CN1319933C

CN1319933C - 小穴壳菌素化合物及其制备方法和应用

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Publication number: CN1319933C
Application number: CNB2005100918813A
Authority: CN
Inventors: 沈月毛; 杜希萍; 郑忠辉; 黄耀坚; 宋思扬; 苏文金
Original assignee: Xiamen University
Current assignee: Xiamen University
Priority date: 2005-08-15
Filing date: 2005-08-15
Publication date: 2007-06-06
Anticipated expiration: 2025-08-15
Also published as: CN1733693A

Abstract

小穴壳菌素化合物及其制备方法和应用，涉及一种聚酮类化合物，尤其是涉及一种小穴壳菌素的具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物及其制备方法，以及它们在制备抗肿瘤药物中的应用。提供一类新的来源于红树林真菌的具有潜在药用价值的化合物及其提取分离方法，以及它们在制备抗肿瘤药物方面的应用。步骤为将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基培养、过滤，得发酵液上清和菌体；发酵液上清萃取，有机相减压浓缩，得组分A；菌体用甲醇充分浸提，减压浓缩，得到石油醚相和水相，石油醚相减压浓缩后得组分B；水相萃取，有机相减压浓缩后得组分C；组分A、B、C层析后，再分别用高效液相色谱分离、硅胶柱纯化、洗脱得化合物A、B、C、D。

Description

小穴壳菌素化合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种聚酮类化合物，尤其是涉及一种源于红树林真菌(小穴壳菌素)的具有抗肿瘤活性的聚酮类化合物及其制备方法，以及它们在制备抗肿瘤药物中的应用。

背景技术

红树林为分布于热带和亚热带海岸潮间带的木本植物群落，是海滩上特有的森林类型。生活在红树林区的红树林真菌(mangrove fungi)由于所处的生境特殊，其遗传及生理特性与其他生境中的微生物有所不同，具有产生新型活性物质的潜力，是开发新约的重要资源。近年来对红树林真菌活性物质的研究引起了国内外的关注，目前已从这类真菌中发现了一些具有药用价值的新化合物，如Isaka等(Isaka，M.，Chotika，S.，Morakot，T.Aigialomycins A-E，new resorcylic macrolides from the marine mangrove fungusAigialus parvus.J.Org.Chem.2002，67：1561-1566.)从红树林真菌Aigialus parvus中分离到5种新的大环内酯类化合物(aigialomycins A～E)，其中aigialomycin D对KB细胞和Vero细胞的IC₅₀分别为3.0μg/mL和1.8μg/mL。Lin等(Lin，Y.C.，Wu，X.Y.，Feng，S.，et al.Five Unique Compounds：Xyloketals from Mangrove Fungus Xylaria sp.fromthe South China Sea Coast.J.Org.Chem.2001，66：6252-6256.)从南海红树林真菌Xylaria sp.(no.2508)发酵液中分离到5种独特的化合物xyloketalsA～E，当xyloketals A浓度为1.5×10^-6mol/L时对乙酰胆碱酯酶有抑制活性。所以我们的研究具有较高的理论价值和实际应用价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一类新的来源于红树林真菌的具有潜在药用价值的化合物及其提取分离方法，以及它们在制备抗肿瘤药物方面的应用。

本发明所说的小穴壳菌素化合物是从红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃(简称HTF3)的发酵培养物中提取分离到的四种结构类似的新化合物，结构分别为小穴壳菌素A，(3，5-Dihydroxy-2-octanoyl-phenyl)-acetic acid methyl ester(化合物A)、小穴壳菌素B，[3，5-Dihydroxy-2-(1-methoxy-octyl)-phenyl]-acetic acid methyl ester(化合物B)、小穴壳菌素C，(3，5-Dihydroxy-2-nonanoyl-phenyl)-acetic acid ethyl ester(化合物C)和小穴壳菌素D，6，8-Dihydroxy-1-(6-hydroxy-heptyl)-isochroman-3-one(化合物D)。

本发明所说的化合物A、化合物B、化合物C、化合物D的结构式分别为：

本发明所用的红树林真菌HTF₃已保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC，中国武汉大学校内)，保藏号为CCTCC NO：M203067，保藏日期为2003年8月29日。

本发明所说的化合物A、B、C和D可从红树林真菌HTF3的发酵培养物中提取分离得到，制备方法的具体步骤如下：

(1)红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃ CCTCC NO：M203067的种子培养：

按质量比培养基为：马铃薯去皮、切碎取20，加水煮沸后过滤，滤液中加葡萄糖1-3，琼脂1.5-2.0，半海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面，挑取菌种接入斜面培养；

(2)红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃ CCTCC NO：M203067的发酵培养：

按质量比发酵培养基为：马铃薯去皮、切碎取20，加水煮沸后过滤，滤液中加葡萄糖1-3，半海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基培养；

