CN104630069B - 一株高产纤维素酶的黑曲霉 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株高产纤维素酶的黑曲霉，本发明属于黑曲霉领域，特别涉及高产纤维素酶的黑曲霉菌株。本发明所提供的黑曲霉(Aspergillusniger)，该菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.7927。发酵罐实验跟踪的各项性能指标表明，该菌株代谢正常，产纤维素酶能力强，是一株优良的纤维素酶高产菌株。

Description

一株高产纤维素酶的黑曲霉
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体是一株高产纤维素酶的黑曲霉。
背景技术
纤维素酶是指能水解纤维素的β-1，4糖苷键，使纤维素降解为纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，是由多个水解酶组成的复杂酶系。该酶主要由外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶组成。纤维素酶主要由真菌、细菌和放线菌等微生物产生。由于纤维素酶能将环境中广泛存在的纤维素质原料如秸秆、稻草、木屑等水解为葡萄糖，因此纤维素酶在纺织、饲料、发酵工业、食品和环境工程等领域具有巨大的市场潜力，甚至在中国完全有可能成为第一大酶种，因此纤维素酶是酶制剂工业中的一个新的增长点。
目前对纤维素酶产生菌的研究大多数集中于木霉属，而木霉属由于存在安全性，在食品和饲料上的应用受到限制。而黑曲霉是一种纤维素酶的产生菌，具较好的安全性，所以目前国内外对其产纤维素酶能力的研究报道逐渐增多。如1996年赵小立等以黑曲霉为出发菌株，采用铜蒸汽激光诱变处理获得了4株高产的突变菌株，每克湿曲的最高酶活：cmc酶活为2839mg葡萄糖/g·h、滤纸酶活为299mg葡萄糖/g·h、β-葡萄糖苷酶活为1091mg葡萄糖/g·h【钱育军等，黑曲霉产纤维素酶菌种的激光选育.中国激光，1996(07)：第667-672页】。2007年胡立明等通过液体深层发酵方法研究黑曲霉产酶条件进行研究，获得的最佳产酶条件为：纤维素粉3％、硝酸钾3％、聚乙二醇0.1％，初始pH6.5，接种量10％、32℃培养5d，纤维素酶各组分酶活力分别为：滤纸酶活力、CMC酶活和β-葡萄糖苷酶活力分别为24.52U/mL、20.63U/mL和6.89U/mL【胡立明等，黑曲霉产纤维素酶液体发酵条件的研究.河南工业大学学报(自然科学版)，2007(01)：第70-74页】。2012年杜晓梅等以啤酒糟为主要原料，采用黑曲霉3.316(Aspergillus niger3.316)固态发酵生产纤维素酶，对培养基组成和培养条件进行优化。结果表明：啤酒糟和麸皮的质量比为8：2、水料质量比为1.5：1、硫酸铵质量分数为3％、发酵时间为4d时，所产纤维素酶活性最大，滤纸酶活性和羧甲基纤维素酶活性分别达72.6118和692.1700nkat【杜晓梅等，黑曲霉3.316固态发酵啤酒糟生产纤维素酶.青岛科技大学学报(自然科学版)，2012(03)：第263-268页】。
虽然众多的研究者对应用黑曲霉生产纤维素酶进行了研究，但如何提高纤维素酶的活力仍然是一个亟待解决的难题。该难题的解决对于开阔其应用领域和市场份额具有重要的的意义。
发明内容
本发明提供一种产高活力纤维素酶的黑曲霉。
本发明提供的黑曲霉Aspergillus niger Li-2013-03是由实验室保藏的一株产纤维素酶的黑曲霉AspergillusnigerLi-2010经亚硝基胍多轮诱变筛选，然后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产高活力纤维素酶的黑曲霉菌株Aspergillus niger Li-2013-03。
本发明提供的产高活力纤维素酶的菌株具体为黑曲霉Aspergillus niger Li-2013-03。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏号为CGMCC NO.7927。
本发明黑曲霉菌株Aspergillus nigerLi-2013-03(CGMCC No.7927)具有以下微生物学特征：
1、形态学特征：
黑曲霉菌株CGMCC No.7927，生物学形态为包括分生孢子、胞梗、顶囊、产胞结构等几部分。分生孢子头球形至辐射形，直径150-450μm，分生孢子梗发生于基质。胞梗茎1000-3000(长度)×12-20(直径)μm，黄色或黄褐色，壁平滑；顶囊球形或近似球形，直径45-75μm，表面全面可育；产胞结构双层，梗基10-20(长度)×4.5-7.0(直径)μm，瓶梗6-10(长度)×2.5-3.5(直径)μm，分生孢子球形或近球形，直径3-4.5μm，褐色，壁粗糙。
2、培养学特征：
菌株在麦芽汁琼脂培养基上生长迅速，28℃4天孢子可铺满斜面；质地丝绒状或稍带絮状；分生孢子结构大量，褐黑色，无渗出液；菌落反面略带黄色。
3、生理生化特征：
黑曲霉菌株CGMCC No.7927可在玉米秸秆、稻草、木屑、马铃薯、玉米粉、可溶性淀粉、糖蜜等碳源上生长，最适pH范围5-6，最适生长温度范围28-33℃，最适产酶温度范围28-30℃。
本发明黑曲霉菌株CGMCC No.7927的筛选技术路线为：出发菌株→斜面培养→孢子悬液的制备→诱变处理→平板分离→初筛→复筛→遗传稳定性测定→扩大实验(发酵性能测定)。
按诱变筛选方案，对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选，得到一株高产酶性能菌株黑曲霉菌Aspergillus nigerLi-2013-03，发酵96小时后纤维素酶的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL。
有益效果：本发明提供的黑曲霉Aspergillus nigerLi-2013-03具有纤维素酶产量高的优点，经筛选过程培养基优化，与出发菌株相比生长迅速，28℃发酵4天直径75mm，发酵液纤维素酶的的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分别比出发菌株提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。
具体实施方式
下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
本发明提供的黑曲霉菌株Aspergillus nigerLi-2013-03是由实验室保藏的一株产纤维素酶产的黑曲霉Aspergillus nigerLi-2010经多轮亚硝基胍诱变，然后对突变株逐级筛选淘汰，最后对优良菌株经发酵性能测试筛选得到产高活力纤维素酶的黑曲霉菌株Aspergillus nigerLi-2013-03。
本发明提供的产高活力纤维素酶的菌株具体为黑曲霉Aspergillus niger Li-2013-03。该菌株已于2013年7月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：中国北京市朝阳区北辰西路1号院3号，邮编100101)，保藏号为CGMCC NO.7927。
产高活力纤维素酶菌株的筛选方法，包括以下步骤：
1)斜面培养：将原始黑曲霉菌株Aspergillus niger Li-2010划线接种斜面培养基，30℃培养2～3d，直至菌丝体成熟、产大量黑色孢子。所述斜面培养基组成如下：12°Brix麦芽汁1000mL，pH值自然，121℃灭菌20min；
2)孢子悬液制备(以下步骤均在无菌条件下操作)：向试管斜面加入15mL无菌水，把孢子刮下，用滤纸过滤，将滤过液倒入已灭菌、并加有5-10粒无菌玻璃珠的150mL三角瓶中，将三角瓶放入摇床振荡10-15min，使孢子分散。
3)亚硝基胍(NTG)诱变
A.用无菌水将孢子悬浮液调节为稀释成106-107个/mL。
B.取10mL菌悬液转移至100mL三角瓶中，加入10mg的NTG，配制成终浓度为10mg/mL的NTG溶液，并加入4-5滴丙酮，以利于NTG溶解。
C.在30℃下200rpm振荡反应30min，5000rpm离心10min收集菌体，用无菌生理盐水洗涤数次，中止反应。
D.适当稀释将孢子浓度调节为103个/mL，取最后稀释度的菌液0.2mL，稀释涂布于纤维素-刚果红平板筛选培养基上。在30℃培养2～3天后挑取透明圈/菌落直径较大的菌株200支。(所述纤维素-刚果红平板筛选培养基组成如下：纤维素粉10g、刚果红0.2g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、明胶2g、琼脂20g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min)。
E.复筛：将获得的200株菌分别用无菌牙签接种于斜面培养基，30℃培养至孢子铺满斜面。分别将孢子以无菌水洗下接种于装有50mL复筛培养基的250mL三角瓶中进行发酵，接种量10％(v/v)，30℃、100r/min培养96h，分别测定各菌株的纤维素酶活性。(所述复筛培养基组成如下：纤维素粉50g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min)。选取纤维素酶酶活力最高的菌株进行放大实验。
4)遗传稳定性试验
将Li-2013-03菌株在斜面上连续十次传代，并用摇瓶复筛的方法检测每次传代后的发酵情况。实验发现，在斜面上连续十次传代，该菌种性状没有明显变化，各项性能指标都正常，说明该菌种的遗传稳定性较强。
5)放大试验
①种子培养：将纤维素酶酶活力最高的菌株Aspergillus nigerLi-2013-03接入500mL三角瓶中，种子培养基装量100毫升，30℃、150rpm摇床培养72-96h。
③种子罐培养：将种子液以10％(v/v)接种量接入装有7.5L发酵液的10L发酵罐中，控制pH值恒定为6.0±0.2，培养温度30±0.1℃，搅拌速度300rpm，通风量(v/v)1：0.8-1.2，培养时间96h，溶解氧20-30％。所述发酵培养基组成为：纤维素粉100g、硫酸铵5g、硫酸镁0.25g、磷酸二氢钾1g、氯化钠0.1g、自来水定容1000mL，pH值5-6，121℃灭菌20min。
发酵结束后，取发酵上清液(粗酶液)进行酶活力检测经测定，菌株AspergillusnigerLi-2013-03的外切β-葡聚糖酶、内切β-葡聚糖酶、β-葡萄糖苷酶和滤纸酶活力分别达到620U/mL、1289U/mL、456U/mL和732U/mL，分别比出发菌株Aspergillus nigerLi-2010提高了9.21倍、7.43倍、8.15倍和10.31倍。

Claims (1)

1.黑曲霉菌株(Aspergillus niger)，保藏编号为CGMCC No.7927。
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Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106467899B (zh) * 2015-08-17 2020-05-05 中国科学院天津工业生物技术研究所 一种高产果糖转移酶的黑曲霉菌株及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1062167A (zh) * 1990-12-05 1992-06-24 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种曲霉纤维素酶菌种的制备方法
CN1374402A (zh) * 2002-02-26 2002-10-16 东莞市豪发生物工程开发有限公司 黑曲霉一次发酵生产获得多酶种高酶活复合酶
CN1651569A (zh) * 2004-02-05 2005-08-10 中国农业大学 一种黑曲霉菌株及其用途
CN102061264A (zh) * 2010-11-12 2011-05-18 广东溢多利生物科技股份有限公司 一种自然组合饲用复合酶及其制备方法
CN103305428A (zh) * 2013-06-26 2013-09-18 武汉合缘绿色生物工程有限公司 一种黑曲霉菌株及其应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1062167A (zh) * 1990-12-05 1992-06-24 中国科学院沈阳应用生态研究所 一种曲霉纤维素酶菌种的制备方法
CN1374402A (zh) * 2002-02-26 2002-10-16 东莞市豪发生物工程开发有限公司 黑曲霉一次发酵生产获得多酶种高酶活复合酶
CN1651569A (zh) * 2004-02-05 2005-08-10 中国农业大学 一种黑曲霉菌株及其用途
CN102061264A (zh) * 2010-11-12 2011-05-18 广东溢多利生物科技股份有限公司 一种自然组合饲用复合酶及其制备方法
CN103305428A (zh) * 2013-06-26 2013-09-18 武汉合缘绿色生物工程有限公司 一种黑曲霉菌株及其应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
丝状真菌产生昆葡聚糖酶的研究，GCN平板的建立及产酶菌株的选育;林宇野;《附件师范大学学报（自然科学版）》;19951231;第11卷(第3期);94-101 *
产β-葡聚糖酶高产菌株的驯化及筛选;李春磊 等;《现代食品科技》;20061231;第22卷(第1期);第23页摘要 *
复合诱变选育高产β-葡聚糖酶菌株;方华平 等;《中国饲料》;20081231(第21期);第14页摘要 *
黑曲酶β-葡聚糖酶菌株诱变选育研究;贺小贤 等;《食品技术》;20051231(第11期);13-16 *

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