CN114032179B - 一株产cbd的工业大麻内生真菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

一株产CBD的工业大麻内生真菌及其应用，涉及微生物领域，尤其涉及一株工业大麻内生真菌及其应用。是要解决现有产CBD的方法难以满足市场需求的问题。该内生真菌为极细链格孢菌HMJ01。保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2021年8月26日，保藏编号为CCTCC M20211091。本发明的工业大麻内生真菌能够抑制细菌活性，且能够发酵产大麻二酚。本发明应用于微生物发酵产大麻二酚领域。

Description

一株产CBD的工业大麻内生真菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，尤其涉及一株工业大麻内生真菌及其应用。
背景技术
大麻二酚CBD作为工业大麻中的非成瘾性成分，是CB1和CB2受体的拮抗剂，不仅可以有效改善THC对机体产生的致幻作用，还以其独特的精神作用及抗肿瘤等方面的活性，吸引了众多学者的关注，现已逐渐成为食品、药品领域中的明星化合物。
关于CBD的生产，最初是采用柱色谱等分离技术从工业大麻原料中直接进行提取分离，但这样的提取分离工艺路线复杂，不利于工业化生产，且上述工艺均为从高CBD、低THC的工业大麻种子资源中直接提取，所生产的CBD，产率较低，难以满足市场的需求。
随着对CBD需求量的增加，研究学者开始致力于CBD的化学合成。但CBD的纯度不高，而且还有副产物生成。
发明内容
本发明是要解决现有化学合成CBD的方法难以满足市场需求的问题，提供一株产CBD的工业大麻内生真菌及其应用。
本发明提供一株工业大麻内生真菌，为极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)HMJ01。保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2021年8月26日，保藏编号为CCTCC NO：M20211091。
本发明极细链格孢菌HMJ01在PDA平板培养基上菌落初期灰白色，后变为黑色，菌丝密集，絮状，基质褐色，生长迅速。
本发明极细链格孢菌HMJ01为好氧菌，能够在PDA培养基上生长，最适生长温度为28℃，最适pH值自然。
本发明极细链格孢菌HMJ01通过ITS序列比对分析，与Alternaria tenuissimaMZ351314的相似性达到了99％。通过结合菌体形态特征、生长条件、生理生化特征和分子鉴定结果确定，本发明的工业大麻内生真菌HMJ01属于极细链格孢菌(Alternariatenuissima)。
本发明还提供极细链格孢菌HMJ01在抑制细菌活性中的应用。
进一步的，所述细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、单增李斯特菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌和粪肠球菌。
进一步的，极细链格孢菌HMJ01对屎肠球菌的抑菌圈直径可达10.50±0.30。
本发明还提供极细链格孢菌HMJ01在发酵产CBD中的应用。
本发明的有益效果：
本发明工业大麻内生真菌为极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)HMJ01，极细链格孢菌HMJ01对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、单增李斯特菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌和粪肠球菌均有一定的抑菌活性作用，其中对屎肠球菌抑菌效果最强，对屎肠球菌的抑菌圈直径可达10.50±0.30。同时本发明极细链格孢菌HMJ01的发酵液中含有大麻二酚CBD，为采用HMJ01菌株发酵的方法生产CBD奠定了基础。
附图说明
图1为工业大麻内生真菌HMJ01的菌落形态图；
图2为工业大麻内生真菌HMJ01的菌丝形态图；
图3为工业大麻内生真菌HMJ01的PCR扩增产物电泳图；
图4为工业大麻内生真菌HMJ01的系统发育树；
图5为工业大麻内生真菌HMJ01发酵液的HPLC图谱。
具体实施方式
下面对本发明的实施例做详细说明，以下实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方案和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1：
本实施例工业大麻内生真菌，为极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)HMJ01。保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是武汉市武汉大学，保藏日期为2021年8月26日，保藏编号为CCTCC NO：M20211091。
本实施例工业大麻内生真菌HMJ01的获取方法为：
(1)材料预处理：于黑龙江省农业科学院绥化分院科技创新农场内，取健康工业大麻(龙大麻5号)茎，冲洗干净后放置阴凉处晾干，无菌刀切成5cm小段，备用。
(2)表面消毒：在75％酒精中浸泡1min，然后置于6％NaClO中漂洗10min，接着用75％酒精浸泡1min，之后无菌水冲洗3次。确保实验操作不引入外源菌，消毒剂应尽量不破坏内生菌群，尽可能多地分离出内生菌。
(3)内生菌分离：将消毒后的实验材料两端各切除1cm后，用无菌手术刀切割成0.5cm的小块，置于PDA培养基中，于28℃与恒温培养箱中培养5-7d；
(4)阴性对照：取最后一次无菌水冲洗液涂布培养平板，或取适量此冲洗液倒入PDA培养基内作对照；另外在相同条件下，将消毒之后的实验材料于培养平板上滚动培养一周，作为对照。
