CN103408503B

CN103408503B - 一种生物碱类化合物的制备方法及其在制备抑制钙离子通道药物中的应用

Info

Publication number: CN103408503B
Application number: CN201310367331.4A
Authority: CN
Inventors: 鞠建华; 丁杰; 宋永相
Original assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Current assignee: South China Sea Institute of Oceanology of CAS
Priority date: 2013-08-21
Filing date: 2013-08-21
Publication date: 2015-03-11
Anticipated expiration: 2033-08-21
Also published as: CN103408503A

Abstract

本发明公开了一种生物碱类化合物的制备方法及其在制备抑制钙离子通道药物中的应用。本发明提供了从海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49制备如（1）所示的生物碱类化合物Methyl saphenate的方法，为Methyl saphenate的制备提供了备选途径。本发明还发现了如（1）所示的生物碱类化合物Methyl saphenate能够用于制备抑制钙离子通道药物，能用于治疗钙通道依赖性心律失常、心绞痛、高血压等疾病中。

Description

一种生物碱类化合物的制备方法及其在制备抑制钙离子通道药物中的应用

技术领域：

本发明涉及从一种从海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49的发酵产物中分离一种具有钙离子通道活性的生物碱类化合物Methyl saphenate的制备方法及其在制备抑制钙离子通道药物中的应用，特别是在制备抑制L-型电压门控性钙离子通道药物，用于治疗钙离子通道依赖性心律失常、心绞痛、高血压等疾病中。

背景技术：

钙通道是药物疗法的重要靶点，抑制钙离子通道药物是强力的血管舒张药并牵涉许多病理学病况，包括原发性高血压、充血性心力衰竭、绞痛、心律不齐、偏头痛和疼痛。钙通道是细胞膜上的孔状蛋白，能允许钙离子（Ca²⁺）和钡离子（Ba²⁺）顺电化学梯度方向进入细胞内。根据激活方式不同，将钙通道分为电压依赖式钙通道（voltage-dependent Ca²⁺channels，VDCC）和受体操纵式钙通道（receptor-operated Ca²⁺channels，ROCC），其中VDCC是Ca²⁺内流的主要途径。而根据电生理和药理学特性不同，又将VDCC分为L、T、N、P/Q和R等亚型，不同亚型的通道在电压和时间依赖性、电导和药理等方面的特性各不相同，其中L-型钙通道，是细胞兴奋时外钙内流的主要途径。Ca²⁺作为重要的细胞内第二信使，通过L-型钙通道调节许多细胞反应与活动，并参与肌肉收缩、心血管系统功能调节等。

本发明的生物碱类化合物Methyl saphenate，其化学结构如式（1）所示，公开于文献：A.Geiger,W.Keller-Schierlein,M.Brandl and H.Zahner,Metabolites of microorganisms.247.Phenazines from Streptomyces antibioticus,strain Tu2706.J Antibiot(Tokyo)1988,41,1542-1551.

发明内容：

本发明的第一个目的是提供一种如式（1）所示的生物碱类化合物Methyl saphenate的制备方法。

本发明的如式（1）所示的生物碱类化合物Methyl saphenate的制备方法，其特征在于，如式（1）所示的生物碱类化合物Methyl saphenate是从海洋放线菌Streptomyces nigrescensSCSIO ZJ49的发酵培养物中制备的。

优选，其具体步骤为：

a、将海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49的发酵产物的上清发酵液和菌丝体分离开，上清发酵液用丁酮萃取，丁酮萃取液浓缩得发酵液浸膏；菌丝体用丙酮萃取，丙酮萃取液浓缩得菌体浸膏，合并发酵液浸膏和菌体浸膏得浸膏；

b、浸膏经正相硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为洗脱剂，从体积比100/0，98/2梯度洗脱，顺序得馏分A1-A2，合并馏分A1，A2，经正向硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，从体积比100/0，80/20，70/30梯度洗脱，顺序得馏分B1-B3，合并B2和B3，经反相中压层析纯化后得到化合物Methyl saphenate。

