CN116731880B - 一种内生真菌多量毛霉及其应用 - Google Patents

一种内生真菌多量毛霉及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种内生真菌多量毛霉及其应用，属于生物转化技术领域，多量毛霉分离自新鲜天麻，具有高效将总皂苷转化为小极性人参皂苷皂苷成分的作用，多量毛霉菌发酵工艺简单，室温、无菌培养即可，具有广阔的工业化前景，转化得到的小极性人参皂苷含有的糖基少，膜通透性好，药理活性也相对较高；本发明首次发现多量毛霉菌具有从三七中生产小极性人参皂苷的能力，具有高效、简便、环保等优点，这一发现将有助于提高三七的药用功能和经济价值。

Description

一种内生真菌多量毛霉及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术应用领域，具体涉及一种天麻内生菌多量毛霉(Mucorabundans)及其应用于高效转化三七总皂苷(人参皂苷Rb1、Rd、Re、Rg1、Rb2、Rc、Rb3、三七皂苷R1)为小极性人参皂苷。
背景技术
三七(Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen)为五加科人参属植物。主要产于云南、广西、四川等地。三七主要的活性成分是皂苷类成分，皂苷是由苷元和各种糖基组成的糖苷类化合物，三七中的皂苷类成分大多数为达玛烷型皂苷。三七根中总皂苷含量高达8～12％，以人参三醇型皂苷为主，其中人参皂苷Rg1、Rb1、Rd、Re和三七皂苷R1含量最高，约占三七根中总皂苷含量的80％。三七花的总皂苷是三七植株中皂苷含量最高的部位，以人参二醇型皂苷为主，其中三七花中主要人参皂苷包括人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rb3、Rd。三七主根及花中天然皂苷都因其母核侧链上连接有不同种类和数量的糖基，而表现出较大的极性。研究表明，较大极性皂苷(天然皂苷)在肠内吸收较差，而小极性人参皂苷(稀有人参皂苷)很容易从胃肠道吸收到血液中，作为活性化合物发挥作用。因此通过体外转化促进天然人参皂苷转化为小极性人参皂苷的方法备受人们关注。
大量研究表明，稀有人参皂苷具有更高的药理活性。例如，研究证实人参皂苷Rk1通过协调端粒酶活性的抑制和细胞凋亡的诱导之间的机制，从而对肝癌HepG2细胞具有抗癌作用。Rg6是一种次要人参皂苷，通过诱导白介素-10和microRNA-146a抑制全身炎症。人参皂苷Rd2通过调节P2Y12下游的信号通路，有效地减弱血小板功能从而可以预防血栓性疾病；三七皂苷Fe可以治疗心脑血管疾病和抑制食源性肥胖。人参皂苷Rk3通过调节PI3K/Akt/mTOR通路介导细胞凋亡和自噬，在体内发挥抗食管癌活性。人参皂苷Rh4可以通过抑制JAK2/STAT3信号抑制肺腺癌转移，也可以抑制癌症细胞增殖。人参皂苷Rg3对肺癌细胞A549、黑色素瘤细胞、直肠癌细胞SW480、胆囊癌细胞等具有抑制作用。人参皂苷Rh1具有重要的抗炎、抗氧化作用等。
目前获得少量人参皂苷的方法主要有物理转化法、化学转化法、生物转化法和人参皂苷克隆酶转化。然而微生物转化法特异性强、条件温和、产物稳定、易分离、环境污染小、转化效率高等多重优势，是目前制备稀有人参皂苷的优选方法之一。
发明内容
本发明提供一种内生真菌多量毛霉(Mucor abundans)及其应用，将内生真菌多量毛霉应用于促进三七总皂苷(人参皂苷Rb1、Rd、Re、Rg1、Rb2、Rc、Rb3、三七皂苷R1)高效转化为小极性人参皂苷，具有转化工艺简单，作用底物多样，转化产物丰富，制备成本低，无环境污染等优势。
本发明多量毛霉(Mucor abundans)属于真菌界(Fungi)，毛霉门(Mucoromycota)，藻状菌纲(Mucoromycetes)，毛霉目(Mucorales)，毛霉科(Mucoraceae)，毛霉属(Mucor)，分离自新鲜天麻。
本发明多量毛霉(Mucor abundans)T63，基因序列已提交至NCBI数据库，并通过其中的Bankit工具申请到GenBank登录号为OQ781160，利用软件MEGA6构建系统发育树，并结合菌落形态观察及菌丝显微形态观察确定T63为多量毛霉(Mucor abundans)。
本发明多量毛霉(Mucor abundans)已在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.40620，保藏日期为2023年5月9日。
