CN102351859B

CN102351859B - 抗生素Pseudonocardian A和B及其制备方法和在制备抗菌、抗肿瘤药物中的应用

Info

Publication number: CN102351859B
Application number: CN 201110231993
Authority: CN
Inventors: 张长生; 李苏梅; 田新朋; 张文军; 张海波; 张光涛; 张偲; 鞠建华
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2011-08-12
Filing date: 2011-08-12
Publication date: 2013-02-27
Anticipated expiration: 2031-08-12
Also published as: CN102351859A

Abstract

本发明公开了两种抗生素PseudonocardianA和B及其制备方法和在制备抗菌、抗肿瘤药物中的应用。本发明的假诺卡氏菌SCSIO 01299是假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)的一个新种，该菌能够产生两种新的抗生素Pseudonocardian A和B，而Pseudonocardian A和B具有抗菌活性和细胞毒活性，有望研发为抗菌和抗肿瘤新药。

Description

抗生素Pseudonocardian A和B及其制备方法和在制备抗菌、抗肿瘤药物中的应用

技术领域：

本发明属于工业微生物领域，具体涉及新的抗生素PseudonocardianA和PseudonocardianB及其制备方法和在制备抗菌、抗肿瘤药物中的应用。

背景技术：

Deoxynyboquinone(DNQ)是一个已经人工合成的化合物，其结构如式(I)所示，该化合物具有显著细胞毒活性，在以产生活性氧自由基(ROS)为抗性机理的抗肿瘤药物中，该化合物表现出优异的特征-在缺氧条件下仍显示出较强活性，成药潜力巨大。与之结构相近的化合物SCH 538415活性较之弱10倍(Bair，J.S.；Palchaudhuri，R.；Hergenrother，P. J.，Chemistry and biology of deoxynyboquinone，a potent inducer of cancer cell death.J Am Chem Soc2010，132，(15)，5469-78.)。

式(I)

发明内容：

本发明的第一个目的是提供两种新的具有抗菌和细胞毒活性的化合物Pseudonocardian A和Pseudonocardian B。

本发明的两种新的抗生素Pseudonocardian A和Pseudonocardian B，其结构如式(II)所示：

式(II)

其中当R＝H时为Pseudonocardian A，当R＝CH₃时为Pseudonocardian B。

本发明的第二个目的是提供一种PseudonocardianA和Pseudonocardian B的制备方法。

本发明的Pseudonocardian A和Pseudonocardian B是从假诺卡氏菌Pseudonocardia spSCSIO 01299的发酵培养物中制备分离得到的。

本发明优选通过以下方法从假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299的发酵培养物中制备得到PseudonocardianA和Pseudonocardian B，具体步骤如下：

a)制备假诺卡氏菌SCSIO 01299的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开，发酵液经丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，浸取液回收丙酮后剩余的水混合液再用丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏B；

b)将浸膏A和浸膏B合并的粗提物经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100∶0～0∶100进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比50∶1梯度洗脱下来的馏分Fr.1，再过LH-20凝胶柱，以氯仿/甲醇体积比1∶1作为流动相洗脱，后经过硅胶柱层析，用氯仿/甲醇体积比为20∶1作为流动相洗脱，再经ODS反相中压液相色谱(YMC*GELODS-A球型填料，120A孔径，50um粒径，40×2.5cm I.D.)，流速为15ml/min，以体积分数从0％～55％的甲醇/水梯度洗脱160min，收集体积分数40～45％的甲醇/水梯度洗脱下来的馏分，得到化合物Pseudonocardian A，收集体积分数50～55％的甲醇/水梯度洗脱下来的馏分，得到化合物Pseudonocardian B。

所述的a)步骤的制备假诺卡氏菌SCSIO 01299的发酵培养物优选通过以下方法制备：将活化的假诺卡氏菌SCSIO 01299接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养48h制得种子液，将种子液以10％的接种量接入到发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养120h，而制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有：淀粉15g，大豆粉5g，蛋白胨15g，甘油15g，CaCO₃2g，粗海盐30g，余量为水，pH 7.4。经本方法制备的假诺卡氏菌SCSIO 01299的发酵培养物中PseudonocardianA和B的含量比较高。

本发明通过实验发现，Pseudonocardian A和B对金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureusATCC 29213，苏云金芽孢杆菌Bacillus thuringensis和粪肠球菌Enterococcus faecalis ATCC29212具有抗菌活力，MIC值在2～4μg/ml之间，由此可见化合物Pseudonocardian A和B具有较好抑菌活性，有望研发成为抗菌新药。

