CN105331668B - 一种生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法，本方法采用锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp.EA‑9或其分泌粗酶液对三七总皂苷进行生物转化，制得人参皂苷Rd和C‑K；本发明方法操作简单、转化特异性强、反应条件温和，微生物次级代谢产物少，提取发酵产物简单；转化率高，可用于人参皂苷Rd的大量制备，实现人参皂苷Rd的产业化。
Description
技术领域
本发明涉及一种生物转化三七总皂苷获得人参皂苷Rd的方法，该方法采用一种微生物分泌的酶类物质作为媒介来修饰总皂苷骨架结构中的糖苷键支链的方式，获得人参皂苷Rd。
背景技术
人参皂苷Rd是二醇型人参皂苷，具有广泛的生物活性，对心脑血管、抗肿瘤、神经和免疫系统等方面作用独特，如作为一种新型钙离子拮抗剂，可特异性阻断受体依赖的钙离子通道，阻断钙离子内流致使神经细胞死亡。因其结构复杂，化学合成尚不可行，需从三七、人参、绞股蓝等植物中提取获得，但因植物中含量较低，且植物资源有限，为此，利用有限的人参二醇型人参皂苷获得大量人参皂苷Rd方法更为可行简便。目前，常用的生物转化三七总皂苷获得人参皂苷Rd的方法多采用微生物发酵或提取微生物粗酶法对皂苷骨架支链结构进行糖水解，获得皂苷结构的改变。微生物发酵法的菌株来源相对复杂，且筛选具有活性或高活性的菌株相对难度大、筛选成功率低、通常选择几百株菌才可筛选出几株有皂苷转化活性的菌株，一般转化率不是很高且转化过程及转化产物种类（包括发酵微生物的自身次级代谢产物）相对复杂； 提取微生物粗酶法，转化特异性高，条件温和，无需微生物发酵所需的培养基，产物目标性明确且不会产生微生物自身的次级代谢产物，但是由于酶的蛋白质属性，且从微生物中提取分离纯化有皂苷转化活性的酶难度大，且纯化后的酶需要溶解在缓冲液中保持酶活力，同时酶回收较困难等一系列问题。所以获得一种高皂苷转化活性，特异性强，次生产物少的菌株发酵方法对于获得工业化生产皂苷Rd十分重要。
发明内容
为了提高皂苷Rd的含量，解决微生物发酵法转化三七总皂苷获得人参皂苷Rd的转化率低的不足，本发明提出了一种微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法，该方法操作简单，转化特异性强，微生物次级代谢产物少，提取发酵产物简单；该方法为工业化生产人参皂苷Rd提供了一种简便方法，可将三七总皂苷中的人参皂苷Rd含量进一步提高。
本发明方法的具体操作如下：
（1）采用常规PDB培养基或马丁氏培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9；锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9已于2015年9月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC NO. 11392；
取4℃斜面保藏的锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9菌进行活化培养，培养基采用PDB培养基或马丁氏培养基，将微生物从保藏试管斜面挑取接入250ml锥形瓶中，每瓶含100 ml已灭菌培养基，接菌过程在无菌环境进行；灭菌条件：121℃，20～30 min。置于22～29℃，摇床培养3～5 d，转速设置在110～180r·min-1；
培养基配制：
PDB培养基：取新鲜市售马铃薯200g，切成3～5 mm见方小块，加水1000 ml加热微沸30～50 min，用4层纱布过滤，补足水至1 L，然后添加葡萄糖20 g，混匀分装灭菌备用；
马丁氏培养基：KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨 5.0g，葡萄糖 10g，加水定容1 L。
（2）将步骤（1）活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比0.02%～10%，摇床培养2～5 d；
（3）按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：4～1：10的比例，用体积百分比浓度为70%～75%的乙醇溶液溶解三七总皂苷，可适当采用超声法加快三七总皂苷粉末的溶解，为降低因底物三七总皂苷添加时引入的乙醇对培养基中菌株的破坏，可控制皂苷与乙醇溶液质量比，浸泡三七总皂苷10～30min后，在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤（2）培养结束后的菌液中，底物三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.02%～1%，高浓度底物会对菌株生长产生抑制作用，不利于微生物的生长，会降低发酵过程中酶的浓度，使转化率降低，然后放置摇床继续培养6～12 d；
（4）发酵结束后，采用超声法破碎菌丝团，超声10～30 min，然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体，然后可适当浓缩发酵后抽滤液，发酵液用水饱和正丁醇等体积萃取3～4次，合并上层正丁醇相，采用减压蒸发浓缩，即得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷。
本发明转化过程亦可采用该菌的粗酶进行催化转化，将步骤（2）接种后扩大培养5～8 d，待菌丝体布满培养基时，采用离心法（5000～12000r·min-1）分离菌丝体与培养基，取上清液用醇沉法分离出粗酶，然后10000～12000r·min-1离心分离获得粗酶沉淀，最后按步骤（3）添加三七总皂苷，然后轻轻震摇转化1～3d，即可转化获得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷。
本发明所述制备方法以三七总皂为反应物，利用Coniochaeta sp. EA-9菌对三七总皂苷进行生物转化，所述三七总皂苷为五加科人参属植物三七主根粉碎经提取纯化获得，提取用体积百分比70%的乙醇或纯甲醇回流提取，滤过后浓缩过D101大孔吸附树脂，水洗脱至无色，再用70%乙醇洗脱干燥获得三七总皂苷。
本发明所述Coniochaeta sp. EA-9是从植物紫茎泽兰中分离获得的锥毛壳属植物内生真菌；经活化后加入到PDB培养基中与三七总皂苷发酵进行生物转化。
本发明的有益效果是，与一般的微生物发酵法相比，转化效率高，转化特异性高，经HPLC分析得出，该菌株可高效特异性地转化三七总皂苷中的人参皂苷Rb1，使其水解脱去C-20位的1→6糖苷键转化为人参皂苷Rd。发酵结束后经HPLC检测发现三七总皂苷中无明显的人参皂苷Rb1峰，故推测三七总皂苷中人参皂苷Rb1全部转化为人参皂苷Rd，后经含量标定，发现该菌亦可继续将二醇型皂苷Rb1的C-3位的两个基水解脱去，获得人参皂苷C-K，以人参皂苷Rb1为基准，经计算最终得出有88.38%的人参皂苷Rb1转化获得人参皂苷Rd，另有约11.62%的Rb1经转化获得人参皂苷C-K；最终使人参皂苷Rd在三七总皂苷中的含量提高了22.52%，生成1.95%人参皂苷C-K。另采用粗酶方法，亦可完成该转化目标，转化率暂未测定，仅进行了HPLC定性分析。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明保护范围不局限于所述内容，实施例中方法如无特殊说明，均为常规方法，使用的试剂如无特殊说明均为常规市售试剂或按常规方法配置的试剂。