(3)将上述培养好的发酵培养物过滤，分别得到发酵液上清和菌体；

(4)发酵液上清用乙酸乙酯萃取，发酵液上清萃取后的有机相减压浓缩，得到组分A；菌体用甲醇充分浸提，合并提取液减压浓缩，得到石油醚相和水相，石油醚相减压浓缩后得到组分B；水相用乙酸乙酯萃取，水相萃取后的有机相减压浓缩后得到组分C；

(5)组分A用硅胶柱和反相硅胶柱层析后，用高效液相色谱分离，收集保留时间为11.6min的洗脱峰，浓缩后得到化合物A；

(6)组分B用硅胶柱层析和凝胶柱层析后，再用硅胶柱纯化，按体积比收集氯仿∶甲醇＝(30～60)∶1的组分得到化合物B；

(7)组分C用硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，得到组分1和组分2，组分1用反相硅胶柱得到化合物C，组分2用硅胶柱纯化得到化合物D。

在步骤1中，挑取菌种接入斜面，28℃培养5-15天。

在步骤2中，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，温度28℃、以100-160转/分震摇，培养5-10天。

在步骤4中，水相用乙酸乙酯萃取2-5遍。

在步骤5中，组分A反复用硅胶柱和反相硅胶柱层析后，用高效液相色谱 Nova- Pak@silica 6μm，7.8mm×300mm，WATO2582分离，洗脱剂为氯仿-甲醇，流量为：1mL/min，检测波长为：280nm。

本发明所说的化合物A、化合物B、化合物C、化合物D具有抗肿瘤活性，可用于制备抗肿瘤药物。由此可见，本发明具有较高的理论价值和实际应用价值。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明。

实施例1

化合物A、B、C、D的分离制备方法：

(1)红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃ CCTCC NO：M203067的种子培养：

培养基以克为单位：马铃薯去皮、切碎20，加水煮沸，纱布过滤，滤液中加葡萄糖2，琼脂2.0，半海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面。挑取菌种接入斜面，28℃培养10天；

(2)红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃ CCTCC NO：M203067的发酵培养：

发酵培养基以克为单位：马铃薯去皮、切碎20，加水煮沸，纱布过滤，滤液中加葡萄糖2，半海水定容至100ml，灭菌，将斜面上培养好的菌株挑入发酵培养基，温度28℃、震摇(120转/分)培养7天；

(3)将上述培养好的发酵培养液用4层纱布过滤，分别得到发酵液上清和菌体；

(4)发酵液上清用等体积乙酸乙酯萃取4遍，发酵液上清萃取后的有机相于50℃减压浓缩，得到组分A；菌体在室温用甲醇充分浸提，合并提取液于50℃减压浓缩，得到石油醚相和水相，石油醚相减压浓缩后得到组分B；水相用乙酸乙酯萃取3遍，水相萃取后的有机相减压浓缩后得到组分C；

(5)组分A反复用硅胶柱层析后，再用反相硅胶柱(22g RP-18)分离，收集甲醇-水＝7∶3(V/V)的组分，浓缩后用高效液相色谱分离( Nova-Pak@silica 6μm，7.8×300mm，WATO2582)，洗脱剂为氯仿∶甲醇＝40∶1(V/V)，流量为：1mL/min，检测波长为：280nm；收集保留时间为11.6min的洗脱峰，浓缩后得到化合物A(3mg)；

(6)组分B用硅胶柱层析，收集氯仿∶甲醇＝30∶1(V/V)的组分，浓缩后用凝胶柱(45g Sephadex LH-20)层析，再用硅胶柱纯化，收集氯仿∶甲醇＝50∶1(V/V)的组分得到化合物B(18mg)。

(7)组分C用硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，得到组分1和组分2。组分1用反相硅胶柱(45g RP-18)分离，收集丙酮∶水＝1∶1(V/V)的组分，浓缩后再用硅胶柱纯化，收集石油醚∶丙酮＝5∶1(V/V)的组分得到化合物C(10mg)。组分2用反相硅胶柱(45gRP-18)分离，收集甲醇∶水＝1∶1(V/V)的组分，浓缩后再用硅胶柱纯化，收集石油醚∶丙酮＝4∶1(V/V)的组分得到化合物D(30mg)。

化合物A的实验数据：黄色油状物；ESIMS m/z 309.0[M+H]+；HRESIMS m/z 331.1527[M+Na]⁺(calcd for C₁₇H₂₄O₅Na，331.1521)：¹H NMR and ¹³C NMR(500MHz，CDCl₃)见表1和表2。

