CN109207377B - 一株青霉菌菌株及其在降解油茶饼粕中纤维素中的应用 - Google Patents

一株青霉菌菌株及其在降解油茶饼粕中纤维素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株青霉菌菌株，该青霉菌(Penicillium)菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其命名为青霉菌L‑1(Penicillium sp.L‑1)，其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No：60395。该菌株具有降解纤维素的能力，为产生降解纤维素酶提供了菌种来源，具有良好的应用前景。本发明还公开了该菌株在降解油茶饼粕中纤维素中的应用，挑取活化后的青霉菌L‑1的单菌落菌丝，于种子培养基中进行扩繁培养，将得到的种子液接种到含有油茶饼粕的发酵培养基中进行发酵培养，不需要光照，发酵培养过程中实现对油茶饼粕中纤维素的降解，对油茶饼粕中的纤维素降解率可达36％以上。

Description

一株青霉菌菌株及其在降解油茶饼粕中纤维素中的应用
技术领域
本发明属于微生物工程技术领域，尤其涉及一株青霉菌菌株及其在降解油茶饼粕中纤维素中的应用。
背景技术
油茶（Camellia Oleifera Aabel）系山茶科山茶属植物，起源于中国，具有悠久的栽培历史，是与油棕、橄榄和椰子齐名的世界四大木本食用油源树种之一。我国的油茶资源丰富，榨油后所产生的油茶饼粕数量可观。榨油后的油茶饼粕，含有粗蛋白10-15%、茶皂素15-20%、糖类30-60%、粗纤维15-25%等其他成分，一般作为清塘剂和燃料，效益不是很高，因此如何充分高效利用油茶饼粕，是目前提高茶产业经济效益的一个重要课题。
微生物肥料近年来发展较为迅速，其中油茶饼粕在饲料和肥料的应用上具有良好的前景，用作肥料可以利用茶皂素抑菌和杀虫，减少了农药的使用量。但是油茶饼粕纤维素含量高，自然分解慢，不能快速有效的为土壤微生物提供营养物质，因此寻求一种降解纤维素的菌种尤为重要。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是，克服以上背景技术中提到的不足和缺陷，提供一株青霉菌菌株及其在降解油茶饼粕中纤维素的应用。
为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为提供一株青霉菌菌株，该青霉菌（Penicillium）菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其命名为青霉菌L-1（Penicillium sp. L-1），其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No：60395，保藏时间为2018年6月25日，保藏单位的地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
上述的青霉菌L-1（Penicillium sp. L-1）是从腐烂的油茶果壳中分离纯化获得，在PDA平板上，倒置30℃培养一段时间后，菌丝为青绿色菌丝，有成熟的绿色孢子，菌落表面较干燥，菌落形态近似为圆形或者椭圆形。
该菌株具有降解纤维素的能力，为产生降解纤维素酶提供了菌种来源，具有良好的应用前景。
上述的青霉菌L-1（Penicillium sp. L-1）的DNA基因序列，见SEQ ID NO.1所示。
上述的青霉菌L-1（Penicillium sp. L-1），其ITS序列在NCBI数据库中用BLAST进行同源性分析，得到相似性较高的序列，运用MEGA6.06软件构建系统发育树；证明该菌株属于曲霉属，结合形态学鉴定为灰黄青霉菌（Penicillium griseofulvum），命名为青霉菌L-1（Penicillium sp. L-1）。
基于一个总的技术构思，本发明还相应提供一种上述的青霉菌菌株在降解油茶饼粕中纤维素的应用。
上述的应用，优选的，所述应用的方法具体包括如下步骤：挑取活化后的青霉菌L-1的单菌落菌丝，于种子培养基中进行扩繁培养，将得到的种子液接种到含有油茶饼粕的发酵培养基中进行发酵培养，不需要光照，发酵培养过程中实现对油茶饼粕中纤维素的降解。
优选的，所述青霉菌L-1的活化方法包括以下步骤：在无菌环境下，取青霉菌L-1斜面，用接种环取一环菌，接种于含马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基的平皿中，在26-30℃条件下倒置培养24-36h后，达到活化的青霉菌L-1。
优选的，所述种子培养基的组分包括土豆、葡萄糖和水，所述土豆、葡萄糖和水的质量比为20:2:100。
优选的，所述发酵培养基的组分包括油茶饼粕、(NH4)2SO4、MgSO4 、KH2PO4和水，所述油茶饼粕、(NH4)2SO4、MgSO4 、KH2PO4和水的质量比为30:（1.5-2.0）:（0.05-0.07）:（0.1-0.2）:100。
优选的，所述扩繁培养的温度为25℃-32℃，扩繁培养的时间为24-30h。
优选的，所述发酵培养的接种量为5-15%，发酵培养的温度为28-30℃，发酵培养的时间为5-7d，发酵培养时摇床震荡的转速为160-180r/min。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
本发明提供的青霉菌菌株，具有降解纤维素的能力，为产生降解纤维素酶提供了菌种来源，具有良好的应用前景，对油茶饼粕中的纤维素降解率可达36%以上；该菌株的酶活较好，在产酶培养基中的酶活达到了170.27 U/mL。
一株青霉菌菌株，其命名为青霉菌L-1（Penicillium sp. L-1），保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC），其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No：60395，保藏时间为2018年6月25日，保藏单位的地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是实施例中青霉菌L-1的菌落形态图。
图2是实施例中青霉菌L-1的孢子微观形态图。
图3是实施例中青霉菌L-1的ITS序列构建的系统发育树图。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下文将结合说明书附图和较佳的实施例对本发明做更全面、细致地描述，但本发明的保护范围并不限于以下具体实施例。
除非另有定义，下文中所使用的所有专业术语与本领域技术人员通常理解含义相同。本文中所使用的专业术语只是为了描述具体实施例的目的，并不是旨在限制本发明的保护范围。
除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
实施例：
