CN103898182A - 白僵菌素的制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种白僵菌素的制备方法。包括下述步骤：1a、制备镰刀菌LF061种子液：将菌株LF061的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，28℃-32℃、转速120rpm-160rpm，培养48-72h获得种子液；1b、镰刀菌LF061种子液经发酵制备白僵菌素：将上述种子液以体积百分比5%-15%的接种量接种于液体发酵培养基，发酵温度28℃-32℃，转速120rpm-160rpm，通气量10L-30L/分，发酵时间96h-144h；所得发酵液分离、精制得白僵菌素。本发明采用液体发酵生产白僵菌素，制备的白僵菌素纯度高，回收率高，适用于工业化生产。

Description

白僵菌素的制备方法

技术领域

本发明属于工业微生物技术领域，具体涉及到一种白僵菌素制备方法。

背景技术

白僵菌素（beauvericin，BEA）是从真菌球孢白僵菌（Beauverla bassiana）发酵菌丝体中提取分离的一种六元环状缩酯肽化合物，由3个N-甲基苯丙氨酸和3个(D)-α- 羟基异戊酸残基交替相连而成，分子式为C₄₅H₅₇N₃O₉，结构如式（Ⅰ）所示。白僵菌素为白色粉末状，不易溶于水，溶于甲醇、丙酮等有机溶剂，可被检测的紫外吸收光谱范围是204nm-225nm。

白僵菌素是一种具有抗菌、杀虫、抗病毒、抗癌、抑制胆甾醇酰基转移酶活性、引发细胞程序性凋亡等生物活性的脂肽类化合物。目前，白僵菌素主要用作除菌剂和杀虫剂等。在抗菌方面，白僵菌素对一些革兰氏阴性菌（大肠杆菌、根癌土壤杆菌、黄瓜角斑病菌、番茄细菌斑点病菌）和十几种革兰氏阳性菌（枯草芽孢杆菌、双歧杆菌、真杆菌、消化链球菌、溶血葡萄球菌）有一定的抑制作用。在杀虫方面，白僵菌素对蚊子幼虫、卤虫、绿头苍蝇和鞘翅目害虫等有杀伤作用，白僵菌素其同系物具有抗结核和疟原虫的活性等。近年来，越来越多的研究表明白僵菌素除了具有杀虫作用之外还具有很多生物活性。在抗病毒方面，白僵菌素通过抑制HIV-1整合酶产生抗艾滋病毒作用。在抗真菌方面，白僵菌素配合酮康唑使用有显著的抗真菌效果，能够明显减少酮康唑的用量，降低其毒性。在抗癌方面，白僵菌素能够诱导人白血病细胞和人肺癌细胞的凋亡，可引起鼠和人类肿瘤细胞系显著的细胞死亡，并且能够强效和特异地抑制鼠肝脏微体中胆固醇酰基转移酶活性。

作为一个有潜力的抗菌剂和杀虫剂，白僵菌素将越来越多地应用于人类医药和农药中。白僵菌素所具有的解热、降胆固醇、抗惊厥和祛痰等作用，使其在临床上用于治疗流行性腮腺炎和上呼吸道感染等病毒性疾病；作为农药，其还可用于农业或林业防治多种害虫，如防治松毛虫等。另外，白僵菌素还可作为先导化合物发现更多的杀虫剂和药物。因此，白僵菌素众多的药理活性和广阔的应用领域将为其及其衍生物带来良好的市场前景。

关于生产白僵菌素的菌种发酵方法，国内目前报道多为利用球孢白僵菌生产白僵菌素，利用镰刀菌生产白僵菌素的报道较少且多为采用固体发酵获得白僵菌素，固体发酵虽然产量较高，但由于操作繁琐，周期长，且固体发酵易受环境湿度的影响，造成产量水平不稳定，不适合大规模工业化生产。朱颖雪等利用液体静置培养镰刀菌Fusarium sp.F1获得白僵菌素（朱颖雪，钟坤，邵志宇等.镰刀菌Fusarium sp.F1制备白僵菌素的初步研究[J].化学世界，2007，增刊：156-157.），但其耗时长，不利于工业化生产。而液体震荡培养虽偶有报道，但发酵水平不稳定，且原料昂贵，成本极高，规模化生产有很大困难。

