CN104046569B - 一种高产糖化酶、α‑淀粉酶和酸性蛋白酶的塔宾曲霉及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高产糖化酶、α‑淀粉酶和酸性蛋白酶的塔宾曲霉及其在白酒酿造中的应用，所述塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)已于2014年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号是CGMCC No.8899。所述菌株能够同时高产糖化酶、α‑淀粉酶和酸性蛋白酶，属于微生物和发酵工程领域。曲霉经固态制曲，可以高产糖化酶、α‑淀粉酶和酸性蛋白酶，增加白酒酿造中淀粉和蛋白的利用率，使用该霉菌可以提高白酒的出酒率并保持较好的风味。
Description
技术领域
本发明涉及一种塔宾曲霉及其应用，特别是一种利用塔宾曲霉在提高酿酒过程中酒精产率工艺中的应用。
背景技术
细菌、酵母和霉菌是中国白酒酿造过程中的三大类微生物，其中霉菌能够分泌多种酶类并降解淀粉、蛋白质等大分子物质，为细菌和酵母的生长和发酵提供物质基础。霉菌同时也能够分泌一些酯化酶和代谢产物，对中国白酒的风味也有一定的影响。中国白酒传统酿造过程中是开放式生产，过程中涉及到复杂的霉菌群落；复杂的霉菌群落既能产生了丰富的酶系，对白酒酿造有着正面贡献，但一些环境中有害的霉菌也可能被涉及，给白酒产品的质量带来了潜在的风险。
纯种霉菌的筛选和使用已经是行业的一种趋势，纯种霉菌麸曲能够代替部分大曲，提高白酒生产的出酒率，控制有害微生物的潜在危险。目前白酒生产中常用的霉菌有河内白曲霉(Aspergillus kawachii)、米曲霉(Aspergillus oryzae)等，这些筛选的霉菌具有较高的糖化力，提高了出酒率。但是传统筛选麸曲霉菌只以糖化酶为指标，所得菌株酶系较为单一，生产的麸曲白酒的酒质比大曲酒差，通常只能用于生产中低端白酒。
糖化酶、α-淀粉酶都能够降解淀粉，他们的含量和比例会控制发酵进程的速度，控制发酵温度过快上升，使得整个微生物群落正常演变，保证白酒发酵的正常进行。白酒酿造的主要原料高粱的成分除了淀粉之外，蛋白质也是一个重要的成分(8％-10％)，是酵母细菌生长的重要物质基础，也是形成风味物质的重要前体。同时，中国白酒发酵体系是一个偏酸的环境，在发酵结束的时候pH最低能够达到3.5，因此酸性蛋白酶也在白酒发酵过程中起到了重要的作用。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种高产糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶的塔宾曲霉及其在酿造白酒中的应用，以适应白酒发酵的过程，提高酒精的产率。
塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)，于2014年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.8899。
本发明所得塔宾曲霉的ITS rDNA序列，在GenBank中进行Blast对比确定其种属，与其同源序列最高的菌株为Aspergillus tubingensis，相似度为97％。
所述塔宾曲霉在PDA培养基上生长，菌落开始为白色，圆形，向四周扩散，然后从菌落中间开始产生白色孢子，最后整个菌落全部变成白色略带红色。菌丝细密。本菌株适应性很强，孢子在PDA培养及平板上30℃萌发，培养3d，菌落直径为4.2-6.5cm。
本发明菌株高产糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶，其发酵工艺为：
种子(PDA)培养基：马铃薯先洗净去皮,再称取200g马铃薯切成小块，加水煮烂(煮沸20-30min)用八层纱布过滤，加20g琼脂，葡萄糖20g，再补足水分至1000毫升，121℃灭菌20min冷却后贮存备用；
发酵培养基：称取新鲜麸皮(或者其他粉碎原料)并加水，使水分含量约为50％，121℃灭菌20min；
种子培养方法：挑取一环塔宾曲霉的孢子，接种于种子培养基斜面，30℃培养3d-7d；
发酵培养方法：250ml锥形瓶装培养基20g，将活化的孢子悬浮液接入灭过菌的发酵培养基并使最终浓度为5×106个/g麸皮，30℃静止培养48h-72h。
测定酶活如下：
菌株在白酒酿造中的应用，将活化的孢子悬浮液接种(一级种子)固体培养基中(1-5％，w/w)，在25-35℃环境中固态发酵32-72h，制成固态菌制剂，再将固态菌制剂作为种子接种到曲池中(二级种子)进行扩大培养24-72h，二级种子按照5-20％w/w接种量加入白酒生产中。
菌株在白酒酿造中的应用，将活化的孢子悬浮液接种于灭菌的液态培养基(1-5％，w/w)，25-35℃培养24h-72h。制成液态菌制剂，再将液态菌制剂作为种子接种到曲池中(二级种子)进行扩大培养24-72h，二级种子按照5-20％w/w接种量加入白酒生产中。
固态原料培养基，原料包括高粱、麸皮、小麦、大麦、豌豆、大米、玉米、糯米、青稞或其组合。
液体培养基为液态原料提取物，原料包括：高粱、麸皮、小麦、大麦、豌豆、大米、玉米、糯米、青稞或其组合。
