CN105255745A - 一株产β-葡萄糖苷酶根霉及其发酵产酶方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株产β-葡萄糖苷酶根霉及其发酵产酶方法，该菌株可以豆粕、硫酸铵、尿素、氯化铵为氮源，以麸皮汁、乳糖、淀粉糖、稻草秸秆、玉米秸秆等为碳源经液态发酵生产β-葡萄糖苷酶，所生产的β-葡萄糖苷酶可以被应用于生物质能源、纺织和食品等方面。发酵产β-葡萄糖苷酶方法具有发酵周期短、耗时短、效率高的特点。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种匍枝根霉及其筛选方法、匍枝根霉作为生产β-葡萄糖苷酶的应用、β-葡萄糖苷酶的生产方法。
背景技术
纤维素酶是由三种不同的酶组成的多酶复合物：外切葡聚糖酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶(BGL)，三种酶协同作用完成对纤维素的水解。目前使用的纤维素酶生产菌株由于β-葡萄糖苷酶活力相对较低，大幅度限制了纤维素酶对纤维质的总体水解速率，使得β-葡萄糖苷酶作为纤维素酶水解纤维素过程的限速酶而成为酶解木质纤维素生产燃料乙醇的技术瓶颈。
β-葡萄糖苷酶(EC3.2.1.21，BGL)，又称β-D-1，4-葡萄糖苷水解酶，常与内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4,EG)和纤维二糖水解酶(EC3.2.191，CBHs)共同构成一组可对纤维素进行高效协同作用的纤维素酶系。β-葡萄糖苷酶可将纤维二糖彻底水解并释放葡萄糖，同时该酶常因微生物自然分泌量的不足而成为整个纤维素酶系水解过程中的主要限速酶。β-葡萄糖苷酶对纤维二糖的水解活性最强，但由于β-葡萄糖苷酶对底物(糖基)部分结构的专一性较差，使得β-葡萄糖苷酶不仅能够使C-O、C-S、C-N和C-F等键断裂，还可以水解β-半乳糖苷键，甚至由于对糖分子结构中C6位的专一性不高而能够水解木糖，这使得β-葡萄糖苷酶除了可以与其它纤维素酶组分协同水解纤维素外，还可以单独在糖苷转移或水解、制茶以及食品增香等多个领域使用。
β-葡萄糖苷酶广泛分布于细菌、霉菌、酵母、植物和动物等物种中，其中小型丝状真菌由于产量高、酶系丰富、易于廉价培养和发酵控制等特点，被认为是β-葡萄糖苷酶良好的生产菌株。目前关于β-葡萄糖苷酶生产和研究的丝状真菌主要有木霉属、曲霉属和青霉属微生物，但是它们的发酵周期一般在6d以上，具有耗时长、效率低等特点。
发明内容
针对以上不足，本发明提供了一种匍枝根霉及其筛选方法、匍枝根霉作为生产β-葡萄糖苷酶的应用、β-葡萄糖苷酶的生产方法，该匍枝根霉菌株可以豆粕、硫酸铵、尿素、氯化铵为氮源，以麸皮汁、乳糖、淀粉糖、稻草秸秆、玉米秸秆等为碳源经液态发酵生产β-葡萄糖苷酶，所生产的β-葡萄糖苷酶可以被应用于生物质能源、纺织和食品等方面。
匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)TP-02，保藏编号为：CGMCCNo.11119。保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年7月16日，保藏地址为：中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)TP-02是从黄山腐木中筛选得到的。该菌株在土豆培养基平板上生长速度快，生长初期菌丝为白色，培养后期产生大量黑褐色分生孢子。
本发明还提供了匍枝根霉的菌种筛选方法，包括以下步骤：培养基平板初筛、摇瓶复筛、发酵培养、菌种鉴定。
所述培养基平板初筛所用培养基平板的配方为：每L培养基含有：土豆浸出汁20g，葡萄糖20g，卡那霉素100mg，琼脂粉20g；
所述摇瓶复筛所用种子培养基的配方为：每L培养基含有：土豆浸出汁200g，乳糖10g；