关于白僵菌素的分离及纯化方法，Quan-Xin Wang等人将尖孢镰刀菌发酵菌丝体用乙酸乙酯反复提取，蒸干有机溶剂得粗提物，粗提物用水分散后，用二氯甲烷萃取，萃取物经过凝胶柱、硅胶柱、ODS反相柱和反相高效液相制备色谱处理，最终得到白僵菌素（Quan-Xin Wang, Sai-Fei Li, Feng Zhao,et al. Chemical constituents from endophytic fungus Fusarium oxysporum[J]. Fitoterapia, 2011 ,82: 777–781）。Lijian Xu等从盾叶薯蓣镰刀菌属内寄生菌中分离得到白僵菌素，将内寄生菌发酵菌丝体用正丁醇提取后浓缩得粗提物，然后通过硅胶柱、凝胶柱、反相色谱柱纯化制得（Lijian Xu, Jihua Wang, Jianglin Zhao,et al.Beauvericin from the Endophytic Fungus,Fusarium redolens, Isolated from Dioscorea zingiberensis and Its Antibacterial Activity[J]. Natural Product Communications,2010,5:811-814）。专利200810056844采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析、RP-18反相柱层析等色谱柱进行反复柱层析，得到白色针状晶体即白僵菌素。以上所提到的三种分离纯化方法均存在同样不足：即操作步骤繁琐，周期长，处理样品少，不适合于工业化生产。

发明内容

本发明的目的在于克服上述不足之处，提供一种生产周期短、操作简单、分离效果好、生产成本低、利于工业化生产的白僵菌素的制备方法。

本发明的白僵菌素的制备方法包括如下步骤： 

1a、制备镰刀菌LF061种子液：

将菌株LF061的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，28℃-32℃、转速120rpm-160 rpm，培养48-72 h获得种子液；

其中所说的种子培养基为YPD培养基含有如下组分：Yeast Extract 10g，Peptone20g, 葡萄糖20g，加蒸馏水定容至1000 m，121 ℃灭菌20 min；

1b、镰刀菌LF061种子液经发酵制备白僵菌素：

将上述种子液以体积百分比5%-15 %的接种量接种于液体发酵培养基，发酵温度28 ℃-32 ℃，转速120rpm-160 rpm，通气量10L-30L/分，发酵时间96h-144 h；所得发酵液分离、精制得白僵菌素；

其中所说的液体发酵培养基含有以下组分：葡萄糖5g-10g，可溶性淀粉20g-30g，工业蛋白胨20g-50g，氯化钾0.1g-0.2g，磷酸二氢钾3g-5g，硝酸钠1g-1.5g，七水硫酸镁0.05g-0.1g，碳酸钙1g-2g，加水定容至1000 ml，121 ℃灭菌30 min。

