CN101717728B

CN101717728B - 一株青霉菌及其用于催化水解木质纤维素的用途

Info

Publication number: CN101717728B
Application number: CN 200910247272
Authority: CN
Inventors: 郁惠蕾; 石乾乾; 李春秀; 许建和
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2009-12-28
Filing date: 2009-12-28
Publication date: 2013-04-10
Anticipated expiration: 2029-12-28
Also published as: CN101717728A

Abstract

本发明公开了一株能降解生物质的、保藏号为CGMCC No.3371的青霉菌Penicillium sp.ECU0913及其用途。利用本发明提供的青霉菌株可同时发酵获得纤维素酶和木聚糖酶，可发挥生物催化效力，分解富含纤维素和半纤维素的生物质并生成单糖，所得水解物可作为碳源用于合成生物能源和生物基化学品。

Description

一株青霉菌及其用于催化水解木质纤维素的用途

技术领域

本发明属于生物催化领域，涉及一株青霉菌及利用该菌株发酵所生产的纤维素酶和木聚糖酶催化水解木质纤维素的方法。

技术背景

随着全球石油储备的日益枯竭，液体燃料短缺将严重制约人类的发展，寻找可再生性的替代资源已成为维持人类社会可持续发展的紧迫任务。大力开发新的可再生资源，也是中国在21世纪保持可持续发展的前提条件。用地球上最丰富的可再生资源——植物纤维素作为原料生产生物能源和生物基化学品已受到国内外的广泛关注，并被认为是21世纪应对化石资源枯竭的最佳途径之一。纤维素是由β-1，4-糖苷键连接而成的线性高分子聚合物，将其降解成为单糖是进而发酵制取乙醇等生物基化学品的关键，这一步需要由纤维素酶来完成，因此生产高效率的纤维素酶成为生物乙醇通路中的一个关键步骤。半纤维素的主要成分是木聚糖，而木聚糖酶能水解木聚糖骨架结构中的β-1，4-糖苷键，生成木聚糖低聚物，并由β-木糖苷酶进一步水解成木糖单元，因此对木聚糖酶的研究也具有非常关键的作用。

目前用于生产纤维素酶的微生物大多属于真菌，因其产生的纤维素酶多为胞外酶，分离提取的工艺也相对简单。研究较多的有木霉属(Trichodema sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)、青霉属(Penicillium sp.)和枝顶孢霉属(Acremonium sp.)的菌株。其中以木霉属的产量居高，里氏木霉(Trichoderma reesei)、康氏木霉(Trichoderma koningi)和绿色木霉(Trichoderma viride)等都是木霉属中酶活性较高的菌种，特别是绿色木霉(Trichoderma viride)及其近缘的菌株。产木聚糖酶活力高的微生物也大多是真菌，如木霉属(Trichoderma sp.)、镰胞菌属(Fusarium sp.)、嗜热子囊菌属(Thermoascus sp.)、曲霉属(Aspergillus sp.)。而能同时高产纤维素酶和木聚糖酶的青霉菌(Penicillium sp.)的报道相对较少，且一般活力都低于木霉属(Trichodema sp.)所产的酶。

发明内容

本发明的目的是提供一株青霉菌；

本发明的目的还提供上述一株青霉菌的用途，采用该菌株液体发酵所生产的高活力纤维素酶和木聚糖酶的粗酶液，并利用该菌株液体发酵所生产的纤维素酶和木聚糖酶的粗酶液催化水解木质纤维素。

本发明的青霉菌Penicillium sp.ECU0913是一种属于青霉菌属的菌株，是发明人从上海、浙江、江苏、山东、山西等地区的100多份土壤样品中，经过初筛、复筛及分离纯化得到的能同时高产纤维素酶和木聚糖酶的菌株，该菌株已于2009年10月28日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号为CGMCC No.3371。

所述的保藏号为CGMCC No.3371的青霉菌Penicillium sp.ECU0913具有如下的微生物学特征：

1、形态大小

分生孢子为椭圆形，光滑，直径3～4μm；

2、适宜生长环境

适宜的生长温度为25～35℃，可以在pH 5.0～9.0环境中生存；

3、平板培养菌落特性

在30℃改良PDA平板上培养7天形成直径30～40mm的菌落，中间28～38mm呈暗绿色，边缘约2～3mm呈白色、絮状，结构较疏松，反面由无色变黄色，无渗出液。

根据《真菌鉴定手册》提供的鉴定方法和上述的微生物学特征，并经ITS序列分析鉴定，确认该菌株为青霉菌属(Penicillium sp.)，标号为Penicillium sp.ECU0913。

