CN107118972B - 可液体发酵产果胶的加拿大一枝黄花内生真菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了加拿大一枝黄花内生真菌，其分类命名为附球菌属L1（Epicoccum sp.L1），该菌株已于2016年7月4号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016365。本发明还公开了一种加拿大一枝黄花内生真菌的应用。本发明中的加拿大一枝黄花内生真菌黑附球菌L1能液体发酵生产果胶，因此可采用本发明的黑附球菌L1发酵法生产果胶，为果胶的生产提供新的方法。

Description

可液体发酵产果胶的加拿大一枝黄花内生真菌及其应用
技术领域
本发明属微生物学领域，具体涉及可液体发酵产果胶的加拿大一枝黄花内生真菌及其应用。
背景技术
果胶(pectin)是一种酸性多糖物质，常为白色至淡黄色粉末，是羟基被不同程度甲酯化的线性聚半乳糖醛酸。除半乳糖醛酸外，果胶分子中还含有一定比例的中性糖残基，如鼠李糖、阿拉伯糖等。果胶一般分为高甲氧基果胶、低甲氧基果胶和酰胺化果胶三大类。高甲氧基果胶广泛应用于酸性乳饮料、果汁饮料、固形物大于55％的高糖果酱和果冻、凝胶糖果、医药保健等行业；低甲氧基果胶和酰胺化果胶广泛应用于低糖果酱、乳制品、烘培产品等领域。当今果胶的总产量以高酯果胶为主，大约占总量的75％。目前，我国的果胶产量和品质都不高，部分依赖进口，且工业生产的果胶80％～90％用于食品工业。
工业生产的果胶一般从柑橘皮、苹果皮、葡萄皮、蚕砂和甜菜渣等植物细胞中通过酸解法提取。酸解法虽然工艺成熟，但是存在能耗高、提取率低以及果胶质量不高等缺憾。近年来国内正在研究开发新的提取工艺并取得了一定的成果，但迄今还未见通过微生物发酵生产果胶的报道。
植物内生菌(Endophyt)是一定阶段或全部阶段生活于健康植物的组织和器官内部的真菌、细菌或放线菌，普遍存在于高等植物中。植物内生菌因可产生多种新化学物质并可参与多种物质的转化过程而倍受研究者的关注。
加拿大一枝黄花(Solidago canadensis L.)，1935年作为观赏植物引入中国，引种后逸生成恶性杂草，对生物多样性构成严重威胁。目前对于加拿大一枝黄花偏重于“防控”，而对于其内生菌的研究还甚少，具有一定的内生菌资源开发利用价值。
发明内容
发明目的：本发明所要解决的技术问题是提供了可液体发酵产果胶的加拿大一枝黄花内生真菌。
本发明还要解决的技术问题是提供了加拿大一枝黄花内生真菌在生产果胶方面的应用。
本发明最后要解决的技术问题是提供了加拿大一枝黄花内生真菌液体发酵生产果胶的方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案为：加拿大一枝黄花内生真菌，其分类命名为附球菌属L1(Epicoccum sp.L1)，该菌株已于2016年7月4号保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCC NO：M 2016365。保藏地址：湖北省武汉市武昌区武汉大学保藏中心(武汉大学第一附属小学对面)，邮编：430072。
本发明所述的加拿大一枝黄花内生真菌L1，它为附球菌属(Epicoccum sp.)黑附球菌(Epicoccum nigrum)，属半知菌亚门，壳霉目，杯霉科，附球菌属。
本发明所述的加拿大一枝黄花内生真菌L1，它为附球菌属(Epicoccum sp.)黑附球菌(Epicoccum nigrum)，在大麦芽汁固体培养基上28℃培养，菌落平整，绒毛状；初始菌丝为白色，后期逐渐变为黄褐色。在16×40倍显微镜下，菌丝透明，有隔。
本发明通过提取所述的加拿大一枝黄花内生真菌L1菌丝体的总DNA，选用通用引物ITS1/ITS4扩增18S rDNA基因序列。将ITS序列提交至NCBI网页，通过BLAST同源性比对分析，结果显示：本发明菌株L1序列与黑附球菌(Epicoccum nigrum)的同源性达到99％以上。结合形态学观察，鉴定L1为附球菌属(Epicoccum sp.)黑附球菌(Epicoccum nigrum)。其中，上述内生真菌ITS碱基序列如SEQ ID NO:1所示。
