CN111972499B - 一种花香低盐腐乳膏发酵生产方法 - Google Patents
一种花香低盐腐乳膏发酵生产方法 Download PDFInfo
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Abstract
腐乳是我国一种传统发酵调味品，高盐含量是其重要特点。近年低盐化饮食有利于健康得到公众的广泛认可。传统发酵腐乳产品基本都是块状，主要适于日常饮食，近年火锅蘸料、烤制食品需要稀态腐乳调味料。本发明提供了一种花香低盐腐乳膏发酵生产方法，通过多种功能菌与复合酶制剂的耦合处理、协同作用，促进了腐乳膏发酵风味物质、滋味物质及功能成分形成，消除潜在安全风险，实现了腐乳膏产品的低盐化，咸淡适口，质地细腻，醇香花香突出，膳食纤维含量高，可作为直接涂抹型调味料。
Description
技术领域
本发明涉及一种花香低盐腐乳膏的发酵生产方法与应用，属于生物工程发酵技术领域。
背景技术
腐乳又称豆腐乳、霉豆腐、酱豆腐，是我国一种传统大豆发酵食品。腐乳中含有游离氨 基酸、肽、钙、磷、核黄素和B族维生素等多种营养物质，含有抗氧化肽、ACE抑制肽、大豆异黄酮等功能成分，具有抗氧化、防衰老、降血压、抗肿瘤等生理活性。
目前，腐乳生产主要方式是前发酵接种单一纯种微生物进行制坯，后发酵过程属于自然 发酵。根据其前发酵接种的微生物可腐乳分为毛霉型、根霉型、细菌型，腐乳生产常用毛霉 主要是总状毛霉(Mucor racemosus)、高大毛霉(Mucor mucedo)、卷枝毛霉(Mucorcircinelloides)、黄色毛霉(Mucor flavus)、雅致放射毛霉(Actinomrcor elegans)等，根霉主要是小孢根霉(Rhizopus microspores)、米根霉(Rhizopus oryzae)、华根霉(Rhizopus chinonsis)等，细菌主要是藤黄微球 菌(Micrococcus luteus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。
高盐含量是中国传统发酵腐乳的重要特色，也是存在的主要问题。现代医学研究发现， 高盐饮食与高血压、心脏病、肾脏疾病和脑出血的诱发有直接关系，低盐化饮食已成为近年 公众的广泛共识，中国传统发酵食品的低盐化是发展趋势和时代需求。
目前常见腐乳的盐含量约为8％～16％，低盐化腐乳研制首先要清楚食盐在腐乳加工与贮 藏中作用。食盐在腐乳质构、抑菌、风味等方面发挥重要作用，盐可使豆腐坯适当脱水、收 缩变硬，防止腐乳块酥烂；在后酵及贮藏阶段，高盐可筛选耐盐功能菌群，抑制蛋白酶活性， 防止蛋白质被过度分解，具有抑菌、防霉变作用，抑制腐败菌和致病菌的生长与存活，延长其保质期；在风味方面，盐赋予腐乳咸香风味及口味，具有调味、助鲜的作用。如果含盐量 过低，易引起腐乳产品酥烂易碎，发酸发臭，甚至带来食用安全风险。因此，降低腐乳中盐 含量既是改进生产工艺的必要措施，也是改善产品品质的技术升级的需要。
