CN104630076B - 高产淀粉酶紫色红曲霉（Monascus purpureus）Mp‑42菌株及其应用 - Google Patents
高产淀粉酶紫色红曲霉（Monascus purpureus）Mp‑42菌株及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产淀粉酶的紫色红曲霉Mp‑42菌株及其应用。本发明的Mp‑42菌株具有高产淀粉酶，生长速度快、产孢量多等优良特性。在发酵培养基初始pH为6.0，培养温度为30℃条件下，Mp‑42菌株淀粉酶酶活可达168 U/mL~178 U/mL。红曲霉在食品药品生产中已获得了长期的实践证明，其生产和应用均不存在安全隐患，Mp‑42菌株可用于淀粉酶的生产、食品加工和酿酒制醋等，为以后工业发酵生产和应用提供优良菌种。
Description
技术领域
本发明属于生物技术微生物领域，涉及1株液体发酵生产淀粉酶的紫色红曲霉Mp-42菌株及其应用。
背景技术
红曲霉（Monascus）是我国重要的食用、药用真菌，是传统中药红曲的基原菌，也是制作传统饮品红曲酒的主要菌种，在我国已有上千年的应用历史。被广泛应用于食品发酵、食品着色、中药配伍等方面。红曲霉在生长过程中能产生多种酶，如淀粉酶、糖化酶、蛋白酶、脂肪酶等。淀粉酶是水解淀粉和糖原酶类的总称，是一类重要的工业用酶，可用于如淀粉类食品或肉类制品生产加工过程，淀粉酶可以将淀粉水解形成糊精、低聚糖和葡萄糖等低分子物质，可改善制品的风味，生成的葡萄糖的产物又可以进一步异构化成果糖，得到商品化的高果糖浆；淀粉酶还能水解淀粉生产糖浆，利用如稻米和高粱等含淀粉的谷物及土豆来生产乙醇和酒类等。
发明内容
本发明的一个目的是提供1株高产淀粉酶红曲霉（Monascus purpureus）Mp-42菌株。本发明所涉及的紫色红曲霉Mp-42菌株具有高产淀粉酶，生长速度快、产孢量多等优良特性。本发明的第二个目的是提供上述的Mp-42菌株的应用。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
本发明所述紫色红曲霉（Monascus purpureus）Mp-42菌株，保藏编号为：CCTCC M2014675，保藏地为：中国典型培养物保藏中心，保藏日期为：2014年12月29日。
本发明Mp-42菌株的菌落特征：PDA培养基上的菌落初期为白色绒毛状，4 d后中心菌丝开始变红色，气生菌丝密而短小，培养15 d后色泽变为橘红色，边缘呈白色，菌落直径达54 mm（附图1）；在淀粉分离培养基上30 ℃培养7 d后，菌落直径为2.58 cm，添加碘液染色，菌落透明圈大小为1.85 cm，在淀粉分离培养基上菌落呈辐射状、裂纹比较密集，边缘光滑呈淡褐色，皮膜状，正面从里到外颜色均为淡黄，微微隆起（附图2）。
Mp-42菌株的显微特征：显微镜观察菌丝光滑，有隔膜，直径4~6 μm的分支状，有深浅不一的红褐色色素颗粒；分生孢子球形或倒梨形，单生或成链，直径5~8 μm；闭囊壳呈球形，囊内孢子可见，子囊孢子椭球形，直径4~7 μm，透明淡红色或无色（附图3）。
Mp-42菌株的生理生化特征：该菌株适宜生长温度范围为26℃~38℃，适宜pH生长范围为4.0~8.0。能够很好的利用各种有机碳源，如可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖、番薯粉等；在氮源利用方面，可利用硝酸钠、氯化铵、硝酸铵等无机氮源和牛肉膏、酵母粉、蛋白胨等多种有机氮源；Mp-42菌株能够高产淀粉酶。
ITS基因序列分析结果表明，其长度为604 bp（附图4），与紫色红曲霉的相似度达99%（附图5）。根据Mp-42形态特征，结合李钟庆和郭芳红曲菌分种检索表，将Mp-42菌株鉴定为紫色红曲霉（Monascus purpureus）。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
上述的紫色红曲霉Mp-42菌株用于生产淀粉酶中的应用。