本发明内容还包括上述的加拿大一枝黄花内生真菌在生产果胶方面的应用。
其中，上述加拿大一枝黄花内生真菌通过液体发酵生产制备果胶。
其中，上述液体发酵培养基为马丁液体培养基、YPG液体培养基、察氏液体培养基和大麦芽汁液体培养基中的一种或几种。
其中，上述液体发酵中的碳源为山梨醇、果糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖和淀粉中的一种或几种。
其中，上述液体发酵中的氮源为菜籽饼粉、花生饼粉、乙二胺四乙酸、氯化铵、尿素、蛋白胨、酵母浸膏、硝酸钾和甘氨酸中的一种或几种。
本发明内容还包括一种采用加拿大一枝黄花内生真菌液体发酵产果胶的方法，将上述的加拿大一枝黄花内生真菌接种到固体培养基培养活化，然后接种到液体培养基发酵培养10～18天即得。
其中，上述固体培养基为大麦芽汁固体培养基。
其中，上述液体培养基为大麦芽汁液体培养基，发酵条件为：温度20-35℃，转速100-150r/min。
其中，上述最佳的发酵条件为：28℃、120r/min条件下震荡发酵培养14d。
其中，通过在发酵液中加入无水乙醇使含醇量达50％-80％以沉淀发酵产物，发酵产物冷冻干燥后，经与标准品红外光谱图分析比对确定发酵产物为果胶。
作为优选，在沉淀果胶时除了加入无水乙醇使含醇量达到50％-80％外还加入了总体积1.5％的HCl。
有益效果：与现有技术相比，本发明的优点是：本发明中的加拿大一枝黄花内生真菌黑附球菌L1，能液体发酵生产果胶，因此可采用发明的黑附球菌L1发酵法生产果胶，为果胶的生产提供新的方法。
附图说明
图1为加拿大一枝黄花内生真菌黑附球菌L1发酵产物和果胶标准品的红外光谱图(a：发酵产物红外光谱图；b：果胶标准品红外光谱图)；
图2为加拿大一枝黄花内生真菌黑附球菌L1的菌落形态图；
图3为加拿大一枝黄花内生真菌黑附球菌L1的显微形态图(a：菌丝体显微形态；b：孢子及孢子囊形态；放大倍数16×40)；
图4为总DNA经通用引物ITS1/ITS4PCR扩增后凝胶电泳图(M：Marker；泳道L1：目的条带)；
图5为加拿大一枝黄花内生真菌黑附球菌L1在马丁液体培养基、YPG液体培养基、察氏液体培养基和大麦芽汁液体培养基中发酵14d前后培养基中可溶性糖含量的变化；
图6加拿大一枝黄花内生真菌黑附球菌L1在马丁液体培养基、YPG液体培养基、察氏液体培养基和大麦芽汁液体培养基中发酵14d后发酵液中果胶的含量；
图7加拿大一枝黄花内生真菌黑附球菌L1在含不同碳源的大麦芽汁液体培养基中发酵14d后菌丝体重量(干重)；
图8加拿大一枝黄花内生真菌黑附球菌L1在含不同碳源的大麦芽汁液体培养基中发酵14d后生成的果胶重量(干重)；
图9加拿大一枝黄花内生真菌黑附球菌L1在含不同氮源的大麦芽汁液体培养基中发酵14d后菌丝体重量(干重)；
图10加拿大一枝黄花内生真菌黑附球菌L1在含不同氮源的大麦芽汁液体培养基中发酵14d后生成的果胶重量(干重)。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1：加拿大一枝黄花内生真菌附球菌属黑附球菌L1的筛选分离
本实施例中加拿大一枝黄花内生真菌黑附球菌(Epicoccum nigrums)L1，分离自健康的加拿大一枝黄花叶片。实验材料于2014年7月采自江苏省镇江市润州区净因寺路边地区。筛选分离按如下步骤进行：
取健康的野生加拿大一枝黄花叶片，用蒸馏水冲洗干净。将上述叶片剪成约5cm长度的叶段，用1.5％次氯酸钠浸泡1-2min，无菌水冲洗3次后，再用75％乙醇浸泡1-2min，无菌水冲洗3次，然后再将其剪成1cm2的小块，贴附在PDA固体培养基平板上于28℃恒温条件下培养。3-7天后，将从叶片切口边缘处长出的内生菌逐个接至新的PDA固体培养基平板上多次划线分离纯化，将筛选到的其中一株内生真菌命名为L1。
