CN1298942A - 烟草为原料制备辅酶q10的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明是以烟草为材料,经过诱导、继代和悬浮培养,产生生长快、辅酶Q10含量高的烟草悬浮培养细胞。收集细胞加入丙酮研磨,过滤。滤液用石油醚萃取。萃取液浓缩后,经硅胶柱层析纯化,用乙醚-石油醚混合液浓度线性梯度洗脱,收集洗脱液。除去有机溶剂,加乙醇溶解。密封,结晶,离心收集辅酶Q10结晶。产率达500—510ug/g干细胞,回收率为57—59%,纯度达98%以上。此发明为辅酶Q10生产开拓了新途径,也为辅酶Q10药源国产化奠定了基础。
Description
本发明涉及生物技术领域尤其是辅酶Q10的制备辅酶Q10(CoenzymeQ10,CoQ10)又称泛醌10,是2,3-二甲氧基-5-甲基-1,4-二苯醌的衍生物,其侧链含有10个异戊烯基。它广泛存在于动物、植物和微生物中,是呼吸链中电子/氢的载体。它可以以NADH脱氢酶,磷酸甘油脱氢酶、脂酰CoA脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、铁硫蛋白等中接受电子/氢,并将电子传递给Cyt。因此,在呼吸链中占据承上启下的重要位置和作用。辅酶Q10是重要的药源,在医药上广泛用于治疗心、脑、肝、肾疾病,细菌和病毒传染病,癌症病人的综合治疗,以及改善机体免疫功能等。
辅酶Q10在国外用化学合成法或微生物发酵法生成,但产率低、产物专一性差,成本高,价格贵,难于满足制药工业需要。目前国内尚无生产,至今我国制药所需辅酶Q10完全依赖进口。因此,辅酶Q10在国内外都存在广阔的市场。以烟草为原料生产辅酶Q10目前国内外都未见报道。
本发明的目的在于采用现代生物技术方法,利用植物细胞工程和酶工程的原理和技术,从发酵高产生长快的烟草细胞中制备高纯度的结晶辅酶Q10,经济、简便的生产辅酶Q10,以适应经济建设和国内外市场的需要。
我们从1994年起对烟草细胞发酵条件、工艺及其生产辅酶Q10技术、辅酶Q10的分离纯化、结晶纯度控制等技术进行了长期深入研究,从而发明了烟草为原料,以烟草细胞悬浮培养生产辅酶Q10的技术。
本发明是这样实现的:
(一)愈伤组织诱导取烟草植体,洗净,70%乙醇溶液浸泡,再用0.1%氯化汞消毒,无菌水冲洗。在无菌条件下切碎,接种于诱导培养基上培养,置16-32℃培养箱中黑暗培养至形成愈伤组织,较理想的培养温度为28±1℃。诱导培养基以MS为基本培养基,加入BA 0.05mg/L,2,4-D 1.0mg/L,NAA 1.0mg/L,蔗糖浓度3%,琼脂0.7%,pH5.8,高压灭菌。
(二)继代培养上述愈伤组织转入继代培养基中进行继代培养,继代培养基以LS为基本培养基,另加入BA 0.05mg/L,2,4-D 1.0mg/L,NAA 1.0mg/L,蔗糖浓度3%,琼脂0.7%,pH5.8,高压灭菌,产生疏松愈伤组织;
(三)悬浮培养出种子细胞:将上述疏松愈伤组织,转入悬浮培养基中进行悬浮培养出种子细胞。
1.悬浮培养基的组成
组 成 含量 最佳含量
无机营养 LS LS
KT,mg/L 0.02-4 0.02
2,4-D,mg/L 0.05-4 2.00
肌醇mg/L 80-800 100
盐酸硫胺素mg/L 0.05-8.0 4.00
酵母膏% 0.05-0.5 0.15
蔗糖% 1045 30
甲硫酸胺mg/L 5-20 20.0
2.培养条件