作为优选，所述的生产的有机碳源采用可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和番薯粉中的一种或多种；氮源采用硝酸钠、氯化铵、硝酸铵、牛肉膏、酵母粉和蛋白胨中的一种或多种。
作为优选，所述的生产的温度范围为26℃~38℃，pH范围为4.0~8.0。作为最优选，所述的生产的pH为6.0，温度为30℃。
本发明的Mp-42菌株具有高产淀粉酶，生长速度快、产孢量多等优良特性。在发酵培养基初始pH为6.0，培养温度为30℃条件下，Mp-42菌株淀粉酶酶活可达168 U/mL~178 U/mL。红曲霉在食品药品生产中已获得了长期的实践证明，其生产和应用均不存在安全隐患，Mp-42菌株可用于淀粉酶的生产、食品加工和酿酒制醋等，为以后工业发酵生产和应用提供优良菌种。
附图说明
图1为Mp-42菌株在PDA培养基上培养15 d菌落正面。
图2 为Mp-42菌株在淀粉分离培养基上培养7 d的菌落；左：培养7 d菌落正面；右：培养7 d加碘液染色后菌落正面， ：透明圈。
图3为Mp-42菌株显微特征（400 X）；左：菌丝及分生孢子，右：闭囊壳及子囊孢子。
图4为Mp-42 菌株ITS基因序列（604 bp）。
图5为基于ITS基因序列建立的红曲霉属（Monascus）系统发育树 。
图6为葡萄糖浓度的标准曲线。
图7为Mp-42菌株在淀粉发酵培养液中的生长曲线。
图8为培养温度对Mp-42菌株的淀粉酶活性影响。
图9为培养基初始pH对Mp-42菌株的淀粉酶活性影响。
具体实施方式
下面对本发明具体实施方式做一个详细的说明。
实施例1 紫色红曲霉（Monascus purpureus）Mp-42菌株的分离、纯化和筛选
1.1 培养基和试剂
（1）PDA培养基：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂粉2.0%，H2O 1 L，pH 6.0~6.5。用于红曲霉菌株的分离纯化。
（2）淀粉分离培养基：蛋白胨20 g，K2HPO4 2 g，MgSO4 0.5 g，KCl 0.5 g，酵母粉 1g，琼脂15 g，可溶性淀粉50 g，H2O 1 L，pH 4.0~5.0。用于产淀粉酶红曲霉菌株的初筛。
（3）种子培养基：蛋白胨1 g，NaCl 1 g，可溶性淀粉1 g，H2O 1 L，pH 7.0~7.2。用于产淀粉酶红曲霉菌株的种子培养。
（4）发酵培养基：蛋白胨10 g，NaCl 5 g，牛肉膏3 g，可溶性淀粉2.5 g，H2O
1 L，pH 7.0~7.2。用于产淀粉酶红曲霉菌株的复筛。
（5）DNS试剂：称取3，5-二硝基水杨酸3.15 g，加水500 mL。搅拌5 s，水浴至45 ℃。然后逐步加入100 mL 0.2g/ mL的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌。直到溶液清澈透明。再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0 g、苯酚2.50 g和无水亚硫酸钠2.50 g。继续45 ℃水浴加热，同时补加水300 mL，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解。冷却至室温后，用水定容至1000mL。过滤后取滤液，储存在棕色瓶中，避光保存备用。
实验方法
1.2.1 红曲霉菌株的分离纯化
紫色红曲霉Mp-42菌株分离自自然发酵的红曲米。将红曲米0.5 g研磨成粉，取少量均匀的洒入PDA培养基表面，30℃培养48 h，待白色绒毛状菌丝长出后，取少许菌丝转接于另一PDA培养平板上继续培养1 W后，重复上述分离纯化3次，即可得到得性状均一的红曲霉菌株。将筛选获得的红曲霉菌株编号保存于25%甘油中，置于4 ℃冰箱备用。从全国各地收集的自然发酵红曲米中分离纯化共获386株红曲霉菌株。
产淀粉酶红曲霉菌株的初筛