本发明提供的一株青霉菌菌株，其命名为青霉菌L-1（Penicillium sp. L-1），保藏于广东省微生物菌种保藏中心（简称GDMCC），其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No：60395，保藏时间为2018年6月25日，保藏单位的地址位于广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所。
1、菌株的筛选
从腐烂的油茶果壳中取腐烂果壳样品1g，加入到含99ml无菌水的锥形瓶中，震荡20min，逐级梯度稀释，选择10-6、10-7和10-8三个梯度的悬浮液各100µL，加到刚果红纤维素培养基上，每个梯度3个平行，涂布均匀，放置30℃培养箱培养72h。挑选有明显透明圈的单菌落进行划线纯化，编号并保存；得到了一株透明圈最大的菌株，即为青霉菌L-1（Penicillium sp. L-1）。
2、菌株的鉴定
本发明对实施例提供的菌株进行了鉴定，该鉴定包括以下内容：
1）形态学鉴定
将菌株接种到PDA平板上，倒置30℃培养72h，观察记录平板上菌落的生长情况。如图1所示，菌株的菌落特征大体上如下：菌落特征：菌丝为青绿色菌丝，有成熟的绿色孢子，菌落表面较干燥，菌落形态近似为圆形或者椭圆形。图2显示孢子微观形态图。
2）菌株的ITS序列分析
本发明实施例采用真菌DNA提取试剂盒（天根生化（北京）有限公司）提取供试菌株DNA。
ITS引物：ITS1 (5'-TCCGTAGGTAACCTGCGG-3')和ITS4 (5'-TCCTCCGCTTAT-TGATATGC-3')。
PCR反应体系（50 μL）：2×PCR Mix 25μL，20mol/L ITS1/ITS4 引物各2.5μL，模板DNA 2μL，ddH2O 18μL。
扩增条件：94℃ 5 min；94℃ 30 s，53℃ 30s，72℃ 60s，共35个循环；72℃10min；4 ℃保存。扩增产物由上海生工生物工程有限公司测序，测序结果在GenBank 中进行BLAST相似性比对，最后用MEGA 6.0的Neighbor-Joining构建系统发育树（系统发育树如图3所示）。
综合形态学观察、ITS序列分析结果，可以确定该菌株为灰黄青霉菌（Penicillium griseofulvum），其被命名为青霉菌L-1（Penicillium sp. L-1）。
3. 青霉菌L-1在降解油茶饼粕中纤维素的应用
1）培养基
种子培养基（PDA液体培养基）：土豆200g ，葡萄糖20g，水1000ml，121℃灭菌20min；
发酵培养基：油茶饼粕30g，(NH4)2SO4 1.5-2.0g，MgSO4 0.05-0.07g，KH2PO4 0.1-0.2g，pH为4.8-5.2，水100mL。
2）纤维素酶酶液的制备
在无菌环境下，取青霉菌L-1斜面，用接种环挑取一环菌，接种于含马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基的平皿中，在26-30℃条件下倒置培养4-6d后，得到活化后的青霉菌L-1。
挑取活化后的青霉菌L-1单菌的菌丝，于种子培养基中培养1d，培养温度为25℃-32℃，将得到的种子液按照10%的接种量接种到发酵培养基中，发酵温度28-30℃，培养时6d，摇床震荡的转速为160-180r/min，不需要光照，发酵培养过程中实现对油茶饼粕中纤维素的降解，对油茶饼粕中的纤维素降解率可达36%以上。
3）纤维素酶Cx酶活测定
纤维素酶Cx酶活测定方法参考已有文献（赵玉萍,杨娟.四种纤维素酶酶活测定方法的比较[J].食品研究与开发,2006(03):116-118.），测得结果为：在50℃下Cx酶活力为170.27U /mL。
以上所述实施方式仅为本发明的优选实施例，而并非本发明可行实施的穷举。对于本领域一般技术人员而言， 在不背离本发明原理和精神的前提下对其所作出的任何显而易见的改动， 都应当被认为包含在本发明的权利要求保护范围之内。
序列表
<110> 湖南省林业科学院，中南林业科技大学
<120> 一株青霉菌菌株及其在降解油茶饼粕中纤维素中的应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 980
<212> DNA
<213> 青霉菌L-1(Penicillium sp. L-1)
<400> 1
gttaccggag tgaggatctg ggtccacctc ccacccgtgt ttattttacc ttgttgcttc 60
ggcgggcccg ccttaactgg ccgccggggg gcttacgccc ccgggcccgc gcccgccgaa 120
gacaccctcg aactctgtct gaagattgaa gtctgagtga aaatataaat tatttaaaac 180
tttcaacaac ggatctcttg gttccggcat cgatgaagaa cgcagcgaaa tgcgatacgt 240
aatgtgaatt gcaaattcag tgaatcatcg agtctttgaa cgcacattgc gccccctggt 300
attccggggg gcatgcctgt ccgagcgtca ttgctgccct caagcccggc ttgtgtgttg 360
ggccccgtcc cccgatctcc gggggacggg cccgaaaggc agcggcggca ccgcgtccgg 420
tcctcgagcg tatggggctt tgtcacccgc tctgtaggcc cggccggcgc ttgccgatca 480
acccaaattt ttatccaggt tgacctcgga tcaggtaggg atacccgctg aacttaagca 540
tatcaataag cggagaaata ccgagtgagg gccctctggg tccaacctcc cacccgtgtt 600
tattttacct tgttgcttcg gcgggcccgc cttaactggc cgccgggggg cttacgcccc 660
cgggcccgcg ccgcgaagac acctcgaact ctgtctgaag attgaagtct gagtgaaaat 720
ataaattatt taaaactttc acacggatct cttggttcgc atcgatgaag aacgcagcga 780
atgcgatacg taatgtgaat tgcaattcag tgaatcatcg agtctttgaa cgccacattg 840
cgccctggta ttccgggggc atgctgtcga gcgtcattgc tgcctcagcc ggcctgtgtg 900
ttgggccccg tccccgatct cggggacggc cgaaagcagc gccgcacgcg tcgtctcgag 960
cgtattgggc ttgtcaccgc 980

