CN105199966B - 一种转化人参皂苷Rb1生产Rd的曲霉及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转化人参皂苷Rb1生产Rd的曲霉及应用，转化人参皂苷Rb1生产Rd的曲霉，其分类命名为曲霉(Aspergillus sp.)LFJ1403，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.11038。实验证明，本发明的曲霉转化人参皂苷Rb1生产Rd具有专一性，不会进一步转化Rd生产其他皂苷产物。在PDA固体培养产孢阶段外分泌大量转化人参皂苷Rb1产Rd的β‑糖基水解酶，据此制备而成的孢子悬液最佳转化体系具有简单高效易制备的优势。2‑3天取孢制备的孢子悬液人参皂苷Rb1转化活性最高。通过进一步优化转化条件人参皂苷Rb1转化率高达96％(w/w)。

Description

一种转化人参皂苷Rb1生产Rd的曲霉及应用

技术领域

本发明属于中药技术领域，涉及一种转化人参皂苷Rb1生产Rd的曲霉及应用。

背景技术

人参(Panax ginseng G.A.Meyer)是我国珍贵的传统中药，应用于中医临床已有二千多年的历史。人参的主要活性成份是人参皂苷(ginsenoside)，其中原人参二醇类皂苷属于达玛烷型四环三萜皂苷，主要包括Rb1、Rb2、Rc、Rd以及Rg3等。其中人参皂苷Rd对心血管，免疫系统，神经系统等具有良好的药理作用，有些药理作用是人参皂苷Rd独有而其他的单体皂苷所没有的。

人参皂苷Rd在人参中含量较低，只有0.2％左右，因其结构复杂，化学合成至今尚未成功，目前从人参、三七等植物根、茎、叶中提取来获得Rd单体，提取方法由于其收率低，成本较高，影响了医疗保健市场需求的进一步扩大，因此有必要开发一种产率高，纯度好，并且简单易行的制取人参皂苷Rd的方法。

对比相对含量较高的人参皂苷Rb1，Rd与其结构差别在于Rd的C₂₀位末端少一个葡萄糖残基。理论上可以通过将Rb1的C₂₀位末端葡萄糖残基水解掉得到人参皂苷Rd。目前有研究试图利用加热、酸水解法、碱水解法等化学方法将主要人参皂苷转化为活性更高的稀有皂苷。但是这些化学水解的条件都比较剧烈，不容易控制，而且在水解过程中能使皂苷元发生脱水、环合、差向异构、羟基化等反应，产生较多副产物，很难得到目标产物。生物转化的区域和立体选择性强、反应条件温和，这就使得酶转化法和微生物转化法制备稀有人参皂苷受到青睐。

从动物代谢角度分析，人参皂苷Rd可以由主要皂苷Rb1代谢而来，与其它皂苷不同的是，在胃中并不能由人参皂苷Rb1水解得到人参皂苷Rd，也不能由肠道菌分解得到人参皂苷Rd。目前只有利用微生物或微生物来源的酶转化得到人参皂苷Rd的研究报道，这些研究中转化过程中存在转化产物不专一以及人参皂苷对酶的明显抑制作用，而且转化效率较低，转化时间长。传统微生物转化应用存在局限性。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术的不足，提供一种高效转化人参皂苷Rb1生产Rd的曲霉。

本发明的第二个目的是提供上述曲霉转化人参皂苷Rb1生产Rd的的应用。

本发明的技术方案概述如下：

一种转化人参皂苷Rb1生产Rd的曲霉，其分类命名为曲霉(Aspergillus sp.)LFJ1403，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.11038。

上述曲霉转化人参皂苷Rb1生产Rd的的应用。

优选地，上述应用包括如下步骤：

(1)在28-32℃下，将PDA平板上培养2-3天的保藏号CGMCC No.11038的曲霉用体积浓度为0.05％-0.3％的Tween80溶液冲洗下来，用pH＝5.0的醋酸盐缓冲液稀释成孢子浓度为在2.0×10⁶-8.0×10⁶个/mL范围内的孢子悬液；所述Tween80溶液的溶剂为pH＝5.0的醋酸盐缓冲液；