腐乳生产过程常存在的问题及部分措施，包括：(1)中国传统发酵腐乳高含盐量，也是 腐乳只能作为调味品的主要原因；腐乳减盐需要改进生产工艺，通过综合性防护措施达到目 的。(2)前期制坯阶段易发生细菌污染，导致豆腐白坯酸化腐败。(3)目前腐乳生产后发 酵阶段为自然发酵，存在潜在安全风险，腐乳中所含生物胺是其中之一，如何减少有害代谢 产物生物胺积累？生物胺来源于发酵微生物的氨基酸脱羧酶对氨基酸的分解代谢，也可通过微生物产生的单胺氧化酶降解消除。(4)腐乳产品褐变，产品风味及品质不稳定。(5)腐 乳发酵与贮藏过程中常见有表面“白点”现象，也是行业的难点问题，如何改善与解决？腐乳 “白点”属于疏水性氨基酸结晶，主要为酪氨酸，少量为苯丙氨酸等，当腐乳中酪氨酸含量超过200mg/100g时，可产生白点。尽管“白点”无毒无害、不影响食用安全性，但也是质量瑕疵 问题。为消除消费者顾虑，厂家不得不在腐乳的商品标签上特别标明“若出现白色结晶，属于 氨基酸结晶，请放心食用”等类似提示。
传统发酵腐乳类产品基本都是块状，主要适于日常饮食。近年火锅蘸料、烤制食品更需 要稀态、膏状的腐乳调味料。由于块状腐乳是整块发酵，使用时需要再搅碎和调浆，常出现 里外颜色不一致，表面易发生氧化发黑，影响外观等问题。针对上述问题，本发明开发了一种花香低盐腐乳膏的发酵生产方法及其产品，丰富腐乳种类，满足市场需求。
发明内容
本发明针对传统腐乳存在的盐含量高、降盐后存在潜在安全风险、产品风味单一等问题， 提供了一种花香低盐腐乳膏的发酵生产方法及其新产品，可将腐乳膏产品的盐度控制在3％～ 5％，前发酵、后发酵各接种不同功能菌株，发酵充分，实现了产品的低盐化、消除安全风险， 并有效提高了腐乳的风味成分、功能成分与营养品质。
作为本发明其中一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供粪肠球菌Gr17，保 藏编号CGMCC No.16677；提供红曲霉M1，保藏编号为CGMCC No.12502。
作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供2种腐乳发酵剂： 所述腐乳发酵剂为使用红曲霉CGMCC No.12502、粪肠球菌CGMCC No.16677生产制得，所 述腐乳发酵剂包括液态发酵剂、粉态发酵剂。
作为本发明所述的花香低盐腐乳膏发酵生产方法的一种优选方案：所述在白坯制作时， 大豆先经煮制，钝化其脂肪氧合酶活性，以利于去除豆腥味和磨浆；全豆或去皮豆与炒制去 皮花生混合，再经细胞破壁机超高速磨浆、胶体磨磨浆均质，以控制豆浆浓度和细度，未经滤渣，不产生豆腐渣，提高了白坯的膳食纤维含量，所述制备的全豆腐乳豆花白胚。
作为本发明所述的花香低盐腐乳膏发酵生产方法的另一种优选方案：所述在腐乳前发酵 阶段，改变传统腐乳前发酵接种单一菌种方式，根据微生物产酶特性进行设计构建，接种驯 化雅致放射毛霉、驯化米曲霉、红曲霉、藤黄微球菌进行多功能菌协同发酵，获得所需的蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、酯化酶、单胺氧化酶等丰富酶系，促进了腐乳后发酵的风味物质、 滋味物质及功能成分的加速形成.
作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供红曲霉CGMCCNo.12502可产生高活性酯化酶、单胺氧化酶、功能成分Monacolin K，且具有降解生物胺活性；提供驯化米曲霉可产生高活性蛋白酶及肽酶；提供藤黄微球菌可产生高活性碱性蛋白酶， 有利于消除贮藏时产生“白点”。
作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，提供粪肠球菌CGMCC No.16677，可产生高活性的细菌素GR17等天然抑菌物质，可抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球 菌、阪崎肠杆菌、单核增生李斯特氏菌、芽孢杆菌等食物腐败细菌和致病菌的生长，且具有 分解生物胺活性，消除腐乳的潜在安全风险。
作为本发明的另一个方面，本发明克服现有技术中存在的不足，所述在腐乳后发酵阶段， 接种粪肠球菌CGMCC No.16677可产生高活性的细菌素GR17等天然抑菌物质，接种鲁氏接合酵母可分泌较高活力糖化酶、单胺氧化酶，并结合腐乳后发酵时卤汁的低盐、高含量酒精、 高酸与低pH，单胺氧化酶降解生物胺，白芷香料抑制酪氨酸酶活性，驯化米曲霉和雅致放射 毛霉抑制酞酰酪氨酸水解酶活性，阻遏“白点”形成，通过综合性的栅栏技术与措施，消除腐 乳酿造及保藏过程中潜在安全风险，延长保质期。
作为本发明所述的花香低盐腐乳膏发酵生产方法的另一种优选方案：所述生产方法中添加纤维素酶、木聚糖酶，可降解豆坯的纤维素、木质素，提高可溶性膳食纤维含量；所述生 产方法中添加风味蛋白酶，脱出苦味肽，加速腐乳后酵时的蛋白质降解，促进腐乳风味肽形 成；添加黄浆水，利用所含的大豆低聚糖，促进粪肠球菌CGMCC No.16677、乳球菌等有益 乳酸菌生长及其细菌素GR17产生等。
作为本发明所述的花香低盐腐乳膏发酵生产方法的另一种优选方案：所述后发酵的卤汁 中添加干茉莉花(或杭白菊、桂花、刺槐花、玫瑰花、梨花、栀子花等)浸膏，增加花香，开发出多种花香风味低盐腐乳，丰富腐乳品类。
生物材料保藏
所述红曲霉为红曲霉(Monascus sp.)M1，已于2016年05月17日由中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.12502，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；所述益生肠球菌为粪肠球菌(Enterococcus faecium)Gr17，已于2018年11月02日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通 微生物中心保藏，保藏编号CGMCC No.16677，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明的有益效果
本发明提供的多功能菌协同发酵花香低盐腐乳膏方法及其应用，实现了产品的低盐化， 在3％～5％的盐度时能很好进行腐乳膏发酵，制备得到花香腐乳膏除食盐含量降低、总酸和水分提高外，其他各指标符合中华人民共和国商务部制定的腐乳商业行业标准SB/T 10170- 2007，花香腐乳膏中生物胺含量、白点率等较传统发酵腐乳明显降低，产品的食盐含量降低 50％以上，咸淡适口，粘稠适中，质地细腻均匀，醇香浓郁，花香突出，膳食纤维含量高， 且含有一定量的Monacolin K、大豆异黄酮、γ-氨基丁酸(GABA)、活性肽等功能成分，可 作为直接涂抹型调味料。
附图说明
图1红曲霉M1发酵Monacolin K的代谢合成及生物量。
图2腐乳膏后发酵过程中微生物区系与VFCs相关性的热图。
(注：热图的范围从+1.00到-1.00；热图上的颜色变化显示了微生物群和特征vfc之间的正 (红色)或负(蓝色)相关性。)
图3腐乳膏后发酵过程中相关酶活力的变化。
具体实施方式