本发明的青霉菌Penicillium sp.ECU0913可以用于纤维素酶和木聚糖酶的生产及应用，具体步骤如下：

(1)菌种的准备

将青霉菌Penicillium sp.ECU0913在灭过菌(121℃，20～40min)的PDA平板上划线，于25～30℃静置培养约2天后挑取单菌落，作为种子进行斜面培养(培养条件同上)，5～10天后保存于4℃冰箱中备用。

(2)菌株的培养

将所说的青霉菌Penicillium sp.ECU0913采用本领域常规的方法，在液体发酵培养基中培养24～36h，温度20～50℃；

再以上述培养液作为种子，基于发酵培养基体积的接种量为1～20％(v/v)，接种至50ml的发酵培养基中，在20～50℃下100～200rpm摇床上培养5～10天，离心得到发酵上清酶液，发酵上清通过超滤浓缩得到粗酶液；

所说的发酵培养基中各组分的含量如下：玉米芯10～50g，NaNO₃10～30g，KH₂PO₄1～10g，MgSO₄0.1～2g，CaCl₂0.1～2g，Mandels微量元素液1ml，吐温-802～10g，自来水1000ml，pH 3～8。

(3)木质纤维素的降解

在pH为4.0～6.0的柠檬酸缓冲液中加入一定量经过预处理的木质纤维素，并加入上述所得的粗酶液，使得整个反应体系中生物质的浓度为20～200g/L，纤维素酶的加入量为6～90FPU/g生物质。在30～50℃和搅拌速率为150～220rpm的条件下反应72～120小时，然后用HPLC分析检测反应液中葡萄糖及木糖含量。所述的木质纤维素推荐为玉米秸秆。

由上述公开的技术方案可见，采用本发明的青霉菌株能同时生产的纤维素酶和木聚糖酶，不仅具有较好的降解生物质的催化效果，得到葡萄糖和木糖，为进一步发酵生产乙醇等提供原料，而且催化剂易于制备、反应条件温和，具有很好的工业应用开发前景。

具体的实施方式

实施例1菌株的筛选

筛选培养基配方：60目玉米芯10.0g/L，酵母膏4.5g/L，NH₄NO₃3.0g/L，NaCl 5.0g/L，K₂HPO₄2.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4g/L，琼脂粉15.0g/L，pH 7.0。

摇管测活培养基配方：60目玉米芯10.0g/L，NaNO₃2.0g/L，蛋白胨1.0g/L，K₂HPO₄2.0g/L，KH₂PO₄3.0g/L，MgSO₄·7H₂O 0.5g/L，无水CaCl₂0.1g/L，Mandels微量元素液1.0ml/L，pH 5.0。

丰富培养基配方：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨3.0g/L，酵母膏0.5g/L，KH₂PO₄2.0g/L，(NH₄)₂SO₄1.5g/L，无水MgSO₄0.15g/L，无水CaCl₂0.3g/L，Mandels微量元素液1.0ml/L，pH 5.0。

取少量的土样悬浮于3ml的无菌水中，梯度稀释至10^-4，将悬浮液涂布于以玉米芯为唯一碳源的筛选培养基平板，在30℃条件下静置培养1～2天，然后根据菌落的形态和颜色的不同挑取单菌落。初步判定这批形态不一的菌都具有利用富含纤维素及半纤维素的玉米芯的能力，故将这些菌保藏到丰富培养基平板，待复筛测活。从丰富培养基平板挑取各初筛菌株接种于3ml摇管测活培养基，在30℃，180rpm摇床上培养3天，取1ml离心(12000rpm，3min)，取上清液测纤维素酶、木聚糖酶活力。最后在200多株候选菌株中筛选出了能高产纤维素酶和木聚糖酶的青霉菌株Penicillium sp.ECU0913，保藏号为：CGMCC No.3371。

实施例2微生物的培养

种子培养基配方：葡萄糖20.0g/L，蛋白胨3.0g/L，酵母膏0.5g/L，KH₂PO₄2.0g/L，(NH₄)₂SO₄1.5g/L，无水MgSO₄0.15g/L，无水CaCl₂0.3g/L，Mandels微量元素液1.0ml/L，pH 5.0。

发酵培养基配方：60目玉米芯30.0g/L，NaNO₃10.0g/L，KH₂PO₄2.0g/L，MgSO₄0.15g/L，CaCl₂0.3g/L，Mandels微量元素液1.0ml/L，吐温-80 5.0g/L，pH 6.0。

