CN102329738B - 一种黑附球菌db3菌株及其制备和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种黑附球菌DB3菌株及其制备和应用，其制备方法，包括：(1)将腐烂海草置于富集培养基中，室温静置培养，然后取富集培养基涂布于分离培养基中，30℃静置培养1～4天，获得野生型亚麻生物处理菌株；(2)将步骤(1)中得到的菌株接种到亚麻木质素营养培养基中，28℃培养72h；(3)从上述亚麻木质素营养培养基中选择出具有降解木质素能力的菌株，即得；该菌株可应用于过氧化物脱胶制备纺织用亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维工艺中。本发明的菌株生长周期短，菌种不易被污染，处理成本低，反应条件温和，抗污染能力强，耐热性能好，无环境污染，处理后纤维质量好；本发明的工艺简单、适合大规模工业化生产。

Description

一种黑附球菌DB3菌株及其制备和应用

技术领域

[0001] 本发明属于黑附球菌菌株及其制备和应用领域，特别涉及一种黑附球菌DB3菌株及其制备和应用。

背景技术

[0002] 麻是纺织原料之一，其品种主要有亚麻、苎麻、大麻、黄麻、红麻、罗布麻、剑麻、蕉麻、荨麻和苘麻等。麻纤维是从各种麻植物取得的纤维的统称，具有吸湿、透气、散热和抗菌等其他天然纤维无法比拟的优点。我国作为世界上麻类资源最丰富的国家之一，每年生产的麻纤维及其制品除满足国内市场的需求，还作为大宗商品出口美国、西欧及东南亚国家，年均创汇近百亿美元。在国家节能减排政策和消费者回归自然、追求绿色的消费观念推动下，麻类纤维绿色加工技术已经成为纺织领域的研究热点。

[0003] 亚麻、大麻、黄麻和红麻纤维的主要组成为纤维素，此外还有较多的半纤维素、果·胶和木质素等非纤维素物质包裹在麻纤维表面。这些胶质，特别是木质素等非纤维素物质胶结在纤维外面，使得原麻呈坚固的片条状。所以，原麻在纺纱过程中须通过一道脱胶过程去除木质素等胶质，以满足纺纱要求。目前，麻纺行业常用的煮练方法主要是化学方法，即利用强酸强碱对原麻或麻粗纱进行处理。化学处理工艺能耗大，设备损耗大、且排放的废水无法循环利用，污染问题严重。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种黑附球菌（Epicoccum nigrum)DB3菌株及其制备和应用，该菌株具有对亚麻、大麻、黄麻或红麻等韧皮纤维木质素降解的能力，其制备方法工艺简单，适合大规模工业化生产。

[0005] 本发明的一种黑附球菌（Epicoccum nigrum)DB3菌株,其18S rRNA基因序列，如下：

[0006] ACTTCGGTCTGCTACCTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACCTTCGTTTCCTCGGCGGGTC

[0007] CGCCCGCCGATTGGACAACATTCAAACCCTTTGCAGTTGCAATCAGCGTCTGAAAAA

[0008] ACATAATAGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACG

[0009] CAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA

[0010] ACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTAC[0011 ] CTTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGCCTCTGCGTGTAGACTCGCCTTA

