通过对茶叶鲜叶加工处理，以提高γ-氨基丁酸含量，主要处理方法有厌氧处理、厌氧好气交替处理、红外线照射处理、微波照射处理、谷氨酸钠溶液综合处理等方法，处理后的茶中γ-氨基丁酸的含量在茶叶干重的0.15-0.2%。

离体培养的高等植物细胞具有合成天然产物的能力,利用这一特性，可以通过优化植物干细胞的培养条件，有目的性的使其积累更多的次生代谢产物。刘亚军等人发表的论文《茶树愈伤诱导及不同儿茶素含量细胞系筛选》，研究了不同培养条件对茶干细胞中儿茶素积累量的影响；钟俊辉等人发表的论文《茶愈伤组织培养及其茶氨酸的累积》，研究了不同培养条件对茶干细胞中茶氨酸积累量的影响。但迄今还未有研究关于不同培养条件对茶干细胞中r-氨基丁酸积累量的影响。

当前从经过处理的茶叶鲜叶中获取γ-氨基丁酸单体，通常将加工处理后的茶叶干燥，然后使用酒精浸出，用大孔离子交换树脂进行提纯，将洗出物使用多次重结晶法获得纯度在90%以上的γ-氨基丁酸晶体。因为传统方法处理的茶叶鲜叶中γ-氨基丁酸其含量只有茶叶干重的0.15-0.2%，含量偏低，并且茶叶中含有的叶黄素含量比较高，工业提纯较为困难，会产生大量有机溶剂废液，对环境不利。

如果通过特定优选的茶叶干细胞的培养条件，可以有目的的获得高含量γ-氨基丁酸的茶叶干细胞，因为茶叶干细胞中并不存在叶黄素，可以使用特定简单的提纯工艺，节约γ-氨基丁酸提纯成本。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的制备方法，该方法获得的茶叶干细胞固体粉末中γ-氨基丁酸茶叶提取物含量较高，γ-氨基丁酸茶叶提取物得率高，γ-氨基丁酸茶叶提取物中γ-氨基丁酸的含量高的优点。

本发明通过以下技术方案实现：一种高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

A、 摘取茶树上的绿茶嫩芽，经过体积分数70%的乙醇消毒，在无菌条件下用剪刀将绿茶嫩芽切成2-5mm长的小段，接种于MS培养基，控制室温在25±1℃，暗培养7天，诱导出乳白色、土黄色、浅绿色三种不同颜色的茶叶愈伤组织；

B、 制备高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液：按质量比称取50-80% MS培养基、10-40%植物凝胶、3.8-7.5% NAA、3.5-7.2%蔗糖、0.01-0.3%吲哚乙酸、0.01-0.36%-苄氨基腺嘌呤、0.01-0.1%二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75-78℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量HEPES缓冲液，调节溶液的PH至6.3-6.7；

C、 选取步骤A所得乳白色的茶叶愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例,装入含250mL高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1500勒克斯，每天光照8小时，培养12天得到乳白色团簇即茶叶干细胞，收获乳白色团簇，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得茶叶干细胞固体粉末；

D、 按质量比1:1将步骤C获得的茶叶干细胞固体粉末与甘油混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；

E、 将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:2混合，依次通过5微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，得高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物。

本发明提供了一种高含量γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养技术，可进行大规模培养获取大量的原材料，采用氨基酸分析仪测定，γ-氨基丁酸茶叶提取物的含量可达茶叶干细胞干重的7.5-10.5%，γ-氨基丁酸茶叶提取物得率可达6.0-8.5%，γ-氨基丁酸茶叶提取物中γ-氨基丁酸的含量大于96%。本发明制备的高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物可用于制备食品、保健品、化妆品以及药品。

本发明通过采用特定的高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液，用植物干细胞培养的方法获取富含γ-氨基丁酸的茶叶干细胞，培养周期短，可进行大规范生产，所得茶叶干细胞固体粉末中γ-氨基酸的含量高；γ-氨基丁酸茶叶提取物的含量可达茶叶干细胞干重的7.5-10.5%，是栽培茶通过各种工艺处理后的50倍左右。γ-氨基丁酸茶叶提取物得率可达6.0-8.5%，γ-氨基丁酸茶叶提取物中γ-氨基丁酸的含量大于96%。