所述的反相中压层析，其层析条件为：流速10mL/min，检测波长236nm，A相-水，B相-甲醇，0～50min，A/B：80/20～15/85进行线性梯度洗脱；50-60min以100%B相进行等梯度洗脱，收集在52min出峰的组分，旋蒸干燥，重复上述反相中压层析，经二次纯化后，得到纯品化合物Methyl saphenate。

所述的海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49的发酵产物优选通过以下方法制备的：

将海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养36h得种子培养液；将种子培养液接入放大发酵培养基中，28℃，200rpm，培养7天，获得海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49的发酵产物；所述放大发酵培养基和种子培养基都为AM2ab发酵培养基，其以质量分数100%计，包括：可溶性淀粉0.5%，大豆粉0.5%，酵母提取粉0.2%，蛋白胨0.2%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，NaCl 0.4%，粗海盐0.3%，CaCO₃ 0.2%，pH7.2-7.4，余量为水。

本发明通过试验发现，如式（1）所示的生物碱类化合物Methyl saphenate对L-型钙离子通道电流特异性抑制，在+20mV测试电压下，Methyl saphenate抑制I_Cav1.2的半数有效剂量为4.5μmol/L。

因此，本发明的第二个目的是提供如式（1）所示的生物碱类化合物Methyl saphenate在制备抑制钙离子通道药物中的应用。特别是在制备抑制L-型电压门控性钙离子通道药物中的应用。

所述的抑制钙离子通道药物为治疗钙通道依赖性心律失常、心绞痛、高血压等疾病的药物。

本发明的第三个目的是提供海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49在制备生物碱类化合物Methyl saphenate中的应用。

本发明提供了从海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49制备如（1）所示的生物碱类化合物Methyl saphenate的方法，为Methyl saphenate的制备提供了备选途径。本发明还发现了如（1）所示的生物碱类化合物Methyl saphenate能够用于制备抑制钙离子通道药物，能用于治疗钙通道依赖性心律失常、心绞痛、高血压等疾病中。

本发明的海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49于2013年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），地址：北京市朝阳区北辰西路1号院，中国科学院微生物研究所，其保藏编号为：CGMCC NO.7864。

附图说明：

图1是化合物1的¹H NMR（500MHz）图谱，溶剂为：CDCl₃；

图2是化合物1的¹³C NMR（125MHz）图谱，溶剂为：CDCl₃；

图3是采用全细胞膜片钳记录HEK293T细胞外源性表达L-型钙离子通道电流（I_CaV1.2），A为转染前，没有I_CaV1.2电流表达，B为转染后，记录到的I_CaV1.2电流；

图4是Methyl saphenate对HEK293T细胞表达的L-型钙通道电流的作用，A：Methyl saphenate在1、3及10μmol/L浓度下对HEK293T细胞表达的L-型钙通道作用的原始电流记录图。标注的纵轴表示1000pA，横轴表示100ms。B：Methyl saphenate在1、3及10μmol/L浓度下对HEK293T细胞表达的L-型钙通道作用的I-V曲线图。显著性差异用*,p<0.05,**,p<0.01和***,p<0.001表示，n=3；图中的49B代表化合物Methyl saphenate。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：

1.种子培养

（1）种子培养基配方：以质量分数100%计，包括可溶性淀粉0.5%，大豆粉0.5%，酵母提取粉0.2%，蛋白胨0.2%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，NaCl 0.4%，粗海盐0.3%，CaCO₃ 0.2%，pH7.2-7.4，余量为水。按照配方将称量好的上述物质溶解、混匀，以每瓶50mL分装于250mL的锥形瓶中，于121℃灭菌20分钟，做为种子培养基。

（2）种子的培养：将菌株Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49的菌丝体或孢子接入到上述种子培养基中，以200rpm的转速、在28℃下、摇床培养36小时得种子培养液。

2．发酵培养

（1）放大发酵培养基配方：以总质量分数100%计，包括可溶性淀粉0.5%，大豆粉0.5%，酵母提取粉0.2%，蛋白胨0.2%，K₂HPO₄ 0.05%，MgSO₄·7H₂O 0.05%，NaCl 0.4%，粗海盐0.3%，CaCO₃ 0.2%，pH7.2-7.4，余量为水。按照配方将称量好的上述物质溶解、混匀，配制总体积约8L，然后以每瓶200mL分装于1000mL的锥形瓶中，于121℃灭菌20分钟，作为放大发酵培养基。

