CN101974464A - 一种链霉菌及利用该菌发酵制备抗霉素类抗生素的工艺 - Google Patents
一种链霉菌及利用该菌发酵制备抗霉素类抗生素的工艺 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种链霉菌及利用该菌发酵制备抗霉素类抗生素的工艺。该菌为链霉菌SCSIO 1635(Streptomyces sp.SCSIO 1635),于2010年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国武汉市武汉大学,其保藏编号为CCTCC No:M2010212。从链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物中的还可制备抗霉素A1、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A或抗霉素A9。因此为抗霉类抗生素:抗霉素A1、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A和抗霉素A9的生产制备提供了一种新的方法。
Description
技术领域:
本发明属于工业微生物领域,具体涉及一种能产生抗霉素类抗生素(antimycins):抗霉素A1(antimycin A1)、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A(kitamycin A)和抗霉素A9(antimycin A9)的链霉菌SCSIO 1635(Streptomyces sp.SCSIO 1635)及利用该菌发酵制备抗霉素类抗生素的工艺。
背景技术:
抗霉素类化合物,具有广泛的生物活性,如抗细菌活性,抗真菌活性,抗蠕虫活性和线粒体呼吸抑制活性等等。
抗霉素A1(antimycin A1),其结构如式(1)所示,该化合物具有抑制血管再生的活性,应用于细胞凋亡的研究,还在鱼类的规模养殖中用于除去杂鱼。
deisovalerylblastmycin,其结构如式(2)所示,该化合物对细菌和真菌有一定抑制活性。柱晶白霉素A(kitamycinA),其结构如式(2)所示,该化合物能够抑制植物生长。
抗霉素A9(antimycin A9),其结构如式(3)所示,该化合物具有潜在的杀线虫和昆虫活性。
发明内容:
本发明的第一目的是提供一种能产生抗霉素类抗生素(抗霉素):抗霉素A1(antimycin A1)、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A(kitamycin A)和抗霉素A9(antimycin A9)的链霉菌SCSIO 1635(Streptomyces sp.SCSIO 1635),该菌于2010年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国武汉市武汉大学,其保藏编号为CCTCC NO:M2010212。
本发明的链霉菌SCSIO 1635是从我国南海北部(E 113°44.320′,N 21°14.773′)水深65米的海底沉积物中分离获得。通过常规方法PCR扩增该菌的16S rDNA,并测序,其序列如SEQ ID NO.1所示,提交到GenBank中,得到序列号HM116843。16S rDNA基因序列分析结果显示该菌株与链霉菌S.violascens ISP 5183,S.hydrogenans NBRC 13475T,S.odorifer DSM 40347T和S.albidoflavus DSM 40455T具有较高相似性,分别为99.7%,99.4%,99.2%和99.2%。如图1所示,通过邻接法清晰地揭示了该菌株与一组链霉菌属物种的系统进化关系,表明该菌属于链霉菌属的一种。将此菌命名为:链霉菌SCSIO 1635(Streptomyces sp.SCSIO 1635),该菌于2010年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国武汉市武汉大学,其保藏编号为CCTCC NO:M2010212。
本发明的另外一个目的是提供从本发明的链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物中制备式(1)、式(2)和式(3)所示的抗霉素A1(antimycin A1)、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A(kitamycin A)和抗霉素A9(antimycin A9)的工艺。
该工艺优选通过以下步骤制备抗霉素A1、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A和抗霉素A9:
a)制备链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物,将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开,发酵液经丁酮萃取,丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏A;菌丝体先用丙酮浸提,浸取液回收丙酮后剩余的水混合液用丁酮萃取,丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏B;
b)将浸膏A和浸膏B合并,经硅胶柱层析,以体积比100∶0~0∶100的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱,收集氯仿-甲醇体积比100∶1~100∶2的梯度下洗脱下来的馏分Fr.1和氯仿-甲醇体积比100∶2~100∶4的梯度下洗脱下来的馏分Fr.2,;馏分Fr1经凝胶柱层析,以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱,再经制备薄层层析,展开剂为体积比为10∶1的氯仿-甲醇,收集Rf值为0.75的馏分,得到化合物1,即为抗霉素A1;馏分Fr.2经硅胶柱层析,以体积比8∶1~1∶1的石油醚-乙酸乙酯作为流动相梯度洗脱,收集石油醚-乙酸乙酯体积比4∶1~3∶1的梯度下洗脱下来的馏分Fr.2-1,收集石油醚-乙酸乙酯体积比2∶1~1∶1的梯度下洗脱下来的馏分Fr.2-2;馏分Fr.2-1经凝胶柱层析,以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱,再经制备薄层层析,展开剂为体积比为10∶1的氯仿-甲醇,收集Rf值为0.55的馏分,得到化合物2,即为deisovalerylblastmycin;馏分Fr.2-2经凝胶柱层析,以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱,再经制备薄层层析,展开剂为体积比为10∶1的氯仿-甲醇,收集Rf值为0.6的馏分,得到化合物3,即为柱晶白霉素A,收集Rf值为0.7的馏分,得到化合物4,即为抗霉素A9。