本发明所得高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物在化妆品中应用，具有保湿功效，下面为测试结果。

本测试使用德国CK公司的Corneometer测试，恒温恒湿房间条件为25℃，50%相对湿度，志愿者100人，平均分为5个小组，每组20人，分别涂抹空白样品、0.5%透.5%透明质酸钠（山东福瑞达公司,平均分子量为130万）及添加0.5%、1.0%和3.0%实施例3制备高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的乳液。

1）受试者需要使用指定的洁面乳清洗双手前臂内侧，清洁后在受试者双手前臂内侧做好测量区域标记。正式测试前应该在恒温恒湿房间内静坐 20min，前臂暴露。

2）使用Corneometer对受试者左右手臂内侧指定区域进行测量和记录。

3）先测量各测试区域的初始值，求平均值，然后将试样均匀涂布于测试区域内。

4）用Corneometer分别在样品使用后2小时、4小时、6小时、8小时进行测量受试区域和空白对照区域的皮肤水合状态值，求平均值。测试由同一个测量人员完成。

皮肤水分含量随时间延长变化情况，实验结果见表1（表中数字为实测的皮肤水合状态值）

表1

样品名称	皮肤水分含量初始值	2h后皮肤水分含量	4h后皮肤水分含量	6h后皮肤水分含量	8h后皮肤水分含量
						A	37.8	40.3	39.2	39.1	38.6
B	37.8	54.5	52.4	50.6	45.3
						C	37.4	56.5	56.4	52.6	50.6
D	38.3	58.6	57.9	56.3	54.3
						E	37.8	58.6	58.4	57.8	56.7

标注：样品A为未添加任何提取物的相同乳剂基质的空白样品；样品B为添加0.5%透明质酸钠样品的相同乳液基质的样品;样品C为添加0.5%实施例3制备提取物的相同乳液基质的样品;样品D为添加1.0%实施例3制备高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的相同乳液基质的样品;样品E为添加3.0%实施例3制备高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的相同乳液基质的样品;

从上表可以看出，涂抹添加0.5%实施例3制备高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的样品C在使用后2小时、4小时、6小时、8小时后皮肤水分含量均高于添加0.5%透明质酸钠样品的相同乳液基质的样品B,说明本发明制备的茶干细胞的保湿性能优于透明质酸钠；样品C、D、E在使用使用后2小时、4小时、6小时、8小时后皮肤水分含量的值随着茶叶干细胞粗提物添加量的增加而升高，呈现量效关系。

本发明制备的高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物在化妆品中具有抗皱功效，以下为测试结果。

测试方法：招募志愿者60人 (年龄30至65岁)，每组20人，分别使用添加0.5%、1.0%和3.0%实施例3制备茶叶干细胞粗提物的相同基质的膏霜，每天使用两次，每次半脸使用，连续使用28后采用德国CK MPA580弹性测试仪和美国CANFIELD公司VISIA皮肤分析测试仪测试皮肤弹性和皱纹深度的变化。 每天早晚清洁面部后取适量以上膏霜均匀涂抹在左脸部，右边脸部涂抹未添加茶叶干细胞粗提取物的膏霜。

使用样品28后使用MPA580弹性测试仪和VISIA皮肤分析测试仪测试左右两侧脸部皮肤弹性和皱纹深度的变化，进行对比分析，实验数据如表2：

表2

样品名称	左侧脸相对右侧皮肤弹性相对增加量(％)	左侧脸相对右侧皮肤皱纹深度相对减少量(％)
			A	16.8	18.4
B	23.6	23.1
			C	27.6	28.2

标注：样品A为添加0.5%实施例3制备茶叶干细胞粗提物的相同基质的膏霜；样品B为添加1.0%实施例3制备茶叶干细胞粗提物的相同基质的膏霜; 样品C为添加3.0%实施例3制备高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的相同基质的膏霜。

从上表可以看出，使用样品A、B和C，28天后左侧脸部的皮肤弹性和皱纹深度情况相对与右侧未添加茶干细胞的膏霜有明显改善，且改善情况随茶叶干细胞粗提物添加量的增加，呈现量效递增关系。