本部分概述了本发明实施例的一些方面，简要介绍一些较佳实施例。为使本发明的上述 目的、特征和优点更明显易懂，下面结合具体实施例对本发明的具体实施方式做详细的说明。
本发明所使用的红曲霉(Monascus sp.)M1CGMCC No.12502、粪肠球菌(E.faecium) CGMCC No.16677，分别于2016年05月17日、2018年11月02日保藏于中国微生物菌种保 藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院 微生物研究所。
本发明所使用的粪肠球菌CGMCC No.16677及其所产细菌素的生物特征及抑菌活性见专 利《一种具有广谱抗菌活性的细菌素Gr17及其应用》(公开号：CN109627299A)；所使用的 红曲霉CGMCC No.12502的生物特征及所产功能成分见专利《一种降血脂燕麦红曲保健茶及制备方法》(公开号：CN106173054A)；所使用的雅致放射毛霉(Actinomucorelegans)3.2778、 藤黄微球菌(Micrococcus luteus)1.290、鲁氏接合酵母(Zygosaccharomyces rouxii)2.4071， 购自中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；所使用的米曲霉(Aspergillus oryzae) CICC2014，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心。
实施例1低盐腐乳的制备方法，包括如下步骤：
(1)雅致放射毛霉和米曲霉的驯化改良
在PDA琼脂培养基中添加0～0.04％浓度的L-酪氨酸，接种雅致放射毛霉、米曲霉，逐 渐增大L-酪氨酸浓度，反复传代15代进行驯化，发现驯化后的雅致放射毛霉、米曲霉的酞酰酪氨酸水解酶活力明显降低，其产生酪氨酸的能力较未驯化菌株分别降低34.3％、32.5％， 腐乳白点率减少。
(2)发酵剂的制备
将红曲霉、驯化雅致放射毛霉、驯化米曲霉分别接种于PDA平板培养基，于28℃培养3～ 5d，0.8％无菌水洗脱，高速匀浆机于1500r/min匀浆5min，制备孢子悬液，血球计数板镜检 计数；将藤黄微球菌接种到LB培养液于30℃、150r/min摇瓶培养36～48h，离心，菌体用 无菌水稀释。将上述制备的3种霉菌孢子与藤黄微球菌按照(1×105～1×106)∶(1×105～1×106)∶ (1×105～1×106)∶(1×106～1×107)的比例混合，得到前发酵多功能菌发酵剂。
将鲁氏接合酵母以1％的接种量接种于YPD液体培养基，于30℃、200r/min震荡培养至 OD600为0.8～1.0；将粪肠球菌以1％接种量接种于MRS液体培养基，于36℃、150rpm震荡培养至OD600为0.8～1.0，离心，菌体用无菌水稀释，作为后发酵功能菌发酵剂。
PDA培养基：马铃薯200g加水蒸煮过滤，加入葡萄糖20克，琼脂20克，去离子水定容至1L。
YPD培养基：葡萄糖20g，蛋白胨20g，酵母粉10g，去离子水定容至1L。
MRS培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母粉5g，乙酸钠5g，柠檬酸氢 二铵2g，磷酸氢二钾2g，吐温801.0mL，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，去离子水定容至1L。
(3)腐乳豆花白坯的制备
所述腐乳豆花白坯的制备过程如下：原料大豆经过筛选除去沙石和杂质，挑选出1kg颗 粒饱满的大豆，以3000mL自来水常温浸泡5～6h，于95～100℃煮制3～5min钝化酶去豆 腥，去皮豆(或全豆)与适当炒制去皮花生按重量比(12～14)∶1混合，黄豆和炒制花生与水的比例为1∶6～8(W/V)，经细胞破壁机20000～35000r/min磨浆10～15min，再经胶 体磨于乳化细度10～30μm磨浆均质1～2次，以控制豆浆的浓度及细度，煮沸并保持微沸5～10min，冷却至80～85℃，在搅拌状态下加入100～150mL 0.8mol/L的MgCl2溶液点浆，静 置20min，制得全豆腐乳豆花白坯。