因此本发明的第三个目的是提供PseudonocardianA和B在制备抗菌药物中的应用。

本发明通过实验发现，Pseudonocardian A和B对人乳腺癌细胞株(MCF-7Cells)、人大细胞肺癌细胞株(NCI-H460)和人胶质瘤细胞株(SF-268)具有极强的细胞毒活性，IC₅₀值在0.02～0.21μM之间，说明化合物Pseudonocardian A和B均具有细胞毒活性，可望开发成为抗肿瘤新药。

因此本发明的第四个目的是提供PseudonocardianA和B在制备抗肿瘤药物中的应用。

本发明的假诺卡氏菌SCSIO 01299是假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)的一个新种，该菌能够产生两种新的抗生素PseudonocardianA和B，而PseudonocardianA和B具有抗菌活性和细胞毒活性，有望研发为抗菌和抗肿瘤新药。

本发明的假诺卡氏菌Pseudonocardia sp.SCSIO 01299于2011年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M2011255。

附图说明：

图1是Pseudonocardia sp SCSIO 01299基于16s rDNA序列的邻接法重建的与之亲缘关系最近的种之间关系的系统发育树；

图2是Pseudonocardia sp SCSIO 01299的孢子形态扫描电镜图；

图3是上清液的提取物-浸膏A和菌丝体的提取物-浸膏B的高效液相色谱图，高效液相色谱(HPLC)条件：色谱柱为phenomex 150×4.6mm(SphereClone SAX)，流动相包括流动A相和流动B相，流动相A相：10％(体积分数)的乙腈+0.08％(体积分数)的三氟乙酸，溶剂为水，流动B相：90％(体积分数)的乙腈，溶剂为水；进样程序：O-20min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95∶5-0∶100，20-21min，流动相比例为A相/B相(体积比)：0∶100，21-22min，流动相比例为A相/B相(体积比)：0∶100-95∶5，22-30min，流动相比例为A相/B相(体积比)：95∶5，检测波长254nm，流速1ml/min；

图4是化合物1(Pseudonocardian A)用软件ChemBio3D Ultra 11.0通过MM2最小能量计算得到的模拟构型图和关键的NOESY相关图

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

一、假诺卡氏菌Pseudonocardia sp SCSIO 01299的分离和鉴定

假诺卡氏菌SCSIO 01299鉴定中涉及的基因组DNA的提取，16S rDNA的PCR扩增，序列比对和系统进化树的建立方法以及生理学、化学和形态学鉴定等，均参考文献[Tian，X.P.，Zhi，X.Y.，Qiu，Y. Q.，Zhang，Y. Q.，Tang，S.K.，Xu，L. H.，Zhang，S.，Li，W. J.Sciscionella marinagen.nov.，sp.nov.，a marine actinomycete isolated from a sediment in the northern South China Sea.Int J Syst EvolMicrobiol，2009，59(Pt 2)：222-228]。

本发明的假诺卡氏菌SCSIO 01299是从我国南海北部(E 120°0.975′，N 19°0.664′)水深3258米的海底沉积物中分离获得的。分离培养基为现有技术中的ISP5培养基，每升含有L-天门冬氨酸1.0g，甘油10.0g，K₂HPO₄1.0g，微量元素溶液1ml，琼脂20.0g，蒸馏水1000ml，pH 7.2，*微量元素溶液为FeSO₄.7H₂O 0.1g，MnCl₂.4H₂O 0.1g，ZnSO₄.7H₂O 0.1g。分离培养条件为：28℃，14天。由此从海底沉积物分离纯化得到一菌株SCSIO 01299(假诺卡氏菌Pseudonocardia sp SCSIO 01299)。

按照参考文献中的方法或者常规方法提取该菌株SCSIO 01299的基因组DNA，应用常规PCR扩增该菌株的16S rDNA并测序，其序列如SEQ ID NO.1所示，而后提交到GenBank中，得到序列号JN204514。对16S rDNA核苷酸序列进行BLAST分析，结果显示，该菌株与Pseudonocardia autotrophica IMSNU 20050^T的相似度为98％，说明该菌株SCSIO 01299为假诺卡氏菌属。如图1所示，通过邻接法清晰地揭示了该菌株与一组假诺卡氏菌属物种的系统进化关系，表明该菌属于假诺卡氏菌属的一种。