综上所述，本发明制备的茶叶干细胞固体粉末中γ-氨基丁酸茶叶提取物含量较高，γ-氨基丁酸茶叶提取物得率高，γ-氨基丁酸茶叶提取物中γ-氨基丁酸的含量高等优点。

具体实施方式

下面结合实施例进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

实施例1：

A、于清明前采摘杭州西湖新鲜龙井十八棵御茶树上的绿茶嫩芽，经过体积分数为70%乙醇消毒，在无菌条件下用剪刀将茶嫩芽切除10段2mm长的小段，均接种在SIGMA公司生产的牌号为M5519的MS培养基中，控制室温在25±1℃暗培养，培养7天诱导出茶愈伤组织，分别出现4个乳白色、3个土黄色、3个浅绿色的愈伤组织。对3颜色的种细胞系分别进行了继代培养，通过对生长速度和γ-氨基丁酸含量的测定，筛选确定乳白色细胞系为长势好，γ-氨基丁酸含量高的细胞系，作为下一步扩大培养的种子细胞；

B、制备高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液：按质量比称取58% MS培养基（生产商Sigma-Aldrich，型号M5519）、34.38%植物凝胶（生产商Sigma-Aldrich，型号P8169）、3.8% NAA（生产商Sigma-Aldrich，型号N0640）、3.5%蔗糖（生产商Ferro，纯度99.7%）、0.3%吲哚乙酸（生产商日本TCI，分析纯）、0.01% 6-苄氨基腺嘌呤（生产商日本TCI，分析纯）、0.01%二氢茉莉酮酸甲酯（生产商日本TCI，分析纯），在玻璃容器中混合加热至75-78℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量HEPES缓冲液（生产商Thermo Fisher，型号15630），调节溶液的PH至6.3-6.7；

C、选取步骤A所得乳白色的茶叶愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例称取12.5g种子细胞,装入含250mL高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1500勒克斯，每天光照8小时，培养12天得到乳白色团簇即茶叶干细胞，收获乳白色团簇的重量为60g，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得茶叶干细胞固体粉末的净重为15g，采用氨基酸分析仪测定固体粉末中γ-氨基丁酸的含量为8.5%；

D、按质量比1:1将步骤C获得的茶叶干细胞固体粉末与甘油混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；

E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:2混合，依次通过5微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，获得结晶的γ-氨基丁酸纯度为96.5%,从茶产细胞干燥后的固体粉末中制备的高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的收率为78%。

实施例2：

A、采摘绿茶嫩芽（本实施例绿茶嫩芽是清明前采摘自建德市天目山上的绿茶茶树），经过体积分数为70%乙醇消毒，在无菌条件下用剪刀将茶嫩芽切除10段2mm长的小段，均接种在SIGMA公司生产的牌号为M5519的MS培养基中，控制室温在25±1℃暗培养，培养7天诱导出茶愈伤组织，筛选乳白色细胞系，作为下一步扩大培养的种子细胞，作为下一步扩大培养的种子细胞；

B、制备高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液：按质量比称取80%  MS培养基（生产商Sigma-Aldrich，型号M5519）、10%植物凝胶（生产商Sigma-Aldrich，型号P8169）、4.2% NAA（生产商Sigma-Aldrich，型号N0640）、5.5%蔗糖（生产商Ferro，纯度99.7%）、0.1%吲哚乙酸（生产商日本TCI，分析纯）、0.12% 6-苄氨基腺嘌呤（生产商日本TCI，分析纯）、0.08%二氢茉莉酮酸甲酯（生产商日本TCI，分析纯），在玻璃容器中混合加热至75-78℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量HEPES缓冲液（生产商Thermo Fisher，型号15630），调节溶液的PH至6.3-6.7；

C、选取步骤A所得乳白色的茶叶愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例称取12.5g种子细胞,装入含250mL高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1500勒克斯，每天光照8小时，培养12天得到乳白色团簇即茶叶干细胞，收获乳白色团簇的重量为70g，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得茶叶干细胞固体粉末的净重为12g，采用氨基酸分析仪测定固体粉末中γ-氨基丁酸的含量为9.0%；