本发明内生真菌多量毛霉高效转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的方法，具体步骤为：
(1)PDB液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖20g/L，自然pH，在101kPa、121℃灭菌30min备用；
(2)采用步骤(1)制备的PDB培养基活化培养2～7d内生菌多量毛霉菌；
(3)吸取步骤(2)活化好的多量毛霉菌悬液，接种到新的PDB液体培养基中，接种的菌悬液体积是培养液体积的0.1～10.0％，室温，摇床无菌培养7～14d；
(4)底物添加：按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:2～1:10的比例，乙醇溶液的体积百分比浓度为70～80％，将三七总皂苷与乙醇溶液混合得到三七总皂苷溶液，在无菌条件下将三七总皂苷溶液添加至步骤(3)培养结束后的菌液中，继续摇床培养7～21d，其中三七总皂苷溶液的添加量为菌液质量的0.02～2.00％；
(5)发酵结束后，采用纱布过滤掉菌体，发酵液用水饱和正丁醇萃取2～3次，合并上清正丁醇溶液，经旋转蒸发浓缩，即得总皂苷转化后的小极性人参皂苷。
本发明内生真菌多量毛霉高效转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的方法，具体步骤为：
(1)PDB液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖20g/L，自然pH，在101kPa、121℃灭菌30min备用；
(2)采用步骤(1)制备的PDB培养基活化培养2～7d内生真菌多量毛霉菌；
(3)吸取步骤(2)活化好的多量毛霉菌悬液，接种到新的PDB液体培养基中，接种的菌悬液体积是培养液体积的0.1～10.0％，室温，摇床无菌培养7～14d；
(4)将步骤(3)培养完毕的菌株用硫酸铵盐析，硫酸铵添加饱和度为60～85％；4000～12000r/min离心10～20min分离获得粗酶沉淀，按1g粗酶添加0.1～1L的pH值为3.5～5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的比例漩涡震荡溶解粗酶沉淀；4000～12000r/min离心5～10min除去不溶物即得粗酶溶液；
(5)采用体积百分比浓度为70～80％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:4～1:20，溶解后在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤(4)的粗酶溶液中，继续培养1～4d，其中三七总皂苷溶液的添加量为粗酶溶液质量的0.02～2.00％；
(6)培养结束后，培养液用水饱和正丁醇萃取2～3次，合并上清正丁醇溶液，经旋转蒸发浓缩，即得总皂苷转化后的小极性人参皂苷。
本发明内生真菌多量毛霉高效转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的方法，具体步骤为：
(1)采用体积百分比为70～80％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，得到终浓度为0.1～1mg/mL三七总皂苷溶液；
(2)利用上述粗酶溶液与步骤(1)中三七总皂苷溶液混合反应，三七总皂苷溶液与粗酶溶液的质量比为1:2～1:20，温度为50～60℃，pH值为3.5～5.0，反应4～72h；
(3)步骤(2)反应结束后加入水饱和正丁醇萃取2～3次，合并上清正丁醇溶液，经旋转蒸发浓缩，即得三七总皂苷转化后的小极性人参皂苷。
所述三七总皂苷包括人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg1、Re、三七皂苷R1中的一种或多种混合；所述三七总皂苷可以为三七主根及三七花的乙醇提取物，其主根总皂苷主要含有人参皂苷Rb1、Rd、Rg1、Re和三七皂苷R1，花总皂苷主要含有主要人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc和Rd。
所述小极性人参皂苷为20(S)-R2、20(R)-R2、20(R)-Rh1、20(S)-Rh1、20(S)-Rg2、20(R)-Rg2、20(R)-Rh2、20(S)-Rh2、F2、Rk3、T5、Rh4、F4、Rg6、20(S)-Rg3、20(R)-Rg3、Rg5、Rk1、Fe(C-Mc1)、Rd2(C-O)、Fd(C-Mx1)、CK中的多种混合。