所述发酵液分离、精制步骤为：

2a、将发酵液离心或过滤，获得白僵菌素菌丝体。

2b、用有机溶剂对菌丝体浸提1-2次，每次2-4小时，合并浸提液，减压浓缩，除去有机溶剂，得到白僵菌素粗提物； 

2c、将白僵菌素粗提物加入有机溶剂进行溶解，上样至装有聚合物色谱填料的色谱柱；

2d、使用有机溶剂与水的混合液进行梯度洗脱，分管收集洗脱液并进行在线检测，将符合要求的洗脱液合并，经浓缩、干燥，得到高纯度的白僵菌素。

所述的聚合物色谱填料是采用聚苯乙烯-二乙烯苯为基质制备的。

所述有机溶剂为乙醇或甲醇。

所述梯度洗脱是指上样后，先用80%体积百分比的甲醇或乙醇水溶液洗脱2个柱体积去除杂质，然后再用甲醇或乙醇进行洗脱。洗脱速度为1-2倍柱体积/小时。

本发明以高效的白僵菌素生产菌在全部采用廉价工业原料制得的液体发酵培养基中培养，其在短时间内即可达到350μg/ml以上的产物水平，工艺周期短，简单易行，可控制性强，重现性好并且稳定，从而为生产用药提供更加安全的技术保障，因而十分适于工业化生产，进而改变了现有的白僵菌素制备方法中所存在的耗时长，工艺复杂，生产成本高、效率低等缺陷。另外，本发明所设计的白僵菌素精制方法，可有效地去除发酵代谢过程产生的杂质，高效率地获得纯度大于96.0%的高纯度的白僵菌素。

附图说明

图1为实施例3中纯化前白僵菌素提取物的液相色谱图。

图2为实施例3纯化后的白僵菌素液相色谱图。

图3为实施例4纯化后的白僵菌素液相色谱图。

具体实施例

下述实施例仅用于阐述实现本发明的方法，不应理解为对本发明的限制，所有基于本发明的思路作出的修改和变化都应归于本发明的保护范围。

本发明所使用的可育镰刀菌（Fusarium proliferatum）LF061菌株，保藏在中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC 3.1777。聚合物色谱填料为苏州纳微科技公司生产。本发明使用的高效液相色谱仪为996型检测器，515泵（Waters公司）。乙醇、甲醇及其它试剂均为市售，Yeast Extract为oxid公司产，Peptone为 BD公司 产。

实施例1

 (a) 制备镰刀菌LF061种子液

按以下比例制备种子培养基为： Yeast Extract 2g，Peptone4g, 葡萄糖4g，加蒸馏水定容至200 ml；调节pH值到5.8，121 ℃灭菌20 min。

将镰刀菌LF061接种于种子培养基，28℃、转速120 rpm培养48 h获得种子液。

（b）镰刀菌LF061种子液经发酵制备白僵菌素：

液体发酵培养基制备：葡萄糖5g，可溶性淀粉20g，工业蛋白胨30g，氯化钾0.1g，磷酸二氢钾3g，硝酸钠1g，七水硫酸镁0.5g，碳酸钙1g，加水定容至1000 ml，pH值自然，121 ℃灭菌30 min；

将镰刀菌LF061种子液以体积百分比15 %的接种量接种于液体发酵培养基，于摇瓶中发酵，发酵温度30 ℃，转速160rpm，发酵时间96h，取发酵液测得白僵菌素为376μg/mL。

(c) 将1L发酵液以3000rpm离心，上清弃去，获得菌丝体约100 ml。

实施例2

 (a) 制备镰刀菌LF061种子液

按以下比例制备种子培养基： Yeast Extract 20g，Peptone40g, 葡萄糖40g，加蒸馏水定容至2000 ml；调节pH值至5.3 ，121 ℃灭菌20 min。

将镰刀菌LF061接种于种子培养基，30℃、转速130rpm培养72 h获得种子液。

 (b) 镰刀菌LF061种子液经发酵制备白僵菌素

液体发酵培养基制备：葡萄糖300g，可溶性淀粉900g，工业蛋白胨1500g，氯化钾6g，磷酸二氢钾150g，硝酸钠45g，七水硫酸镁3g，碳酸钙60g，加水定容至30L，pH值自然，121 ℃灭菌30 min；

将镰刀菌LF061种子液以体积百分比5%的接种量接种于液体发酵培养基，于50L发酵罐中发酵，发酵温度28 ℃，转速140rpm，通气量20L/分，发酵时间144h，取发酵液测得白僵菌素为425μg/mL。

实施例3 

取实施例2所制白僵菌素发酵液10 L，发酵单位为425μg/mL。将白僵菌素发酵液过滤，得到2.5kg菌丝体。在上述菌丝体中加入甲醇5.0L，搅拌浸提4小时后过滤，收集白僵菌素浸提液。浸提液40℃下真空度为0.09MPa下浓缩至无液体流出，得到白僵菌素粗提物，纯度为53%（液相色谱图见附图1）。取白僵菌素粗提物10g，用60mL甲醇溶解，加样于UniPS30-300型聚合物微球装量为1000mL的中压层析柱（Ф5.5×50cm），使用80%体积百分比的甲醇水溶液作为流动相洗涤2000mL后，用甲醇洗涤，并分管接收，流速为1500mL/h。HPLC检测，白僵菌素纯度大于95.0%的洗脱液合并，浓缩，在45℃下真空干燥，得到3.65g白僵菌素，纯度95.6%（液相色谱图见附图2）。