☆摇床转速,100-150r/min,最佳转速为100r/min,振幅2cm
☆培养基pH,pH4.0-8.0,最佳pH5.8
☆培养温度,16-32℃,最佳培养温度为28±1℃
☆培养时间,8天
☆黑暗中培养
(四)辅酶Q10的制备
1.辅酶Q10的提取用丙酮作为抽提溶剂,将烟草悬浮培养细胞与丙酮按1:2(质量/体积比)混合,研磨,过滤,残渣重复2次以上,合并滤液,用0.5倍滤液体积的石油谜(30-65)℃作萃取剂进行萃取,所得石油醚萃取液为辅酶Q10的石油醚提取液。
2.辅酶Q10分离纯化:将石油醚提取液用蒸发法浓缩至原体积的1/15,上硅胶柱层析纯化,硅胶(60-325孔/cm)烘至恒重,加60克/L水活化,装柱(2.0×20.0cm2),用体积分数为4%的乙醚-石油醚浓度线性梯度洗脱,流速1ml/分钟、5ml/管,收集黄色部分洗脱液,为辅酶Q10纯化液。
3.结晶:将纯化辅酶Q10溶液于60℃水浴上蒸发除去有机溶剂后,干物质入乙醇溶解,密封于4-8℃冰箱中结晶,结晶完全后离心(10500转/分钟,4℃,15分钟),收集结晶为辅酶Q10。
4.干燥:用冷冻干燥法干燥,密封避光保存。
5.辅酶Q10含量每克干重细胞产辅酶Q10500-510ug,回收率达59.2%,纯度98%。辅酶Q10的特征特性
辅酶Q10正品为黄色长菱形结晶,无毒,无味,易溶于有机溶液。水分<5%,
辅酶Q10正品为黄色长菱形结晶,无毒,无味,易溶于有机溶液。水分<5%,灰份<3%,辅酶Q9及其他杂质<0.2%。
其化学结构式:辅酶Q10含量检测
将辅酶Q10溶于10ml无水乙醇,取3ml在275 nm波长下测定其氧化型吸光值(A1);然后,加入0.1ml0.7%硼氢化钠水溶液,又在275nm波长下测定其还原型吸光值(A2)。对照为无水乙醇。按下式计算辅酶Q10含量:CoQ10ug/g.dw细胞=(A1-A2)×n×106
142×s式中:n为稀释倍数,s为细胞干重(g),142为辅酶Q10的1%无水乙醇溶液在275波长下氧化型和还原型吸光值之差。
每g干重细胞达500-510ug辅酶Q10质量标准检验
采用高效液相色谱法(HPLC)检测辅酶Q10的纯度。色谱条件:色谱柱Zorbaxods7u;流动相为60%的乙醇/甲醇溶液;流速为1ml/min,波长283nm,进样量为30ul,标样和样品辅酶Q10的浓度4.9umol/L。纯度)98%,辅酶Q9及其他杂质<0.2%。
水分、灰份检测按常规法。
细胞干重按常规恒重法。
本发明的优点
1.本发明为辅酶Q10药源生产开辟了新途径,为辅酶Q10药源国产化奠定了基础。以适应市场和经济发展的需要。
2.本发明用烟草细胞为材料,细胞生长快,辅酶Q10含量高。从发酵细胞中易于提取辅酶Q10。
3.本发明工艺生产设备简单,可以国产化,而且投资少,工艺简便。辅酶Q10成本低。
4.发明辅酶Q10回收率高,纯度高。达到药用要求,可以用于制药。
实例:
取盆栽砂培烟草黄花大金元具3-4片真叶幼苗的叶片,用自来水洗净。在无菌条件下70%乙醇溶液浸泡5-8秒,再用0.1%氯化汞消毒8-10分钟,无菌水冲洗3次,切成0.5cm-0.5cm小块,接种于诱导培养基上培养,置28±1℃培养箱中黑暗培养25天形成愈伤组织。将愈伤组织转入继代培养基中进行继代培养,产生疏松愈伤组织。将疏松愈伤组织转入装有50ml悬浮培养基的250ml锥形瓶中,接种4g。摇瓶;转速为100-120r/分钟,振幅2cm,28±1℃黑暗中培养8天。用吸管吸取培养基中上部细胞并过滤,可作为悬浮培养的种子细胞。