实施例2：工业大麻内生真菌HMJ01的理化特征和分子鉴定
参阅《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》，观察菌株HMJ01于PDA平板培养基(28℃，7d)上菌落形状，颜色，浓密程度，基内菌丝形态及是否产色素等；同时，取HMJ01 PDA平板(培养时间：2d)，将无菌盖玻片倾斜扦入该平板中，继续培养5d后，取出，镊取盖玻片，置于显微镜下观察，初步确定菌株的分类地位。
将HMJ01菌种划线接种于PDA平板上培养5d，从菌落上挑取适量的菌丝，转接到50mLPDA培养基中，28℃，120r/min摇床培养4d。待菌丝长到适量时，抽滤发酵液得菌丝体，25％乙醇漂洗2次，灭菌的去离子水冲洗2次，离心去上清液，冷冻干燥，低温保存备用。
(1)取低温保存备用的菌丝体10mg置于研钵中，加液氮研磨成粉末，加1.5mL离心管中。加入200μL Buffer Digestion和2μL巯基乙醇，再加入20μL Proteinase K溶液，震荡混匀，56℃水浴1h至细胞完全裂解。
(2)加入100μL Buffer PF，充分颠倒混匀，-20℃放置5min。
(3)室温10,000rpm离心5min，将上清转移到1.5mL离心管中。
(4)加入200μL Buffer BD，充分颠倒混匀。
(5)加入200μL无水乙醇，充分颠倒混匀。
(6)将吸附柱放入吸附管中，用移液器将溶液及半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再室温10,000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液。
(7)将吸附柱放回收集管，加入500μL PW solution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。
(8)将吸附柱放回收集管，加入500μL Wash solution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。
(9)将吸附柱重新放回收集管，于12,000rpm室温离心2min，离去残留的Washsolution。
(10)取出吸附柱，放入一个新的1.5mL离心管中，加入50μL TE Buffer静置3min，12,000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。
采用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒(上海生工生物工程股份有限公司生产)，提取纯培养后的内生真菌HMJ01菌悬液DNA(-20℃下保存)；PCR扩增，PCR反应体系见表1，反应程序见表2。通用引物ITS1和ITS4(上海生工生物工程股份有限公司合成)序列如下：
ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’
ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’
表1 PCR反应体系
反应成分 体积
10×PCR Buffer 2.5μL
dNTP(each 10mM) 0.5μL
Taq Plus DNA Polymerase(5U/μl) 0.5μL
50mM MgSO4 2μL
引物F(10μM) 1μL
引物R(10μM) 1μL
Template(DNA) 1μL
ddH2O 16.5μL
Total 25μL
表2 PCR循环条件
Figure BDA0003282035140000041
工业大麻内生真菌HMJ01的分离结果：
从健康的工业大麻茎中分离出内生真菌HMJ01，并且阴性对照中对照平板和对照液体培养基内均无任何菌长出，多次重复均如此，证明所分到的菌是植物内生真菌，而不是表面的附生菌。
菌种鉴定结果：
对工业大麻内生真菌HMJ01菌落形态及菌丝进行形态学观察，菌落初期灰白色，后变为黑色，菌丝密集，絮状，基质褐色，生长迅速。结果如图1和图2所示。
采用上海生工Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取工业大麻内生真菌HMJ01DNA并进行扩增，在500bp附近得到一扩增片段，结果如图3，图3中泳道1为Mark，泳道2为内生真菌HMJ01。
上海生工生物工程公司对菌株HMJ01的测序结果见表3所示。
表3菌株HMJ01的ITS序列
Figure BDA0003282035140000051
将测序结果利用BLAST分析并与GenBank中的序列进行比对，然后用MEGA7软件构建内生真菌HMJ01的系统发育树，工业大麻内生真菌HMJ01系统发育树的构建结果见图4。可知，该内生真菌HMJ01与Alternaria tenuissima MZ351314的相似性达到了99％。可以初步判断内生真菌HMJ01属于极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)。
参照《真菌分类学》、《真菌鉴定手册》和《半知菌属图解》，结合生理生化特征和测序结果，鉴定内生真菌HMJ01为极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)，命名为极细链格孢菌(Alternaria tenuissima)HMJ01。
实施例3：抑菌活性实验
一、采用牛津杯法。以11株菌为供试菌，分别以100μg/mL链霉素和制霉素溶液作为阳性对照、甲醇为阴性对照，对内生菌发酵液的抑菌活性进行研究。