加拿大一枝黄花叶片表面消毒后，将最后一次冲洗的无菌水吸取0.2mL涂布在PDA固体培养基平板上在28℃进行培养，周围无任何菌落长出，证明样品表面灭菌彻底，本发明黑附球菌L1来源于加拿大一枝黄花叶片组织内部，而不是叶片表面的附生菌。
马铃薯(PDA)固体培养基：称取200g去皮马铃薯小块，加入700-800mL水，煮沸30min后，用4层纱布过滤。滤液中加入20g蔗糖和15g琼脂，加热溶解后补水至1000mL，pH自然(pH7左右)。121℃高压蒸汽灭菌20min。
实施例2：加拿大一枝黄花内生真菌附球菌属黑附球菌L1最适生长培养基筛选
本实施例中将黑附球菌L1分别点接至PDA固体培养基、马丁固体培养基、YPG固体培养基、察氏固体培养基和大麦芽汁固体培养基平板中心，28℃静止培养。本发明菌株在PDA固体培养基中生长速度缓慢，在马丁固体培养基、YPG固体培养基和察氏固体培养基上生长速度中等，在大麦芽汁固体培养基中生长速度最快。说明大麦芽汁培养基适合本发明菌株L1的生长。
马铃薯(PDA)固体培养基配制同实施例1。
马丁固体培养基：700-800mL水中加入蛋白胨5g，蔗糖20g，KH2PO4·3H2O 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，酵母膏2g和琼脂15g，加热溶解后补水至1000mL(pH6.2～6.6)。121℃高压蒸汽灭菌20min。
YPG固体培养基：700-800mL水中加入酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g和琼脂15g，加热溶解后补水至1000mL(pH6.0～6.5)。121℃高压蒸汽灭菌20min。
察氏固体培养基：700-800mL水中加入蔗糖30g，NaNO3 3g，MgSO4.7H2O 0.5g，KCl0.5g，FeSO4.7H2O 0.01g，K2HPO4 1g和琼脂15g，加热溶解后补水至1000mL(pH7左右)。121℃高压蒸汽灭菌20min。
大麦芽汁固体培养基：1000mL水中加入20g大麦芽，加热煮沸25min。四层纱布过滤，滤液加入蔗糖20g，蛋白胨1g和琼脂15g，加热溶解后补水至1000mL(pH6.4左右)。121℃高压蒸汽灭菌20min。
PDA培养基、马丁培养基、YPG培养基、察氏培养基和大麦芽汁培养基是实验室中常用的真菌生长培养基。
实施例3：加拿大一枝黄花内生真菌附球菌属黑附球菌L1发酵液的制备
将本发明黑附球菌L1菌株接种至大麦芽汁固体培养基平板上，28℃静止培养7d以活化菌株。取6块直径6mm菌块接种入含150mL大麦芽汁液体培养基的三角瓶(250mL)中，28℃、120r/min条件下震荡发酵培养14d。四层纱布过滤，滤液即为黑附球菌L1发酵液。发酵液4℃低温放置12h后呈粘稠胶状。
大麦芽汁液体培养基配制同实施例2，区别在于1000mL培养基中去掉15g琼脂。
实施例4：黑附球菌L1发酵产物的鉴定
在上述实施例3制得的发酵液中加入同体积的无水乙醇及总体积1.5％的盐酸，缓慢搅拌，静止30min后滤去发酵液获得絮状发酵产物。发酵产物冷冻干燥。取1～2mg干燥后的发酵产物与200mg烘干的KBr(溴化钾)置于玛瑙研钵中研磨均匀，模具中压成透明薄片，在傅里叶红外光谱仪上测定产物的红外光谱图。
请参阅图1为本发明黑附球菌L1发酵产物和果胶标准品的红外光谱图，所述黑附球菌L1发酵产物与果胶标准品的红外光谱图基本一致。红外光谱图不同之处在于果胶聚半乳糖醛酸主链上的侧链单糖所含的官能团不同所致。确定本发明黑附球菌L1发酵产物为果胶。
实施例5：黑附球菌L1发酵所产果胶的甲氧基含量测定
称取0.03g实施例4中获得的黑附球菌L1的固体发酵产物，加入100mL水。搅拌溶解后，加入1滴1％的酚酞试剂，用0.1mol/L的NaOH溶液滴定至溶液呈粉红色且保持半分钟以上不褪色。然后加入20mL 0.5mol/L的NaOH溶液，皂化2.5h，用1mol/L的硫酸标准溶液滴定，记录硫酸消耗的体积V，计算出甲氧基含量。