[0012] AAACAATTGGCAGCCGGCGTATTGATTTCGGAGCGCAGTACATCTCGCGCTTTGCACT

[0013] CATAACGACGACGTCCAAAAGTACATTTTTACACTCTTGACCTCGGATCAGGTAGGGA

[0014] TACCCGCTGAACTTAAGCATATCA。

[0015] 上述的黑附球菌（Epicoccum nigrum) DB3菌株,特征如下：菌丝较粗而长,菌落较大，没有局限性，其菌落可扩展到整个培养皿，有的种则有一定的局限性，直径1-11厘米或更小；菌落质地一般比放线菌疏松，外观干燥，不透明，呈现或紧或松的蛛网状、绒毛状或棉絮状；菌落与培养基的连接紧密，不易挑取；菌落平展，初点状生长，棉絮状，白色，后期粉红色、红色、黄褐色或灰褐色，有时在一个菌落上可以同时产生几种颜色；土豆马铃薯培养基上，25°C下，2周直径3. 5-5. 5cm ;体视镜下清晰可见紧密着生在球形分生孢子座上的黑色分生孢子；菌丝体表生或埋生；菌丝无色或淡褐色，具隔膜，分枝或少数不分枝，光滑，宽I. 5-2. 5 μ m0分生孢子座垫状，有时培养中并不明显；分生孢子梗常短粗，直立或弯曲，0-2隔膜，光滑，无色或极淡褐色，3-5 X 1-2 μ m ;分生孢子从分生孢子梗顶端膨大处生出，初无色或极淡黄色，无隔膜，后黄褐色、褐色或黑色，球形、亚球形、梨形或有时形状不规则，表面密被疣突，具有网状的隔膜，直径9-19 μ m，基部细胞淡褐色，光滑；老熟孢子表面常具明显的疤状瘤突，隔膜不易看清。

[0016] 本发明的黑附球菌（Epicoccum nigrum) DB3菌株的保藏号为CGMCC No. 4687 ;保藏日为2011年3月17日，建议的分类命名为黑附球菌（Epicoccum nigrum),保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路I号院3号。

[0017] 根据18sR DNA测序（如图5、图6)Blast及聚类分析结果，该菌与黑附球菌相似性为99%,结合生理生化试验结果和镜检分析,命名此菌株为黑附球菌（Epicoccum nigrum)DB3菌株。

[0018] 本发明的一种黑附球菌DB3菌株的制备方法，包括：

[0019] (I)将腐烂海草按Ig ： 20ml的比例置于富集培养基中室温静置培养30天，然后取O. Iml富集培养基涂布于分离培养基中，30°C静置培养I〜4天，获得野生型亚麻生物处理优势菌株；

[0020] (2)将步骤（I)中得到的菌株接种到亚麻木质素营养培养基中，28°C培养72h ；

[0021] (3)从上述亚麻木质素营养培养基中选择出具有降解木质素能力的菌株。

[0022] 所述步骤（I)中的富集培养基配方为：亚麻粉5g，自来水200ml，pH自然；分离培养基配方为：亚麻粉 5g, (NH4)2SO4 5g，K2HPO4 lg, MgSO4 O. 5g，KCl O. 5g，FeSO4 0. 01，琼脂20g,水 IOOOmL,用 NaOH 将 pH 调节到 7-7. 2。

[0023] 所述步骤（2)中的亚麻木质素营养培养基的组分包括：亚麻木质素2g，NaNO3 3g，K2HPO4 0. 5g，MgSO4 lg,琼脂 20g,水 IOOOmL,用 NaOH 将 pH 调节到 7-7. 2。

[0024] 本发明的一种黑附球菌DB3菌株在过氧化物脱胶制纺织用亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维工艺中的应用。

[0025] 所述的应用步骤，包括：

[0026] (I)将黑附球菌DB3菌株保存于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，30°C 220rpm培养48h，添加冻存缓冲液；冻存缓冲液由磷酸二氢钾0. 0627g，磷酸氢二钾0. 0177g，柠檬酸钠0. 0588g，七水合硫酸镁0. 02645g，甘油10ml，加水定容至IOOml制得；

[0027] (2)在灭菌冷却后的50mL马铃薯葡萄糖培养基中，接入步骤⑴所得的菌一环，在转速220r/min、温度30°C条件下摇瓶培养48h ；

[0028] (3)将步骤⑵所得的培养基种入亚麻木质素发酵培养基5L，在转速220r/min、温度30°C条件下摇瓶培养48h得到发酵菌液；其中，亚麻发酵培养基配方为：亚麻原麻木质素5g，KCl 0.05g，磷酸氢二钾 0. lg，MgSO4 0. 05g, FeSO4 0. 001g，(NH4)2SO4 0. 5g，补水至 100ml

