CN102001921B - 倍半萜混对苯二酚类化合物及其制备方法和用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及两种倍半萜混苯二酚类化合物的制备方法和用途。本发明用采自南海海绵样品中的链格孢菌SP-32(Alternaria sp.)生产出结构新颖的倍半萜混苯二酚类化合物。经实验证实，该类化合物具有抗甲型H1N1流感病毒作用，有开发成为抗甲流药物制剂的潜力。

Description

倍半萜混对苯二酚类化合物及其制备方法和用途

技术领域：

本发明涉及用链格孢菌SP-32(Alternaria sp.)(保藏编号是：CCTCC M2010044)生产倍半萜混苯二酚类化合物的方法；本发明还涉及该类化合物在制备抗甲型H1N1流感药物中的用途。

背景技术：

倍半萜混苯酚类化合物是多产生于海绵、海鞘等无脊椎动物的一种活性混源萜类化合物，但链格孢菌作为其来源未见报道。本发明人研究得知，链格孢菌SP-32(Alternaria sp.)(保藏编号：CCTCC M2010044，保藏日期：2010年2月5日，保藏单位：中国典型培养物保藏中心，地址：武汉市武汉大学)液体发酵产物经超声破碎后的粗提物有很好的抗甲型H1N1流感病毒增殖作用，遂对其活性成分进行了研究。研究发现所示倍半萜混苯二酚类化合物具有较强的抗甲型H1N1流感病毒活性，目前尚未见该化合物的化学结构及抗甲型H1N1流感病毒的报道，因此市场上也尚未见有与此有关的药物。

发明内容：

本发明旨在提供一个结构独特的具有抗甲型H1N1流感病毒作用的新化合物。其结构式为：

式I化合物

其结构特征是：此结构是新颖的倍半萜混苯酚类化合物，其中R1-R5为氢、氨基、羟基、烷氧基、酰氧基或酰氨基。

本发明优选的结构中R₁-R₄为羟基、R₅为甲氧基。

本发明所涉及的化合物可通过微生物发酵培养来获取含有倍半萜混苯酚类化合物的发酵物，然后从发酵物中采用硅胶柱层析、Sephadex LH20凝胶柱层析制备HPLC等方法分离纯化得到。

本发明的下述实施例中列举了利用链格孢菌SP-32(Alternaria sp.)(保藏编号是：CCTCC M2010044)制备本发明所示化合物的实例。

具体实施方式：

在如下的实施例中所指的化合物的化学结构(结构式中的阿拉伯数字是化学结构中碳原子的标位)为：

实施例1化合物的发酵生产及分离精制

1发酵生产

生产菌的发酵培养：按培养微生物的常规方法，取链格孢菌SP-32(Alternariasp.)(保藏编号是：CCTCC M2010044)适量，接种到PDA固体斜面培养基上，在28摄氏度培养箱中培养4天。

取斜面培养4天的链格孢菌SP-32(Alternaria sp.)适量，接种到装有200mL培养液[培养基组成(克/升)∶麦芽糖20.0，甘露醇20.0，味精10.0，KH₂PO₄0.5，MgSO₄0.3，酵母膏3.0，pH自然]的500mL锥型瓶中，在28℃、160转/分钟条件下摇床培养8天，获得菌丝体和发酵液。

2浸膏的获得

用棉布将菌丝体和发酵液分离。将发酵液等体积乙酸乙酯萃取三次，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗浸膏。

3化合物的分离精制

浸膏用氯仿-甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶(青岛海洋化工集团公司产品)拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-丙酮，氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为5个流份。将Fr-4(氯仿-甲醇97∶3洗脱物)以氯仿-甲醇(1∶1)为溶剂进行LH20柱层析，再经加压硅胶柱层析以石油醚∶丙酮(9∶1→5∶5)为溶剂，最后经半制备反相高效液相色谱(甲醇∶水＝65∶35)得所示化合物。

化合物I无色油状，正离子ESI-MS m/z415.2[M+Na]+，[α]²⁰D4.4(c0.1，MeOH)，分子式C₂₂H₃₄O₅，IR(KBr)cm-1：1693，1620，1509，1441，1308，1222，1017，990。¹H和¹³C-NMR数据见表1。