Claims (8)

1.一株青霉菌菌株，其特征在于，该青霉菌（Penicillium）菌株保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其命名为青霉菌L-1（Penicillium sp. L-1），其在广东省微生物菌种保藏中心的保藏编号为GDMCC No：60395，保藏时间为2018年6月25日。
2.一种根据权利要求1所述的青霉菌菌株在降解油茶饼粕中纤维素的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述应用的方法具体包括如下步骤：挑取活化后的青霉菌L-1的单菌落菌丝，于种子培养基中进行扩繁培养，将得到的种子液接种到含有油茶饼粕的发酵培养基中进行发酵培养，不需要光照，发酵培养过程中实现对油茶饼粕中纤维素的降解。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述青霉菌L-1的活化方法包括以下步骤：在无菌环境下，取青霉菌L-1斜面，用接种环取一环菌，接种于含马铃薯葡萄糖琼脂固体培养基的平皿中，在26-30℃条件下倒置培养24-36h后，达到活化的青霉菌L-1。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述种子培养基的组分包括土豆、葡萄糖和水，所述土豆、葡萄糖和水的质量比为20:2:100。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述发酵培养基的组分包括油茶饼粕、(NH4)2SO4、MgSO4 、KH2PO4和水，所述油茶饼粕、(NH4)2SO4、MgSO4 、KH2PO4和水的质量比为30:（1.5-2.0）:（0.05-0.07）:（0.1-0.2）:100。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述扩繁培养的温度为25℃-32℃，扩繁培养的时间为24-30h。
8.根据权利要求3-7中任一项所述的应用，其特征在于，所述发酵培养的接种量为5-15%，发酵培养的温度为28-30℃，发酵培养的时间为5-7d，发酵培养时摇床震荡的转速为160-180r/min。
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