实施例1：本微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法按如下步骤进行：
（1）采用常规PDB培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9
取4℃斜面保藏的锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9菌进行活化培养，培养基采用PDB培养基，将微生物从保藏试管斜面挑取接入250ml锥形瓶中，每瓶含100 ml已灭菌培养基，接菌过程在无菌环境进行；灭菌条件：121℃， 30 min。置于25℃，摇床培养5d，转速设置在150r·min-1；
培养基配制：
PDB培养基：取新鲜市售马铃薯200g，切成3～5 mm见方小块，加水1000 ml加热微沸30～50 min，用4层纱布过滤，补足水至1 L，然后添加葡萄糖20 g，混匀分装灭菌备用；
（2）将步骤（1）活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比0.02%，摇床培养5 d；
（3）按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：4的比例，用体积百分比浓度为75%的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡三七总皂苷20min后，在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤（2）培养结束后的菌液中，底物三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.05%，然后放置摇床继续培养12 d；
（4）发酵结束后，采用超声法破碎菌丝团，超声10min，然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体，浓缩发酵后抽滤液，发酵液用水饱和正丁醇等体积萃取3次，合并上层正丁醇相，采用减压蒸发浓缩，即得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷，最终人参皂苷Rd含量为30.35%，人参皂苷C-K含量为1.95%。
实施例2：本微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法按如下步骤进行：
（1）采用常规马丁氏培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9
取4℃斜面保藏的锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9菌进行活化培养，培养基采用马丁氏培养基，将微生物从保藏试管斜面挑取接入250ml锥形瓶中，每瓶含100 ml已灭菌培养基，接菌过程在无菌环境进行；灭菌条件：121℃，25 min。置于22℃，摇床培养4d，转速设置在110r·min-1；
培养基配制：
马丁氏培养基：KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨 5.0g，葡萄糖 10g，加水定容1 L。
（2）将步骤（1）活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比2%，摇床培养3d；
（3）按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：6的比例，用体积百分比浓度为70%的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡三七总皂苷10min后，在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤（2）培养结束后的菌液中，底物三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.5%，然后放置摇床继续培养8d；
（4）发酵结束后，采用超声法破碎菌丝团，超声20min，然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体，浓缩发酵后抽滤液，发酵液用水饱和正丁醇等体积萃取4次，合并上层正丁醇相，采用减压蒸发浓缩，即得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷，人参皂苷Rd含量为29.80%，人参皂苷C-K含量为1.89%。
实施例3：本微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法按如下步骤进行：
（1）采用常规马丁氏培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9
取4℃斜面保藏的锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9菌进行活化培养，培养基采用马丁氏培养基，将微生物从保藏试管斜面挑取接入250ml锥形瓶中，每瓶含100 ml已灭菌培养基，接菌过程在无菌环境进行；灭菌条件：121℃，20min。置于28℃，摇床培养3d，转速设置在180r·min-1；
培养基配制：
马丁氏培养基：KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨 5.0g，葡萄糖 10g，加水定容1 L。
（2）将步骤（1）活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比9%，摇床培养2d；
（3）按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：10的比例，用体积百分比浓度为73%的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡三七总皂苷30min后，在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤（2）培养结束后的菌液中，底物三七总皂苷的添加量为菌液质量的1%，然后放置摇床继续培养8d；
（4）发酵结束后，采用超声法破碎菌丝团，超声30min，然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体，浓缩发酵后抽滤液，发酵液用水饱和正丁醇等体积萃取4次，合并上层正丁醇相，采用减压蒸发浓缩，即得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷，人参皂苷Rd含量为31%，人参皂苷C-K含量为2.08%。
实施例4：本微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法按如下步骤进行：
（1）采用常规PDB培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9