所述的a)步骤的制备链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物优选通过以下方法制备的,将活化的链霉菌SCSIO 1635接入种子培养基中,28℃,180rpm,培养48h制得种子液,将种子液以10%的接种量接入到发酵培养基中,28℃,180rpm,振荡培养144h,而制得发酵培养物,所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有:大豆粉20g,蛋白胨2g,葡萄糖20g,可溶性淀粉5g,酵母膏2g,K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,碳酸钙2g,粗海盐30g,余量为水,pH 7.4。经本方法制备的链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物中抗霉素A1、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A和抗霉素A9的含量比较高。
所述的a)步骤中的发酵液经丁酮萃取,其优选为发酵液用丁酮萃取4次,所加溶剂的量为发酵液的2倍体积。
通过结构分析,对本发明的从链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物中制备4个化合物—化合物1、化合物2、化合物3和化合物4的鉴定结果如下:
化合物1:无色油状,ESI-MS data(m/z 571[M+Na]+and m/z 547[M-H]-),其二维核磁数据如表1所示,该化合物的核磁数据与文献(J Am Chem Soc,1999,121:4902-4903)报道的抗霉素A1基本一致,因此化合物1鉴定为抗霉素A1。
表1:化合物1的二维核磁数据(500MHz in CDCl3)(δppm,JHz)
化合物2:无色油状,ESI-MS data(m/z 459[M+Na]+and m/z 435[M-H]-),1H NMR(CD3OD,500MHz)δ:8.37(1H,s,H-1),8.28(1H,d,J=8.0Hz,H-3),7.72(1H,d,J=8.0Hz,H-5),6.95(1H,t,J=8.0Hz,H-4),5.65(1H,t,J=7.0Hz,H-9),5.34(1H,d,J=7.0Hz,H-10),4.79(1H,dt,J=6.0,9.5Hz,H-15),3.43(1H,t,J=10.0Hz,H-14),2.33(1H,dt,J=3.0,10.0Hz,H-13),1.65(2H,m,H-18),1.43(3H,d,J=6.0Hz,H-16),1.33(2H,m,H-20),1.25(2H,m,H-19),0.94(3H,t,J=7.5Hz,H-21).13C NMR(CD3OD,125MHz)δ:162.2(d,C-1),128.1(s,C-2),126.7(d,C-3),119.7(d,C-4),124.3(d,C-5),115.9(s,C-6),152.4(s,C-7),170.3(s,C-8),55.3(d,C-9),72.4(d,C-10),18.8(q,C-11),176.7(s,C-12),53.7(d,C-13),78.1(d,C-14),77.9(d,C-15),15.4(q,C-16),171.2(s,C-17),29.8(t,C-18),23.7(t,C-19),30.7(t,C-20),14.2(q,C-21).化合物2的氢谱和碳谱数据与文献[J Antibiot,1976,29(8):804-808;Chem Lett,1976,7:701-704]报道的deisovalerylblastmycin基本一致,因此化合物2鉴定为deisovalerylblastmycin。
化合物3:无色油状,ESI-MS data(m/z 487[M+Na]+and m/z 463[M-H]-).1H NMR(CDCl3,500MHz)δ:12.85(1H,s,OH-6),8.55(1H,d,J=8.0Hz,H-3),8.50(1H,s,H-1),7.94(1H,s,NH-1),7.25(1H,d,J=8.0Hz,H-5),7.09(1H,d,J=7.5Hz,OH-8),6.92(1H,t,J=8.0Hz,H-4),5.71(1H,penta,J=7.0Hz,H-10),5.25(1H,t,J=7.8Hz,H-9),4.87(1H,dd,J=6.5,9.5Hz,H-15),3.60(1H,m,H-14),2.35(1H,dt,J=2.8,10.3Hz,H-13),1.59(2H,brs,H-18),1.46(3H,d,J=6.5Hz,H-16),1.31(3H,d,J=6.8Hz,H-11),1.27-1.30(8H,m,H-19-22),0.87(3H,t,J=7.0Hz,H-23).13C NMR(CDCl3,125MHz)δ:159.0(d,C-1),127.4(s,C-2),124.8(d,C-3),119.0(d,C-4),120.2(d,C-5),112.7(s,C-6),150.7(s,C-7),169.5(s,C-8),53.8(d,C-9),70.7(d,C-10),15.0(q,C-11),174.0(s,C-12),52.2(d,C-13),77.4(d,C-14),76.7(d,C-15),18.4(q,C-16),170.1(s,C-17),28.9(t,C-18),22.5(t,C-19),27.2(t,C-20),31.6(t,C-21),29.1(t,C-22),14.0(q,C-23).