本发明的有益效果：
本发明首次发现多量毛霉菌具有从三七中生产小极性人参皂苷的能力，具有高效、简便、环保等优点，这一发现将有助于提高三七的药用功能和经济价值。
附图说明
图1为菌株T63的菌落形态；
图2为菌株T63的孢子形态；
图3为菌株T63的系统发育树；
图4为菌株T63粗酶转化三七主根总皂苷产物的薄层色谱分析结果；
图5为菌株T63粗酶转化三七花总皂苷产物的薄层色谱分析结果；
图6为菌株T63粗酶转化三七主根总皂苷产物的高效液相色谱分析结果；
图7为菌株T63粗酶转化三七花总皂苷产物的高效液相色谱分析结果；
图8为菌株T63生物转化人参皂苷Rb1,Rb2,Rb3,Rc,Rg1,Re和三七皂苷R1的转化路径(a-d)。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明。实施例中未详细说明的均是本领域的公知常识。
实施例中磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液配制：按不同体积比混合配好浓度为0.2mol/L磷酸氢二钠溶液和浓度为0.1mol/L的柠檬酸溶液，不同体积比混合得到pH范围为3.5～5.0不同的缓冲液。
实施例1
多量毛霉(Mucor abundans)T63分离自新鲜天麻，该菌按照以下步骤进行分离纯化：
(1)马丁培养基配制：每升培养基中含葡萄糖20g、酵母浸膏2g、蛋白胨5g、MgSO40.5g、KH2PO41g、琼脂25g，余量为水，pH自然，用高压蒸汽灭菌锅121℃，灭菌30min，灭菌结束后取出培养基放入超净工作台，待培养基温度冷却至45℃左右，将提前配好的质量分数1％的链霉素水溶液，按每1L培养基对应4mL链霉素水溶液的比例进行添加，最后摇匀、倒平板即可；
(2)PDA固体培养基配制：每升培养基中含马铃薯浸出粉5g、葡萄糖15g、琼脂20g，pH自然；配制PDA斜面培养基配制时需将琼脂浓度调至25g/L，其余成分比例与PDA固体培养基一致；
(3)菌株的分离：取新鲜天麻，采用纯净水清洗，后放入超净工作台内采用体积分数75％乙醇溶液浸泡5min，后用蒸馏水冲洗3次，将清洗好的天麻放入质量分数6％的次氯酸钠溶液中浸泡5min，后用蒸馏水冲洗3次用无菌滤纸吸水，将杀菌处理后的天麻切片(1cmx1cmx0.3cm)至步骤(1)含有链霉素的马丁培养基上，置于恒温培养箱中25℃培养6d；
(4)菌株的纯化：在超净工作台中，用接种环挑取马丁氏培养基上形态各异的单菌落，以平板划线法将其逐一接种到新配制的多个PDA固体培养基上，倒置于25℃恒温培养箱中，培养6d后观察是否长出不同的菌落，若有不同菌落出现，则继续重复挑取单菌落，并用平板划线法将其接种到新的PDA培养基上，直至纯化到只有一种形态的菌落为止，将纯化所得的菌株接种到PDA斜面培养基上，进行一个临时性的编号T63，置于4℃冰箱保存，即为多量毛霉菌T63(Mucor abundans)。
菌株T63的显微形态及分子生物学鉴定：
(1)菌落形态鉴定：挑取少量菌丝接种于PDA固体培养基的3个点上，25℃培养6d后观察到如图1所示的菌落形态，从菌落形态可看出该菌落表面为白色，呈绒毛状，菌落绒毛凸起，菌丝生长的培养基最初是白色的，但后来变成了淡棕色，这与文献关于多量毛霉的报道是相吻合的。(2)显微形态鉴定：用光学显微镜对菌株的菌丝进行制片观察，得如图2所示的分生孢子梗形态，从图可以看出分枝的孢子清晰透明，顶端呈球形，分枝的孢子周围产生大量孢子囊，孢子囊为球状或近球状，显微形态的观察结果与相关文献描述一致。
(3)真菌ITS测序鉴定：将本实施例分离纯化到的菌株送至北京擎科生物科技有限公司进行ITS rDNA基因的测序，最后将测定结果提交至NCBI数据库进行BLAST同源比对，并选择相近种属的菌株利用软件MEGA6中的邻近法(Neighbor-joining)构建得如图3所示的菌株系统发育树，从发育树可以初步判断菌株T63与毛霉属的多量毛霉真菌相似度最高，所以综合上述所有数据确定该菌株为毛霉属的多量毛霉真菌(Mucor abundans)。
实施例2
三七主根总皂苷的提取，具体步骤如下：
(1)将三七主根加入到溶剂中，溶剂为体积分数60％的乙醇溶液，三七主根与溶剂的液料质量体积比为1:14，60℃保温1.5h来提取三七根总皂苷；