取4℃保藏的青霉菌斜面，挑取一环接种至装有50ml种子培养基的250ml的摇瓶中。在30℃下，180rpm培养24h，按15％(v/v)的接种量转接至装有100ml发酵培养基的500ml的摇瓶中，于30℃、180rpm培养5天，离心得发酵上清液。测得发酵液的酶活力为纤维素酶2.4FPU/ml，木聚糖酶241IU/ml。

纤维素酶测活方法：在1ml柠檬酸缓冲液(50mM，pH 4.8)中，加入50mg Whatman No.1滤纸条，再加入0.5ml适当稀释的酶液，在50℃条件下反应1小时，然后加入3ml DNS溶液并在沸水浴中煮沸10分钟，测定反应液在540nm下的吸光度，计算反应液中还原糖的含量。

木聚糖酶测活方法：在1.8ml浓度为1％的木聚糖溶液(溶于50mM、pH 5.3的柠檬酸缓冲液)中加入0.2ml适当稀释的酶液，在50℃条件下反应1小时，然后加入3ml DNS溶液并在沸水浴中煮沸10分钟，测反应液在540nm下的吸光度，从而计算反应液中的还原糖含量。酶活力单位的定义为：在反应条件下，每分钟催化降解底物生成1.0μmol还原糖的酶量。

实施例3利用青霉菌粗酶液催化水解玉米秸秆(20ml规模)

在20ml柠檬酸缓冲液(50mM，pH 4.8)中，加入0.4g蒸汽爆破预处理的玉米秸秆(含纤维素32.6％，半纤维素26.4％)，再加入青霉菌Penicillium sp.ECU0913所产的纤维素酶2.61FPU，使其加入量为20FPU/g葡聚糖，在50℃、200rpm的条件下反应72h后，用HPLC检测反应液中葡萄糖、木糖的含量(采用伯乐公司Aminex HPX-87P色谱柱，φ0.78cm×30cm，流动相为超纯水，流速0.4ml/min，柱温85℃)。测得反应液中葡萄糖、木糖浓度分别为3.5g/L、0.97g/L。计算得到纤维素、半纤维素的水解转化率分别为48％、25％。

实施例4利用青霉菌粗酶液催化水解玉米秸秆(0.5L规模)

在500ml柠檬酸缓冲液(50mM，pH 4.8)中加入50g蒸汽爆破预处理的玉米秸秆(含纤维素32.6％，半纤维素26.4％)，再加入青霉菌Penicillium sp.ECU0913所产的纤维素酶326FPU，使其加入量为20FPU/g葡聚糖，在45℃、200rpm的条件下反应96h后，用HPLC检测反应液中葡萄糖、木糖含量(采用伯乐公司Aminex HPX-87P色谱柱，φ0.78cm×30cm，流动相为超纯水，流速0.4ml/min，柱温85℃)。测得反应液中葡萄糖、木糖的浓度分别为23g/L和11g/L。计算得到纤维素、半纤维素的水解转化率分别为64％、42％。

Claims

1.一株青霉菌(Penicillium sp.)ECU0913，其保藏号为CGMCC No.3371。

2.一种如权利要求1所述的青霉菌(Penicillium sp.)ECU0913的用途，其特征是用于发酵生产纤维素酶和木聚糖酶，其发酵粗酶液能催化水解木质纤维素。

3.根据权利要求2所述的青霉菌的用途，其特征在于采用权利要求1所述的菌株发酵生产纤维素酶和木聚糖酶，并利用发酵所得的粗酶液催化木质纤维素水解的方法，包括如下步骤：

(1)将权利要求1所述的青霉菌株在发酵培养基中进行液体培养，经过离心得到发酵上清液，再通过超滤浓缩得到浓缩酶液；

(2)于pH为4.0～6.0的柠檬酸缓冲液中加入经过预处理的木质纤维素，并加入上述浓缩酶液，在30～50℃条件下反应72～120小时，将纤维素和半纤维素降解为单糖。

4.根据权利3所述的用途，其特征在于，所说的发酵培养基组分为：玉米芯10～50g，NaNO₃10～30g，KH₂PO₄1～10g，MgSO₄0.1～2g，CaCl₂0.1～2g，Mandels微量元素液1～2ml，吐温-80 2～10g，自来水1000ml，pH 3～8。

5.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的柠檬酸缓冲液中酶的含量为6～90FPU/g生物质。

6.根据权利要求3所述的用途，其特征在于，所述的预处理过的木质纤维素为经过蒸汽爆破预处理的玉米秸秆，其在反应体系中的浓度为20～200g/L，其中纤维素含量为7～70g/L，半纤维素含量为5～50g/L。