化合物3与文献[J Antibiot,1999,52(3):325-328]报道的柱晶白霉素A基本一致,因此鉴定为柱晶白霉素A.
化合物4:无色油状,ESI-MS data(m/z 577[M+Na]+ and m/z 553[M-H]-).1H NMR(CDCl3,500MHz)δ:8.55(1H,d,J=8.0Hz,H-3),8.50(1H,s,H-1),7.34(1H,d,J=6.8Hz,H-26,28),7.29(1H,d,J=6.8Hz,H-25,27,29),7.24(1H,d,J=8.0Hz,H-5),6.92(1H,t,J=8.0Hz,H-4),5.73(1H,dd,J=6.8,14.0Hz,H-10),5.29(1H,t,J=7.5Hz,H-9),5.08(1H,t,J=9.8Hz,H-14),4.98(1H,dd,J=6.5,9.8Hz,H-15),3.66(2H,s,H-23),2.49(1H,dd,J=2.8,11.0Hz,H-13),1.59(1H,m,H-18,19),1.30(1H,d,J=6.8Hz,H-11),1.16(1H,m,H-20),1.15(3H,d,J=6.5Hz,H-16),1.15(1H,m,H-19),1.06(1H,m,H-20),0.81(3H,t,J=7.0Hz,H-21).13C NMR(CDCl3,125MHz)δ:159.0(d,C-1),127.5(s,C-2),124.9(d,C-3),119.0(d,C-4),120.1(d,C-5),112.6(s,C-6),150.7(s,C-7),169.4(s,C-8),53.7(d,C-9),71.0(d,C-10),15.0(q,C-11),172.9(s,C-12),50.1(d,C-13),75.8(d,C-14),74.8(d,C-15),17.8(q,C-16),170.1(s,C-17),28.2(t,C-18),29.3(t,C-19),22.4(t,C-20),13.8(q,C-21),169.6(s,C-22),41.6(t,C-23),133.1(s,C-24),129.2(d,C-25,29),128.8(d,C-26,28),127.6(d,C-27)。化合物4的氢谱碳谱数据与文献[J Antibiot,2005,58(1):74-78;J Antibiot,2007,60(1):65-72]所述抗霉素A9基本一致,因此鉴定为抗霉素A9。
本发明提供了一种海洋来源的能产生抗霉素类抗生素的生产菌—链霉菌SCSIO 1635,并且本发明还提供了一种由本发明的链霉菌SCSIO 1635制备抗霉素类抗生素:抗霉素A1、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A和抗霉素A9的工艺,因此为抗霉类抗生素:抗霉素A1、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A和抗霉素A9的生产制备提供了一种新的方法。
本发明的链霉菌SCSIO 1635(Streptomyces sp.SCSIO 1635),于2010年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国武汉市武汉大学,其保藏编号为CCTCCNO:M2010212。
附图说明:
图1是本发明的链霉菌SCSIO 1635的系统进化树和基于16S rDNA序列的邻接法重建的与之亲缘关系最近的种。
具体实施方式:
以下是对本发明的进一步说明,而不是对本发明的限制。
实施例1:
一、链霉菌SCSIO 1635(Streptomyces sp.SCSIO 1635)的鉴定
链霉菌SCSIO 1635鉴定中涉及的基因组DNA的分离,16S rDNA的PCR扩增,序列比对和系统进化树的建立方法等均参考文献Int J Syst Evol Microbiol,2009,59(Pt 2):222-228。
a)菌株来源:链霉菌SCSIO 1635是从我国南海北部(E 113°44.320′,N 21°14.773′)水深65米的海底沉积物中分离获得。