定容；

[0029] (4)将灭菌后的亚麻、大麻、黄麻或红麻原料与步骤（3)所得发酵菌液按浴比I ： 20混合，在30°C，160-220rpm摇床中分别处理I〜4天，处理时间到时，除去发酵液，得到亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维；

[0030] (5)将上述亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维和含有过氧化物的脱胶液混合，在30-10(TC温度下处理1-5小时，然后水洗，按常规的方法上油，干燥，即得到可供纺织用的纤维；其中亚麻、大麻和黄红麻纤维对脱胶液的重量比为I : 8-1 ： 25，脱胶温度为70-100°C，时间为1-8小时。

[0031] 步骤（4)中所述的亚麻、大麻、黄麻或红麻原料为麻的原茎、纱线或织物。

[0032] 步骤（5)中所述的脱胶液是由过氧化物脱胶剂、螯合剂、氢键破坏剂和水组成；其中过氧化物脱胶剂、螯合剂和氢键破坏剂之和与脱胶溶液的重量比1:8-1: 25。

[0033] 步骤（5)中所述的过氧化物脱胶剂为过氧化氢、过硫酸钾、过硫酸钠、过硫酸铵、过碳酸钾、过碳酸钠、过碳酸铵、过硼酸钾、过硼酸钠或过硼酸铵，其用量为亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维重量的O. 25-8%。·

[0034] 步骤（5)中所述的螯合剂是磷酸钠、三聚磷酸钠，偏磷酸钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、柠檬酸、乙二胺四乙酸二钠的一种或几种，其用量为亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维重量的O. 1-4% ;氢键破坏剂是尿素，其用量为亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维重量的O. 05-2%。

[0035] 本发明的菌株的DNA进行PCR扩增，选用真菌18S rRNA基因通用引物序列（5-ATTGGA GGG CM GTC TGG TG-3 和 5-CCG ATC CCT AGT CGG CAT AG-3);进而测得菌株 18S rTNA全序列，如下：

[0036] ACTTCGGTCTGCTACCTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACCTTCGTTTCCTCGGCGGGTC

[0037] CGCCCGCCGATTGGACAACATTCAAACCCTTTGCAGTTGCAATCAGCGTCTGAAAAA

[0038] ACATAATAGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACG

[0039] CAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA

[0040] ACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTAC

[0041] CTTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGCCTCTGCGTGTAGACTCGCCTTA

[0042] AAACAATTGGCAGCCGGCGTATTGATTTCGGAGCGCAGTACATCTCGCGCTTTGCACT

[0043] CATAACGACGACGTCCAAAAGTACATTTTTACACTCTTGACCTCGGATCAGGTAGGGA

[0044] TACCCGCTGAACTTAAGCATATCA。

[0045] 在构建的培养条件下，该菌株培养条件粗放，耐热性好，生长繁殖快，可以有效去除亚麻、大麻和黄红麻纤维中的木质素等胶质，且酶活稳定，菌、酶均无毒性。该菌株及培养系统能够直接用于亚麻脱胶。

[0046] 菌种前处理或处理后，实用环境友好型过氧化物进行灭活处理，以替代传统的沸水灭活工艺，以节约用水；同时利用灭活工艺中过氧化物的强氧化性对菌种处理后的麻试样进行精炼和漂白处理，以进一步优化工艺，节能减排。

[0047] 本发明的菌株具有对亚麻、大麻和黄红麻等韧皮纤维木质素降解的能力，能应用于韧皮纤维表面改性。本发明提供菌株及培养系统能够直接用于亚麻、大麻和黄红麻等韧皮纤维纺织加工的生物前处理。本发明提供菌株具有生长周期短，菌种不易被污染，处理成本低，处理后纤维质量好，脱胶条件温和，抗污染能力强，耐热性能好，无环境污染等优点；与现有技术相比，本发明具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点，对于探索黑附球菌在大规模生产条件下进行韧皮纤维表面改性和纺织加工前木质素去除的生物前处理具有重要意义。