(2)用pH＝5.0的醋酸盐缓冲液配制浓度为1.2-1.3mg/mL的人参皂苷Rb1溶液；

(3)将步骤(1)获得的孢子悬液与步骤(2)获得的人参皂苷Rb1溶液等体积混合，在35-38℃、pH＝5.0转化44-52h，得到人参皂苷Rd的转化液。

本发明的优点：

1、实验证明，本发明通过利用人参皂苷作为特定底物筛选菌株策略，筛得一株能够转化人参皂苷Rb1生产稀有人参皂苷Rd的菌株LFJ1403。通过菌株鉴定方法确定该菌为曲霉(Aspergillus sp.LFJ1403，Genebank accession number：KM925044)。该曲霉目前未有任何转化人参皂苷报道。

2、通过对曲霉LFJ1403的转化产物的液相色谱及质谱分析。该菌转化人参皂苷Rb1生产Rd具有专一性(专一水解Rb1的C₂₀位糖链末端β-1,6葡萄糖苷键)，不会进一步转化Rd生产其他皂苷产物。

3、通过四种不同转化体系转化人参皂苷Rb1的对比，证实了曲霉(Aspergillussp.)LFJ1403在PDA固体培养产孢阶段外分泌大量转化人参皂苷Rb1产Rd的β-糖基水解酶，据此制备而成的孢子悬液最佳转化体系具有简单高效易制备的优势。2-3天取孢制备的孢子悬液人参皂苷Rb1转化活性最高。通过进一步优化转化条件人参皂苷Rb1转化率高达96％(w/w)。

附图说明

图1-1至图1-2为人参皂苷Rb1及LFJ1403转化产物的高效液相色谱图：其中，图1-1为人参皂苷Rb1的高效液相色谱图；图1-2为LFJ1403转化产物的高效液相色谱图。

图2-1至图2-2为人参皂苷Rb1及LFJ1403转化产物的质谱图谱；其中，图2-1为人参皂苷Rb1的质谱图谱，图2-2为LFJ1403转化产物的的质谱图谱。

图3为基于18S rDNA构建的曲霉LFJ1403与相关真菌的进化树。图中各真菌的18SrDNA序列来自Genebank(序列号在进化树中已给出)，Neighour-Joining方法构建该树，Bootstrap设置为1000；

图4为不同取孢时间制备孢子悬液对人参皂苷Rd产率影响；

图5.为不同转化体系对人参皂苷Rd产率影响；

图6为不同人参皂苷Rb1底物浓度对人参皂苷Rd产率影响；

图7为不同转化温度对人参皂苷Rd产率影响；

图8为不同初始pH对人参皂苷Rd产率影响；

图9为不同转化时间对人参皂苷Rd产率影响；

图10为孢子悬液在Q-Sepharose柱上的梯度洗脱图谱；(图中的带有三角形标记的曲线为盐离子强度)

图11为各单组份酶的β-糖基水解酶酶活检测；

图12为第4号管单组份酶转化人参皂苷Rb1产Rd的高效液相色谱图；

图13为第4号管单组份酶的SDS-PAGE电泳图(图中左边为Mark)；

图14为2L反应体系中不同转化时间对转化率的影响。

菌种保藏：

转化人参皂苷Rb1生产Rd的曲霉，其分类命名为曲霉(Aspergillus sp.)LFJ1403，于2015年7月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)并存活，保藏号CGMCC No.11038，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码100101。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

本发明所采用的Rb1购自吉林省宏久生物科技股份有限公司。公开Rb1的购买单位是为了使本领域的技术人员能够更好地理解本发明，但其它来源的Rb1也可以用于本发明。

实施例1

人参皂苷Rb1转化菌株LFJ1403的筛选

(1)取来自吉林农业大学参园的土壤1g，溶于5mL无菌水中得到该土壤的母液，再将该母液分别用无菌水稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5五个梯度。各梯度取200μL涂布含有0.1g/L氯霉素的PDA平板。30℃倒置培养至单菌落长出，长出的各单菌落不断转接PDA平板直至获得纯化的单菌落并4℃保存斜面备用。

PDA平板上长好的45株单菌落分别用适量20mmol/L醋酸盐缓冲液(pH＝5.0)冲洗，同时将菌孢子轻轻刮下，转至灭菌三角瓶中，120rpm振荡2小时直至孢子在缓冲液中混匀。将孢子用三层纱布过滤至50mL离心管(滤液为孢子悬液)，用20mmol/L醋酸盐缓冲液定容至20mL，取1mL放置于2.5mL离心管中，分别稀释10^-1、10^-2、10^-3、10^-4、10^-5五个梯度，显微镜下观察各梯度孢子数量，使最终孢子浓度为5.0×10⁶个/mL。