(2)三七主根总皂苷的纯化：采用D-101大孔吸附树脂的预处理，上样，洗脱：依次用体积分数10％、30％、50％、70％、90％、100％的乙醇溶液洗脱，洗脱液用TLC检测分析，合并洗脱液，经旋转蒸发仪减压浓缩，得三七根总皂苷；
(3)三七根总皂苷的检测分析：通过TLC和HPLC检测，判断三七主根中主要含5种皂苷，分别为人参皂苷Rb1、Rd、Re、Rg1、三七皂苷R1。
实施例3
三七花总皂苷的提取，具体步骤如下：
(1)将三七花加入到溶剂中，溶剂为体积分数60％的乙醇溶液，三七花与溶剂的液料质量体积比为1:14，60℃保温1.5h来提取三七花总皂苷；
(2)三七花总皂苷的纯化：采用D-101大孔吸附树脂的预处理，上样，洗脱：依次用体积分数10％、30％、50％、70％、90％、100％的乙醇溶液洗脱，洗脱液用TLC检测分析，合并洗脱液，经旋转蒸发仪减压浓缩，得三七花总皂苷；
(3)三七花总皂苷的检测分析：通过TLC和HPLC检测，判断三七花总皂苷中主要含有5种皂苷，分别为人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rb3、Rd。
实施例4
内生真菌多量毛霉(Mucor abundans)转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的应用，具体步骤如下：
(1)PDB液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖15g/L，余量为水，自然pH，压力101kPa，121℃高温高压灭菌30min；
(2)在无菌条件下，利用步骤(1)的PDB液体培养基活化实施例1提取的菌种培养2d；
(3)吸取步骤(2)活化好的多量毛霉菌悬液，接种到新的PDB液体培养基中，接种量为菌悬液体积是培养液体积的10.0％，室温，摇床无菌培养7d；
(4)底物添加：按三七根总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:2的比例，用体积百分比浓度为70％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，在无菌条件下将三七主根总皂苷溶液分别添加至步骤(3)培养结束后的菌液中，继续摇床培养7d，其中三七总皂苷溶液的添加量为菌液质量的2.00％；三七总皂苷为三七主根总皂苷提取物，主要含有人参皂苷Rb1、Rd、Rg1、Re和三七皂苷R1；
(5)发酵结束后，采用纱布过滤掉菌体，发酵液用水饱和正丁醇萃取2～3次，合并上清正丁醇溶液，经旋转蒸发浓缩，即得总皂苷转化后的产物；
(6)步骤(5)转化产物用于TLC和HPLC分析，得到小极性人参皂苷。
实施例5
内生真菌多量毛霉(Mucor abundans)转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的应用，具体步骤如下：
(1)PDB液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖15g/L，余量为水，自然pH，压力101kPa，121℃高温高压灭菌30min；
(2)在无菌条件下，利用步骤(1)的PDB液体培养基活化实施例1提取的菌种培养7d；
(3)吸取步骤(2)活化好的多量毛霉菌悬液，接种到新的PDB液体培养基中，接种量为菌悬液体积是培养液体积的0.1％，室温，摇床无菌培养14d；
(4)底物添加：按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:10的比例，用体积百分比浓度为80％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，在无菌条件下将三七花总皂苷溶液分别添加至步骤(3)培养结束后的菌液中，继续摇床培养21d，其中三七总皂苷溶液的添加量为菌液质量的0.02％；三七总皂苷为三七花总皂苷提取物，主要含有5种皂苷，分别为人参皂苷Rb1、Rb2、Rc、Rb3、Rd；
(5)发酵结束后，采用纱布过滤掉菌体，发酵液用水饱和正丁醇萃取2～3次，合并上清正丁醇溶液，经旋转蒸发浓缩，即得总皂苷转化后的产物；
(6)步骤(5)转化产物用于TLC和HPLC分析，得到小极性人参皂苷。
实施例6
内生真菌多量毛霉(Mucor abundans)转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的应用，具体步骤如下：