[0048] 有益效果

[0049] (I)本发明提供菌株及培养系统，经检测可同时高产果胶酶和半纤维素酶，能够直接用于亚麻脱胶，具有脱胶周期短，纤维分散率达100 %，对亚麻脱胶效果良好，脱胶效率达95%，菌种不易被污染，处理成本低，纤维质量好，脱胶条件温和，抗污染能力强，耐热性能好，无环境污染等优点；

[0050] (2)本发明具有工艺简单、适合大规模工业化生产等特点。利用该体系进行亚麻脱胶具有脱胶时间短,亚麻纤维分散率达到100%，脱胶率达到90%以上，精干麻质量好。

附图说明

[0051] 图I为显微镜染色照片（油镜）；·[0052] 图2为土豆马铃薯培养基菌落照片；

[0053] 图3为真菌处理过程照片；

[0054] 图4为处理后亚麻纤维照片；

[0055] 图5和图6为黑附球菌DB3菌株的18SrDNA序列。

具体实施方式

[0056] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

[0057] 实施例I

[0058] 亚麻脱胶菌种的筛选获得

[0059] (I)从东海舟山海域取样腐烂海草，先将海草与富集培养基按Ig ： 20ml的比例于富集培养基中室温静置培养30天，然后取O. Iml富集培养基涂布于分离培养基，30°C静置培养I〜4天，获得野生型亚麻生物处理优势菌株；

[0060] 其中，富集培养基配方为：亚麻粉5g,自来水200ml, pH自然；分离培养基配方为：亚麻粉 5g，(NH4)2SO4 5g，K2HPO4 lg, MgSO4 O. 5g, KCl O. 5g, FeSO4 0· 01，琼脂 20g，/KIOOOmL,用 NaOH 将 pH 调节到 7-7. 2 ；

[0061] (2)将步骤（I)中得到的菌株接种到亚麻木质素营养培养基中，28°C培养72h。亚麻木质素营养培养基，其组分包括：亚麻木质素2g，NaNO3 3g，K2HPO4 O. 5g，MgSO4 lg，琼脂20g,水 IOOOmL,用 NaOH 将 pH 调节到 7-7. 2 ；

[0062] (3)从上述培养基中选择出具有降解木质素能力的菌株。

[0063] 实施例2

[0064] 发酵菌液的制备：

[0065] (I)链格孢DB2菌株保存于马铃薯葡萄糖琼脂培养基，300C 220rpm培养48h，添加冻存缓冲液；冻存缓冲液由磷酸二氢钾0. 0627g，磷酸氢二钾0. 0177g，柠檬酸钠0. 0588g,七水合硫酸镁0. 02645g，甘油10ml，加水定容至IOOml制得；

[0066] (2)在灭菌冷却后的50mL马铃薯葡萄糖培养基中，接入步骤⑴所得的菌一环，在转速220r/min、温度30°C条件下摇瓶培养48h ；

[0067] (3)将步骤（2)所得的培养基接种入亚麻木质素发酵培养基5L，在转速220r/min、温度30°C条件下摇瓶培养48h得到发酵菌液；其中，亚麻发酵培养基配方为：亚麻原麻木质素 5g，KCl 0.05g，磷酸氢二钾 O. lg，MgS04 O. 05g, FeSO4 O. OOlg, (NH4)2SO4 0.5g，补水至IOOml定容。

[0068] 实施例3

[0069] 亚麻脱胶工艺如下：

[0070] 将5g亚麻原茎置入250ml三角瓶，以亚麻原茎与实施例2的发酵菌液按浴比I ： 20分装于三角瓶中，装液量为100ml，在40°C，200rpm摇床中分别脱胶I天；脱胶时间 到时，除去脱胶液，停止生物处理。将生物处理后的亚麻原茎进行灭活处理，其工艺为：生物处理后的亚麻原茎和脱胶液以I : 10的比例混合，并在70°C的条件下处理3小时，其中过氧化物的用量为亚麻原茎的3%，尿素用量为亚麻原茎的O. 05%，三聚磷酸钠的用量为亚麻原茎的2%，乙二胺四乙酸二钠的用量为亚麻原茎的O. 1%。脱胶后可制的2130支的纺织用亚麻纤维。