取100g悬浮培养细胞,加入200ml丙酮,研磨,过滤,残渣重复2次以上,合并滤液,用300ml石油谜(30-60)℃作萃取剂进行萃取,所得萃取液为辅酶Q10的石油醚提取液。将石油醚提取液置于60℃水浴浓缩至20ml,上硅胶柱(2.0×20.0cm),用体积分数为4%的乙醚-石油醚浓度线性梯度洗脱,流速1ml/分钟,5ml/管,收集黄色部分洗脱液250ml,60℃水浴上蒸发除去有机溶剂后,干物质加入10ml乙醇溶解,密封避光,置于4-8℃冰箱中结晶,2天后结晶完全,离心(10500转/分钟,4℃,15分钟),收集结晶,冷冻干燥,即为辅酶Q10成品。产率为500-510ug/干细胞,回收率达59.2%,纯度98%以上。
Claims (5)
1.烟草为原料制造辅酶Q10的方法,其特征在于:(1)愈伤组织诱导:取烟草植体,洗净,70%乙醇溶液浸泡,再用0.1%氯化汞溶液消毒,无菌水冲洗除去浸泡液和消毒液,在无菌条件下,切成小块,接种于诱导培养基上,置16-32℃培养箱中黑暗培养至形成愈伤组织;(2)继代培养:将上述愈伤组织转入继代培养基中进行继代培养,产生疏松愈伤组织;(3)悬浮培养出种子细胞:将上述疏松愈伤组织,转入悬浮培养基中培养出种子细胞;(4)辅酶Q10提取:用丙酮作为抽提溶剂,将烟草悬浮培养细胞与丙酮按1∶2(质量/体积比)混合,研磨,过滤,残渣重复2次以上,合并滤液,用0.5倍滤液体积的石油谜(30-65)℃作萃取剂进行萃取,所得石油醚萃取液为辅酶Q10的石油醚提取液;(5)辅酶Q10分离纯化:将石油醚提取液用蒸发法浓缩至原体积的1/15,上硅胶柱用体积分数为4%的乙醚-石油醚浓度混合液线性梯度洗脱,收集黄色部分洗脱液,为辅酶Q10纯化液;(6)结晶:将纯化辅酶Q10溶液于60℃水浴上蒸发除去有机溶剂后,加入无机乙醇溶解,密封于4-8℃冰库中结晶,结晶完全后离心,收集结晶,即为辅酶Q10产品。
2.根据权利要求1所说的烟草为原料制备辅酶Q10方法,其特征在于:愈伤组织培养基以MS为基本培养基,加入BA 1.Smg/L,NAA 1.4mg/L,蔗糖浓度3%,琼脂0.7%,pH6.0,较理想的培养温度为28±1℃。
3.根据权利要求1所说的烟草为原料制造辅酶Q10方法,其特征在于:继代培养基以LS为基本培养基,加入BA 0.05mg/L,2,4-D 1.0mg/L,NAA 1.0mg/L,蔗糖浓度3%,琼脂0.7%,pH5.8。
4.根据权利要求1所说的烟草为原料制备辅酶Q10方法,其特征在于:悬浮培养基中各营养成分为:无机营养LS,KT0.02-4mg/L,2,4-D0.05-4mg/L,肌醇80-800mg/L,盐酸硫胺素0.05-8.0mg/L,酵母膏0.05-0.5%,蔗糖1045%,甲硫酸胺5-20mg/L;各营养成分较佳含量为LS(无机),KT0.02mg/L,2,4-D2.00mg/L,肌醇100mg/L,盐酸硫胺素4.00mg/L,酵母膏0.15%,蔗糖30%,甲硫氨酸10mg/L。
5.根据权利要求1和4所说的烟草为原料制备辅酶Q10方法,其特征在于:烟草细胞在悬浮培养基的培养条件为:摇床转速100-150转/分钟,最佳转速为100转/分钟,培养基的pH4.0-8.0,最佳的pH5.8,培养温度16-32℃,最佳培养温度为28±1℃,培养时间8天。
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