表1化合物I的¹H和¹³C NMR数据(600和150MHz，in DMSO-d₆)^a

a)本表信号归属基于DEPT、HMQC及HMBC图谱解析结果。碳信号的多重度利用DEPT方法确定并分别用s(单重峰)、d(二重峰)、t(三重峰)和q(四重峰)表示。

b)此栏中的数字和代号分别代表在HMBC谱中与相应行中的¹H给出偶合相关信号的¹³C核。

c)此栏中的数字和代号分别代表在¹H-¹H COSY谱中与相应行中的¹H给出偶合相关信号的¹H核。

实施例2体外抗H1N1病毒活性的测试

1.实验样品及实验方法

被测样品溶液的配制    测试样品为上述实施例1中分离精制的化合物I纯品。精密称取适量样品，用DMSO配制成所需浓度的溶液，供测活性。

病毒株及受感染细胞系的培养    采用甲型流感病毒株[A/PR/8/34(H1N1)]感染狗肾上皮细胞(MDCK)，于感染同时将待测样品加入细胞维持液(不含血清)中，在37摄氏度下通入5％二氧化碳的培养箱中继代培养，而后采用倒置显微镜观察感染细胞的CPE(细胞病变)情况。

四氮唑盐(MTT)法    取对数生长期的狗肾上皮细胞(MDCK)细胞，将细胞密度调至每毫升2×10⁵个细胞，按每孔50微升接种于96孔细胞培养板中，于37℃通入5％CO₂的培养箱中培养24小时。每孔接种50μL的1000TCID50的甲型流感病毒液，于37℃吸附60min，弃病毒上清。每孔加入200μL细胞维持液(无血清，含有5μg/mL胰蛋白酶)，然后在相应的孔分别加入样品液或阳性对照药各2μL，并设阳性对照组(利巴韦林)，正常细胞对照组(不感染病毒)和病毒对照组(不加药)。将培养板置37℃继续培养，每日观察CPE情况，在病毒对照组有75％-100％的CPE出现时，弃培养液上清，每孔加入含5mg/mLMTT的不含血清的培养液50微升，继续培养2-3小时，小心吸去上清。每孔加入DMSO各100μL，在微量振荡器上振荡15分钟，至结晶完全溶解后，利用MD公司产SPECTRA MAX Plus型酶标仪测定每孔在570nm处的吸光值(OD值)。在同一块96孔板中样品的每个浓度均设置三孔。取三孔平均OD值，按病毒抑制率IR％＝(OD_样品组-OD_病毒组)/(OD_正常组-OD_病毒组)×100％计算每个浓度下的病毒增殖抑制率(IR％)。

2.实验结果

在MTT法测试中，化合物I对H1N1病毒增殖抑制结果见表2

表2化合物I对H1N1病毒增殖的抑制率(％)

3.结论

该类化合物具有抗甲型H1N1流感病毒作用，有开发成为抗甲流药物制剂的潜力。

Claims (3)

1.化合物I结构

其中R₁-R₄为羟基、R₅为甲氧基。

2.权利要求1所述化合物的制备方法，其特征是发酵培养链格孢菌SP-32(Alternaria sp.)获取发酵液，再将发酵液用等体积乙酸乙酯萃取三次，将乙酸乙酯萃取液减压浓缩，得粗浸膏，再将上述粗浸膏用氯仿-甲醇混合溶剂溶解后，加200-300目硅胶拌样，减压除去溶剂后，用硅胶柱层析，以石油醚、石油醚-丙酮，氯仿，氯仿-甲醇为溶剂进行梯度洗脱，分为5个流份。将氯仿-甲醇97∶3洗脱物以氯仿-甲醇1∶1为溶剂进行LH20柱层析，再经加压硅胶柱层析以石油醚∶丙酮9∶1→5∶5洗脱，最后经半制备反相高效液相色谱，甲醇∶水＝65∶35洗脱得所示化合物。

3.权利要求1所述的化合物在制备研发抗甲型H1N1流感病毒药物中的用途。