（2）发酵培养

在无菌条件下，将培养好的种子培养液分别接种于放大发酵培养基中，每1000ml锥形瓶（含约200mL放大发酵培养基）接种一瓶种子培养液（约50mL），以200rpm的转速、在28℃下、摇床培养约7天得海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49的发酵产物。

3.产物分析

从第五天开始，对发酵代谢产物进行取样分析。每次取发酵物50mL，加入丁酮80mL，混匀超声50min，静置分层后取上层萃取液约50mL，旋蒸干燥后用1mL甲醇溶解于1.5mL离心管，12000rpm离心2min，取15μL进行HPLC与标准品对照分析，浓度曲线达到顶点时结束发酵。

4.Methyl saphenate的分离纯化

将海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49的发酵产物，以3600rpm离心10min，得上清发酵液和菌丝体，上清发酵液用丁酮等体积萃取3次，丁酮萃取液40℃减压浓缩得发酵液浸膏；菌丝体用共计1.5L丙酮萃取三次，丙酮萃取液在40℃下减压浓缩得菌体浸膏；经HPLC-DAD检测后，合并发酵液浸膏和菌体浸膏共计得约15.3g浸膏。浸膏经正相硅胶柱层析（硅胶颗粒度100～200目），以氯仿（C）/甲醇（M）为洗脱剂，从体积比C/M100/0，98/2，96/4，94/6，92/8，9/1，8/2，5/5梯度洗脱，顺序得馏分A1-A8，合并馏分A1，A2，再经正向硅胶柱层析（硅胶颗粒度100～200目），以石油醚（P）/乙酸乙酯（E）为洗脱剂，从体积比P/E100/0,80/20,70/30,60/40,50/50,40/60,20/80,0/100梯度洗脱，顺序得馏分B1-B8。合并馏分B2和B3，进行反相中压柱层析（110*280mm,YMC GEL ODS-A），层析条件为：流速10mL/min，检测波长236nm，A相-水，B相-甲醇，在0～50min，A/B：80/20～15/85（体积比）进行线性梯度洗脱；50-60min以100%B相进行等梯度洗脱，收集在52min左右出峰的组分，旋蒸干燥，重复上述反相中压柱层析，经二次纯化后，得到化合物1（纯品Methyl saphenate）。

5.Methyl saphenate的结构鉴定及理化数据。

化合物1为黄色方形晶体，熔点（m.p.）169-170℃;[α]²⁵ _D-24.2(c0.57,MeOH);UV(MeOH)λ_max(logε):212(3.80),251(3.86),365(3.33)nm;CD(0.169mM,MeOH),λ_max(Δε):226(-1.60),257(-1.33)nm;¹H NMR和¹³C NMR图1和图2所示.ESI-MS m/z[M+H]⁺:283.07,[M+Na]⁺305.05,[2M+Na]⁺587.19;HR-ESI-MS[M+H]⁺m/z283.1091,(calcd for C₁₆H₁₅N₂O₈,283.1083)，与文献所报道的Methyl saphenate结构一致（A.Geiger,W.Keller-Schierlein,M.Brandl and H.Zahner,Metabolites of microorganisms.247.Phenazines from Streptomyces antibioticus,strain Tu2706.J Antibiot(Tokyo)1988,41,1542-1551.），确定为Methyl saphenate，其结构式如式（1）所示。

实施例2：

1.外源性L-型钙离子通道模型的构建：

从标准菌库（ATCC，Manassas，USA）中获得HEK293T细胞株，用Quantum286Medium（购自Sigma公司）培养基+青霉素/链霉素，培养HEK293T细胞，生长在培养瓶里的HEK293T细胞要用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，培养基洗去胰蛋白酶，在培养瓶中重新添加含有血清的培养基Quantum286Medium覆盖底层的细胞，37℃、5.5％CO₂饱和湿度下培养至少12小时。