PDA培养基为马铃薯葡萄糖琼脂培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，琼脂15，pH自然。

(2)用pH＝5.0的醋酸盐缓冲液配制Rb1浓度为0.25mg/mL；

(3)将步骤(1)获得的孢子悬液与步骤(2)获得的溶液等体积混合，在30℃，130rpm条件下反应。从0小时开始，每隔24小时取样一次，每次200μL，加入等体积正丁醇萃取两次，50℃挥干溶剂后用色谱纯甲醇定容100μL。HPLC检测分析，通过与Rb1标准品峰图比对分析，从45株菌中确定一株可以转化Rb1且转化效果最好的菌株LFJ1403(图1-1和图1-2)。并用LS/MS液质联用鉴定转化产物，确定产物为单一人参皂苷Rd(图2-1和图2-2)。

实施例2

菌株LFJ1403的形态学及遗传学鉴定

菌株LFJ1403的形态学鉴定：

将菌株LFJ1403按照实施例1步骤(1)的操作获得孢子悬液，用该孢子悬液涂布PDA平板，30℃倒置培养，每隔24小时观察菌落形态并拍照记录。经观察，培养24小时的菌落呈白色绒毛状，菌落局部呈浅绿色。培养48小时的菌落逐渐呈绿色绒毛状，单菌落直径2-5mm，菌落背面呈浅黄色。培养72小时的菌落完全呈灰绿色致密绒毛状，菌落边缘呈白色，背面呈深黄色，并有潮霉气味。培养96小时的菌落灰绿色继续加深，表面孢子簇凸起呈丝状，背部颜色呈黑黄色，放大100倍光学显微镜下菌丝呈现放射状且分支较多。

菌株LFJ1403的遗传学鉴定：

取1.5mL菌液12000rpm离心收集菌体约0.02g，用双蒸水清洗3次。加入600μL裂解液。漩涡震荡30s，-80℃冷冻1min后立即转入70℃水浴融解2min。重复上述震荡冷冻融解过程三次。加入600μL苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)，充分颠倒混匀，12000rpm离心2min，收集上清液，重复萃取1-2次直至上清液颜色变淡，表面无杂质。收集上清液，以等体积异丙醇沉淀，充分混匀，-20℃静置1h后12000rpm离心5min，弃上清。DNA沉淀用500μL 70％乙醇水溶液洗涤一次，12000rpm离心5min，弃上清液。剩余液体尽量吸净，并37℃干燥。加入50μL无菌水溶解DNA，37℃保温30min，-20℃保存备用。

用引物FR1(SEQ ID NO.1)和NS1(SEQ ID NO.2)从上述提取的菌株LFJ1403DNA基因组中获取18S rDNA部分基因序列并扩增，将PCR产物送北京华大测序，并将序列拼凑结果在NCBI数据库中进行比对。用N-J方法构建菌株LFJ1403的进化树(图3)，确定其为曲霉，命名为Aspergillus sp.LFJ1403，并将18S rDNA序列提交Genebank数据库获得Genebankaccession number：KM925044。

本发明所用基因组裂解液组成为：50mM Tris-HCl，50mM EDTA，1.4M NaCl，3％(V/V)CTAB，pH＝8.0。

本发明所用pcr酶为北京全式金生物技术有限公司的pfu聚合酶，PCR扩增体系如表1。依照下述在冰上配制PCR反应体系，先加水，最后加pfu聚合酶；

表1 PCR扩增体系

在PCR仪上设置扩增程序。扩增条件为95℃预变性2分钟(1个循环)；95℃变性30秒、48℃退火45秒、72℃延伸2分钟(35个循环)；72℃延伸10分钟(1个循环)。

本发明中涉及到的寡核苷酸引物列于表2.

表2引物序列

将获得的转化人参皂苷Rb1生产Rd的曲霉菌株LFJ1403在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，相关信息见菌种保藏。

实施例3

1、最佳取孢时间的确定

30℃条件下PDA平板上倒置培养的曲霉LFJ1403孢子分别在培养至2、3、4、5和6天时用体积百分浓度为0.1％的Tween80溶液冲洗下来，所述Tween80溶液的溶剂为pH＝5.0的醋酸盐缓冲液，将孢子浓度控制在5.0×10⁶个/mL制成孢子悬液。以上5种不同取孢时间制成的孢子悬液与等体积的0.25mM人参皂苷Rb1溶液(人参皂苷Rb1溶液的溶剂为pH＝5.0醋酸盐缓冲液)混匀后30℃，200rpm培养。转化96hour取样HPLC分析测Rb1转化率，2天和3天取孢制备成的孢子悬液的Rd产率比4、5、6天取孢要高，所以在2天至3天时间段取孢制备孢子悬液转化体系(图4)。