用透明圈法。将分离纯化得到的386株红曲霉菌株在PDA培养基上培养7 d后，转接到淀粉分离培养基上，30℃培养7 d后加入碘液染色，由于碘遇淀粉变蓝，所以红曲霉菌株产生的淀粉酶分解淀粉后不变蓝呈现透明状，未被淀粉酶分解的淀粉培养基遇碘变蓝色。通过测量红曲霉菌落周围的透明圈大小（a）和菌落直径大小（b），计算a/b的比值，比值的大小可以作为红曲霉菌株产淀粉酶活性大小的初筛指标，筛选a/b比值大的菌株进行复筛。
产淀粉酶红曲霉菌株的复筛
（1）红曲霉菌株的培养和淀粉粗酶液的制备
将初筛a/b比值较大的50株红曲霉菌株先接入种子培养基中，在30℃，180 r/min下培养3 d后，取1 mL孢子悬液转接入发酵培养基，在30℃，180 r/min下培养7 d后，培养液用8000 r/min离心10 min，取上清液即为淀粉粗酶液。
（2）红曲霉菌株淀粉酶活的检测
在50 mL三角瓶中，加入2 mL 5%可溶性淀粉和2 mL柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液，先40℃水浴10 min，然后加1 mL粗酶液，40℃水浴反应1 h后加入DNS试剂2 mL终止反应，摇匀后置沸水浴中煮沸5 min，立即冷却，用水定容至20 mL后，于520 nm波长下，用10 mm比色皿在分光光度计迅速测定反应液的吸光值。
（3）红曲霉菌株淀粉酶酶活的计算和定义
参照葡萄糖标准曲线（附图6），根据淀粉酶酶活的定义计算不同红曲霉菌株产淀粉酶的酶活。
淀粉酶酶活的定义：在以上反应条件下，1 min释放1μg葡萄糖的酶量定义为一个活力单位。
实验结果
把淀粉酶酶活的大小做为产淀粉酶红曲霉菌株的复筛指标，最终通过初筛和复筛得到产淀粉酶活性最高的Mp-42菌株。Mp-42菌株在初始pH 6.0、培养温度30℃、180 r/min条件下发酵培养基上培养7 d，发酵粗酶液淀粉酶活性为168 U/mL~178 U/mL。
实施例2 Mp-42菌株在淀粉发酵培养基上生长曲线的测定
1.1菌株和培养基：Mp-42菌株，种子培养基和发酵培养基配方同实施例1。
实验方法
（1）Mp-42菌株的培养
淀粉分离培养基上培养7 d的Mp-42菌株，用0.9 cm的打孔器打出菌饼6个接入50mL的种子培养基中，置于30 ℃，180 r/min摇床中，培养3 d后；取1 mL孢子悬液接入发酵培养基，置于30 ℃，180 r/min摇床中，培养7 d后，取1 mL培养液至1.5 mL离心管中测定菌丝干重。
（2）菌丝干重的测定
1.5 mL空离心管先放于在105℃的烘箱中烘干15 min后取出，放于干燥器内冷却后称取空离心管质量为m；每管吸取1 mL培养液，在4 ℃，10000 r/min离心10 min，弃上清；加入无菌蒸馏水，吹打均匀后再离心，弃上清，放入105℃烘箱中烘至恒重，放入干燥器内冷却后称取质量为M；菌丝的干重质量为M-m，每隔8 h取1 mL Mp-42培养液测定菌丝干重。以取样时间为横坐标，Mp-42菌株菌丝干重为纵坐标绘制Mp-42菌株的生长曲线。
实验结果
Mp-42菌株在发酵培养基中生长速度较快（附图7），培养8 h~40 h为迟缓期，40 h~120 h为对数生长期，120 h~176 h为稳定生长期，第176 h后进入衰亡期。
实例3 培养温度对Mp-42菌株淀粉酶活性的影响
1.1菌株和培养基：Mp-42菌株，种子培养基和发酵培养基配方同实施例1。
实验方法
（1）Mp-42菌株的培养和粗酶液的制备
淀粉分离培养基上培养7 d的Mp-42菌株的菌落，用0.9 cm的打孔器打出菌饼6个接入50 mL的种子培养基中，分别置于24 ℃，26 ℃，28 ℃，30 ℃，32 ℃，34 ℃的温度下，180 r/min摇床培养3 d后；取1 mL孢子悬液接入发酵培养基，分别置于24 ℃，26 ℃，28℃，30 ℃，32 ℃，34 ℃的温度下，180 r/min摇床培养7 d；培养液在8000 r/min离心10min，取上清液即为粗酶液。
（2）Mp-42菌株淀粉酶酶活测定和计算：方法同实施例1。
实验结果
不同培养温度对Mp-42菌株产淀粉酶酶活有一定的影响，当培养温度为30 ℃时，Mp-42菌株产淀粉酶活性最大，为168.1 U/mL（附图8）。