表1 化合物A、B、C和D的¹H-NMR数据

Position	A^a)	B^a)	C^a)	D^b)
Position	A^a)	B^a)	C^a)	D^b)	12345678910111213141516171819	-3.92(s，2H)-6.40(s)-6.35(s)---2.91(t，7.3，2H)1.77(d，6.9，2H)1.33-1.37(brm)1.33-1.37(brm)1.33-1.37(brm)1.33-1.37(brm)0.95(t，6.9，3H)3.80(s，3H)	-3.55(m，2H)-6.31(s)-6.26(s)--4.52(t，5.4)1.94(dd，9.1，13.0)1.60(dd，10.2，23.8)1.60(dd，10.2，23.8)1.271.271.271.270.87(t，6.8，3H)3.69(s，3H)3.35(s，3H)	-3.80(s，2H)-6.29(s)-6.27(s)---2.46(t，7.3，2H)1.72(dt，7.4，14.8，2H)2.86(dt，7.2，14.4，2H)1.26-1.36(br m)1.26-1.36(br m)1.26-1.36(br m)1.26-1.36(br m)0.85(t，6.9，3H)4.21(q，7.1，2H)0.90(t，5.9，3H)	-3.80(d，19.5)3.52(d，19.0)-6.21(s)-6.12(s)--5.61(dd，4.1，9.1)1.83(m)1.34-1.47(m)1.34-1.47(m)1.34-1.47(m)1.34-1.47(m)3.71(m)1.13(d，6.2，3H)

a)CDCl₃；b)CD₃OD

表2 化合物A、B、C和D的¹³C-NMR数据

Position	A^a)	B^a)	C^a)	D^b)
Position	A^a)	B^a)	C^a)	D^b)	12345678910111213141516171819	171.3(s)41.5(t)13.6.6(s)103.2(d)164.6(s)112.4(d)160.2(s)116.6(s)206.7(s)43.4(t)25.0(t)29.0(t)29.2(t)31.7(t)22.6(t)14.0(q)52.4(q)	171.8(s)38.6(t)133.4(s)103.7(d)156.2(s)109.9(d)157.6(s)116.5(s)81.8(d)35.6(t)26.1(t)29.2(t)29.4(t)31.8(t)22.6(t)14.0(q)52.1(q)57.2(q)	171.4(s)41.7(t)136.6(s)103.1(d)164.0(s)112.6(d)160.7(s)116.7(s)206.3(s)43.4(t)24.5(t)28.6(t)29.7(t)31.9(t)24.5(t)23.5(t)11.1(q)61.5(t)14.1(q)	174.0(s)35.5(t)132.8(s)102.0(d)159.5(s)106.1(d)155.2(s)113.9(s)80.1(d)36.7(t)26.7(t)30.7(t)30.3(t)31.0(t)68.5(d)23.5(q)

a)CDCl₃；b)CD₃OD

化合物B的实验数据：无色无定形粉末；ESIMS m/z 347.1[M+Na]；HRESIMS m/z 347.1832[M+Na]⁺(calcd for C₁₈H₂₈O₅Na，347.1834)；¹H NMR and ¹³C NMR(400MMHz，CDCl₃)见表1和表2。

化合物C的实验数据：黄色油状物；ESIMS m/z 337.0[M+H]⁺(calcd for C₁₉H₂₈O₅)；¹H NMR and ¹³C NMR(400MHz，CDCl₃)见表1和表2。

化合物D的实验数据：黄色油状物；ESIMS m/z 295.1[M+H]⁺(calcd for C₁₆H₂₂O₅)；¹H NMR and ¹³C NMR(500MHz，CD₃OD)见表1和表2。

实施例2

采用体外测定细胞毒的MTT(Methyl Thiazolyltetrazolium)法检测化合物A、B、C、D的抗肿瘤活性：

(1)肿瘤细胞株：

人B淋巴瘤Raji细胞、人口腔皮样癌KB细胞和人肝癌Hepg II细胞

(2)材料

a MTT(噻唑蓝)：

用0.01mol/L的磷酸盐缓冲液(PBS)溶解MTT(Thiazoyl blue)到终浓度5mg/ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，分装后于4℃避光保存；

b SDS裂解液：

100g十二烷基磺酸钠(SDS)，1N HCl 10ml，加热溶解，蒸馏水定容至1000ml。

c细胞培养基(全培)：

一袋10g干粉RMPI 1640(Gibco Co.Ltd.)细胞培养基溶于1L双蒸水中；加入2g NaHCO₃搅匀溶解后封口，置于4℃过夜，以自然沉淀除去杂质；次日加入10-15％已灭活(56℃，30min)的小牛血清及1％多抗母液；混匀后用0.22μm孔径的滤膜过滤除菌。