2、曲霉LFJ1403转化人参皂苷Rb1的最适转化体系的确定

将PDA平板上30℃倒置培养3天的曲霉LFJ1403孢子用体积百分浓度为0.1％的Tween80溶液冲洗下来，所述Tween80溶液的溶剂为pH＝5.0的醋酸盐缓冲液，并用pH＝5.0的醋酸盐缓冲液稀释成孢子浓度为5.0×10⁶个/mL的混合液；分别做如下操作制备四种转化体系：

第1种：混合液与等体积的0.25mM人参皂苷Rb1溶液混匀后得到孢子悬液转化体系(circle)；

第2种：混合液25000g离心30min，保留上清液与等体积0.25mM人参皂苷Rb1溶液混匀后得到上清液转化体系(regular triangle)；

第3种：混合液25,000g离心30min，弃上清，保留下层孢子，用pH＝5.0，50mM醋酸盐缓冲液重新稀释定容后与等体积0.25mM人参皂苷Rb1溶液混匀得到离心孢子转化体系(square)；

第4种：混合液25,000g，离心30min，弃去上清，保留下层孢子，用PDB液体培养基重新稀释定容，培养3天待观察到菌丝体生成后与等体积0.25mM人参皂苷Rb1溶液混匀得到菌悬液转化体系(inverted triangle)。

0.25mM人参皂苷Rb1溶液(溶剂为pH＝5.0，50mM醋酸盐缓冲液)

PDB液体培养基为马铃薯葡萄糖液体培养基(g/L)：马铃薯200，葡萄糖20，pH自然。

以上四种转化体系于30℃，200rpm摇床培养，每隔12h取样。通过HPLC检测不同转化体系各时间点的人参皂苷Rb1转化情况确定最佳转化体系，96hour时第1种孢子悬液转化体系和第2种上清液转化体系人参皂苷Rd产率高达94％(w/w)。相比上清液转化体系，孢子悬液制备过程简单，故孢子悬液为最佳转化体系(图5)。

实施例4

曲霉LFJ1403转化人参皂苷Rb1的转化条件优化

分别对底物浓度、转化温度、pH及转化时间条件进行优化。

1、不同底物浓度对人参皂苷Rb1转化影响

将人参皂苷Rb1底物浓度用20mM醋酸盐缓冲液(pH＝5.0)调整为0.6mg/mL、1.25mg/mL、1.85mg/mL、2.5mg/mL和3.75mg/mL共5个底物浓度。与等体积的孢子悬液转化体系(5.0×10⁶孢子/mL)混匀后在37℃，200rpm转速条件下进行转化培养，待转化到96hours后停止摇床培养。取200μL转化液于离心管中，加入等体积的水饱和正丁醇重复萃取二次，有机相挥干后残余物质用色谱纯甲醇溶解，HPLC检测。当底物浓度少于1.25mg/mL时，人参皂苷Rb1产Rd的转化率随底物浓度增加而升高，底物浓度大于1.25mg/mL后，随着底物浓度增加转化率随之降低，但Rd产率随之缓慢增加。这是因为随着底物浓度增加抑制了酶转化活性，转化效率降低，但Rd整体产量还是增加的趋势。为了在最适转化率和最适产量之间寻找一个平衡点，选取1.25mg/mL浓度的人参皂苷Rb1为最适底物浓度(图6)。

2、不同转化温度对人参皂苷Rb1转化影响

1.25mg/mL人参皂苷Rb1的醋酸盐溶液(pH＝5.0)与等体积孢子悬液转化体系(5.0×10⁶孢子/mL)混匀后分别在转化温度25℃、30℃、37℃及40℃条件下，转速200rpm下转化培养，待转化到96hours停止摇床培养。取200μL转化液于离心管中，加入等体积的水饱和正丁醇重复萃取二次，有机相挥干后残余物质用色谱纯甲醇溶解，HPLC检测。选取的四个温度梯度条件下均可以转化人参皂苷混合物中Rb1产Rd，但是温度为37℃时Rd产量最高。故最适转化温度选取37℃(图7)。