取4℃斜面保藏的锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9菌进行活化培养，培养基采用PDB培养基，将微生物从保藏试管斜面挑取接入250ml锥形瓶中，每瓶含100 ml已灭菌培养基，接菌过程在无菌环境进行；灭菌条件：121℃，30 min；置于25℃，摇床培养5d，转速设置在150r·min-1；
培养基配制：
PDB培养基：取新鲜市售马铃薯200g，切成3～5 mm见方小块，加水1000 ml加热微沸30～50 min，用4层纱布过滤，补足水至1 L，然后添加葡萄糖20 g，混匀分装灭菌备用；
（2）将步骤（1）活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比0.02%，摇床培养8d；待菌丝体布满培养基时，12000r·min-1离心，取上清液用醇沉法分离出粗酶，然后10000r·min-1离心分离获得粗酶沉淀，按1g粗酶添加磷酸缓冲液1L的比例，用pH 6磷酸缓冲液涡旋震荡溶解粗酶沉淀，制得粗酶液；
（3）按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：4的比例，用体积百分比浓度为75%的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡三七总皂苷20min后，在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤（2）粗酶液中，底物三七总皂苷的添加量为酶液质量的0.05%，然后轻轻震摇转化1d；即可转化获得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷；人参皂苷Rd含量为28.30%，人参皂苷C-K含量为1.65%。
实施例5：本微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法按如下步骤进行：
（1）采用常规马丁氏培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9
取4℃斜面保藏的锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9菌进行活化培养，培养基采用马丁氏培养基，将微生物从保藏试管斜面挑取接入250ml锥形瓶中，每瓶含100 ml已灭菌培养基，接菌过程在无菌环境进行；灭菌条件：121℃，30 min；置于25℃，摇床培养5d，转速设置在150r·min-1；
培养基配制：
马丁氏培养基：KH2PO4 1.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨 5.0g，葡萄糖 10g，加水定容1 L。
（2）将步骤（1）活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比5%，摇床培养6d；待菌丝体布满培养基时，6000r·min-1离心，取上清液用醇沉法分离出粗酶，然后12000r·min-1离心分离获得粗酶沉淀，按1g粗酶添加磷酸缓冲液0.8L的比例，用pH 7磷酸缓冲液涡旋震荡溶解粗酶沉淀，制得粗酶液；
（3）按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：8的比例，用体积百分比浓度为70%的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡三七总皂苷30min后，在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤（2）粗酶液中，底物三七总皂苷的添加量为酶液质量的0.5%，然后轻轻震摇转化2d；即可转化获得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷；人参皂苷Rd含量为31.84%，人参皂苷C-K含量为2.14%。
Claims (2)
1.一种微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于按如下步骤进行：
（1）采用常规PDB培养基或马丁氏培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9；
（2）将步骤（1）活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比0.02%～10%，摇床培养2～5 d；
（3）按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：4～1：10的比例，用体积百分比浓度为70%～75%的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡10～30min后，在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤（2）培养结束后的菌液中，继续摇床培养6～12 d，其中三七总皂苷的添加量为菌液质量的0.02%～1%；
（4）发酵培养结束后，采用超声法破碎菌丝团，超声时间10～30 min，然后减压抽滤分离发酵液与菌丝体，发酵液用水饱和正丁醇等体积萃取3～4次，合并上层正丁醇相，减压蒸发浓缩，即得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷；
所述锥毛壳属植物内生菌Coniochaeta sp. EA-9在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO. 11392。
2.一种微生物转化三七总皂苷制备人参皂苷Rd的方法，其特征在于按如下步骤进行：
（1）采用常规PDB培养基或马丁氏培养基活化培养锥毛壳属植物内生菌Coniochaetasp. EA-9；
（2）将步骤（1）活化后菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为质量百分比0.02%～10%，接种后扩大培养5～8 d，5000～12000r·min-1离心，取上清液用醇沉法分离出粗酶，然后10000～12000r·min-1离心分离获得粗酶沉淀，按1g粗酶添加磷酸缓冲液0.1～2L的比例，用pH 6.00～7.00磷酸缓冲液涡旋震荡溶解粗酶沉淀，制得粗酶液；
（3）按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1：4～1：10的比例，用体积百分比浓度为70%～75%的乙醇溶液溶解三七总皂苷，浸泡10～30min后，在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤（2）粗酶液中，然后轻轻震摇转化1～3d，即转化获得富含人参皂苷Rd的转化后三七总皂苷，其中三七总皂苷的添加量为粗酶液质量的0.05%、0.5%；
所述锥毛壳属植物内生菌Coniochaeta sp. EA-9在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO. 11392。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |