CN103045558A - 红曲霉生产酯化酶制剂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物酶制剂技术领域，具体涉及一种利用红曲霉生产酯化酶制剂的方法。一种红曲霉生产酯化酶制剂的方法，其采用的菌株红曲霉菌Monascus sp.于2012年11月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.6807，该菌株在麦芽汁培养基上呈现烟灰色，底色呈现粉色，在显微镜下观察该菌丝有横隔，多核，分枝多且不规则。采用本发明的方法分离筛选得到的菌落，酯化酶系和淀粉酶系发达，所制得曲种的酯化酶活力、液化酶活力、糖化酶活力有明显提高，酯化力由传统方法中的35mg/g提高到60mg/g，液化力由20mg/g提高到40mg/g，糖化力由1500u/g提高到2000u/g以上。
Description
技术领域
本发明属于生物酶制剂技术领域，具体涉及一种利用红曲霉生产酯化酶制剂的方法。
背景技术
红曲起源于我国，红曲霉在我国主要用于红曲酿酒、发酵食品、色素生产等方面。红曲霉在代谢中可产生淀粉酶、酯化酶、蛋白酶等多种酶类，并且有不少红曲霉菌株可以产生较高活性的蛋白酶，可用于腌渍鱼、肉、豆腐等高蛋白食品，使食品色香味俱佳。而红曲霉代谢中产生的酸性蛋白酶不仅可以用于食品，还在饲料、纺织、皮革生产等其它领域有着广泛的应用。红曲霉生长过程中能产生生物活性较强的酯化酶，而大量用于酿酒和发酵食品及多孔淀粉的生产。在我国红曲霉的生产主要分布在福建、浙江和台湾等地。红曲霉在籼稻米上生长，由古至今多用固体培养红曲霉生产酯化酶，目前也有研究院所进行红曲霉液态发酵产生酯化酶方面的研究，但皆产酶能力较低，离实际大生产还有很大距离。
由于多种红曲霉菌种皆具有产生高酶活酯化酶的能力，因此，在浓香型大曲酒的酿造过程中，红曲酯化酶的应用比较普遍。查阅国内外文献后发现，基本所有的红曲霉菌种都是单酶发酵，有少部分菌种为双酶发酵，但一般仅有其中一种酶具有较大利用价值，而另一种酶活力则不尽人意。红曲酯化酶制剂已早有商品问世（武汉佳成生物制品有限公司）且已应用于白酒生产，但其酶系单一，酯化力最高只有35mg/g左右。
目前，国内白酒行业的现状大都是利用单一菌种分别制造各种单一的曲种，在白酒生产过程中需要通过分别加入不同的曲种来实现酿造过程中淀粉的糖化、蛋白的水解及香味的增加，多种菌制曲的产品相比较显得产品质量风味不足，酯香不浓，出品率低，所以红曲酯化酶制剂的使用将会改变国内白酒行业的这一现状。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明提供了一种利用红曲霉生产酯化酶制剂的方法，采用该方法生产的酶制剂其酯化酶活力高、液化酶活力和糖化酶活力高。
本发明其采用的菌株红曲霉菌Monascus sp.于2012年11月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.6807，该菌株在麦芽汁培养基上呈现烟灰色，底色呈现粉色，在显微镜下观察到该菌丝有横隔，多核，分枝多且不规则。
一种红曲霉生产酯化酶制剂的方法，包括下述的步骤：
a.菌种诱变：
出发菌株为：烟灰色红曲菌株，紫红色红曲菌株，橙色红曲菌株；采用细胞融合方法和紫外照射相结合，将三种出发菌株培养至菌龄30-40小时，进行细胞质分解，质解条件为： 25-30℃，时间2.5-3小时，质解酶系统包括0.1-5%溶菌酶，0.3-1%蜗牛酶和0.3-0.8%纤维素酶，将质解的红曲菌原生质在距离15w紫外灯下25厘米，照射80-100秒，使致死率达88%-91%；
b.分离：
将诱变后菌种做平板分离，平板培养基如下，蛋白胨0.5-1.2%，聚乙烯醇橄榄油乳化液2-3 %，氯化钠0.2-1%，琼脂1-5%， 28-32℃培养65-80小时后，挑选菌落透明圈较大的单菌落，进行至少三次筛选，待遗传性状稳定后进行选定；
c.制曲：加入麸皮60-100%，玉米面10-20%，大豆粉3-7%，磷酸二氢钾0.01-0.03%，加水60-90%，润水一小时，常压蒸煮一小时，冷却到30-35℃，无菌环境下接种操作，在通风曲床30℃培养72小时，测定酶活力。
优选的，一种红曲霉生产酯化酶制剂的方法，包括下述的步骤：
a.菌种诱变：
出发菌株为：烟灰色红曲菌株，紫红色红曲菌株，橙色红曲菌株；采用细胞融合方法和紫外照射相结合，将三种出发菌株培养至菌龄36小时，进行细胞质分解，质解条件为： 28℃，时间2.5-3小时，质解酶系统包括0.3%溶菌酶，0.5%蜗牛酶和0.5%纤维素酶，将质解的红曲菌原生质在距离紫外灯下29厘米，照射80-100秒，致死率达88%-91%；
b.分离：
将诱变后菌种做平板分离，平板培养基如下，蛋白胨1%，聚乙烯醇橄榄油乳化液2.5%，氯化钠0.5%，琼脂2%， 30℃培养72小时后，挑选菌落透明圈较大的单菌落，进行至少三次筛选，待遗传性状稳定后进行选定；
c.制曲：加入麸皮80%，玉米面15%，大豆粉5%，磷酸二氢钾0.02%，加水80%，润水一小时，常压蒸煮一小时，冷却到30-35℃，无菌环境下接种操作，在通风曲床30℃培养72小时，干燥至水分＜20%，测定酶活力。
本发明的有益效果在于，采用本发明的方法分离筛选得到的菌落，酯化酶系和淀粉酶系发达，所制得曲种的酯化力、液化力、糖化力有明显提高，酯化力由传统方法中的35mg/g提高到60 mg/g，液化力由20提高到40 mg/g，糖化力由1500u/g提高到2000u/g以上。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作更进一步的说明，以便本领域的技术人员更了解本发明，但并不因此限制本发明。
以下实施例中采用的菌株红曲霉菌Monascus sp.于2012年11月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.6807，该菌株在麦芽汁培养基上呈现烟灰色，底色呈现粉色，在显微镜下观察到该菌丝有横隔，多核，分枝多且不规则。
实施例1
一种红曲霉生产酯化酶制剂的方法，包括下述的步骤：
a.菌种诱变：
出发菌株为：烟灰色红曲菌株，紫红色红曲菌株，橙色红曲菌株；采用细胞融合方法和紫外照射相结合，将三种出发菌株培养至菌龄30小时，进行细胞质分解，质解条件为： 25℃，时间2.5小时，质解酶系统包括0.1%溶菌酶，0.3%蜗牛酶和0.3%纤维素酶，将质解的红曲菌原生质在距离15w紫外灯下25厘米，照射80-100秒，使致死率达88%-91%；
b.分离：
将诱变后菌种做平板分离，平板培养基如下，蛋白胨0.5%，聚乙烯醇橄榄油乳化液2 %，氯化钠0.2%，琼脂1%， 28℃培养65小时后，挑选菌落透明圈较大的单菌落，进行至少三次筛选，待遗传性状稳定后进行选定；
c.制曲：加入麸皮60%，玉米面10%，大豆粉3%，磷酸二氢钾0.01%，加水60%，润水一小时，常压蒸煮一小时，冷却到30℃，无菌环境下接种操作，在通风曲床30℃培养72小时，测定酶活力。
实施例2
a.菌种诱变：
出发菌株为：烟灰色红曲菌株，紫红色红曲菌株，橙色红曲菌株；采用细胞融合方法和紫外照射相结合，将三种出发菌株培养至菌龄36小时，进行细胞质分解，质解条件为： 28℃，时间2.5-3小时，质解酶系统包括0.3%溶菌酶，0.5%蜗牛酶和0.5%纤维素酶，将质解的红曲菌原生质在距离紫外灯下29厘米，照射80-100秒，致死率达88%-91%；
b.分离：
将诱变后菌种做平板分离，平板培养基如下，蛋白胨1%，聚乙烯醇橄榄油乳化液2.5%，氯化钠0.5%，琼脂2%， 30℃培养72小时后，挑选菌落透明圈较大的单菌落，进行至少三次筛选，待遗传性状稳定后进行选定；
c.制曲：加入麸皮80%，玉米面15%，大豆粉5%，磷酸二氢钾0.02%，加水80%，润水一小时，常压蒸煮一小时，冷却到30-35℃，无菌环境下接种操作，在通风曲床30℃培养72小时，干燥至水分＜20%，测定酶活力。
实施例3
一种红曲霉生产酯化酶制剂的方法，包括下述的步骤：
a.菌种诱变：
出发菌株为：烟灰色红曲菌株，紫红色红曲菌株，橙色红曲菌株；采用细胞融合方法和紫外照射相结合，将三种出发菌株培养至菌龄40小时，进行细胞质分解，质解条件为： 30℃，时间3小时，质解酶系统包括5%溶菌酶， 1%蜗牛酶和0.8%纤维素酶，将质解的红曲菌原生质在距离15w紫外灯下25厘米，照射100秒，使致死率达88%-91%；
b.分离：
将诱变后菌种做平板分离，平板培养基如下，蛋白胨1.2%，聚乙烯醇橄榄油乳化液3 %，氯化钠1%，琼脂5%，32℃培养80小时后，挑选菌落透明圈较大的单菌落，进行至少三次筛选，待遗传性状稳定后进行选定；
c.制曲：加入麸皮100%，玉米面20%，大豆粉7%，磷酸二氢钾0.03%，加水90%，润水一小时，常压蒸煮一小时，冷却到35℃，无菌环境下接种操作，在通风曲床30℃培养72小时，测定酶活力。
Claims (4)