3、不同初始pH对人参皂苷Rb1转化影响

1.25mg/mL人参皂苷Rb1醋酸盐溶液与等体积孢子悬液转化体系(5.0×10⁶孢子/mL)混匀，初始pH用1M的HCL溶液分别调整为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0和8.0。在37℃温度下，转速200rpm条件下转化培养96hours，待转化到96hours停止摇床培养。取200μL转化液于离心管中，加入等体积的水饱和正丁醇重复萃取二次，有机相挥干后残余物质用色谱纯甲醇溶解，HPLC检测。当pH值低于3.0或高于7.0时酶活性被显著抑制或失活从而降低Rd产率。pH为5.0时β-糖基水解酶酶活最高，故选取pH＝5.0为最适pH值(图8)。

4、不同转化时间对人参皂苷Rb1转化影响

1.25mg/mL人参皂苷Rb1醋酸盐溶液(pH＝5.0)与等体积孢子悬液转化体系(5.0×10⁶孢子/mL)混匀后在37℃温度下，转速200rpm条件下转化培养，初始pH为5.0。每隔12h取样检测，待转化96hours停止摇床培养。取200μL转化液于离心管中，加入等体积的水饱和正丁醇重复萃取二次，有机相挥干后残余物质用色谱纯甲醇溶解，HPLC检测。人参皂苷Rd产量在转化48hour时达到1.20mg/ml，随后一直维持平衡状态，故最佳转化时间为48hours(图9)。

实施例5

一种曲霉LFJ1403人参皂苷转化酶即β-糖基水解酶的分离纯化

孢子悬液在6000rpm、4℃条件下离心20min。将上清液吸取至离心管，用0.25μm滤膜过滤除杂质，将滤液移至截留分子量30KDa超滤管中，6000rpm、4℃条件下离心10min至管内蛋白浓缩液体积500μL。用Q-Sepharose强阴离子交换柱对混合酶液进行分离，上样量1mL，紫外吸收波长为280nm。上样后先用25mM Tris-HCl洗脱液(pH8.2)进行洗脱杂质，待蛋白吸收信号和盐离子强度信号稳定后，将含有0.5M NaCl的25mM Tris-HCl洗脱液洗脱体积设置为梯度洗脱，范围控制在0-80％。自动收集器收集洗脱下来的各单组份蛋白。各单组份蛋白的柱分离峰图见图10。

得到的各单组份酶液用PNPG比色法测其β-糖基水解酶活性，四号管的β-糖基水解酶活力最高(图11)，其余各管均无水解酶活力。

各单酶组分的人参皂苷Rb1转化能力检测则以人参皂苷Rb1作为底物，测其转化能力。待转化24h用HPLC检测其底物转化情况。HPLC结果表明(图12)，曲霉孢子悬液经离心、过滤、超滤及柱分离后的4号胞外酶液可以转化人参皂苷Rb1产Rd。由β-糖基水解酶活力检测及人参皂苷Rb1转化能力实验表明，四号管单组份酶即为曲霉外分泌到胞外可以专一转化人参皂苷Rb1生成Rd的糖基水解酶。SDS-PAGE电泳结果表明其分子量为97KDa(图13)。

实施例6

曲霉的应用，包括如下步骤：

(1)在30℃下，将PDA平板上培养2天的保藏号CGMCC No.11038的曲霉孢子用体积百分浓度为0.1％的Tween80溶液冲洗下来，所述Tween80溶液的溶剂为pH＝5.0的醋酸盐缓冲液，并用pH＝5.0的醋酸盐缓冲液稀释使孢子浓度为在5.0×10⁶个/mL范围内的孢子悬液；

(2)用pH＝5.0的醋酸盐缓冲液配制浓度为1.25mg/mL的Rb1溶液；

(3)将步骤(1)获得的孢子悬液与步骤(2)获得的溶液等体积混合，在37℃、pH＝5.0转化时间48h，得到人参皂苷Rd的转化液。人参皂苷Rd的质量比转化率可达96％(w/w)。

实施例7

曲霉的应用，包括如下步骤：

(1)在28℃下，将PDA平板上培养3天的保藏号CGMCC No.11038的曲霉孢子用体积百分浓度为0.05％的Tween80溶液冲洗下来，所述Tween80溶液的溶剂为pH＝5.0的醋酸盐缓冲液，并用pH＝5.0的醋酸盐缓冲液稀释使孢子浓度为在2.0×10⁶个/mL范围内的孢子悬液；