形态学特征和生理生化分析：

菌株SCSIO 01299属于革兰氏阳性，好氧放线菌，基丝微黄分枝，气丝白色分支并分化成卷曲的孢子链；孢子杆状(如图2所示)，长1.3-2.5μm，表面光滑。Czapek’s agar有可溶性色素产生。能水解淀粉、纤维素、吐温20，40，60；明胶液化、牛奶凝固和胴化阴性，H₂S产生，吐温80水解，氧化酶和硝酸盐还原反应阴性。接触酶反应阳性，黑色素产生和脲酶反应阴性。可以利用D-阿拉伯糖，D-纤维二糖，草酸盐，D-半乳糖，D-葡萄糖，肌醇，D-麦芽糖，D-甘露醇，D-甘露糖，D-棉子糖，L-鼠李糖，D-核糖，D-蔗糖，卫矛醇，D-乳糖，D-山梨糖和木糖醇，果糖和D-木糖为唯一碳源和能源生长，而不能利用D-海藻糖。pH、盐浓度和温度的耐受范围分别为pH 6.0-8.0，0-15％和4-40℃。细胞壁含有meso-DAP。磷脂组分为PG，DPG，PE，PI，PIM和未知磷脂PL。优势醌为MK-8(H4)。主要脂肪酸为i-C16:0，i-C16:1H，ai-C17:0和i-C17:1w9c。G+C摩尔含量为73.2(±0.5)％。根据以上形态学、生理学、化学等分析，其与已知最接近菌株Pseudonocardia autotrophica IMSNU 20050^T有较大的差异，且基因组杂交显示其与最接近菌株Pseudonocardia autotrophica IMSNU 20050^T的杂交值为36％；远低于种内差异标准的70％(Stackebrandt，E.& Ebers，J.Taxonomic parametersrevisited：tarnished gold standards.Microbiol Today.(2006).33，152-155.)。因此，综合分析多项分类数据，鉴定此菌株为假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)的一个新种，并将此菌命名为：假诺卡氏菌Pseudonocardia sp SCSIO 01299，该菌于2011年7月18日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，其保藏编号为CCTCC NO：M 2011255。

二、Pseudonocardian A和B的分离和制备

1、培养基

A、种子培养基：每升含有淀粉15g，大豆粉5g，蛋白胨15g，甘油15g，CaCO₃2g，海盐30g，余量为水，pH 7.4。121℃，灭菌30min；

B、发酵培养基：配方同种子培养基。121℃，灭菌30min。

2、发酵

2.1、种子培养：将培养皿上活化的假诺卡氏菌Pseudonocardia sp SCSIO 01299的单菌落分别接入18瓶，每瓶含有50mL种子培养基的250mL的锥形培养瓶中，28℃，200r·min^-1，培养48h，制得种子液900mL。

2.2、发酵培养：将种子液以10％的接种量(体积百分比)接入到9L发酵培养基(置于250mL的锥形培养瓶，每瓶含有50ml发酵培养基，共180瓶)中，28℃，200r·min^-1，振荡培养120h，得到9L发酵培养物。

3、萃取

发酵培养物先进行离心分离(3500r·min^-1，8min)，得到9L体积的上清液(发酵液)和菌丝体。发酵液用2倍体积的丁酮萃取4次，合并萃取液，丁酮层减压蒸馏得上清液提取物-浸膏A(11.3g)；菌丝体用2L丙酮在室温下浸提3次，每次3小时，提取液减压回收丙酮后剩余水混合液用6L丁酮萃取，丁酮层减压蒸馏得菌丝体提取物-浸膏B(3.2g)。

4、化合物Pseudonocardian A和B的提取分离和鉴定

分别取少量浸膏A和浸膏B的样品溶于100μl甲醇中，离心取上清10μl，经HPLC进样检测，表明，浸膏A中含有化合物2，浸膏B中含有化合物1(图3)，将二者合并。将该合并的粗提物经硅胶柱(300-400目)层析，以氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比为100∶0到0∶100梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比50∶1梯度洗脱下来的馏分Fr1(320mg)，蒸干，过Sephadex LH-20凝胶柱(30g)，用氯仿/甲醇体积比1∶1作为流动相洗脱，而后再经过硅胶柱色谱(300-400目，40g)，用氯仿/甲醇体积比为20∶1作为流动相洗脱，再经ODS反相中压液相色谱，(YMC*GEL ODS-A球型填料，120A孔径，50um粒径，40×2.5cm I.D.)，流速为15ml/min，以体积分数从0％～55％的甲醇/水梯度洗脱160min，收集体积分数40～45％的甲醇/水梯度洗脱下来的馏分，得到化合物1(15.8mg)，收集体积分数50～55％的甲醇/水梯度洗脱下来的馏分，得到化合物2(12.5mg)。