实施例4 白僵菌素精制

取实施例2所制白僵菌素发酵液10 L，发酵单位为425μg/mL。将白僵菌素发酵液过滤，得到2.5kg菌丝体。在上述菌丝体中加入乙醇3.0L，搅拌浸提2小时后过滤。菌丝体再加入乙醇3.0L进行二次浸提，搅拌2小时后过滤。合并2次白僵菌素浸提液。浸提液40℃下真空度为0.09MPa下浓缩至无液体流出，得到白僵菌素粗提物，纯度为51%。取白僵菌素粗提物10g，用50mL乙醇溶解，加样于UniPS30-300型聚合物微球装量为1000mL的中压层析柱（Ф5.5×50cm），使用80%体积百分比的乙醇水溶液作为流动相洗涤2000mL后，用乙醇洗涤，并分管接收，流速为1000mL/h。HPLC检测，白僵菌素纯度大于95.0%的洗脱液合并，浓缩，在45℃下真空干燥，得到3.53g白僵菌素，纯度96.2 %（见附图3）。

图1、图2及图3的液相色谱图对比显示，经本发明设计的纯化方法可使白僵菌素的纯度明显提高。

Claims (4)

1.一种白僵菌素的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：

1a、制备镰刀菌LF061种子液：

将菌株LF061的斜面培养物或孢子液接种于种子培养基，28℃-32℃、转速120rpm-160 rpm，培养48-72 h获得种子液；

其中所说的种子培养基为YPD培养基，其含有如下组分：Yeast Extract 10g，Peptone20g, 葡萄糖20g，加蒸馏水定容至1000 ml，121 ℃灭菌20 min；

1b、镰刀菌LF061种子液经发酵制备白僵菌素：

将上述种子液以体积百分比5%-15 %的接种量接种于液体发酵培养基，发酵温度28 ℃-32 ℃，转速120rpm-160 rpm，通气量10L-30L/分，发酵时间96h-144 h；所得发酵液分离、精制得白僵菌素；

其中所说的液体发酵培养基含有以下组分：葡萄糖5g-10g，可溶性淀粉20g-30g，工业蛋白胨20g-50g，氯化钾0.1-0.2g，磷酸二氢钾3g-5g，硝酸钠1g-1.5g，七水硫酸镁0.05g-0.1g，碳酸钙1g-2g，加水定容至1000 ml，121 ℃灭菌30 min。

2.根据权利要求1所述的白僵菌素的制备方法，其特征在于，所述发酵液分离、精制步骤为：

2a、将发酵液离心或过滤，获得白僵菌素菌丝体；

2b、用有机溶剂对菌丝体浸提1-2次，每次2-4小时，合并浸提液，减压浓缩，除去有机溶剂，得到白僵菌素粗提物； 

2c、将白僵菌素粗提物加入有机溶剂进行溶解，上样至装有聚合物色谱填料的色谱柱；

2d、使用有机溶剂与水的混合液进行梯度洗脱，分管收集洗脱液并进行在线检测，将符合要求的洗脱液合并，经浓缩、干燥，得到高纯度的白僵菌素。

3.根据权利要求1或2所述的白僵菌素的制备方法，其特征在于：所述有机溶剂为乙醇或甲醇。

4.根据权利要求2所述的白僵菌素的制备方法，其特征在于：所述梯度洗脱是指上样后，先用80%体积百分比的甲醇或乙醇水溶液洗脱2个柱体积去除杂质，然后再用甲醇或乙醇进行洗脱，洗脱速度为1-2倍柱体积/小时。

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