CN104312928B - 一株产纤维素酶菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株产纤维素酶的菌株，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8339，类命名为：青霉菌株Penillium piceum H16。所述青霉菌株是将在秸秆中筛选得到的菌株Penillium piceum 9‑3为出发菌株经诱变处理后得到的。本发明将Penillium piceum 9‑3做为出发菌株诱变育种，选育得到一株产高活力纤维素酶的青霉菌株Penillium piceum H16，所述青霉菌株H16发酵得到的纤维素酶粗酶液，其滤纸酶活力达到7IU/mL，β‑葡萄糖苷酶酶活力达到50IU/mL。通过将所述青霉菌株H16和里氏木霉RUT‑C30的不同纤维素酶系进行不同配比研究，得出在最优配比时大幅度高了酶活以及对微晶纤维素的水解率，降低了用酶成本。

Description

一株产纤维素酶菌株及其应用
技术领域
本发明微生物学领域，特别涉及一株产纤维素酶菌株及其应用。
背景技术
人类进入21世纪以来，在能源、资源、环境等方面面临着越来越严峻的挑战。纤维素是地球上最大的可再生性有机资源，利用这些廉价的、可再生的植物纤维素原料来生产生物基产品以及生物质能，对人类的可持续发展是非常有利的。纤维素是植物细胞壁的主要成分，是自然界中分布最广、含量最多的一种多糖，占植物界碳含量的50％以上。在我国，每年有数亿吨的农作物秸秆被焚烧掉，既污染了环境又浪费了资源。目前纤维素糖化的方法主要有酸解法和酶解法，但酸解法有耗能大、对设备损耗大、污染大等缺点，因此酶解法将是纤维素酶糖化的主要趋势。但由于纤维素酶的生产成本过高，导致木质纤维素降解成本过高，使得无法真正实现工业化。因此，为了提高酶水解效率，降低工业生产中纤维素酶的成本，世界各国科学家围绕纤维素酶展开了广泛的研究，包括菌株的筛选、发酵工艺的优化等等。
纤维素酶是使纤维素降解生成葡萄糖的一组酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶的三个组分经过协同作用，将大分子的纤维素降解为低分子量的寡糖、双糖或多糖。纤维素酶广泛的应用于食品加工业、酿造业、造纸工业、饲料添加剂、纺织工业、医药领域、植物细胞融合等方面。
目前，纤维素酶的生产方法一般是固态发酵和液态发酵。固态发酵成本低，但易污染杂菌，不易提取，难以进行大规模工业化生产。而液态发酵，属于密闭式发酵，发酵过程中不易污染，且发酵条件以控制，后期分离提取 酶液简便，因此便于大规模生产。生产高活性的纤维素酶除具有优良的发酵工艺路线，包括培养基、发酵时间、发酵温度等，最关键的因素是选育高产菌株。
纤维素酶的产生菌包括细菌、真菌、酵母菌等，但目前主要用于纤维素酶生产的菌种主要为丝状真菌。丝状真菌产生的纤维素酶酶系较全，且其产生的酶多为胞外酶，便于后期的分离提取。目前研究较多的菌包括木霉、曲霉等，例如里氏木霉、黑曲霉，尤以木霉属最为受关注，而对青霉属的报道较少。本发明所表述的即为一株高产纤维素酶的青霉属菌株。
发明内容
本发明目的在于提供一株产纤维素酶菌株。本发明是利用诱变方法对出发菌株进行诱变筛选出更高产的纤维素酶菌株，并且所述纤维素酶的酶活力得到了很大提高。本发明对仪器设备要求低，操作简单，很大程度上降低了用酶成本。
为实现上述目的，本发明所采取的技术方案为：
一株产纤维素酶的菌株，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8339，分类命名为：桧状青霉Penicilliumpiceum，保藏单位地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期为：2013年10月15日。
本发明的桧状青霉Penicillium piceum的形态学特征为：
本发明的桧状青霉H16的形态学特征为：菌株H16在PDA培养基上30℃恒温培养2d即可看到清晰的白色菌落，菌落开展，绒状，4～5d时表层着生一层墨绿色分生孢子粉，菌株生长后期背面观察呈黄色。孢子的颜色较出发菌株Penillium piceum9-3相比要深，出发菌株为黄绿色，H16的孢子为墨绿色。
所述青霉菌株H16是将菌株Penillium piceum9-3经诱变方法处理后筛选 得到的。
所述诱变筛选方法包括以下步骤：
1)在所述菌株Penillium piceum9-3的孢子悬液中添加硫酸二乙酯，所述硫酸二乙酯添加量为使所述孢子悬液中硫酸二乙酯的质量百分比浓度为1％，之后在10～30℃，50～150rpm震荡反应10～120min，获得所述孢子悬液的诱变处理液，备用；
2)以所述反应时间为准，每间隔10min按体积比为1∶9取出诱变处理液与浓度为25％的硫代硫酸钠溶液进行混合，获得诱变终止液并根据时间顺序编号；
3)将编号的所述诱变终止液按顺序分别涂布PDA平板，25～33℃培养直至长出单菌落；
4)将所述单菌落通过对比在刚果红平板上透明圈与菌落直径之比的大小和发酵培养测定粗酶液酶活力的方法筛选得到所述青霉菌株H16。
所述步骤1)所述反应时间为60min。
所述青霉菌株H16应用于生产纤维素酶。
一株应用权利要求1～5所述产纤维素酶菌株产纤维素酶的方法，其特征在于，用于培养所述产纤维素酶菌株的培养基的组分含量为：微晶纤维素10～30g/L，葡萄糖1～10g/L，玉米浆干粉10～20g/L，硫酸铵1～10g/L，磷酸二氢钾1～10g/L，硫酸镁1～10g/L以及加水至1L。
优选的是，所述培养条件为：温度为26～32℃，转速为150～250rpm震荡培养，初始pH为5.0～6.0，接种量为1～5％，发酵培养时间为96～144h。
优选的是，所述培养条件为：初始pH为5.5，发酵培养时间为120h。
本发明的有益效果是本发明将Penillium piceum9-3做为出发菌株诱变育种，选育得到一株产高活力纤维素酶的青霉菌株，所述菌株发酵得到的纤维素酶粗酶液，其滤纸酶活力达到7IU/mL，β-葡萄糖苷酶酶活力达到50IU/mL。通过将所述菌株H16和里氏木霉RUT-C30的不同纤维素酶系进行不同配比研 究，得出在最优配比时大幅度高了酶活以及对微晶纤维素的水解率，降低了用酶成本。本发明对仪器设备要求低，操作简单，很大程度上降低了用酶成本。
附图说明
图1为本发明所述产纤维素酶菌株诱变筛选方法流程图。
图2为本发明所述产纤维素酶菌株发酵所得粗酶液与里氏木霉RUT-C30的粗酶液按照不同体积比例配比所得混合酶液的滤纸酶活力比较图。
图3为本发明所述产纤维素酶菌株和里氏木霉RUT-C30的混合酶提取液与里氏木霉酶RUT-C30提取液的水解率的比较图。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
实施例1：出发菌株的培养
将桧状青霉菌株9-3在PDA斜面上连续活化两次，在30℃恒温箱中培养3-4天，之后，4℃保存备用。
桧状青霉9-3(Penicillium piceum9-3)。保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2011年10月9日，保藏号：CGMCC5314。
实施例2：硫酸二乙酯诱变筛选菌株H16(如图1所示)
1)硫酸二乙酯诱变
用pH为7的磷酸缓冲液洗下PDA斜面培养的孢子，无菌玻璃珠打散，两层无菌擦镜纸过滤，得孢子悬液，血球计数板计数，调整孢子浓度为106个/mL，取4mL孢子悬液，加入到16mL的pH为7的磷酸缓冲液中，再添加0.2mL硫酸二乙酯，在30℃，150r/min条件下反应开始20min后每隔5min取反应液0.1mL加入到0.9mL的浓度为25％的硫代硫酸钠中充分混合，终止诱变反应，然后将混合液稀释三个梯度使混合液中菌种终浓度为105个/mL、 104个/mL、103个/mL，分别取三种浓度的稀释液0.1mL涂布PDA平板，30℃培养直至长出单菌落，用于检测诱变的致死率和正突变率。如表1所示，55min时致死率(％)和正突变率(％)几乎达到100％。
2)筛选
①刚果红染色筛选：在上述平板上选取不同处理时间、不同形态的菌落100株，接种到含有蛋白胨10g/L，酵母粉10g/L，氯化钠5g/L，羧甲基纤维素钠10g/L，磷酸二氢钾1g/L，琼脂18g/L，吐温-802mL/L。30℃培养4-5天后，用浓度为1％的刚果红染色1h。在上述平板上选取透明圈与菌落直径比值较大的菌落9个，接种到PDA斜面，30℃培养4-5天后保存菌种。
②发酵培养筛选：将上述保存的菌株接种到种子培养基中增值培养，然后接入到发酵培养基进行诱导产酶，并对离心获得粗酶液进行酶活测定，经过对比筛选得到1株酶活较高的菌株。
所述的种子培养基为：微晶纤维素20g/L，玉米浆干粉17g/L，葡萄糖2g/L。
所述的发酵培养基为：微晶纤维素20g/L，玉米浆干粉17g/L，硫酸铵5g/L，碳酸钙2.5g/L，磷酸二氢钾6g/L，硫酸镁1g/L。在30℃，200转/min，初始pH5.5，接种量3％，发酵培养120h。
时间(min) 致死率(％) 正突变率(％)
20 5.12 0.14
25 16.53 4.83
30 25.25 7.99
35 46.77 12.12