b)菌种鉴定:参考上述文献中的方法,PCR扩增链霉菌SCSIO 1635的16S rDNA并测序而后提交到GenBank中,得到序列号HM116843。该16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示,16S rDNA基因序列分析结果显示该菌株与链霉菌S.violascens ISP 5183,S.hydrogenans NBRC 13475T,S.odorifer DSM 40347T和S.albidoflavus DSM 40455T具有较高相似性,分别为99.7%,99.4%,99.2%和99.2%。如图1所示,通过邻接法清晰地揭示了链霉菌SCSIO 1635与一组链霉菌属物种的系统进化关系,表明该菌属于链霉菌属的一种,因此将该菌株命名为:链霉菌SCSIO 1635(Streptomyces sp.SCSIO 1635),该菌于2010年8月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC),地址:中国武汉市武汉大学,其保藏编号为CCTCC NO:M2010212。
二、链霉菌SCSIO 1635的规模发酵
a)配制培养基:
种子培养基配制:大豆粉20g,蛋白胨2g,葡萄糖20g,可溶性淀粉5g,酵母膏2g,K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,碳酸钙2g,粗海盐30g,加自来水1000mL,调节pH 7.4,115℃,灭菌30min,备用。
b)发酵:
种子培养:将在平板上活化的链霉菌SCSIO 1635接入种子培养基(700mL)中,28℃,180rpm,培养48h制得种子液;
规模发酵培养:
发酵培养基的配方同种子培养基,115℃,保温30min灭菌,备用。
接种:将种子液以10%接种量接入到发酵培养基中(7L),28℃,180rpm,培养144h,而制得链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物。
三、抗霉素类抗生素:抗霉素A1、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A和抗霉素A9的分离
a)发酵液的萃取
将上述规模发酵的链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物,经纱布过滤使发酵液和菌丝体分离,发酵液用两倍体积的丁酮萃取4次,减压蒸馏得发酵液提取物,即为浸膏A;菌丝体用3倍体积丙酮浸提3次,减压蒸馏回收丙酮后剩余的水混合液用其两倍体积丁酮萃取4次,浓缩获得菌丝体提取物,即为浸膏B。浸膏A和浸膏B经海虾毒性检测,均具有海虾毒性,说明其均含有抗霉素类抗生素,因此将浸膏A和浸膏B合并得到粗浸膏12.7g。
b)抗霉素类抗生素:抗霉素A1、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A和抗霉素A9的分离
将粗浸膏上硅胶柱(100~200目),以体积比为100∶0~0∶100的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱,海虾毒性实验结果显示氯仿-甲醇体积比为100∶1~100∶2的梯度下洗脱下来的馏分Fr.1和氯仿-甲醇体积比为100∶2~100∶4的梯度下洗脱下来的馏分Fr.2,具有海虾毒性,收集上述馏分。
Fr.1(121.6mg)经Sephadex LH-20凝胶柱层析(30g),以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱,再经制备薄层层析(20×20cm),展开剂为体积比为10∶1的氯仿-甲醇,收集Rf值为0.75的馏分,得到化合物1(4.3mg),经上述结构分析鉴定为抗霉素A1。
Fr.2(247.8mg)经硅胶柱层析(300~400目),以体积比为8∶1~1∶1的石油醚-乙酸乙酯作为流动相梯度洗脱,收集石油醚-乙酸乙酯体积比为4∶1~3∶1的梯度下洗脱下来的馏分Fr.2-1(75.6mg),收集石油醚-乙酸乙酯体积比为2∶1~1∶1的梯度下洗脱下来的馏分Fr.2-2(29.3mg);Fr.2-1经Sephadex LH-20凝胶柱层析(30g),以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱,再经制备薄层层析(20×20cm),展开剂为体积比为10∶1的氯仿-甲醇,收集Rf值为0.55的馏分,得到化合物2(3.6mg),经上述结构分析鉴定为deisovalerylblastmycin。Fr.2-2经Sephadex LH-20凝胶柱层析(20g),以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱,再经制备薄层层析(20×20cm),展开剂为体积比为10∶1的氯仿-甲醇,收集Rf值为0.6的馏分,得到化合物3(2.6mg),经上述结构分析鉴定为柱晶白霉素A,收集Rf值为0.7的馏分,得到化合物4(6.6mg),经上述结构分析鉴定为抗霉素A9。