(4)腐乳的前发酵
所述的腐乳前发酵过程如下：以2％接种量(V/V)将前发酵多功能菌发酵剂加入腐乳白 坯，稀乳酸pH4.0～4.5，于温度30℃、80～120r/min条件搅拌发酵48～72h，制得腐乳毛坯。
(5)腐乳的后发酵
所述的腐乳后发酵过程如下：将腐乳毛坯分装于150mL～1000mL容量的灭菌玻璃瓶中， 每瓶装量约3/5～4/5，然后加入粪肠球菌1×106～1×107cfu/L、鲁氏接合酵母1×105～1×106cfu/L、调制卤汁，搅拌，拧紧瓶盖，发酵。调制卤汁是添加黄浆水30～50ml/L、茉莉花(或 杭白菊、桂花、玫瑰花、刺槐花、梨花、栀子花等)浸膏30～50g/L、复合风味蛋白酶10～ 15万U/L、纤维素酶10～15万U/L、木聚糖酶5～10万U/L、红曲米细粉(色价1000U/g)、面曲细粉、香辛料细粉或水煮液(包括：白芷、花椒、八角、桂皮等)、黄酒、凉白开水等，卤汁调制至食盐浓度12.5％～15.0％(W/V)、酒精浓度38％～50％(V/V)、pH4.0～4.5。
(6)花香低盐腐乳膏成品制备
所述的花香低盐腐乳膏制备过程如下：腐乳后发酵放于室温发酵40～70天，待腐乳膏成 熟，于400W～500W微波处理2～3min，即得到花香低盐腐乳膏产品。
实施例2粪肠球菌所产细菌素的抗菌活性及其在腐乳膏发酵中的应用
本发明所使用的粪肠球菌(E.Faecium)CGMCC No.16677及其所产细菌素的生物特征、功 能鉴定、抗菌效果等见专利《一种具有广谱抗菌活性的细菌素Gr17及其应用》(公开号： CN109627299A)。该粪肠球菌Gr17是从中国传统低盐发酵全鱼产品中分离，并测定了其完整基因组序列；粪肠球菌Gr17发酵液经硫酸铵盐析沉淀、离子交换层析、HPLC纯化，获得的 肠球菌细菌素Gr17分子量为4531.01Da；细菌素Gr17对单核增生李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aereu)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)、粪肠球菌(Enterococcus faecalis)、 绿脓杆菌(Pseudomonas aeruginosa)、热死环丝菌(Brochothrix thermosphacta)、白色念珠菌 (Candida albicans)等均有一定抑菌、杀菌作用，其抗菌谱测试结果见表1。Gr17菌株的单胺 氧化酶活性15.9U/mL，可降解生物胺；该菌具有较高产有机酸能力、一定耐酒精能力，导致腐乳膏后发酵过程中可滴定酸的增加和pH值的降低，抑制腐败菌和食源病原菌的生长繁殖， 发挥抗菌活性，提高其食用安全性。
表1粪肠球菌CGMCC No.16677所产细菌素Gr17的抗菌谱
注：CMCC，中国医学微生物菌种保藏管理中心(National Center for MedicalCulture Collections)；ATCC，美国典型培养保藏中心(American Type CultureCollection)；CGMCC， 中国普通微生物保藏中心(China Center of General MicrobialCultureCollection)；CVCC，中 国兽医微生物菌种保藏管理中心(China Center ofVeterinary Culture Collection)；CICC，中 国工业微生物菌种保藏管理中心(ChinaCenter of Industrial Culture Collection)。
实施例3红曲霉CGMCC No.12502的活性成分及其在腐乳膏发酵中的应用