1.一种红曲霉生产酯化酶制剂的方法，其采用的菌株红曲霉菌Monascus sp.于2012年11月13日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO.6807。
2.如权利要求1所述的红曲霉生产酯化酶制剂的方法，其特征在于，所采用的菌株红曲霉菌Monascus sp.在麦芽汁培养基上呈现烟灰色，底色呈现粉色，在显微镜下观察该菌丝有横隔，多核，分枝多且不规则。
3.一种如权利要求1所述的红曲霉生产酯化酶制剂的方法，包括下述的步骤：
a.菌种诱变：
出发菌株为：烟灰色红曲霉菌株，紫红色红曲霉菌株，橙色红曲霉菌株；采用细胞融合方法和紫外照射相结合，将三种出发菌株培养至菌龄30-40小时，进行细胞质分解，质解条件为： 25-30℃，时间2.5-3小时，质解酶系统包括0.1-5%溶菌酶，0.3-1%蜗牛酶和0.3-0.8%纤维素酶，将质解的红曲菌原生质在距离15w紫外灯下25厘米，照射80-100秒，使致死率达88%-91%；
b.分离：
将诱变后菌种做平板分离，平板培养基如下，蛋白胨0.5-1.2%，聚乙烯醇橄榄油乳化液2-3%，氯化钠0.2-1%，琼脂1-5%， 28-32℃培养65-80小时后，挑选菌落透明圈较大的单菌落，进行至少三次筛选，待遗传性状稳定后进行选定；
c.制曲：加入麸皮60-100%，玉米面10-20%，大豆粉3-7%，磷酸二氢钾0.01-0.03%，加水60-90%，润水一小时，常压蒸煮一小时，冷却到30-35℃，无菌环境下接种操作，在通风曲床30℃培养72小时，测定酶活力。
4.如权利要求1或2所述的一种红曲霉生产酯化酶制剂的方法，包括下述的步骤：
a.菌种诱变：
出发菌株为：烟灰色红曲菌株，紫红色红曲菌株，橙色红曲菌株；采用细胞融合方法和紫外照射相结合，将三种出发菌株培养至菌龄36小时，进行细胞质分解，质解条件为： 28℃，时间2.5-3小时，质解酶系统包括0.3%溶菌酶，0.5%蜗牛酶和0.5%纤维素酶，将质解的红曲菌原生质在距离紫外灯下29厘米，照射80-100秒，致死率达88%-91%；
b.分离：
将诱变后菌种做平板分离，平板培养基如下，蛋白胨1%，聚乙烯醇橄榄油乳化液2.5%，氯化钠0.5%，琼脂2%， 30℃培养72小时后，挑选菌落透明圈较大的单菌落，进行至少三次筛选，待遗传性状稳定后进行选定；
c.制曲：加入麸皮80%，玉米面15%，大豆粉5%，磷酸二氢钾0.02%，加水80%，润水一小时，常压蒸煮一小时，冷却到30-35℃，无菌环境下接种操作，在通风曲床30℃培养72小时，干燥至水分＜20%，测定酶活力。
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Address after: 251707, No. 108, King sang Road, Wei Town, Huimin County, Shandong, Binzhou Applicant after: Zhong Hui biotech inc, Shandong Applicant after: Zhao Jixing Address before: 251707, No. 108, King sang Road, Wei Town, Huimin County, Shandong, Binzhou Applicant before: Shangdong Zhonghui Food Co., Ltd. Applicant before: Zhao Jixing |
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Denomination of invention: Monascus strains and method for producing esterifying enzyme preparation Effective date of registration: 20170710 Granted publication date: 20160323 Pledgee: China Co truction Bank Corp Huimin subbranch Pledgor: Zhao Jixing|Shandong Zhonghui biological Polytron Technologies Inc Registration number: 2017990000617 |
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