继而，利用脂质体转染技术，使用Lipofectamine^TM2000（Invitrogen）转染试剂盒，将携带钙离子通道目的基因片段的DNA（α_1C、β_2a及α₂δ）（0.15μg/孔）转染到HEK293T细胞内部，使其在HEK293T细胞上稳定表达L-型钙离子通道，在HEK293T细胞上构建钙离子通道。将转染后的HEK293T细胞接种于细胞培养板中（24孔板），37℃、5.5%CO₂培养箱孵育，8～12小时后在倒置显微镜下观察细胞状态，然后用基础培养基Quantum286Medium换液，继续培养24～48小时。采用电生理膜片钳记录HEK293T细胞上表达的L-型钙离子电流，如图3所示。

我们采用全细胞膜片钳技术（whole-cell recording）对以上所述化合物Methyl saphenate进行L-型钙离子通道活性检测，发现化合物Methyl saphenate能电压及浓度依赖性的抑制HEK293T细胞外源性表达的L-型钙离子电流，结果如图4所示。

当施予-40～+60mV，阶跃为10mV，300ms时程的方波脉冲刺激，并以各脉冲下峰电流密度（pA/pF）对相应电位作图得到电流电压曲线图（I-V曲线）。由I-V曲线可知，内向钙电流于-20mV时开始被激活，+20mV达到峰值，其翻转电位为+60mV，且在-20mV～+60mV呈电压依赖性。化合物Methyl saphenate在1、3和10μmol/L时，能浓度依赖性的抑制I_CaV1.2，与对照组（未加入化合物Methyl saphenate）相比具有显著性差异（图4）。在+20mV测试电压下，Methyl saphenate抑制I_Cav1.2的半数有效剂量为4.5μmol/L。

Claims

1.一种如式(1)所示的生物碱类化合物Methyl saphenate的制备方法，其特征在于，如式(1)所示的生物碱类化合物Methyl saphenate是从海洋放线菌Streptomyces nigrescensSCSIO ZJ49的发酵培养物中制备的；

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，具体步骤为：

b、浸膏经正相硅胶柱层析，以氯仿/甲醇为洗脱剂，从体积比100/0，98/2梯度洗脱，顺序得馏分A1-A2，合并馏分A1，A2，经正相硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯为洗脱剂，从体积比100/0，80/20，70/30梯度洗脱，顺序得馏分B1-B3，合并B2和B3，经反相中压层析纯化后得到化合物Methyl saphenate。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的反相中压层析，其层析条件为：流速10mL/min，检测波长236nm，A相-水，B相-甲醇，0～50min，A/B：80/20～15/85进行线性梯度洗脱；50-60min以100％B相进行等梯度洗脱，收集在52min出峰的组分，旋蒸干燥，重复上述反相中压层析，经二次纯化后，得到纯品化合物Methyl saphenate。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述的海洋放线菌Streptomyces nigrescensSCSIO ZJ49的发酵产物是通过以下方法制备的：

将海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49接入种子培养基中，28℃，200rpm，培养36h得种子培养液；将种子培养液接入放大发酵培养基中，28℃，200rpm，培养7天，获得海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49的发酵产物；所述放大发酵培养基和种子培养基，其以质量分数100％计，包括：可溶性淀粉0.5％，大豆粉0.5％，酵母提取粉0.2％，蛋白胨0.2％，K₂HPO₄0.05％，MgSO₄·7H₂O0.05％，NaCl0.4％，粗海盐0.3％，CaCO₃0.2％，pH7.2-7.4，余量为水。

5.如式(1)所示的生物碱类化合物Methyl saphenate在制备抑制钙离子通道药物中的应用；

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抑制钙离子通道药物是抑制L-型电压门控性钙离子通道药物。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的抑制钙离子通道药物为治疗钙通道依赖性心律失常、心绞痛或高血压的药物。

8.海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49在制备生物碱类化合物Methyl saphenate中的应用。

9.海洋放线菌Streptomyces nigrescens SCSIO ZJ49，其保藏编号为：CGMCC NO.7864。