所述发酵培养所用发酵培养基的配方为：每L培养基含有：稻草秸秆10g，5％麸皮浸出汁100g，(NH4)2SO43g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O1g，CaCl22g，失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚0.025g。
本发明还提供了匍枝根霉作为生产β-葡萄糖苷酶的应用。
本发明还提供了一种β-葡萄糖苷酶的生产方法。该方法具有发酵周期短、耗时短、效率高的特点。
其技术方案为：一种β-葡萄糖苷酶的生产方法，包括以下步骤：
(a)制备种子培养液，将权利要求1所述的匍枝根霉在种子培养基中培养后进行接种；
(b)使用产β-葡萄糖苷酶培养基液态发酵β-葡萄糖苷酶。
(c)使用primeplus纯化系统对β-葡萄糖苷酶进行纯化
所述步骤(a)具体包括：菌种在斜面培养基中培养3d后用无菌水洗下孢子，使用血球计数板计算孢子数并稀释至1×105个/mL。按1％体积接种量接入种子培养基中，于30℃、200rpm条件下培养24h后作为种子液备用，使用-80℃超低温甘油冻结管保藏法保藏种子液。
取-80℃超低温甘油冻结管置25-32℃室温溶解，并划线接种于斜面培养基，于30℃培养培养3d后用无菌水洗下菌丝或孢子，每个平板使用5mL无菌水进行洗涤，将洗涤后获得的菌丝悬液接入种子培养基中，洗涤后获得的菌丝悬液与种子培养基的体积比为1:24，30℃、200rpm/min恒温培养24h后，即可得到种子培养液。
所述斜面培养基配方：每L培养基含有：土豆浸出汁200g，葡萄糖20g，琼脂20g。
所述种子培养基配方：每L培养基含有：土豆浸出汁200g，葡萄糖20g，琼脂20g，pH6.0。
所述步骤(b)具体包括：
将步骤(a)得到的种子培养液接种到产β-葡萄糖苷酶培养基中，种子培养液与产β-葡萄糖苷酶培养基的体积比为1:9～14，30℃、200～350rpm/min、PH5.5～6.0的培养条件下培养88h。
所述产β-葡萄糖苷酶培养基的配方为：每L培养基含有：80～120目5～15g的玉米秸秆、稻草、或麦秆，5％麸皮浸出汁80～120g，(NH4)2SO425～30g，KH2PO410g，MgSO4·7H2O5～10g，CaCl210～20g，失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚0.1～0.25g，FeSO4·7H2O0.005g，MnSO4·H2O0.00156g，ZnSO4·7H2O0.0014g，CoCl20.002g。
所述5％麸皮浸出汁的制备方法为：50g麸皮，煮沸30分钟，4层纱布过滤，定容至1000mL。
所述步骤(c)具体包括：
发酵88h后结束发酵，并使用4层纱布过滤去除发酵液中的菌丝体等大型固体物，过滤液在4℃、5000r/min条件下离心30min，收集上清液，即制得β-葡萄糖苷酶粗酶液。粗酶液经70％饱和硫酸铵盐析后使用超纯水溶解沉淀并经透析过夜后于4℃、10000r/min高速离心10min，取上清并使用0.22μm微孔滤膜过滤。
使用primeplus纯化系统对滤过液进行纯化。粗酶液上样于SephadexG-100柱子，洗脱液为pH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，洗脱梯度为15ml/h；收集含β-葡萄糖苷酶的洗脱峰经HitrapTMdesalting(GE)柱脱盐并真空冷冻干燥；使用pH7.0的Tris-HCl缓冲液溶解酶粉并上样于HitrapTMDEAE-SepharoseFF(GE)柱，使用20mmol/LTris-HCl缓冲液(0.1～1.0mol/LNaCl，pH7.0)进行梯度洗脱；收集含β-葡萄糖苷酶的洗脱峰再经HitrapTMdesalting(GE)柱脱盐并真空冷冻干燥，使用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解酶粉并上样于HitrapTMCM-SepharoseF(GE)柱，收集含β-葡萄糖苷酶的洗脱峰并进行酶活力测定和SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)测定。对纯化酶液进行再脱盐和真空冷冻干燥以制备β-葡萄糖苷酶酶粉备用。