(1)PDB液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖15g/L，余量为水，自然pH，压力101kPa，121℃高温高压灭菌30min；
(2)采用步骤(1)制备的PDB培养基活化培养2d实施例1提取的天麻内生真菌多量毛霉；
(3)吸取步骤(2)活化好的多量毛霉菌悬液，接种到新的PDB液体培养基中，接种量为菌悬液体积是培养液体积的5.0％，室温，摇床无菌培养10d；
(4)底物添加：按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:5的比例，用体积百分比浓度为80％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，在无菌条件下将三七总皂苷溶液分别添加至步骤(3)培养结束后的菌液中，继续摇床培养14d，其中三七总皂苷溶液的添加量为菌液质量的1.00％；三七总皂苷为三七主根及花总提取物主要含有8种皂苷，分别为人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg1、Re和三七皂苷R1；
(5)发酵结束后，采用纱布过滤掉菌体，发酵液用水饱和正丁醇萃取2～3次，合并上清正丁醇溶液，经旋转蒸发浓缩，即得总皂苷转化后的产物；
(6)步骤(5)转化产物用于TLC和HPLC分析，得到小极性人参皂苷。
实施例7
内生真菌多量毛霉(Mucor abundans)粗酶转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的应用，具体步骤如下：
(1)PDB液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖15g/L，余量为水，自然pH，压力101kPa，121℃高温高压灭菌30min；
(2)采用步骤(1)制备的PDB培养基活化培养5d实施例1纯化好的天麻内生真菌多量毛霉；
(3)将步骤(2)活化后的菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为菌悬液体积是培养液体积的10.0％，摇床培养14d；
(4)将步骤(3)培养完毕的菌株培养液过滤除去菌体后用硫酸铵盐析，硫酸铵添加饱和度为85％(即硫酸铵的加入量是其达到饱和溶液的量的85％，全文相同)；12000r/min离心10min分离获得粗酶沉淀，按1g粗酶添加pH值为4.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液0.5L的比例漩涡震荡溶解粗酶沉淀；12000r/min离心5min除去不溶物即得粗酶溶液；
(5)采用体积百分比浓度为75％的乙醇溶液溶解三七主根总皂苷，三七主根总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:4的比例，溶解后在无菌条件下将三七主根总皂苷溶液倒入步骤(4)提取完毕的粗酶溶液中，继续培养4d，其中三七主根总皂苷溶液的添加量为粗酶溶液质量的2.00％，培养完毕即可获得三七主根总皂苷转化产物；
(6)步骤(5)转化产物加入水饱和正丁醇萃取2～3次，取上清液减压浓缩后用于TLC和HPLC分析，得到小极性人参皂苷。
实施例8
内生真菌多量毛霉(Mucor abundans)粗酶转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的应用，具体步骤如下：
(1)PDB液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖15g/L，余量为水，自然pH，压力101kPa，121℃高温高压灭菌30min；
(2)采用步骤(1)制备的PDB培养基活化培养2d天麻内生真菌多量毛霉；
(3)将步骤(1)活化后的菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为菌悬液体积是培养液体积的0.1％，摇床培养7d；
(4)将步骤(3)培养完毕的菌株培养液过滤除去菌体后用硫酸铵盐析，硫酸铵添加饱和度为60％；4000r/min离心20min分离获得粗酶沉淀，按1g粗酶添加pH值为5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液1L的比例漩涡震荡溶解粗酶沉淀；8000r/min离心7min除去不溶物即得粗酶溶液；