甲氧基含量(％)＝(C1V1-CV)×0.031/W×100
V1：皂化时加入的标准碱溶液的体积，mL
C1：皂化时加入的标准碱溶液的浓度，mol/L
V：滴定皂化过量的碱消耗的硫酸体积，mL
C：硫酸标准溶液浓度，mol/L
W：试样重量，g
0.031：甲氧基的克当量数
酯化度(％)＝甲氧基含量×100/16.3
本发明的黑附球菌L1的发酵产物果胶的甲氧基含量为9.2％，酯化度为59％，属于高酯果胶。
按照酯化度不同，通常把酯化度≥50％(甲氧基含量≥7％)的果胶称为高酯果胶；把酯化度<50％(甲氧基含量<7％)的果胶称为低酯果胶，不同酯化度的果胶有不同的应用方向。
高酯化度果胶的应用目前主要分为以下几个方面：在果酱、果子冻、果冻中起胶凝作用，可以使产品细腻，富有弹性和韧性；在棒冰、冰淇淋中加入起乳化稳定作用，产品口感细腻，滑爽；酸奶、乳酸菌、果汁中加入高酯果胶起稳定，增稠作用，可延长制品的保存期；烘焙时加入可提高面团的透气性，增强口感，延长保质期。
实施例6：黑附球菌L1菌株的鉴定
以下从形态学和分子生物学两个方面鉴定从加拿大一枝黄花成熟叶片中分离并纯化得到的内生真菌L1。
1、菌株平板形态观察
将本发明菌株接种在大麦芽汁固体培养基平板上，于28℃真菌培养箱内培养，观察菌落的形态。
请参阅图2为本发明黑附球菌L1的菌落形态图，所述黑附球菌L1的菌落形态为：菌落边缘平整，绒毛状；初始菌丝为白色，后期逐渐变为黄褐色。
2、菌株显微形态观察
用灭菌镊子夹取少量菌丝体涂于载玻片上，显微镜下观察本发明菌株L1的显微形态。
请参阅图3为本发明黑附球菌L1的显微形态图，所述黑附球菌L1的显微形态(16×40高倍显微镜)为：菌丝无色或淡黄色透明，呈管状，分枝，光滑，具有隔膜，间距不等。分生孢子在分生孢子梗顶端生出，褐色或黑色，有时培养中并不明显。
3、菌株的分子生物学鉴定
(1)DNA的提取
收集大麦芽汁液体培养基发酵10天的菌丝体。将菌丝体用液氮冷冻研磨后，用真菌基因组DNA提取试剂盒(厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司)提取总DNA。
(2)ITS区序列的PCR扩增
引物序列为：ITS1(5′–TCCGTAGGTGAACCTGCGC–3′)和ITS4(5′–TCCTCCGCTTATTGATATGC–3′)。
PCR反应体系为：去离子水18μL、10×Buffer 2.5μL、DNA模板2μL、dNTP各1μL、引物各0.5μL、Taq酶0.5μL。
PCR反应条件为：94℃预热3min，94℃变性40s，55℃退火30s，72℃延伸40s，共30个循环；72℃延伸10min。由PCR产物电泳结果切割所需DNA目的条带(电泳结果参见图4，该目的条带为530-540bp左右；)经DNA凝胶回收试剂盒(厂家：生工生物工程(上海)股份有限公司)纯化。扩增产物由生工生物工程(上海)股份有限公司完成测序。
本发明所述内生真菌ITS碱基序列为(SEQ ID NO：1)：
TCCGGCTTATTGATATGCTTAAGTTCAGCGGGTATCCC TACCTGATCCGAGGTCAAGAGTGTAAAAATGTACTTTTGGACGTCGTCGTTATGAGTGCAAAGCGCGAGATGTACTGCGCTCCGAAATCAATACGCCGGCTGCCAATTGTTTTAAGGCGAGTCTACACGCAGAGGCGAGACAAACACCCAACACCAAGCAGAGCTTGAAGGTACAAATGACGCTCGAACAGGCATGTCCCATGGAATACCAAGGGGCGCAATGTGCGTTCAAAGATTCGATGATTCACTGAATTCTGCAATTCACACTACTTATCGCATTTCGCTGCGTTCTTCATCGATGCCAGAACCAAGAGATCCGTTGTTGAAAGTTGTAACTATTATGTTTTTTCAGACGCTGATTGCAACTGCAAAGGGTTTGAATTTGTCCAATCGGCGGGCGGACCCGCCGAGGAAACGAAGGTACTCAAAAGACATGGGTAAGAGGTAGCAGACCGAAGTCTACAAACTCTAGGTAATGATCCTTCCGCAGGTTCACCTACGGA