通过结构分析，对本发明的从假诺卡氏菌SCSIO 01299的发酵培养物中制备得到的2个化合物-化合物1和2进行鉴定，其鉴定结果如下：

化合物1：白色固体，其核磁数据归属如表1所示，

+1.52°(c＝0.46，MeOH)。UV^{(CH3CN:H2O：Trifluoroacetic acid)}：234.9，300.0nm.¹H NMR(500MHz，CD₃OD)and¹³C NMR(125MHz，CD₃OD)，见表1。HR-MS：m/z 343.1305[M+H]⁺(calcd.for C₁₈H₁₉N₂O₅343.1294)，ESIMS：m/z343.2[M+H]⁺，685.4[2M+Na]⁺，3411[M-H]^-，683.3[2M-H]^-。高分辨质谱HRESIMS m/z343.1305[M+H]⁺，C₁₈H₁₉N₂O₅计算值为343.1294[M+H]⁺，不饱和度为11。与已知化合物deoxynyboquinone相比(Bair，J.S.；Palchaudhuri，R.；Hergenrother，P.J.，Chemistry and biology ofdeoxynyboquinone，a potent inducer of cancer cell death.J Am Chem Soc 2010，132，(15)，5469-78.)，化合物1的碳谱少了1个酮基碳，多了2个连氧的sp³杂化的季碳[δ_C 72.7(s，C-10)，97.6(s，C-19)]，1个亚甲基[δ_H 2.71(d，J＝13.5Hz，H-18)，3.30(d，J＝13.5Hz，H-18)，δC 52.4(t，C-18)]和1个单峰的甲基[δ_H 2.19(s，Me-20)，δ_C26.5(q，Me-20)]。根据其不饱和度为11，说明化合物1中还存在一个环状结构。通过HMBC相关谱，可看到H-18与C-10/C-11/C-14/C-19相关，H-20与C-18/C-19相关，同时，C-19(δ_C 97.6)偏低场的位移说明C-19与N-9相连。通过仔细分析HMBC相关谱，化合物1的平面结构可以确定为式(II)所示。根据用氘代二甲基亚砜(DMSO-d₆)作溶剂得到的NOESY相关谱(图4)，发现C-10位羟基质子与C-20位甲基质子相关，说明该结构上的两个羟基处于异侧。这一结论与用软件ChemBio3D Ultra11.0通过MM2最小能量计算得到的模拟构型相一致(图4)。因此，化合物1的相对构型确定如式(II)所示，其R＝H，将该化合物命名为Pseudonocardian A。

式(II)

化合物2：白色固体，其核磁数据归属如表1所示。

-1.56°(c＝0.90，MeOH)。UV^{(CH3CN:H2O：Trifluoroacetic acid)}：234.7，300.0nm。¹H NMR(500MHz，CD₃OD)and¹³C NMR(125MHz，CD₃OD)，见表1。HR-MS：m/z 357.1456[M+H]⁺(calcd.for C₁₉H₂₁N₂O₅，357.1450)；ESIMS m/z357.2[M+Na]⁺，379.3[M+Na]⁺，735.3[2M+Na]⁺，355.2[M-H]^-，711[2M-H]^-.高分辨质谱HRESIMS m/z 357.1456[M+H]⁺，C₁₉H₂₁N₂O₅计算值为357.1450[M+H]⁺。其碳氢谱与化合物1相比，C-19位的单峰甲基被1个乙基基团[δ_H 1.22(t，J＝7.5Hz，Me-21)，2.41(dd，J＝7.5，14.0Hz，H-20a)，2.84(dd，J＝7.5，14.0Hz，H-20b)，δ_C 9.3(q，Me-21)，31.6(t，C-20)]取代。HMBC相关谱中H-21与C-19/C-20相关，H-20与C-18/C-19/C-21相关证实了该结论。因此，化合物2的结构确定为如式(II)所示，其R＝CH₃，将该化合物命名为：Pseudonocardian B。

表1：化合物1-2的核磁数据归属(¹H-NMR数据于500MHz测定，括号中为偶合常数(Hz)，¹³C-NMR数据于125MHz测定，核磁数据在氘代甲醇中测得)

实施例2：Pseudonocardian A和B的抗菌活性测定

采用金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 29213，苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringensis，粪肠球菌Enterococcus faecalisATCC 29212三种细菌作为指示菌，进行MIC值测定。

菌株金黄色葡萄球菌Staphylococcus aureus ATCC 29213和苏云金芽孢杆菌Bacillusthuringensis菌株作为指示菌培养在Mueller-Hinton(MH)肉汤培养基中进行MIC测定，粪肠球菌Enterococcus faecalis ATCC 29212菌株使用脑心浸出液培养基(Brain heart infusionbroth)培养。MIC的测定参照the National Committee for Clinical Laboratory Standards方法，使用微量肉汤稀释法(broth microdilution method)测定化合物对各个指示菌的MIC(抗菌谱测定)。