实施例4 培养基初始pH对Mp-42菌株产淀粉酶活性的影响
1.1菌株和培养基：Mp-42菌株，种子培养基和发酵培养基配方同实施例1。
实验方法
（1）Mp-42菌株的培养
淀粉分离培养基上培养7 d的Mp-42菌株的菌落，用0.9 cm的打孔器打出菌饼6个接入50 mL的种子培养基中，180 r/min摇床培养3 d，吸取1 mL孢子悬液接入pH分别调节到3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0的发酵培养基中，180 r/min摇床培养7 d后，培养液8000 r/min离心10 min，取上清液即为粗酶液。
（2）Mp-42菌株淀粉酶活的测定和计算：同实施例1。
实验结果
不同培养基初始pH对Mp-42菌株产酶的活性一定的影响，当培养基初始pH为6.0时，Mp-42菌株产淀粉酶活性最大，为178.2 U/mL（附图9）。
序列表
<110>浙江师范大学
<120>高产淀粉酶紫色红曲霉（Monascus purpureus）Mp-42菌株及其应用
<160>1
<210>1
<211>604
<212>DNA
<400>1
TCCTCCGCTT ATTGATATGC TTAAGTTCAG CGGGTATCCC TACCTGATCC GAGGTCAACC 60
TAAGGAAAAA AAGGTTGGAG AGGGCAAAGG CCCCGGCCCG ACCTACTGAG CGGGTGACAA 120
AGCCCCATAC GCTCGAGGAC CGGACGCGGC GCCGCCACTG CCTTTCGGGC CCGTCCCCGT 180
TGCCCGGAGG CGCAGGGGAC GGCGGCCCAA CACACAAGCC GCGCTTGAGG GGCAGTAATG 240
ACGCTCGGAC AGGCATGCCC CCCGGAATAC CAGGGGGCGC AATGTGCGTT CAAAGATTCG 300
ATGATTCACT GAATTCTGCA ATTCACATTA CTTATCGCAT TTCGCTGCGT TCTTCATCGA 360
TGCCGGAACC AAGAGATCCG TTGTTGAAAG TTTTAACCGA TTTGGTATGT TTACTCAGAC 420
AGCAATCCTT TTCAAAGACA GCGTTCGAGA AGATGTCTCC GGCGGGCCCC AGGGGGCCGC 480
GCCGAAGCAA CAGGAGGTAC AATAATCACG GGTGGGAGGT TGGGTCCCAC GAAGGGGACC 540
CGCACTCGGT AATGATCCTT CCGCAGGTTC ACCTACGGAA ACCTTGTTAC GACTTTTACT 600
TCCA 604
Claims (5)
1.高产淀粉酶紫色红曲霉（Monascus purpureus）Mp-42菌株，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为：CCTCC M 2014675，保藏日期为：2014年12月29日。
2.权利要求1所述的紫色红曲霉Mp-42菌株用于生产淀粉酶中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：生产的有机碳源采用可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、麦芽糖和番薯粉中的一种或多种；氮源采用硝酸钠、氯化铵、硝酸铵、牛肉膏、酵母粉和蛋白胨中的一种或多种。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：生产的温度范围为26℃~38℃，pH范围为4.0~8.0。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：生产的pH为6.0，温度为30℃。
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