该β-葡萄糖苷酶活力的检测方法为：
采用水杨苷法测定：准确吸取酶液0.5mL，加入1mL1％水杨苷(w/v)及0.5mLpH4.8的0.05mol/L柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液，于50℃保温30min后加入3mLDNS试剂，沸水浴加热10min，冷却后加水稀释至25mL，测定520nm处吸光值。
所述酶液的制备方法为：将纯化后获得的β-葡萄糖苷酶酶粉用pH4.8的0.05mol/L柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液稀释成0.1～1U/mL的酶液。
所述1％水杨苷的制备方法为：将1g水杨苷溶于100mLpH4.8的0.05mol/L柠檬酸—柠檬酸钠缓冲溶液而制得。
β-葡萄糖苷酶活力单位定义：在上述反应条件下，每分钟水解生成1μmol葡萄糖所需的酶量为1个酶活国际单位(IU)。
本发明中提供的菌种及液态发酵产β-葡萄糖苷酶方法与其它菌种和液态发酵制备β-葡萄糖苷酶方法相比较具有以下优点：
1.菌种生长速度快，产酶速率高，发酵时间短，在4d内可结束发酵。
2.菌种为野生菌，活力旺盛，不易染菌，易于纯培养。
3.菌种可利用农业副产物如麸皮汁、稻草秸秆、麦秸秆、玉米秸秆发酵产β-葡萄糖苷酶，营养基质利用范围广且成分廉价、易得。
4.重复发酵性能稳定，发酵活力达16IU/mL以上。
5.发酵pH适应范围广，工艺控制简单。
6.酶液在60℃以下热稳定性良好，在pH4.0～7.0范围内稳定性较好。
附图说明
图1匍枝根霉菌株TP-02菌落照片(左)和孢子电镜照片(右)；
图2匍枝根霉菌株TP-02系统进化树；
图3匍枝根霉菌株TP-02发酵产β-葡萄糖苷酶曲线；
图4β-葡萄糖苷酶分离纯化SDS-PAGE图，M：蛋白质分子量标准；4-7：纯化后β-葡萄糖苷酶样品；
图5温度对β-葡萄糖苷酶活性的影响；
图6pH对β-葡萄糖苷酶活性的影响；
图7金属离子对β-葡萄糖苷酶活性的影响；
具体实施方式
实施例1
匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)TP-02，保藏编号为：CGMCCNo.11119。保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2015年7月16日，保藏地址为：中国科学院微生物研究所，北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
所述匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)TP-02是从黄山腐木中筛选得到的。该菌种筛选方法为：
1平板初筛
使用无菌水对采集的自然样进行洗涤或打碎混匀后进行10-1、10-2和10-3等梯度稀释，分别取0.2mL梯度稀释液涂布于无菌的固体筛选培养基平板(每L培养基含有：土豆浸出汁20g，葡萄糖20g，卡那霉素100mg，琼脂粉20g)。将涂布后的平板放置于30℃恒温培养箱中培养3d，挑取丝状真菌菌丝或孢子点种新培养基平板并使用-80℃超低温甘油冻结管保藏法分别保藏所得菌株。
2摇瓶复筛与发酵培养
将筛选获得的β-葡萄糖苷酶产生菌株划线接种斜面培养基(每L培养基含有：土豆浸出汁200g，葡萄糖20g，琼脂20g)。并于30℃恒温培养箱中培养3d后，每个平板使用5mL无菌水进行洗涤，吸取2mL洗涤后获得的菌丝或孢子悬液接入48mL种子培养基(每L培养基含有：土豆浸出汁200g，乳糖10g)中，接种后种子培养基装液量为250mL三角瓶装50mL培养基。接种后置于震荡恒温培养中培养，培养温度为30℃，摇床转速为200rpm，培养24h。
吸取5mL种子培养液接种于45mL液态发酵培养基(每L含有：稻草秸秆10g，5％麸皮浸出汁100g，(NH4)2SO43g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O1g，CaCl22g，Tween800.025g)，接种后发酵培养基装基装液量为250mL三角瓶装50mL培养基。接种后置于震荡恒温培养中培养，培养温度为30℃，摇床转速为200rpm/min，培养5d，期间每12h从发酵液中吸取1mL液体并对其β-葡萄糖苷酶活力进行测定。
3菌种鉴定
经上述两种方法对自然样本进行反复筛选和比较，最终获得一株发酵周期较短、产β-葡萄糖苷酶活力较高菌株，经菌落形态学观察、显微形态观察(图1)和分子生物鉴定(图2)将该菌株鉴定为匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)，并命名为：匍枝根霉TP-02(RhizopusstoloniferTP-02)。
所述所述匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)TP-02的分子生物学鉴定方法为：
(1)根霉染色体提取
使用CTAB抽提法，具体步骤如下：
①把分离到的菌种接种到斜面培养基培养3d至长出孢子，转接到液体PDA种子液中培养36h，离心收集菌体，用无菌水洗涤菌体至洗液澄清，真空冷冻干燥；②取冷冻干燥的菌体，放于预冷的研钵中，快速充分研磨；③加入1mL65℃预热的CTAB和100μLSDS，充分混匀后在65℃水浴中保温40min，每8min轻柔混匀一次；④10000rpm/min，4℃，离心10min，收集上清液；⑤加入等体积的酚：氯仿(酚和氯仿按体积比1:1混合)，轻柔混匀1min，10000rpm/min，4℃离心5min，收集上清液；⑥往上清液中加入等体积的氯仿抽提，轻柔混匀，10000rpm/min，4℃离心5min，收集上清液；⑦上清液加入2.5倍体积的无水乙醇，室温沉淀20min后，10000rpm/min，4℃离心10min，收集核酸沉淀；⑧加入1mL75％乙醇洗涤沉淀，10000rpm/min，4℃离心5min；⑨吸去上清，将离心管倒扣于干净的纸巾上，室温干燥DNA沉淀15min。加入20μL重蒸水，-20℃备用。
(2)根霉菌5.8SrDNA-ITS基因PCR扩增和序列测定
以CTAB抽提法获得的染色体DNA为模板，以5.8SrDNA-ITS区域通用引物(ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'，ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3')为扩增引物，使用PCR方法获得菌株5.8SrDNA-ITS基因片段。
PCR扩增体系(50μl)如下：
将PCR产物连接载体pUCm-T，并转化EscherichiacoliDH5α感受态细胞，抽提重组质粒并委托生工生物工程(上海)股份有限公司完成目的基因的序列测定，测定序列见SEQUENCELISTING1。
(3)系统进化树构建
将菌株的5.8SrDNA-ITS基因片段测序结果通过在线数据库Blast/blastp(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)对测定序列进行比对，选取相近序列并使用BioEdit软件进行多重比对，比对结果通过软件MEGA5.1利用Neighbor-Joining(NJ)法构建系统发育树，结合形态学观察结果将该分离菌株鉴定为匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)。
实施例2
采用实施例1得到的匍枝根霉生产β-葡萄糖苷酶。
β-葡萄糖苷酶的生产方法为：
(a)制备种子培养液，将匍枝根霉在种子培养基中培养后进行接种；
取-80℃超低温甘油冻结管置25-32℃室温溶解并划线接种于斜面培养基(每L培养基含有：土豆浸出汁200g，葡萄糖20g，琼脂20g)，于30℃培养培养3d后用无菌水洗下菌丝或孢子，每个平板使用5mL无菌水进行洗涤，吸取2mL洗涤后获得的菌丝悬液接入48mL种子培养基中(每L培养基含有：土豆浸出汁200g，葡萄糖20g，琼脂20g，pH6.0)，接种后种子培养基装液量为250mL三角瓶装50mL培养基。培养条件：培养温度为30℃，摇床转速为200rpm，恒温培养24h后即可制得产酶种子培养液。
(b)使用产β-葡萄糖苷酶培养基液态发酵β-葡萄糖苷酶；
在250mL三角瓶装45mL产β-葡萄糖苷酶培养基，接入5mL种子培养液并置于震荡恒温培养中培养中。培养条件：培养温度为30℃，摇床转速为200rpm/min。在上述培养条件下，培养88h后，发酵液中的β-葡萄糖苷酶活力为13IU/mL。
每L产β-葡萄糖苷酶培养基含有：80目的玉米秸秆10g，5％麸皮浸出汁100g，KH2PO410g，(NH4)2SO425g，MgSO4·7H2O5g，CaCl210g，Tween800.1g，FeSO4·7H2O0.005g，MnSO4·H2O0.00156g，ZnSO4·7H2O0.0014g，CoCl20.002g，pH6.0。
(c)使用primeplus纯化系统对滤过液进行纯化
发酵88h后结束发酵，并使用4层纱布过滤去除发酵液中的菌丝体等大型固形物，过滤液在4℃、5000r/min条件下离心30min，收集上清液即制得β-葡萄糖苷酶粗酶液。粗酶液经70％饱和硫酸铵盐析后使用超纯水溶解沉淀并经透析过夜后于4℃、10000r/min高速离心10min，取上清液并使用0.22μm微孔滤膜过滤。
使用primeplus纯化系统对滤过液进行纯化。粗酶液上样于SephadexG-100柱子，洗脱液为pH4.8的醋酸-醋酸钠缓冲液，洗脱梯度为15ml/h；收集含β-葡萄糖苷酶的洗脱峰经HitrapTMdesalting(GE)柱脱盐并真空冷冻干燥；使用pH7.0的Tris-HCl缓冲液溶解酶粉并上样于HitrapTMDEAE-SepharoseFF(GE)柱，使用20mmol/LTris-HCl缓冲液(0.1～1.0mol/LNaCl，pH7.0)进行梯度洗脱；收集含β-葡萄糖苷酶的洗脱峰再经HitrapTMdesalting(GE)柱脱盐并真空冷冻干燥，使用pH4.0的醋酸-醋酸钠缓冲液溶解酶粉并上样于HitrapTMCM-SepharoseF(GE)柱，收集含β-葡萄糖苷酶的洗脱峰并进行酶活力测定和SDS-PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)。对纯化酶液进行再脱盐和真空冷冻干燥以制备β-葡萄糖苷酶酶粉备用。
实施例3
采用实施例1得到的匍枝根霉生产β-葡萄糖苷酶。
产酶种子培养液的制备方法同实施例2。
β-葡萄糖苷酶的生产方法为：
在10L发酵罐中装7L产β-葡萄糖苷酶培养基，接入500mL种子培养液进行发酵。发酵条件：培养温度为30℃，搅拌转速为350r/min，通气量为5vvm，罐压为0.02MPa，通过流加氨水控制pH在5.5～6.0范围内。在上述培养条件下，培养88h后，发酵液中的β-葡萄糖苷酶活力为11IU/mL。
每L产β-葡萄糖苷酶培养基含有：80目的稻草秸秆5g，5％麸皮浸出汁(50g麸皮，煮沸30分钟，4层纱布过滤，定容至1000mL)80g，(NH4)2SO430g，KH2PO410g，MgSO4·7H2O10g，CaCl220g，Tween800.25g，FeSO4·7H2O0.005g，MnSO4·H2O0.00156g，ZnSO4·7H2O0.0014g，CoCl20.002g。
β-葡萄糖苷酶的纯化方法同实施例2。
实施例4
采用实施例1得到的匍枝根霉生产β-葡萄糖苷酶。
产酶种子培养液的制备方法与实施例2相同。
β-葡萄糖苷酶的生产方法为：
在10L发酵罐中装7L产β-葡萄糖苷酶培养基，接入500mL种子培养液进行发酵。发酵条件：培养温度为30℃，搅拌转速为350r/min，通气量为5vvm，罐压为0.02MPa，通过流加氨水控制pH在5.5～6.0范围内。在上述培养条件下，培养88h后，发酵液中的β-葡萄糖苷酶活力为15IU/mL。
每L产β-葡萄糖苷酶培养基含有：80目的玉米秸秆10g，5％麸皮浸出汁(50g麸皮，煮沸30分钟，4层纱布过滤，定容至1000mL)100g，(NH4)2SO430g，KH2PO410g，MgSO4·7H2O10g，CaCl220g，Tween800.25g，FeSO4·7H2O0.005g，MnSO4·H2O0.00156g，ZnSO4·7H2O0.0014g，CoCl20.002g。