(5)采用体积百分比浓度为80％的乙醇溶液溶解三七花总皂苷，三七花总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:20的比例，溶解后在无菌条件下，将三七花总皂苷溶液倒入步骤(4)提取完毕的粗酶溶液中，继续培养1d，其中三七花总皂苷溶液的添加量为粗酶溶液质量的0.02％，培养完毕即可获得三七花总皂苷转化产物；
(6)步骤(5)转化产物加入水饱和正丁醇萃取2～3次，取上清液减压浓缩后用于TLC和HPLC分析，得到小极性人参皂苷。
实施例9
内生真菌多量毛霉(Mucor abundans)粗酶转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的应用，具体步骤如下：
(1)PDB液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖15g/L，余量为水，自然pH，压力101kPa，121℃高温高压灭菌30min；
(2)采用步骤(1)制备的PDB培养基活化培养7d天麻内生真菌多量毛霉；
(3)将步骤(2)活化后的菌种接种到无菌PDB培养基进行扩大培养，接种量为菌悬液体积是培养液体积的5.0％，摇床培养10d；
(4)将步骤(3)培养完毕的菌株培养液过滤除去菌体后用硫酸铵盐析，硫酸铵添加饱和度为75％；8000r/min离心15min分离获得粗酶沉淀，按1g粗酶添加pH值为3.5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液0.1L的比例漩涡震荡溶解粗酶沉淀；4000r/min离心10min除去不溶物即得粗酶溶液；
(5)采用体积百分比浓度为80％的乙醇溶液溶解三七花总皂苷，三七花总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:10的比例，溶解后在无菌条件下将三七花总皂苷溶液倒入步骤(4)提取完毕的粗酶溶液中，继续培养2d，其中三七花总皂苷溶液的添加量为粗酶溶液质量的1.00％，培养完毕即可获得三七花总皂苷转化产物；
(6)步骤(5)转化产物加入水饱和正丁醇萃取2～3次，取上清液减压浓缩后用于TLC和HPLC分析，得到小极性人参皂苷。
实施例10
内生真菌多量毛霉(Mucor abundans)粗酶转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的应用，具体步骤如下：
(1)采用体积百分比为70％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，使三七总皂苷溶液终浓度为1mg/mL；
(2)步骤(1)中三七总皂苷为人参皂苷标准品(HPLC≥98％)Rb1、Rd、Re、Rg1、Rb2、Rc、Rb3、三七皂苷R1等量混合而成；
(3)利用实施例9中的粗酶溶液与步骤(1)中三七总皂苷溶液反应，三七总皂苷溶液与粗酶溶液的质量比为1:2；反应条件：温度为60℃，pH值为3.5，反应时间为4h；
(4)步骤(3)反应结束后加入水饱和正丁醇萃取2～3次，取上清液减压浓缩后用于TLC和HPLC分析，得到小极性人参皂苷。
实施例11
内生真菌多量毛霉(Mucor abundans)粗酶转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的应用，具体步骤如下：
(1)采用体积百分比为80％的乙醇溶液溶解三七总皂苷，使三七总皂苷溶液终浓度为0.5mg/mL；
(2)步骤(1)中三七总皂苷为三七根总皂苷；
(3)利用实施例8中的粗酶溶液与步骤(1)中三七总皂苷溶液反应，三七总皂苷溶液与粗酶溶液的质量比为1:10；反应条件：温度为50℃，pH值为5.0，反应时间为72h；
(4)步骤(3)反应结束后加入水饱和正丁醇萃取2～3次，取上清液减压浓缩后用于TLC和HPLC分析，得到小极性人参皂苷。
实施例12
多量毛霉菌(Mucor abundans)粗酶转化三七总皂苷为小极性人参皂苷的应用，具体步骤如下：
(1)采用体积百分比为75％的乙醇溶液溶解三七皂苷，使三七皂苷单体溶液终浓度为0.1mg/mL；
(2)步骤(1)中三七总皂苷为人参皂苷标准品(HPLC≥98％)Rb1、Rd、Re、Rg1、Rb2、Rc、Rb3、三七皂苷R1中的一种；
(3)利用实施例9中的粗酶溶液分别与步骤(1)中三七皂苷单体溶液单独进行反应，三七皂苷单体溶液与粗酶溶液的质量比为1:20；反应条件：温度为50℃，pH值为3.5，反应时间为48h；
(4)步骤(3)反应结束后加入水饱和正丁醇萃取2～3次，取上清液减压浓缩后用于TLC和HPLC分析，得到小极性人参皂苷。