D、按质量比1:1将步骤C获得的茶叶干细胞固体粉末与甘油混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；

E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:2混合，依次通过5微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，获得结晶的γ-氨基丁酸纯度为96.6%,从茶产细胞干燥后的固体粉末中制备的高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的收率为80%。

实施例3：

A、于清明前采摘杭州西湖新鲜龙井十八棵御茶树上的绿茶嫩芽，经过体积分数为70%乙醇消毒，在无菌条件下用剪刀将茶嫩芽切除10段2mm长的小段，均接种在SIGMA公司生产的牌号为M5519的MS培养基中，控制室温在25±1℃暗培养，培养7天诱导出茶愈伤组织，筛选乳白色细胞系，作为下一步扩大培养的种子细胞，作为下一步扩大培养的种子细胞；

B、制备高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液：按质量比称取50% MS培养基（生产商Sigma-Aldrich，型号M5519）、38.57%植物凝胶（生产商Sigma-Aldrich，型号P8169）、7.5% NAA（生产商Sigma-Aldrich，型号N0640）、3.5%蔗糖（生产商Ferro，纯度99.7%）、0.2%吲哚乙酸（生产商日本TCI，分析纯）、0.15% 6-苄氨基腺嘌呤（生产商日本TCI，分析纯）、0.08%二氢茉莉酮酸甲酯（生产商日本TCI，分析纯），在玻璃容器中混合加热至75-78℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量HEPES缓冲液（生产商Thermo Fisher，型号15630），调节溶液的PH至6.3-6.7；

C、选取步骤A所得乳白色的茶叶愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例称取12.5g种子细胞,装入含250mL高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1500勒克斯，每天光照8小时，培养12天得到乳白色团簇即茶叶干细胞，收获乳白色团簇的重量为55g，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得茶叶干细胞固体粉末的净重为7.5g，采用氨基酸分析仪测定固体粉末中γ-氨基丁酸的含量为7.5%；

D、按质量比1:1将步骤C获得的茶叶干细胞固体粉末与甘油混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；

E、将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:2混合，依次通过5微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，获得结晶的γ-氨基丁酸纯度为96.0%,从茶产细胞干燥后的固体粉末中制备的高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的收率为75%。

实施例4：

A、采摘绿茶嫩芽（本实施例绿茶嫩芽是清明前采摘自杭州市北高峰山区绿茶茶树），经过体积分数为70%乙醇消毒，在无菌条件下用剪刀将茶嫩芽切除10段2mm长的小段，均接种在SIGMA公司生产的牌号为M5519的MS培养基中，控制室温在25±1℃暗培养，培养7天诱导出茶愈伤组织，筛选乳白色细胞系，作为下一步扩大培养的种子细胞，作为下一步扩大培养的种子细胞；

B、制备高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液：按质量比称取70% MS培养基（生产商Sigma-Aldrich，型号M5519）、15.05%植物凝胶（生产商Sigma-Aldrich，型号P8169）、7.5% NAA（生产商Sigma-Aldrich，型号N0640）、7.2%蔗糖（生产商Ferro，纯度99.7%）、0.05%吲哚乙酸（生产商日本TCI，分析纯）、0.15% 6-苄氨基腺嘌呤（生产商日本TCI，分析纯）、0.05%二氢茉莉酮酸甲酯（生产商日本TCI，分析纯），在玻璃容器中混合加热至75-78℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量HEPES缓冲液（生产商Thermo Fisher，型号15630），调节溶液的PH至6.3-6.7；

C、选取步骤A所得乳白色的茶叶愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例称取12.5g种子细胞,装入含250mL高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1500勒克斯，每天光照8小时，培养12天得到乳白色团簇即茶叶干细胞，收获乳白色团簇的重量为80g，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得茶叶干细胞固体粉末的净重为14g，采用氨基酸分析仪测定固体粉末中γ-氨基丁酸的含量为10.0%；

D、按质量比1:1将步骤C获得的茶叶干细胞固体粉末与甘油混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；

E、步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:2混合，依次通过5微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，获得结晶的γ-氨基丁酸纯度为96.2%,从茶产细胞干燥后的固体粉末中制备的高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的收率为83%。