四、活性追踪
a)海虾培养:将100mg海虾卵放入400ml人工海水(400ml自来水+12g海盐)中室温通气培养48h备用。
b)待测样品溶液配制:将步骤三中所得的浸膏A和浸膏B分别配成浓度为20μg/μl的溶液,粗分得到的各馏分(Fr.1,Fr.2,Fr.3,Fr.4……)分别配成浓度为2μg/μl的溶液,溶剂均为二甲亚砜(DMSO)。
c)海虾毒性试验:将含海虾的人工海水加入到96孔培养板上,每孔200μl,含海虾10-20只,再将待测样品溶液加入,每孔5μl,2h后观察海虾致死率。
d)海虾毒性试验结果见表2:
表2菌液提取物浸膏A、菌丝体提取物浸膏B和各粗分馏分的海虾毒性试验结果
Claims (5)
1.链霉菌SCSIO 1635(Streptomyces sp.SCSIO 1635),其保藏编号为CCTCC NO:M2010212。
2.一种制备抗霉素A1、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A或抗霉素A9的工艺,其特征在于,抗霉素A1、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A或抗霉素A9是从权利要求1所述的链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物中制备得到的。
3.根据权利要求2所述的工艺,其特征在于,所述的从权利要求1所述的链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物中制备抗霉素A1、deisovalerylblastmycin、柱晶白霉素A或抗霉素A9,具体工艺步骤为:
a)制备链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物,将该发酵培养物的发酵液和菌丝体分离开,发酵液经丁酮萃取,丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏A;菌丝体先用丙酮浸提,浸取液回收丙酮后剩余的水混合液用丁酮萃取,丁酮层经蒸馏浓缩后得到浸膏B;
b)将浸膏A和浸膏B合并,经硅胶柱层析,以体积比100∶0~0∶100的氯仿-甲醇作为流动相梯度洗脱,收集氯仿-甲醇体积比100∶1~100∶2的梯度下洗脱下来的馏分Fr1和氯仿-甲醇体积比100∶2~100∶4的梯度下洗脱下来的馏分Fr.2;馏分Fr.1经凝胶柱层析,以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱,再经制备薄层层析,展开剂为体积比为10∶1的氯仿-甲醇,收集Rf值为0.75的馏分,得到化合物1,即为抗霉素A1;馏分Fr.2经硅胶柱层析,以体积比8∶1~1∶1的石油醚-乙酸乙酯作为流动相梯度洗脱,收集石油醚-乙酸乙酯体积比4∶1~3∶1的梯度下洗脱下来的馏分Fr.2-1,收集石油醚-乙酸乙酯体积比2∶1~1∶1的梯度下洗脱下来的馏分Fr.2-2;馏分Fr.2-1经凝胶柱层析,以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱,再经制备薄层层析,展开剂为体积比为10∶1的氯仿-甲醇,收集Rf值为0.55的馏分,得到化合物2,即为deisovalerylblastmycin;馏分Fr.2-2经凝胶柱层析,以体积比为1∶1的氯仿-甲醇作为流动相洗脱,再经制备薄层层析,展开剂为体积比为10∶1的氯仿-甲醇,收集Rf值为0.6的馏分,得到化合物3,即为柱晶白霉素A,收集Rf值为0.7的馏分,得到化合物4,即为抗霉素A9。
4.根据权利要求3所述的工艺,其特征在于,所述的a)步骤的制备链霉菌SCSIO 1635的发酵培养物是通过以下方法制备的,将活化的链霉菌SCSIO 1635接入种子培养基中,28℃,180rpm,培养48h制得种子液,将种子液以10%的接种量接入到发酵培养基中,28℃,180rpm,振荡培养144h,而制得发酵培养物,所述的种子培养基和发酵培养基的配方都为每升培养基中含有:大豆粉20g,蛋白胨2g,葡萄糖20g,可溶性淀粉5g,酵母膏2g,K2HPO4 0.5g,MgSO4·7H2O 0.5g,碳酸钙2g,粗海盐30g,余量为水,pH7.4。
5.根据权利要求3或4所述的工艺,其特征在于,所述的a)步骤中的发酵液经丁酮萃取,是发酵液用丁酮萃取4次,所加溶剂的量为发酵液的2倍体积。
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