转化产物薄层色谱(TLC)分析：取出正丁醇层，旋转蒸发仪蒸干，利用甲醇溶解，用毛细管吸取甲醇溶解液，进行薄层色谱分析，展开剂为三氯甲烷-甲醇-水-冰醋酸6.7:2.6:0.4:0.3(v/v/v/v)，显色剂为10％硫酸-乙醇溶液，实施例7和实施例8的TLC分析结果分别见图4和图5，从图4和图5中可以看出，皂苷转化组底物被转化并且出现多个迁移距离较大的新显色点，说明这些物质具有较小的极性，这一结果提示有小极性人参皂苷生成。
转化产物高效液相色谱(HPLC)分析：高效液相分析条件是C18柱(5μm，250mm×4.6mm)；检测波长203nm；柱温30℃；体积流量1.0mL/mL；进样量30μL；流动相水溶液(A)-乙腈(B)；洗脱程序为：0-30min，20％(B)；30-60min，20-36％(B)；60-65min，36-38％(B)；65-68min，38-49％(B)；68-88min，49-60％(B)；88-91min，60-62％(B)；91-101min，62-75％(B)，实施例7的HPLC分析结果见图6，其中A为13种人参皂苷对照品，B为8种人参皂苷对照品，C为酶转化三七主根总皂苷转化产物(2,20(S)-R2；3,Rb1；4,20(R)-R2；5,20(R)-Rh1；6,Rd；7,F2；8,Rk3；9,T5；10,Rh4；11,20(S)-Rg3；12,20(R)-Rg3；15,Rg5；16,Rk1；1,13,14未知化合物)，D为三七主根总皂苷；由图6可知粗酶可以将三七主根中主要皂苷(人参皂苷Rb1，Rd，Rg1，Re和三七皂苷R1)转化为次要人参皂苷(20(S)-R2，20(R)-R2，20(R)-Rh1，F2，Rk3，T5，Rh4，20(S)-Rg3，20(R)-Rg3，Rg5，Rk1和未知化合物)。
实施例8的HPLC分析结果见图7，其中A为13种人参皂苷对照品，B为8种人参皂苷对照品，E为酶转化三七花总皂苷转化产物(2,Fc；3,Rb2；4,Rb3；6,Rd；8,Fe；9,Rd2+Fd；10,F2；11,Rk3；12,20(S)-Rg3；13,20(R)-Rg3,17,Rg5；18,Rk1；19,CK；1,5,7,14,15,16未知化合物)，F为三七花总皂苷，由图7可知粗酶可以将三七花中主要皂苷(Rb1，Rb2，Rb3，Rc和Rd)转化为次要人参皂苷(Fc，Fe，Rd2，Fd，F2，Rk3，20(S)-Rg3，20(R)-Rg3，Rg5，Rk1，CK和未知化合物)。
从实施例12的分析结果可以推测出三七单体皂苷转化路径如图8所示，C.abundans粗酶主要水解PPD型人参皂苷中的C-3与C-20相连的内葡萄糖外葡萄糖生成20(S/R)-异构体，以及通过脱水形成双键异构体(如图8a所示)，也可以水解PPT型皂苷C-20的内葡萄糖和外葡萄糖生成20(S/R)-异构体；后通过脱水形成双键异构体(如图8b、8c、8d所示)，那么由图8可知人参皂苷Rb1转化路径为：Rb1→Rd→20(S/R)-Rg3→Rh5/Rk1(主要路径)；Rb1→Rd→F2→20(S/R)-Rh2(次要路径)；人参皂苷Rb2转化路径为：Rb2→Rd2(C-O)(主要路径)；Rb2→Rd→F2/20(S/R)-Rg3→20(S/R)-Rh2/Rg5/Rk1(次要路径)；人参皂苷Rb3转化路径为：Rb3→Fd(C-Mx1)(主要路径)；Rb3→Rd→F2/20(S/R)-Rg3→20(S/R)-Rh2/Rg5/Rk1(次要路径)；人参皂苷Rc转化路径为：Rc→Fe(C-Mc1)(主要路径)；Rc→Rd→F2/20(S/R)-Rg3→20(S/R)-Rh2/Rg5/Rk1(次要路径)；人参皂苷Rg1转化路径为：Rg1→20(S/R)-Rh1→Rh4/Rk3；人参皂苷Re转化路径为：Re→20(S/R)-Rg2→Rg6/F4；三七皂苷R1转化路径为：R1→20(S/R)-R2→T5/3β，12β-二羟基达玛烷-(E)-20(22)，24-二烯-6-o-β-d-吡喃木糖基-(1→2)-β-D-吡喃葡萄糖苷，转化路径推导结果与实施例12的结论相符合。
本发明首次将多量毛霉真菌应用于三七总皂苷转化领域，且从产物来看可获得22种稀有人参皂苷(小极性人参皂苷)，说明多量毛霉在转化天然人参皂苷制备稀有人参皂苷方面具有较大的应用价值。本发明以三七主根和三七花提取物为底物，采用多量毛霉菌进行生物转化生产小极性人参皂苷。本发明对环境友好且经济实惠，为工业化生产奠定可靠的理论基础。