(3)数据处理
序列数据在NCBI的Genbank中进行同源序列搜索比对，分析其同源性。将ITS序列提交至NCBI网页，通过BLAST同源性比对分析，结果显示：本发明菌株L1序列与黑附球菌(Epicoccum nigrum)的同源性达到99％以上。
综合传统形态学分类鉴定结果和现代分子生物学分类鉴定结果，最终鉴定该菌株为附球菌属(Epicoccum sp.)黑附球菌(Epicoccum nigrums)。
实施例7：黑附球菌L1最适产果胶培养基的筛选
将本发明黑附球菌L1菌株接种至大麦芽汁固体培养基平板上，28℃静止培养7d以活化菌株。取6块直径6mm菌块接种入含150mL马丁液体培养基、YPG液体培养基、察氏液体培养基和大麦芽汁液体培养基的三角瓶(250mL)中，28℃、120r/min条件下震荡发酵培养14d。测定发酵前后发酵液中可溶性糖含量和发酵液中果胶含量。
发酵前后发酵液中可溶性糖含量测定：吸取发酵液用蒸馏水适当稀释一定倍数。精密吸取稀释液各1mL，置于10mL试管中。然后向每支试管中加入5％的苯酚溶液各1mL，混合后，以先慢后快的流速悬空加入5mL浓硫酸，充分混匀后室温放置30min-40min直至冷却，在波长490nm下测定吸光度值。空白对照以蒸馏水代替发酵液，苯酚和浓硫酸的加入量不变。
以葡萄糖为标准品绘制可溶性糖标准曲线。
请参阅图5为本发明黑附球菌L1在马丁液体培养基、YPG液体培养基、察氏液体培养基和大麦芽汁液体培养基中发酵前后可溶性糖含量的变化。发酵液中可溶性糖含量在发酵14天后均下降，其中马丁液体培养基和大麦芽汁液体培养基下降幅度相近，分别为58.24％和56.74％，察氏液体培养基下降了44.36％，而YPG液体培养基仅下降13.98％。
发酵液中果胶含量测定：吸取发酵液用蒸馏水适当稀释一定倍数。试管中加入6mL浓硫酸，置冰水浴中边冷却边加入1mL发酵稀释液，充分混匀。冰水浴中冷却后在沸水浴中准确加热10min，用流水迅速冷却到室温。加入0.15％咔唑试剂0.5mL，室温下放置30min后在530nm波长下测定吸光度值。空白对照以蒸馏水代替发酵稀释液。
以半乳糖醛酸为标准品绘制标准曲线。
请参阅图6为本发明黑附球菌L1在马丁液体培养基、YPG液体培养基、察氏液体培养基和大麦芽汁液体培养基中发酵14d后发酵液中果胶的含量。发酵14d后YPG液体培养基中果胶含量最低，为0.341mg/mL，糖转化率也最低，为1.71％；大麦芽汁液体培养基中果胶含量最多，为1.916mg/mL，糖转化率也最大，为9.58％。
综合分析发酵14d前后发酵液中可溶性糖含量和发酵液中果胶含量二个指标，大麦芽汁液体培养基是最适本发明黑附球菌L1产果胶的发酵培养基。
马丁液体培养基、YPG液体培养基、察氏液体培养基和大麦芽汁液体培养基的配制同实施例2，区别在于1000mL培养基中去掉15g琼脂。
实施例8：大麦芽汁液体培养基中不同碳源对黑附球菌L1产果胶量的影响
将本发明黑附球菌L1菌株接种至大麦芽汁固体培养基平板上，28℃静止培养7d以活化菌株。取6块直径6mm菌块接种入含150mL不同碳源的大麦芽汁液体培养基的三角瓶(250mL)中，28℃、120r/min条件下震荡发酵培养14d。测定不同碳源的大麦芽汁液体培养基发酵后产果胶的量。
含不同碳源的大麦芽汁液体培养基：9000mL水中加入180g大麦芽，加热煮沸25min。四层纱布过滤，滤液中溶解9g蛋白胨，补水至9000mL，pH自然。将含蛋白胨的大麦芽滤液分成9份，每份1000mL。在每份大麦芽汁滤液中分别加入20g山梨醇、20g果糖、20g半乳糖、20g葡萄糖、20g木糖、20g麦芽糖、20g蔗糖、20g乳糖和20g淀粉。将每份大麦芽汁液体培养基分装在6个三角瓶(250mL)中，每瓶150mL。121℃高压蒸汽灭菌20min。