β-葡萄糖苷酶的纯化方法同实施例2。
实施例5
采用实施例1得到的匍枝根霉生产β-葡萄糖苷酶。
产酶种子培养液的制备方法与实施例2相同。
β-葡萄糖苷酶的生产方法为：
在10L发酵罐中装7L产β-葡萄糖苷酶培养基，接入500mL种子培养液进行发酵。发酵条件：培养温度为30℃，搅拌转速为350r/min，通气量为5vvm，罐压为0.02MPa，通过流加氨水控制pH在5.5～6.0范围内。在上述培养条件下，培养88h后，发酵液中的β-葡萄糖苷酶活力为16IU/mL。
每L产β-葡萄糖苷酶培养基含有：120目的稻草秸秆15g，5％麸皮浸出汁(50g麸皮，煮沸30分钟，4层纱布过滤，定容至1000mL)100g，(NH4)2SO430g，KH2PO410g，MgSO4·7H2O10g，CaCl220g，Tween800.25g，FeSO4·7H2O0.005g，MnSO4·H2O0.00156g，ZnSO4·7H2O0.0014g，CoCl20.002g。
β-葡萄糖苷酶的纯化方法同实施例2。纯化后测得该酶分子量为52kDa，如图4所示。
实施例6
采用实施例1得到的匍枝根霉生产β-葡萄糖苷酶。
产酶种子培养液的制备方法与实施例2相同。
β-葡萄糖苷酶的生产方法为：
在10L发酵罐中装7L产β-葡萄糖苷酶培养基，接入500mL种子培养液进行发酵。发酵条件：培养温度为30℃，搅拌转速为350r/min，通气量为5vvm，罐压为0.02MPa，通过流加氨水控制pH在5.5～6.0范围内。在上述培养条件下，培养88h后，发酵液中的β-葡萄糖苷酶活力为14.5IU/mL。
每L产β-葡萄糖苷酶培养基含有：120目的稻草秸秆5g，5％麸皮浸出汁(50g麸皮，煮沸30分钟，4层纱布过滤，定容至1000mL)120g，(NH4)2SO430g，KH2PO410g，MgSO4·7H2O10g，CaCl220g，Tween800.25g，FeSO4·7H2O0.005g，MnSO4·H2O0.00156g，ZnSO4·7H2O0.0014g，CoCl20.002g。
β-葡萄糖苷酶的纯化方法同实施例2。
实施例7
本实施例为匍枝根霉β-葡萄糖苷酶基本酶学性质试验
(1)β-葡萄糖苷酶最适作用温度及温度稳定性
分别在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃条件下测定β-葡萄糖苷酶活性，以最高酶活力测定值为100％计算标准相对活力，以确定反应温度对酶活力的影响；分别将酶液在30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃和90℃条件下分别保温30min后，立即在0℃冰箱中冷却，然后测定残留酶活力，以未经过保温处理的酶活性作为评价热稳定性的指标。结果表明该酶最适反应温度为55℃，在50℃-60℃之间保持90％以上的酶活力，在30℃-50℃之间都保持较高酶活，达到92％以上，如图5所示。
(2)β-葡萄糖苷酶最适作用pH及pH稳定性
分别在pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0条件下测定酶活力，以最高酶活力测定值为100％计算标准相对活力，以确定反应pH对酶活力的影响；将酶液分别使用pH3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0和9.0的缓冲液稀释并保温30min后测定残余酶活力，以最高测定值为100％计算相对酶活，以确定pH对酶活力损失的影响。结果表明该酶最适反应pH为5.0，在pH为4.0和6.0时，能分别具有40％和72％的相对酶活，在pH为4.0-7.0环境中较为稳定，都能保持80％以上的活性。如图6所示。
(3)金属离子对β-葡萄糖苷酶催化活性的影响