40 59.53 21.24
45 72.18 31.88
50 90.12 45.26
55 99.98 100
表1
实施例3：菌种遗传稳定性
对实施例2所得到的活性较高的菌株H16进行遗传稳定性考察。将菌株连续转接6代，每代均接入实施例2所述的发酵培养基中发酵培养。如下表2所示，菌株H16酶活力较高、且稳定性良好。
表2
实施例4：纤维素酶活力测定
本发明涉及的酶活力测定包括滤纸酶活、β-葡萄糖苷酶酶活力。
本发明涉及的各种酶活力同意定义为：在50±0.1℃，pH4.8的条件下，1mL酶液水解底物1min产生相当于1μmol葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，用IU/mL表示。
所述的酶活检测方法均根据国际方法IUPAC进行。
滤纸酶活力的测定方法：1mL粗酶液，在50±0.1℃，pH4.8的条件下，水解50±1mg滤纸1h所产生的还原糖的量，用DNS法测定还原糖的生成量。
β-葡萄糖苷酶酶活力的测定方法：1mL粗酶液，在50±0.1℃，pH4.8的条件下，水解1mL1％的纤维二糖30min，所产生的葡萄糖的量，用生物传感器测定葡萄糖的生成量。
实施例5：出发菌株与诱变菌株的酶活力以及蛋白分泌量比较
将桧状青霉出发菌株9-3与诱变菌株H16同时进行发酵培养，发酵培养 基如实施例2所述，培养条件为：30℃，200rpm，初始pH5.5，接种量3％，发酵培养120h。对比两菌株酶活力如表1所示：
表3
如表3中所示，与出发菌株相比，诱变菌株H16的产酶活力与蛋白分泌能力均有大幅度提高。
实施例6：桧状青霉Penicillium piceum转化葡萄糖为槐糖方面的应用
将桧状青霉Penicillium piceum按照上述培养条件与上述培养基发酵所得粗酶液按照上述测定纤维二糖酶活力的方法测定β-葡糖苷酶的酶活力，与模式菌株里氏木霉RUTC30以同蛋白量(3mg/mL)的酶液作用于葡萄糖底物，其中青霉酶液的添加量为1mL，木霉酶液的添加量为0.8mL，葡萄糖的浓度为400g/L，在50℃反应30min，生物传感仪测定葡萄糖剩余量，HPLC分析转化液中槐糖含量。分析表明，反应液中槐糖浓度高达10.57g/L，是里氏木霉RUTC30的6倍。说明该菌株在产生纤维素酶高效诱导物-槐糖方面具有优势。
实施例7：桧状青霉Penicillium piceum与里氏木霉RUT-C30的粗酶液酶系配比后的滤纸酶活
将桧状青霉Penicillium piceum按照上述培养条件与上述培养基发酵所得粗酶液与里氏木霉RUT-C30的粗酶液按照不同比例配比，将所得混合酶液按照上述滤纸酶活测定方法测滤纸酶活，结果如附图2所示，当里氏木霉与青霉菌株H16按体积比为5∶1配比时，滤纸酶活较里氏木霉自身酶液提高37％。
实施例8：桧状青霉Penicillium piceum与里氏木霉RUT-C30的粗酶液配比后的水解效果
将桧状青霉Penicillium piceum按照实施例2所述培养条件和培养基发酵所得粗酶液与里氏木霉RUT-C30的粗酶液按照最佳滤纸酶活比例配比，将所得混合酶液按照10IU/g微晶纤维素反应，以里氏木霉自身酶液作为对照，在50℃水解12h、24h、36h、48h、60h，以水解所得残糖量为标准，水解结果如附图3所示，里氏木霉与青霉菌株H16的混合酶系较里氏木霉自身水解率提高22％。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出的实施例。

Claims (3)

1.一株产纤维素酶的菌株，其特征在于，所述菌株在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏号为：CGMCC No.8339，分类命名为：桧状青霉Penicillium piceum。
2.应用权利要求1所述的一株产纤维素酶菌株产纤维素酶的方法，其特征在于，用于培养所述产纤维素酶菌株的培养基的组分含量为：微晶纤维素10~30 g/L ，葡萄糖1~10 g/L，玉米浆干粉10~20 g/L，硫酸铵 1~10 g/L，磷酸二氢钾1~10 g/L，硫酸镁 1~10 g/L以及加水至1 L；
所述培养条件为：温度为26~32℃，转速为150~250 rpm震荡培养，初始
pH为5.0~6.0，接种量为1~5%，发酵培养时间为96~144 h。
3.如权利要求2所述的应用一株产纤维素酶菌株产纤维素酶的方法，其特征在于，所述培养条件为：初始pH 为5.5，发酵培养时间为120 h。
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