本发明所使用的红曲霉CGMCC No.12502的生物特征及所产活性成分，见专利《一种降 血脂燕麦红曲保健茶及制备方法》(公开号：CN106173054A)。该菌是申请人团队诱变选育的“M1”菌株，保藏编号为“CGMCC No.12502”。HPLC检测M1菌株发酵液中Monacolin K含量 达到了421.7mg/L，较出发菌株M1提高了142.1％，其经10次传代培养后产Monacolin K的性能仅下降了4.3％，遗传稳定性良好，表明M1菌株具有高产功能成分Monacolin K的特性。 M1菌株的选育过程及特性详见发表论文【郎天丹、梁健、王成涛、张婵、刘录祥，利用高能 混合粒子场诱变选育高产Monacolin K、低产桔霉素的红曲霉菌株”，食品工业科技，2016， 37(2)：165-169】(该文M1-20与专利保藏菌种时登记时M1为同一菌株)。M1发酵Monacolin K的代谢合成过程及产量见说明书附图(图1)。关于红曲霉M1，在最初送到中国微生物菌 种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行专利菌种保藏时，只鉴定到属水平，未进行 种水平鉴定，获得保藏编号为CGMCC No.12502)。近期对该菌株又进行了更深入的菌种鉴定， 红曲霉(Monascus sp.)M1鉴定为紫色红曲霉(Monascus purpureus)M1。研究表明，红曲霉产生MonacolinK与土曲霉产生洛伐他汀(Lovastatin)为同一物质，MonacolinK可有效抑 制胆固醇合成关键酶HMG-CoA活性，具有降胆固醇、改善血脂等作用，广泛应用于保健食 品、医药等；红曲霉CGMCC No.12502分泌蛋白酶、糖化酶、酯化酶、单胺氧化酶的活力分 别为128.0U/mL、136.3U/mL、18.5U/mL、10.8U/mL。该菌株应用于腐乳膏发酵，有利于大 豆蛋白酶解，获得鲜味氨基酸、呈味肽、功能肽，促进脂肪酸分解及小分子酯形成，提高香气，赋予腐乳中Monacolin K、γ-氨基丁酸等功能成分，减少生物胺产生，提高食用安全性。
实施例3腐乳膏后发酵过程中微生物群落结构演替与风味代谢产物分析
腐乳膏后酵过程中，间隔一定时间取样，基于高通量基因测序分析腐乳膏的微生物多样 性，细菌采用16S rDNA测序，真菌采用ITS1测序。结果发现，膏醅中占主体地位的细菌属主要为乳球菌属(Lactococcus)、鞘脂杆菌属(Sphingobacterium)、芽孢杆菌属(Bacillus)、 肠球菌(Enterococcus)，其丰度逐渐增加，成为成熟期的主要种群，丰度达到42.76％，而魏斯 氏菌属(Weissella)、假单胞菌属(Pseudomonas)等呈下降趋势。参与后发酵的真菌主要是 鲁氏接合酵母(Saccharomyces rouxii)、毕赤酵母属(Pichia)、毛霉属(Mucor)、曲霉属 (Aspergillus)红曲霉属(Monascus)、隐球酵母属(Cryptococcus)等。上述功能菌协同作 用，代谢产生各种有机酸、乙醇形成酯类，蛋白质水解产生多肽和氨基酸，共同构成腐乳膏 的特殊香气，红曲色素形成腐乳的特有颜色；经初步鉴定，腐乳膏的挥发成分80余种，其中 酯类13种、醛类9种、醇类6种和杂类化合物10种。
实施例4腐乳膏发酵生产及产品贮藏过程中栅栏技术的应用
实施例2及表1结果表明，粪肠球菌CGMCC No.16677可产生高活性的细菌素GR17、有机酸等抑菌物质，并结合红曲米色素成分的抑菌活性，以及卤汁的低pH(pH4.0～5.0)、高含量酒精(15％～20％)环境条件，显著抑制杀灭腐乳膏发酵及贮藏过程中的单核增生李斯特氏菌(L.monocytogenes)、金黄色葡萄球菌(S.aereu)、大肠杆菌(E.coli)、阪崎肠杆菌(E. sakazakii)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、蜡样芽孢杆菌、假单胞菌等腐败菌及致病菌生长。
传统腐乳自然发酵过程中，发酵微生物可分解氨基酸积累生物胺。低盐腐乳膏发酵中添 加粪肠球菌、红曲霉、鲁氏接合酵母等发酵剂，具有降解生物胺活性，腐乳膏所含生物胺降 低了70％以上，消除其潜在安全风险。