在50℃，pH5.0的条件下，在酶促反应液中加入10mmol/L的Hg2+，Mg2+，Ca2+，K+，Cu2+，Mn2+，Fe2+和Zn2+，测定这些金属离子对该酶活性的影响。结果表明在相同浓度和反应条件下，Mg2+、Mn2+和Fe2+对该酶的活性有促进作用，其中Mg2+增强作用最明显，相对酶活达到了130％，而Hg2+、Ca2+、K+、Cu2+和Zn2+则对该酶活性有抑制作用，如图7所示。
Claims (10)
1.匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)TP-02，保藏编号为：CGMCCNo.11119。
2.根据权利要求1所述的匍枝根霉的菌种筛选方法，其特征在于，所述筛选方法包括以下步骤：培养基平板初筛、摇瓶复筛、发酵培养、菌种鉴定；
所述培养基平板初筛所用培养基平板的配方为：每L培养基含有：土豆浸出汁20g，葡萄糖20g，卡那霉素100mg，琼脂粉20g；
所述摇瓶复筛所用种子培养基的配方为：每L培养基含有：土豆浸出汁200g，乳糖10g；
所述发酵培养所用发酵培养基的配方为：每L培养基含有：稻草秸秆10g，5％麸皮浸出汁100g，(NH4)2SO43g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O1g，CaCl22g，失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚0.025g。
3.根据权利要求1所述的匍枝根霉作为生产β-葡萄糖苷酶的应用。
4.一种β-葡萄糖苷酶的生产方法，其特征在于：所述生产方法包括以下步骤：
(a)制备种子培养液，将权利要求1所述的匍枝根霉在种子培养基中培养后进行接种；
(b)使用产β-葡萄糖苷酶培养基液态发酵β-葡萄糖苷酶；
(c)使用primeplus纯化系统对β-葡萄糖苷酶进行纯化。
5.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，所述步骤(a)具体包括：
菌种在斜面培养基中培养3d后用无菌水洗下孢子，使用血球计数板计算孢子数并稀释至1×105个/mL，按1％体积接种量接入种子培养基中，于30℃、200rpm/min条件下培养24h后作为种子液备用，使用-80℃超低温甘油冻结管保藏法保藏种子液；
取-80℃超低温甘油冻结管置25-32℃室温溶解并划线接种于斜面培养基，于30℃培养培养3d后用无菌水洗下菌丝或孢子，每个平板使用5mL无菌水进行洗涤，将洗涤后获得的菌丝悬液接入种子培养基中，洗涤后获得的菌丝悬液与无菌种子培养基的体积比为1:24，30℃、200rpm/min恒温培养24h后，即可得到种子培养液。
6.根据权利要求4或5所述的生产方法，其特征在于，所述种子培养基的配方为：每L种子培养基含有：土豆浸出汁200g，葡萄糖20g，琼脂20g，pH6.0。
7.根据权利要求5所述的生产方法，其特征在于，所述斜面培养基的配方为：每L培养基含有：土豆浸出汁200g，葡萄糖20g，琼脂20g。
8.根据权利要求4所述的生产方法，其特征在于，所述步骤(b)具体包括：将步骤(a)得到的种子培养液接种到产β-葡萄糖苷酶培养基中，种子培养液与产β-葡萄糖苷酶培养基的体积比为1:9～14，30℃、200～350rpm/min、PH5.5～6.0的培养条件下培养88h。
9.根据权利要求4或8所述的生产方法，其特征在于，所述产β-葡萄糖苷酶培养基的配方为：每L培养基含有：80～120目5～15g的玉米秸秆、稻草、或麦秆，5％麸皮浸出汁80～120g，(NH4)2SO425～30g，KH2PO410g，MgSO4·7H2O5～10g，CaCl210～20g，失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚0.1～0.25g，FeSO4·7H2O0.005g，MnSO4·H2O0.00156g，ZnSO4·7H2O0.0014g，CoCl20.002g。
10.根据权利要求9所述的生产方法，其特征在于，所述5％麸皮浸出汁的制备方法为：50g麸皮，煮沸30分钟，4层纱布过滤，定容至1000mL。
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