11种供试菌株：金黄色葡萄球菌(StapHlococcus aureus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、单增李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、粪肠球菌(Enterococcus facalis)、屎肠球菌(Enterococcus faecium)、大肠杆菌(Escherichia coli)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baummanii)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、白假丝酵母(Candida albicans)，均购于黑龙江省微生物研究所。
二、抑菌试验用培养基：
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g，蛋白胨10g，NaCl 5g，琼脂粉16g，水1000mL；加热至所有药品溶化后，定容至1000mL，调节pH7.0-7.2，121℃高压灭菌30min。
马铃薯培养基(PDA)：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂粉16g，水1000mL；马铃薯去皮，切成小块煮沸30min，用6层纱布过滤，再加入糖及琼脂，加热溶化后，定容至1000mL，pH自然，121℃高压灭菌30min。
三、发酵液的制备：
用接种环挑取活化的工业大麻内生真菌的菌丝，接种于含有50mL PDB培养基的三角瓶中，于28℃，120r/min摇床培养3d，制成1×107CFU/mL种子培养液。将种子培养液(1×107CFU/mL)以20％的装液量接种于装有300mL PDB培养基的锥形瓶中，于28℃120r/min摇床培养14d，抽滤，滤液加3倍体积的95％乙醇醇沉，滤去沉淀后，50℃减压浓缩至近干，用1mL甲醇溶解，作为供试品溶液备用。
四、含试验菌株平板的制作：
将活化后的10株受试细菌接于含有NA培养基试管平面上，于37℃恒温培养24h；1株真菌接于含有PDA固体培养基的试管平面上，于28℃恒温培养3d。取培养好的试管斜面加入无菌水5mL，振荡至所有菌体混悬于无菌水中，滴一滴放在血球计数器载玻片与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下进行计数，然后稀释到菌体浓度为1×107CFU/mL，得到菌悬液；再按每100mL培养基中加入1mL菌悬液的比例向50℃培养基中加入菌悬液，混匀后，迅速的分装到灭菌后的空平板(放入牛津杯)中，冷却，成含菌平板，备用。
五、抑菌实验：
取内生菌发酵液、空白对照品液、阳性对照液各150μL加入到上述平板的孔径中，将含有受试细菌的平板水平放置于37℃恒温箱中培养，24h后测量抑菌圈直径；将含有受试真菌的平板水平放置于28℃恒温箱中培养，3d后测量抑菌圈直径。
抑菌活性实验结果：
以10株致病细菌和1株致病真菌为指标，对供试品溶液进行抑菌活性测定，其结果如表4。
表4工业大麻内生真菌HMJ01发酵液抑菌活性结果
Figure BDA0003282035140000071
注：指示菌：A：大肠杆菌；B：枯草芽孢杆菌；C：金黄色葡萄球菌；D：短小芽孢杆菌；E：铜绿假单孢菌；F：单增李斯特菌；G：肺炎克雷伯菌H：鲍曼不动杆菌；I：屎肠球菌；J：粪肠球菌；K：白假丝酵母。
从表4可以看出，工业大麻内生真菌HMJ01对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、单增李斯特菌、肺炎克雷伯菌以及屎肠球菌和粪肠球菌均有一定的抑菌活性作用，其中对屎肠球菌抑菌效果最强。
实施例4：工业大麻内生真菌HMJ01次生代谢产物分析
一、对照品溶液的制备
称取大麻二酚(CBD)对照品用甲醇稀释溶解，制成质量浓度为0.5mg/mL对照品溶液，备用。
二、供试品溶液的制备
挑取已活化的工业大麻内生真菌HMJ01的菌丝，接种于50mL PDB培养基中，于28℃，120r/min摇床培养3d，制成1×107CFU/mL种子培养液。将种子培养液(1×107CFU/mL)以2％(v/v)的装液量接种于装有300mL PDB培养基的锥形瓶中，于28℃120r/min摇床培养14d，抽滤，50℃减压浓缩至近干，用1mL甲醇溶解，作为供试品溶液备用。
三、空白对照品溶液的制备：
取PDB培养液同“供试品溶液制备”操作后，作为空白对照品液。
色谱条件：
色谱柱：Venusil XBP-C18柱(柱4.6mm×250mm，5μm，USA)；
流动相：甲醇-水(78:22)；
流速：1mL/min；
柱温：25℃；
检测波长：220nm；
进样量：10μL。
四、工业大麻内生真菌HMJ01次生代谢产物分析结果
工业大麻内生真菌HMJ01发酵液次生代谢产物HPLC分析结果见图5。图5中A表示大麻二酚(CBD)标准品，B表示内生真菌HMJ01发酵液样品，C表示PDB空白样品。
从图5可以看出，在工业大麻内生真菌HMJ01发酵液中含有CBD，阴性对照无干扰。说明工业大麻HMJ01为CBD产生菌。
上述研究说明工业大麻内生真菌HMJ01不仅具有较好的抑菌活性，还是CBD产生菌，为采用HMJ01菌株发酵的方法生产CBD奠定了基础。

Claims (3)

1.一株产CBD的工业大麻内生真菌，其特征在于该内生真菌为极细链格孢菌（Alternaria tenuissima）HMJ01，保藏编号为CCTCC NO：M20211091。
2.如权利要求1所述极细链格孢菌HMJ01在抑制细菌活性中的应用；所述细菌为大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单孢菌、单增李斯特菌、肺炎克雷伯菌、屎肠球菌和粪肠球菌。
3.如权利要求1所述极细链格孢菌HMJ01在发酵产CBD中的应用。
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