腐乳膏产“白点”的综合防治。研究发现，低盐腐乳膏中蛋白质二级结构中β-折叠、α-螺旋 较传统腐乳汤汁中蛋白质分别低于13.70％、高于20.04％，说明低盐腐乳膏中蛋白肽的疏水 性明显低于传统腐乳，蛋白质水解产生酪氨酸能力减弱；研究了白芷香料对酪氨酸酶的抑制 活力，发现白芷水提液对酪氨酸酶抑制率为20.40％，白芷醇提液对酪氨酸酶抑制率为32.27％， 加入白芷香料有利于减少酪氨酸产生；酸性条件可抑制腐乳“白点”的形成；成熟腐乳膏经 400W～500W微波处理2～3min，贮存4个月后的腐乳膏样品的酪氨酸、水溶性蛋白质均无 明显增加，表明适当微波处理可有效降低酞酰酪氨酸水解酶活力，阻滞酪氨酸生成，达到抑制“白点”继续生成、防止蛋白质被过度分解等目的。
通过上述综合性栅栏技术，消除腐乳膏酿造及贮藏过程中潜在安全风险、“白点”形成，这与传统腐乳通过添加高浓度食盐达到抑菌防腐作用明显不同，具有首创性、引领性。
实施例5主要功能菌株的代谢酶活性分析与腐乳膏特征风味形成
多功能菌株协同发酵可产生所需的丰富酶系，腐乳膏后发酵过程中相关酶活力的变化见 说明书附图(图3)。使用的驯化雅致放射毛霉3.2778分泌酸性蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活 力分别为128.0U/mL、24.5U/mL、8.5U/mL；驯化米曲霉CICC2014分泌中性蛋白酶、淀粉酶、 糖化酶、单胺氧化酶活力分别为305.2U/mL、152.5U/mL、31.2U/mL、12.5U/mL，产生高活性肽酶，氨基酸脱羧酶活力低；藤黄微球菌分泌碱性蛋白酶、淀粉酶分别、谷氨酰胺酶为85.7U/mL、32.0U/mL、62.4U/mL；鲁氏接合酵母分泌的糖化酶、单胺氧化酶活力分别为58.9U/mL、26.7U/mL；粪肠球菌Gr17分泌单胺氧化酶活性为15.9U/mL。上述酶可发挥降解蛋白、淀粉、脂肪等大分子物质的作用，为腐乳膏后发酵的风味物质、滋味物质及功能成分的形成提供支撑。
腐乳膏后发酵的卤汁中外源添加了纤维素酶、木聚糖酶，可使豆坯中纤维素和木质素含 量较未添加时分别降低25.6％、28.8％，而可溶性膳食纤维含量提高27.4％；外源添加风味蛋 白酶时，腐乳膏后发酵过程中蛋白质酶解速度提高28.5％，加速了腐乳呈味肽形成，且对后苦味脱出效果明显；卤汁中添加黄浆水，利用其所含的大豆低聚糖，促进了粪肠球菌、乳球 菌属等有益乳酸菌的生长及细菌素GR17产生，也较未添加黄浆水时改善作用明显。腐乳膏 特征风味成分形成过程见说明书附图(图3)。
腐乳膏后发酵的卤汁中添加茉莉花(或杭白菊、桂花、玫瑰花、刺槐花、梨花、栀子花 等)浸膏，增加了花香成分，开发出多种花香风味低盐腐乳，丰富腐乳品类。
实施例6鲜花浸膏的制备
超声辅助提取：称取一定量新鲜或干茉莉花(或杭白菊、桂花、刺槐花、玫瑰花、梨花、 栀子花等)放入超声提取器中，按1∶(10～15)加入95％食用酒精(W/V)，于水浴80℃超声辅助提取1～2h，并与压出的花残留液合并，过滤，于水浴温度为35～42℃，真空度为0.08～ 0.09MPa条件下旋转蒸发仪减压蒸馏，制得天然鲜花食用香料浸膏，浸膏得率2.0％～2.5％。
超临界CO2萃取：干茉莉花(或桂花、刺槐花、玫瑰花、杭白菊、梨花、栀子花等)， 压力12～16MPa，温度310～320K，时间1.5～2h，浸膏得率0.25％左右。
实施例7花香低盐腐乳膏产品的感官特征、功能成分与理化分析
按照中华人民共和国商务部制定的腐乳商业行业标准SB/T 10170-2007进行检测，花香低 盐腐乳膏产品除食盐含量、总酸、水含量外，其他各指标符合其规定，其感官特征、理化及 卫生指标评价结果见表2。花香腐乳膏产品特征：食盐含量显著降低，咸淡更适口，醇香浓郁， 花香突出，无腐乳块，质地细腻均匀，膳食纤维含量高，且含有一定量Monacolin K、异黄酮、 γ-氨基丁酸(GABA)等功能成分，适于直接涂抹、调味。
按照GB 5009.208-2016食品中生物胺含量进行检测，腐乳膏中生物胺(色胺、β-苯乙胺、 腐胺、尸胺、组胺、酪胺、精胺等)总含量22.72～41.10mg/kg，较传统发酵腐乳的42.16mg/kg～ 585.40mg/kg明显降低。