在白酒酿造过程中以固态接种或者液态接种的形式加入所述曲霉，最终发酵会可以将白酒出酒率从20-28％提高到25-33％，淀粉利用率提高3％，并保持酒的风格和风味。
塔宾曲霉可以自身可以高产糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶，增加白酒酿造中淀粉和蛋白的利用率，改善出酒率。
本发明还提供了高产糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶的塔宾曲霉及其在白酒酿造中的应用。在酿酒过程中加入该菌所制的固态发酵菌剂，能够提高原料中的淀粉和蛋白质的利用率，提高出酒率，同时保持白酒产品的风味和风格。
生物材料保藏
塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)，于2014年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.8899。
具体实施案例
实施例1：塔宾曲霉与某商业化糖化霉菌SC1和ZKY1固态发酵产糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶的比较研究
将所述塔宾曲霉接种于麸皮固态发酵培养基中，30℃恒温发酵72h，测定固态发酵菌制剂的酶活，其具体方法如下：
1.样品准备：称取5.0g固体发酵培养基(干重)，置入250ml烧杯中，加90ml水和10mlpH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液，摇匀，于40℃水浴中保温1h，每隔15min搅拌一次。用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。
2.糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶测定：参照沈怡方《白酒生产技术全书》和QBT4257-2011酿酒大曲通用分析方法。
该株塔宾曲霉固态发酵菌制剂中的3种酶活分别为：糖化酶2473.4±148.6U/g、α-淀粉酶1545.3±253.6U/g和酸性蛋白酶410.1±116.8U/g。相比于商业菌株SICC3.917，本发明提供的塔宾曲霉的酸性蛋白酶活力高出2倍，糖化酶活力相近，α-淀粉酶也高出500U/g；相比于CGMCC3.05232菌株，糖化酶与α-淀粉酶活力都高出2倍。
表1不同霉菌的产酶能力
实例2：提高白酒原料淀粉利用率和出酒率，并保持白酒风味
将塔宾曲霉(CGMCC No.8899)于PDA斜面培养，收集孢子然后经过三级扩大培养(三角瓶、浅盘制曲和曲池制曲)制霉菌麸曲，按照7％(w/w)使用量添加到已经混合好大曲的酒醅中，然后继续按传统工艺发酵。
分析结果如表2所示，与只使用大曲的对照组相比，添加塔宾曲霉(CGMCCNo.8899)的实验组中淀粉利用率和出酒率明显提高：淀粉残留分别降低了3％白酒出酒率分别3.5％。将两个组所产白酒的香气和口味进行品评打分，实验组保留较好的香气和口味，与只使用大曲的实验组相差不多大(表3)。
表2.实验组与对照组淀粉残留和出酒率比较
表3.实验组与对照组品评结果比较
Claims (9)
1.一株高产糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶的塔宾曲霉(Aspergillu tubingensis)，于2014年3月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.8899。
2.权利要求1所述塔宾曲霉(Aspergillus tubingensis)在白酒酿造中的应用。
3.权利要求2所述的应用，其特征在于所述塔宾曲霉高产糖化酶、α-淀粉酶和酸性蛋白酶，能增加白酒酿造中淀粉和蛋白的利用率，改善出酒率。
4.如权利要求2或3所述的应用，其特征在于将活化的塔宾曲霉孢子悬浮液接种至固体培养基，接种浓度为1-5％w/w，在25-35℃环境中固态发酵32-72h，制成固态菌制剂，再将固态菌制剂作为种子接种到曲池中进行扩大培养24-72h，二级种子按照5-20％w/w接种量加入白酒生产中。
5.权利要求2所述的应用，其特征在于将活化的塔宾曲霉孢子悬浮液接种于灭菌的液态培养基，接种浓度为1-5％w/w，25-35℃培养24h-72h，制成液态菌制剂，再将液态菌制剂作为种子接种到曲池中进行扩大培养24-72h，二级种子按照5-20％w/w接种量加入白酒生产中。
6.权利要求4所述的应用，其特征在于，固态原料培养基，原料包括高粱、麸皮、小麦、大麦、豌豆、大米、玉米、糯米、青稞或其组合。
7.权利要求5所述的应用，其特征在于，液态培养基为原料提取物，原料包括高粱、麸皮、小麦、大麦、豌豆、大米、玉米、糯米、青稞或其组合。
8.权利要求2所述的应用，其特征在于所述塔宾曲霉以固态接种或者液态接种的形式加入。
9.权利要求2所述的应用，其特征在于所述塔宾曲霉可以将白酒出酒率从20-28％提高到25-33％，淀粉利用率提高3％-5％，并保持酒的风味。
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