发酵后菌丝体的获得及干燥：将上述每份6瓶发酵液四层纱布过滤收集菌丝体，菌丝体在60℃烘箱中烘干至恒重，万分之一精密分析天平称重。
请参阅图7为黑附球菌L1在不同碳源的大麦芽汁液体培养基中发酵14d后菌丝体的干重。本发明黑附球菌L1在提供的等量的9种碳源的大麦芽汁液体培养基中均生长良好，淀粉碳源长势最佳，山梨醇、果糖、木糖、蔗糖和乳糖碳源相近，长势次之。
发酵后果胶的获得及干燥：将上述每份6瓶发酵液四层纱布过滤收集滤液，在滤液中加入同体积的无水乙醇及总体积1.5％的盐酸，缓慢搅拌，静止30min后过滤得絮状果胶。果胶在60℃烘箱中烘干至恒重，万分之一精密分析天平称重。
请参阅图8为黑附球菌L1在不同碳源的大麦芽汁液体培养基中发酵14d后生成的果胶干重。山梨醇碳源有利于菌株生长，但是果胶产量极少；其他8种碳源均有果胶生成，但果糖碳源果胶的生长量最大，淀粉碳源次之，半乳糖和蔗糖相当。
综合分析，本发明黑附球菌L1能以醇、单糖、寡糖和多糖为碳源，但仅能在糖碳源培养基中发酵产生果胶，且果糖碳源有利于果胶的生成。
实施例9：大麦芽汁液体培养基中不同氮源对黑附球菌L1产果胶量的影响
将本发明黑附球菌L1菌株接种至大麦芽汁固体培养基平板上，28℃静止培养7d以活化菌株。取6块直径6mm菌块接种入含150mL不同氮源的大麦芽汁液体培养基的三角瓶(250mL)中，28℃、120r/min条件下震荡发酵培养14d。测定含不同氮源的大麦芽汁液体培养基发酵后产果胶的量。
含不同氮源的大麦芽汁液体培养基：9000mL水中加入180g大麦芽，加热煮沸25min。四层纱布过滤，滤液中溶解180g果糖，补水至9000mL，pH自然。将含果糖的大麦芽滤液分成9份，每份1000mL。在每份大麦芽汁滤液中分别加入1g菜籽饼粉、1g花生饼粉、1g乙二胺四乙酸(EDTA)、1g氯化铵、1g尿素、1g蛋白胨、1g酵母浸膏、1g硝酸钾和1g甘氨酸。将每份大麦芽汁液体培养基分装在6个三角瓶(250mL)中，每瓶150mL。121℃高压蒸汽灭菌20min。
发酵后菌丝体的获得及干燥同实施例8。
请参阅图9为黑附球菌L1在不同氮源的大麦芽汁液体培养基中发酵14d后菌丝体的干重。本发明黑附球菌L1在提供的等量的9种氮源的大麦芽汁液体培养基中除EDTA氮源外均生长良好，菜籽饼粉氮源长势最佳，氯化铵、酵母浸膏、甘氨酸和花生饼粉氮源相近，长势次之。
发酵后果胶的获得及干燥同实施例8。
请参阅图10为黑附球菌L1在不同氮源的大麦芽汁液体培养基中发酵14d后生成的果胶干重。花生饼粉氮源产果胶量最大，其次是蛋白胨和酵母浸膏氮源，再次为菜籽饼粉和甘氨酸氮源；硝酸钾和EDTA氮源不利于果胶的产生。
综合分析，本发明黑附球菌L1能利用无机氮和有机氮为氮源生长，但有机氮更有利于果胶的产生，且花生饼粉为氮源时产生的果胶量最大。花生饼粉是花生油生产过程中的副产品，工业生产使用时可有效降低成本。
上述仅为本发明优选的实施例，并不限制于本发明。对于所属领域的技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施例来举例说明。而由此方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110>江苏科技大学
<120> 可液体发酵产果胶的加拿大一枝黄花内生真菌及其应用
<130> SG20170523001
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 542
<212> DNA
<213> 黑附球菌（Epicoccum nigrum）
<220>
<400> 1
tccggcttat tgatatgctt aagttcagcg ggtatcccta cctgatccga ggtcaagagt 60
gtaaaaatgt acttttggac gtcgtcgtta tgagtgcaaa gcgcgagatg tactgcgctc 120
cgaaatcaat acgccggctg ccaattgttt taaggcgagt ctacacgcag aggcgagaca 180