表2本方法生产的花香腐乳膏的感官特征、理化及卫生指标评价
最后需要说明的是，上述描述中阐述了很多具体细节，以充分理解本发明，但本发明还 可采用其他不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可在不违背本发明内涵情况 下做类似推广，因此本发明不受上述公开的具体实施例的限制。另外，此处所称的“实施例”是指可包含于本发明至少一个实现方式中的特定特征、结构或特性。以上实施例仅用作帮助 本领域技术人员理解本发明的实质，并不用做对本发明保护范围的限定。
Claims (5)
1.一种花香低盐腐乳膏的发酵生产方法，其特征在于，所述方法为在腐乳白坯制作时，细胞破壁机对大豆与花生进行超高速磨浆、胶体磨磨浆均质；在腐乳前发酵阶段，添加驯化改良的雅致放射毛霉、红曲霉、驯化改良的米曲霉、藤黄微球菌进行多功能菌协同发酵；腐乳后发酵阶段，卤汁调制时添加黄浆水、鲜花浸膏、复合风味蛋白酶、纤维素酶、木聚糖酶，后发酵菌剂为肠球菌和鲁氏接合酵母；所述红曲霉为红曲霉(Monascus sp.)M1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.12502；所述肠球菌为粪肠球菌(Enterococcus Faecium)Gr17，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号CGMCC No.16677；所述雅致放射毛霉和米曲霉的驯化改良方法为：在PDA琼脂培养基中添加0～0.04％浓度的L-酪氨酸，接种雅致放射毛霉、米曲霉，逐渐增大L-酪氨酸浓度，反复传代15代进行驯化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述雅致毛霉(Actinomrcor elegans)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、红曲霉(Monascus sp.)、藤黄微球菌(Micrococcus luteus)的比例为(1×105～1×106)∶(1×105～1×106)∶(1×105～1×106)∶(1×106～1×107)；所述后发酵菌剂为粪肠球菌和鲁氏接合酵母，其接种量分别为1×106～1×107cfu/L、1×105～1×106cfu/L。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法为在白坯制作时，浸泡大豆于95～100℃煮制3～5分钟钝化酶去豆腥，全豆或去皮豆与适当炒制去皮花生按重量比(12～14)∶1混合，黄豆和炒制花生与水的比例为1∶(6～8)，经细胞破壁机20000～35000转/分钟磨浆10～15min、胶体磨进行磨浆均质乳化使细度达到10～30μm，再经煮浆、点浆制备得到全豆腐乳豆花白坯。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述前发酵的多功能菌发酵剂以1％～3％接种量(V/V)加入全豆腐乳豆花白坯，稀乳酸调节pH4.0～4.5，于温度30℃、80～120转/分钟条件搅拌发酵48～72h，制得腐乳毛坯。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述调制卤汁是添加黄浆水30～50ml/L、刺槐花、杭白菊、桂花、茉莉花、玫瑰花、梨花、栀子花之一的浸膏30～50g/L、复合风味蛋白酶10～15万U/L、纤维素酶10～15万U/L、木聚糖酶5～10万U/L、白芷香料细粉，使食盐浓度12.5％～15.0％(W/V)、酒精浓度38％～50％(V/V)、pH4.0～4.5；每100g所述花香低盐腐乳膏中食盐含量为3.1g～5.0g，醇香浓郁，花香突出。
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