Claims (5)

1.一种内生真菌多量毛霉（Mucor abundans），已在中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心保藏，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为CGMCC No.40620，保藏日期为2023年5月9日。
2.权利要求1所述内生真菌多量毛霉在三七总皂苷转化为小极性人参皂苷中的应用，所述三七总皂苷为人参皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd、Rg1、Re、三七皂苷R1中的多种混合；
所述小极性人参皂苷为20(S)-R2、20 (R) - R2、20(R)-Rh1、20(S)-Rh1、20(S)-Rg2、20(R) - Rg2、20(R)-Rh2、20(S)-Rh2、F2、Rk3、T5、Rh4、F4、Rg6、20 (S) - Rg3、20 (R) - Rg3、Rg5、Rk1、Fe(C-Mc1)、Rd2(C-O)、Fd(C-Mx1)、CK中的多种混合。
3.根据权利要求2所述应用，其特征在于，具体步骤为：
（1）PDB液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖20g/L，自然pH，在101kPa、121℃灭菌30min备用；
（2）采用步骤（1）制备的PDB培养基活化培养2～7d内生菌多量毛霉；
（3）吸取步骤（2）活化好的多量毛霉菌悬液，接种到新的PDB液体培养基中，接种的菌悬液体积是培养液体积的0.1～10.0%，室温，摇床无菌培养7～14d；
（4）按三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:2～1:10的比例，乙醇溶液的体积百分比浓度为70～80%，将三七总皂苷与乙醇溶液混合得到三七总皂苷溶液，在无菌条件下将三七总皂苷溶液添加至步骤（3）培养结束后的菌液中，摇床培养7～21d，其中三七总皂苷溶液的添加量为菌液质量的0.02～2.00%；
（5）发酵结束后，采用纱布过滤掉菌体，发酵液用水饱和正丁醇萃取2～3次，合并上清正丁醇溶液，经旋转蒸发浓缩，即得总皂苷转化后的小极性人参皂苷。
4.根据权利要求2所述应用，其特征在于，具体步骤为：
（1）PDB液体培养基的配制：培养基中各成分的比例为马铃薯浸出粉5g/L、葡萄糖20g/L，自然pH，在101kPa、121℃灭菌30min备用；
（2）采用步骤（1）制备的PDB培养基活化培养2～7d内生真菌多量毛霉；
（3）吸取步骤（2）活化好的多量毛霉菌悬液，接种到新的PDB液体培养基中，接种的菌悬液体积是培养液体积的0.1～10.0%，室温，摇床无菌培养7～14d；
（4）将步骤（2）培养完毕的菌株培养液除去菌体后用硫酸铵盐析，硫酸铵添加饱和度为60～85%；4000～12000r/min离心10～20min分离获得粗酶沉淀，按1g粗酶添加0.1～1L pH值为3.5～5.0的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲溶液的比例漩涡震荡溶解粗酶沉淀；4000～12000r/min离心5～10min除去不溶物即得粗酶溶液；
（5）采用体积百分比为70～80%的乙醇溶液溶解三七总皂苷，三七总皂苷与乙醇溶液的质量比为1:4～1:20，溶解后在无菌条件下将三七总皂苷溶液倒入步骤（4）的粗酶溶液中，继续培养1～4d，其中三七总皂苷溶液的添加量为粗酶溶液质量的0.02～2.00%；
（6）培养结束后，培养液用水饱和正丁醇萃取2～3次，合并上清正丁醇溶液，经旋转蒸发浓缩，即得总皂苷转化后的小极性人参皂苷。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，具体步骤为：
（1）采用体积百分比为70～80%的乙醇溶液溶解三七总皂苷，得到终浓度为0.1～1mg/mL的三七总皂苷溶液；
（2）利用权利要求4中步骤（4）获得的粗酶溶液与步骤（1）中三七总皂苷溶液混合反应，三七总皂苷溶液与粗酶溶液的质量比为1:2～1:20，温度为50～60℃，pH值为3.5～5.0，反应4～72h；
（3）步骤（2）反应结束后加入水饱和正丁醇萃取2～3次，合并上清正丁醇溶液，经旋转蒸发浓缩，即得三七总皂苷转化后的小极性人参皂苷。
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