抗菌药物贮存液制备：各样品(Pseudonocardian A和B)精密称取5mg以上，用经过0.22μm微孔滤膜过滤的DMSO作溶剂，配置成5.12mg/ml。配制好的抗菌药物贮存液应于4℃冰箱中保存。

MIC板制备：无菌操作，将2倍比稀释后不同浓度的化合物溶液分别加到无菌的96孔透明聚苯乙烯微孔板中，第1至第11孔加化合物，第12孔不加药作为生长对照。使第1孔化合物的终浓度为128μg/ml。

接种物制备：用生长法制备浓度相当于5×10⁸个/ml的菌悬液，经肉汤1∶1000稀释后，每孔加入到终体积为100ul，使得第1孔至第11孔化合物的终浓度分别为128、64、32、16、8、4、2、1、0.5、0.25、0.125μg/ml。密封后置37℃培养箱中，孵育16～20h观察结果。

结果判断：以用肉眼观察，在小孔内完全抑制细菌生长的最低药物浓度为MIC，结果见表2。其结果明确的显示Pseudonocardian A和B具有抗菌活力，MIC值在2～4μg/ml之间。由此可见Pseudonocardian A和B具有较好抑菌活性，有望研发成为抗菌新药。

实施例3：Pseudonocardian A和B的细胞毒活性测定

Pseudonocardian A和B针对三种肿瘤细胞株：人乳腺癌细胞株(MCF-7Cells)、人大细胞肺癌细胞株(NCI-H460)和人胶质瘤细胞株(SF-268)进行了活性测定，实验方法参考文献[Wu，Z.C.；Li，D.L.；Chen，Y. C.；Zhang，W.M.，A new isofuranonaphthalenone andbenzopyrans from the endophytic fungus Nodulisporium sp.A4 from Aquilaria sinensis.Helv.Chim.Acta 2010，93，(5)，920-924.]，以顺铂(Cisplatin)作为对照。

其结果如表2所示，结果表明Pseudonocardian A和B具有极强的细胞毒活性，IC₅₀值在0.02～021μM之间。说明PseudonocardianA和B均具有细胞毒活性，可望开发成为抗肿瘤新药。

表2：Pseudonocardian A和B的抑菌活性(MIC)和细胞毒活性(IC₅₀)结果

注：ND：未检测

Claims

1.化合物Pseudonocardian A和Pseudonocardian B，其结构如式（Ⅱ）所示：

其中当R=H时为Pseudonocardian A，当R=CH₃时为Pseudonocardian B。

2.一种权利要求1所述的Pseudonocardian A和Pseudonocardian B的制备方法，其特征在于，

a)制备假诺卡氏菌SCSIO 01299的发酵培养物，将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开，发酵液经丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏A；菌丝体先用丙酮浸提，浸提液回收丙酮后剩余的水混合液再用丁酮萃取，丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏B；

b)将浸膏A和浸膏B合并的粗提物经硅胶柱层析，用氯仿/甲醇作为洗脱剂，从体积比100：0～0：100进行梯度洗脱，收集氯仿/甲醇体积比50:1梯度洗脱下来的馏分Fr.1，再过LH-20凝胶柱，以氯仿/甲醇体积比1:1作为流动相洗脱，后经过硅胶柱层析，用氯仿/甲醇体积比为20:1作为流动相洗脱，再经ODS反相中压液相色谱YMC*GEL ODS-A球型填料，120 ?孔径，50um粒径，40×2.5cm I.D.，流速为15ml/min，以体积分数从0%～55%的甲醇/水梯度洗脱160min，收集体积分数40～45%的甲醇/水梯度洗脱下来的馏分，得到化合物Pseudonocardian A，收集体积分数50～55%的甲醇/水梯度洗脱下来的馏分，得到化合物Pseudonocardian B；

所述的a）步骤的制备假诺卡氏菌SCSIO 01299的发酵培养物通过以下方法制备：将活化的假诺卡氏菌SCSIO 01299接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养48h制得种子液，将种子液以10%的接种量接入到发酵培养基中，28℃，200rpm，振荡培养120h，而制得发酵培养物，所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有：淀粉15g，大豆粉5g，蛋白胨15g，甘油15g，CaCO₃ 2g，粗海盐30g，余量为水，pH 7.4。

3.权利要求1所述的Pseudonocardian A和Pseudonocardian B在制备抗菌药物中的应用。

4.权利要求1所述的Pseudonocardian A和Pseudonocardian B在制备抗肿瘤药物中的应用。