aacacccaac accaagcaga gcttgaaggt acaaatgacg ctcgaacagg catgtcccat 240
ggaataccaa ggggcgcaat gtgcgttcaa agattcgatg attcactgaa ttctgcaatt 300
cacactactt atcgcatttc gctgcgttct tcatcgatgc cagaaccaag agatccgttg 360
ttgaaagttg taactattat gttttttcag acgctgattg caactgcaaa gggtttgaat 420
gttgtccaat cggcgggcgg acccgccgag gaaacgaagg tactcaaaag acatgggtaa 480
gaggtagcag accgaagtct acaaactcta ggtaatgatc cttccgcagg ttcacctacg 540
ga 542
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ITS1
<400> 2
tccgtaggtgaacctgcgc 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> ITS4
<400> 3
tcctccgcttattgatatgc 20

Claims (10)

1.加拿大一枝黄花内生真菌，其特征在于，其分类命名为附球菌属L1（Epicoccumsp.L1），该菌株已于2016年7月4号保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2016365。
2.根据权利要求1所述的加拿大一枝黄花内生真菌，其特征在于，所述内生真菌ITS碱基序列如SEQ ID NO: 1所示。
3.权利要求1或2所述的加拿大一枝黄花内生真菌在生产果胶方面的应用。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述加拿大一枝黄花内生真菌通过液体发酵生产制备果胶。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述液体发酵培养基为马丁液体培养基、YPG液体培养基、察氏液体培养基和大麦芽汁液体培养基中的一种或几种。
6.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述液体发酵中的碳源为山梨醇、果糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖和淀粉中的一种或几种。
7.根据权利要求4或5所述的应用，其特征在于，所述液体发酵中的氮源为菜籽饼粉、花生饼粉、氯化铵、尿素、蛋白胨、酵母浸膏和甘氨酸中的一种或几种。
8.一种采用加拿大一枝黄花内生真菌液体发酵产果胶的方法，其特征在于，将权利要求1或2所述的加拿大一枝黄花内生真菌接种到固体培养基培养活化，然后接种到液体培养基发酵培养10~18天即得，所述液体培养基为大麦芽汁液体培养基，液体发酵中的氮源为菜籽饼粉、花生饼粉、氯化铵、尿素、蛋白胨、酵母浸膏和甘氨酸中的一种或几种。
9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述固体培养基为大麦芽汁固体培养基。
10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述发酵条件为：温度20-35℃，转速100-150r/min。
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CN102329738B (zh) * 2011-08-30 2013-01-16 东华大学 一种黑附球菌db3菌株及其制备和应用
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