[0071] 实施例4

[0072] 大麻织物生物处理工艺如下：

[0073] 将5g灭菌后的大麻织物置入250ml三角瓶，以大麻织物与实施例2的发酵菌液按浴比I : 20分装于三角瓶中，装液量为100ml，在35°C，200rpm摇床中分别脱胶2天；脱胶时间到时，除去脱胶液，停止生物处理。将生物处理后的大麻织物进行灭活处理，其工艺为：生物处理后的大麻织物和脱胶液以I : 25的比例混合，并在90°C的条件下处理I小时，其中过氧化物的用量为大麻织物重量的5%，尿素用量为大麻织物重量的I %，磷酸氢二钠的用量为大麻织物重量的2%，磷酸二氢钠的用量为大麻织物重量的2%。脱胶后制备的纺织用大麻织物手感柔软、白度高、刺痒感显著降低。

[0074] 实施例5

[0075] 黄麻粗线煮练工艺如下：

[0076] 将5g灭菌后的黄麻纱线置入250ml三角瓶，以黄麻纱线与实施例2的发酵菌液按浴比I : 20分装于三角瓶中，装液量为100ml，在40°C，200rpm摇床中分别脱胶4天；脱胶时间到时，除去脱胶液，停止生物处理。将生物处理后的黄麻纱线进行灭活处理，其工艺为：生物处理后的黄麻纱线和脱胶液以I : 8的比例混合，并在100°C的条件下处理8小时，其中过氧化物的用量为黄麻纱线重量的8%，尿素用量为黄麻纱线重量的2%，偏磷酸钠的用量为黄麻纱线重量的2%，乙二胺四乙酸二钠的用量为黄麻纱线重量的2%，三聚磷酸钠的用量为黄麻纱线重量的2%。脱胶后可制的760支的纺织用黄麻纱线。

[0077] 实施例6

[0078] 亚麻纱线煮练工艺如下：

[0079] 将5g灭菌后的亚麻纱线（亚麻粗纱或亚麻二粗）置入250ml三角瓶，以亚麻纱线与实施例2的发酵菌液按浴比I : 20分装于三角瓶中，装液量为100ml，在40°C，200rpm摇床中分别脱胶I天；脱胶时间到时，除去脱胶液，停止生物处理。将生物处理后的亚麻纱线进行灭活处理，其工艺为：生物处理后的亚麻纱线和脱胶液以I : 15的比例混合，并在90°C的条件下处理2小时，其中过氧化物的用量为亚麻纱线的2%，尿素用量为亚麻纱线的O. 05%，三聚磷酸钠的用量为亚麻纱线的2%，磷酸钠的用量为亚麻纱线的I %。脱胶后可制的1530支的纺织用亚麻纱线。·

Claims (2)

1. 一种黑附球菌（Epicoccum nigrum)DB3菌株,该菌株的保藏号为CGMCC No. 4687,其18S rRNA基因序列，如下： ACTTCGGTCTGCTACCTCTTACCCATGTCTTTTGAGTACCTTCGTTTCCTCGGCGGGTC CGCCCGCCGATTGGACAACATTCAAACCCTTTGCAGTTGCAATCAGCGTCTGAAAAA ACATAATAGTTACAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACG CAGCGAAATGCGATAAGTAGTGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGA ACGCACATTGCGCCCCTTGGTATTCCATGGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTGTAC CTTCAAGCTCTGCTTGGTGTTGGGTGTTTGTCTCGCCTCTGCGTGTAGACTCGCCTTA AAACAATTGGCAGCCGGCGTATTGATTTCGGAGCGCAGTACATCTCGCGCTTTGCACT CATAACGACGACGTCCAAAAGTACATTTTTACACTCTTGACCTCGGATCAGGTAGGGA TACCCGCTGAACTTAAGCATATCA。

2.如权利要求I所述的一种黑附球菌DB3菌株在过氧化物脱胶制备纺织用亚麻、大麻、黄麻或红麻纤维的工艺中的应用。