实施例5：

A、 采摘绿茶嫩芽（本实施例绿茶嫩芽是清明前采摘自新昌县山区绿茶茶树），经过体积分数为70%乙醇消毒，在无菌条件下用剪刀将茶嫩芽切除10段2mm长的小段，均接种在SIGMA公司生产的，牌号为M5519的MS培养基中，控制室温在25±1℃暗培养，培养7天诱导出茶愈伤组织，筛选乳白色细胞系，作为下一步扩大培养的种子细胞，作为下一步扩大培养的种子细胞；

B、 制备高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液：按质量比称取78% MS培养基（生产商Sigma-Aldrich，型号M5519）、11.8%植物凝胶（生产商Sigma-Aldrich，型号P8169）、5.5% NAA（生产商Sigma-Aldrich，型号N0640）、4.5%蔗糖（生产商Ferro，纯度99.7%）、0.06%吲哚乙酸（生产商日本TCI，分析纯）、0.06% 6-苄氨基腺嘌呤（生产商日本TCI，分析纯）、0.08%二氢茉莉酮酸甲酯（生产商日本TCI，分析纯），在玻璃容器中混合加热至75-78℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量HEPES缓冲液（生产商Thermo Fisher，型号15630），调节溶液的PH至6.3-6.7；

C、 选取步骤A所得乳白色的茶叶愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例称取12.5g种子细胞,装入含250mL高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1500勒克斯，每天光照8小时，培养12天得到乳白色团簇即茶叶干细胞，收获乳白色团簇的重量为68g，用去离子水冲洗干净并冷冻干燥得茶叶干细胞固体粉末的净重为11g，采用氨基酸分析仪测定固体粉末中γ-氨基丁酸的含量为9.5%；

D、 按质量比1:1将步骤C获得的茶叶干细胞固体粉末与甘油混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；

E、 将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:2混合，依次通过5微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，获得结晶的γ-氨基丁酸纯度为96.1%,从茶产细胞干燥后的固体粉末中制备的高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的收率为85%。

Claims (2)

1.一种高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的制备方法，其特征在于包括以下步骤：

摘取茶树上的绿茶嫩芽，经过体积分数70%的乙醇消毒，在无菌条件下用剪刀将绿茶嫩芽切成2-5mm长的小段，接种于MS培养基，控制室温在25±1℃，暗培养7天，诱导出乳白色、土黄色、浅绿色三种不同颜色的茶叶愈伤组织；

制备高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液：按质量比称取50-80% MS培养基、10-40%植物凝胶、3.8-7.5% NAA、3.5-7.2%蔗糖、0.01-0.3%吲哚乙酸、0.01-0.3%6-苄氨基腺嘌呤、0.01-0.1%二氢茉莉酮酸甲酯，在玻璃容器中混合加热至75-78℃，搅拌到完全溶解后冷却到室温，加入适量HEPES缓冲液，调节溶液的PH至6.3-6.7；

选取步骤A所得乳白色的茶叶愈伤组织作为种子，按接种量为质量比5%的比例,装入含250mL高产γ-氨基丁酸茶叶干细胞培养液的500mL培养瓶中悬浮培养，摇床转速控制在120rpm，培养温度控制在25±1℃，光照控制在1500勒克斯，每天光照8小时，培养12天得到乳白色团簇即茶叶干细胞，收获乳白色团簇并冷冻干燥得茶叶干细胞固体粉末；

将步骤C获得的茶叶干细胞固体粉末用去离子水冲洗干净，按质量比1:1将茶叶干细胞固体粉末与甘油混合搅拌均匀，使用高压均质机在25000PSI条件下进行破壁匀浆处理；

将步骤D获得的细胞破壁匀浆混合物和无水乙醇按质量比1:2混合，依次通过5微米聚丙烯过滤器、医用活性炭过滤器、0.45微米聚丙烯过滤膜进行过滤，获得清液在-10℃冰箱中静置24小时，下层得无色透明柱型结晶，用分液漏斗分出下层柱型结晶，用无水酒精淋洗干净后真空干燥，得高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物。

2.权利要求1所述高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物的制备方法，其特征在于：所得高含量γ-氨基丁酸茶叶提取物可以添加至化妆品，使得化妆品具有保湿和抗皱功效。