(3)化合物A、B、C和D的配置

分别取一定量的化合物A、B、C和D，用甲醇溶解并调整浓度为10mg/ml，0.22μm孔径的滤膜过滤除菌，4℃保存备用。

(4)肿瘤细胞的培养

a细胞活化：

取一干净烧杯，装入干净温水，水温调至37-40℃；将冻存管从液氮中取出迅速投入温水解冻，并将冻存细胞接入预装有细胞培养基的培养瓶内，在37℃、5％CO₂、100％湿度的条件下培养，观察细胞生长情况，及时更换培养液、分瓶。

b细胞计数：

选对数生成期细胞，胰酶消化，移入离心管中，加全培至10ml，取一滴滴入计数板一侧凹槽中，倒置显微镜下计数。调整细胞数至1×10⁵/ml。

c活性检测：

①96孔板在超净工作台内紫外光下照射1小时；

②在各孔中加入细胞悬液80μl，37℃、5％CO₂、100％湿度的条件下培养24小时；

③加入20μl用全培梯度稀释成一系列浓度的A、B、C和D溶液，继续培养48小时；

④每孔加入MTT溶液10μl，轻轻震摇使颗粒溶解，37℃放置3小时；

⑤取出培养板，每孔加入10％SDS溶液100μl，37℃溶解过夜；

⑥用酶联反应仪590nm测定各孔吸光值，按下列公式计算抑制率：

抑制率＝(对照组OD值-实验组OD值)/对照组OD值×100％

⑦以抑制率为纵坐标，受试样品浓度的对数为横坐标作图，求出抑制率为50％时的浓度即为IC₅₀。

d实验结果：

化合物A-D对三种肿瘤细胞均具有抗肿瘤活性，但其活性及抗瘤谱有些差异。化合物B和化合物C对人淋巴瘤Raji细胞的IC₅₀均小于2μg/mL，而化合物A和化合物D对人淋巴瘤Raji细胞的IC₅₀均大于20μg/mL；化合物A-D对人口腔上皮癌KB细胞和人肝癌HepgII细胞的IC₅₀均大于10μg/mL。

实施例3

与实施例1类似，其区别在于在红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃ CCTCC NO：M203067的种子培养中，滤液中加葡萄糖1，琼脂1.8，半海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面。挑取菌种接入斜面，28℃培养10天：

在红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃ CCTCC NO：M203067的发酵培养中震摇160转/分培养5天；

将上述培养好的发酵培养液用3层纱布过滤，分别得到发酵液上清和菌体；发酵液上清用等体积乙酸乙酯萃取3遍，水相用乙酸乙酯萃取5遍。

实施例4

与实施例1类似，其区别在于在红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃；CCTCC NO：M203067的种子培养中，滤液中加葡萄糖3，琼脂1.5，半海水定容至100ml，灭菌，制成试管斜面。挑取菌种接入斜面，28℃培养10天；

在红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃；CCTCC NO：M203067的发酵培养中震摇100转/分培养10天；

将上述培养好的发酵培养液用5层纱布过滤，分别得到发酵液上清和菌体；发酵液上清用等体积乙酸乙酯萃取2遍，水相用乙酸乙酯萃取2遍。

Claims

1、小穴壳菌素化合物A，其特征在于其结构为：

2、小穴壳菌素化合物B，其特征在于其结构为：

3、小穴壳菌素化合物C，其特征在于其结构为：

4、如权利要求1所述的小穴壳菌素化合物A的制备方法，其特征在于其步骤为：

(1)红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃ CCTCC NO：M203067的种子培养：

(2)红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃ CCTCC NO：M203067的发酵培养：

(5)组分A用硅胶柱和反相硅胶柱层析后，用高效液相色谱分离，收集保留时间为11.6min的洗脱峰，浓缩后得到化合物A。

5、如权利要求2所述的小穴壳菌素化合物B的制备方法，其特征在于其步骤为：

(1)红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃ CCTCC NO：M203067的种子培养：

(2)红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃ CCTCC NO：M203067的发酵培养：

(6)组分B用硅胶柱层析和凝胶柱层析后，再用硅胶柱纯化，按体积比收集氯仿∶甲醇＝30～60∶1的组分得到化合物B。

6、如权利要求3所述的小穴壳菌素化合物C的制备方法，其特征在于其步骤为：

(1)红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃ CCTCC NO：M203067的种子培养：

(2)红树林真菌Dothiorella sp.HTF₃ CCTCC NO：M203067的发酵培养：

(4)发酵液上清用乙酸乙酯萃取，发酵液上清萃取后的有机相减压浓缩，得到组分A；菌体用甲醇充分浸提，合并提取液减压浓缩，得到石油醚相和水相，水相用乙酸乙酯萃取，水相萃取后的有机相减压浓缩后得到组分C；

(5)组分C用硅胶柱层析，氯仿-甲醇梯度洗脱，得到组分1和组分2，组分1用反相硅胶柱和硅胶柱纯化得到化合物C。

7、如权利要求1或2或3所述的小穴壳菌素化合物用于制备抗肿瘤药物的应用。