(2)用pH＝5.0的醋酸盐缓冲液配制浓度为1.2mg/mL的Rb1溶液；

(3)将步骤(1)获得的孢子悬液与步骤(2)获得的溶液等体积混合，在35℃、pH＝5.0转化时间52h，得到人参皂苷Rd的转化液。人参皂苷Rd的质量比转化率可达95.8％(w/w)。

实施例8

曲霉的应用，包括如下步骤：

(1)在32℃下，将PDA平板上培养3天的保藏号CGMCC No.11038的曲霉孢子用体积百分浓度为0.3％的Tween80溶液冲洗下来，所述Tween80溶液的溶剂为pH＝5.0的醋酸盐缓冲液，并用pH＝5.0的醋酸盐缓冲液稀释使孢子浓度为在8.0×10⁶个/mL范围内的孢子悬液；

(2)用pH＝5.0的醋酸盐缓冲液配制浓度为1.3mg/mL的Rb1溶液；

(3)将步骤(1)获得的孢子悬液与步骤(2)获得的溶液等体积混合，在38℃、pH＝5.0转化时间44h，得到人参皂苷Rd的转化液。人参皂苷Rd的质量比转化率可达95.5％(w/w)。

实施例9

曲霉的应用，5L罐放大反应，包括如下步骤：

(1)挑取4℃保存的曲霉(CGMCC 11038)孢子，溶于无菌水中，稀释至孢子浓度为3.0×10⁴个/mL，取555μL该孢子溶液在PDA平板(直径150mm)上涂布，并置于30℃培养箱培养3天。

(2)在30℃下，将PDA平板上培养3天的保藏号CGMCC No.11038的曲霉孢子用体积百分浓度为0.1％的Tween80溶液冲洗下来，所述Tween80溶液的溶剂为pH＝5.0的醋酸盐缓冲液，并用pH＝5.0的醋酸盐缓冲液稀释使孢子浓度为5.0×10⁶个/mL，得到1L孢子悬液；

(3)用pH＝5.0的醋酸盐缓冲液配制体积为1L的Rb1溶液，浓度为1.25mg/mL；

(4)将步骤(2)获得的孢子悬液与步骤(3)获得的溶液等体积混合得到2L反应混合体系，将该体系置于5L发酵罐中，在37℃，pH＝5.0，转速为200rmp条件下转化48h，得到人参皂苷Rd的转化液。人参皂苷Rd的质量比转化率可达85％(w/w)(图14)。

实施例10

曲霉LFJ1403的产物检测和鉴定

实施例1中曲霉LFJ1403转化人参皂苷Rb1而成的单一产物Rd的定性用LC-MS进行。液相色谱条件：进样量5μL，安捷伦ZORBAX SB-Aq；流动相为乙腈：水＝4:6，流速：0.2mL/min。质谱条件：雾化气和干燥气都为N₂；碰撞电压：-70V；喷雾电压：4.5kV；离子源：ESI；离子源温度：120℃；脱溶温度：300℃；柱后流出物导入离子源速率：5μL/min；质谱扫描质量数范围：200-1500Da。

实施例1、3、4、5中所采用的HPLC液相色谱条件：进样量20μL，大连依利特C18柱；紫外吸收波长203nm，流动相为乙腈(A)：水(B)＝40：:60(v/v)，柱温为室温，流速为1.0ml.min^-1。

Claims (3)

1.一种转化人参皂苷Rb1生产Rd的曲霉，其分类命名为曲霉(Aspergillus sp.)LFJ1403，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCCNo.11038。

2.权利要求1的曲霉转化人参皂苷Rb1生产Rd的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征是包括如下步骤：

(1)在28-32℃下，将PDA平板上培养2-3天的保藏号CGMCC No.11038的曲霉用体积浓度为0.05％-0.3％的Tween80溶液冲洗下来，用pH＝5.0的醋酸盐缓冲液稀释成孢子浓度为在2.0×10⁶-8.0×10⁶个/mL范围内的孢子悬液；所述Tween80溶液的溶剂为pH＝5.0的醋酸盐缓冲液；

(2)用pH＝5.0的醋酸盐缓冲液配制浓度为1.2-1.3mg/mL的人参皂苷Rb1溶液；

(3)将步骤(1)获得的孢子悬液与步骤(2)获得的人参皂苷Rb1溶液等体积混合，在35-38℃、pH＝5.0转化44-52h，得到人参皂苷Rd的转化液。