CN113481103B - 一种灰黄青霉 - Google Patents

Abstract

本发现公开了一种灰黄青霉。将得到的菌群，在通用培养基PDA上活化富集，对菌群进行纯化。以滤纸条为纤维素降解指示物，当培养基内指示物崩解，即可得到高效的纤维素降解菌，最后进行酶活测定。通过上述方法，能够有效地筛选到性能稳定的纤维素降解菌灰黄青霉。本发明还发现了一种纤维素降解灰黄青霉菌应用方法，可用于降解水稻秸秆，且可在培养基中形成菌丝球。

Description

一种灰黄青霉

技术领域

本发明属于微生物领域。具体地说，涉及一株高效降解纤维素的微生物菌株及其形成的微球的应用。

背景技术

第二次世界战争以后，化石能源在世界经济的发展中发挥着巨大的作用。但是，化石能源产生了严重的环境污染。另外，作为不可再生能源，化石能源的衰竭以及全球对温室气体排放引起的环境问题的日渐关注，由于能源安全问题和环境影响，对可再生能源消费急剧增加。生物能源在推广可再生能源方面发挥着重要作用。生物质能源由生物质加工而成，被视为环境友好型能源，不仅能缓解能源供给的矛盾，对于应对全球气候变化及可持续性发展都有着积极的推动作用。木质纤维素是世界上最丰富的可再生有机化合物，每年有89％的生物质能未能被利用或者未能被有效利用(比如直接焚烧)。如果可以将这部分生物质可再生资源转变成可直接利用的能源，不仅能实现其可持续利用和生产清洁能源的目

的，更是对能源危机的缓解起到了重要的作用。

中国是一个农业大国，各类秸秆资源非常丰富，年产量近八亿吨，秸秆是一种具有非常大的利用空间的资源。但大部分秸秆资源并未合理的开发利用，绝大多数被弃置田间或被焚烧,造成资源的浪费和环境的严重污染。因此高效利用纤维素，可以解决环境污染并生成可再生能源，从可持续发展的角度出发，纤维素被彻底降解而不会对环境造成污染的一条有效途径便是利用纤维素酶的水解作用，但由于纤维素酶的酶系组成相当复杂，活性不高，生产成本过高而导致其应用仍受到限制，因此产纤维素降解酶系的微生物逐渐被关注。

利用微生物降解纤维素第一个问题是选育高效降解纤维素的微生物，第二个问题就是降解之后工程菌的流失。而菌丝球是在真菌培养过程中，由菌丝缠绕而形成一种微生物颗粒，它生存能力较强，具有良好的生物活性，沉降速度快，易于固液分离，可实现重复利用等特点，且形成的菌丝球的微生物还能继续生长，具有产酶、代谢等功能，可保留生物降解和生物吸附等的生物活性。菌丝球作为自固化生物体系，可吸附其他微生物，或吸附一些重金属，对染料进行脱色等作用。

发明内容

本发明的目的是筛选到一种具有高效降解纤维素的真菌，且在一定条件下可形成

菌丝球。

所述高效降解纤维素真菌，有高效的降解纤维素酶活性。

本发明还涉及一种纤维素降解灰黄青霉菌的筛选方法，具体步骤为：

(1)得到菌群

(2)在通用培养基中活化富集；

(3)得到的菌落用去离子水冲洗，得到富集液，取100μl富集液稀释后涂布于CMC

培养基平板上，之后于30℃培养箱中倒置恒温培养，3天后观察，平板上出现菌落；

（4）挑取形态不同的单个菌落，接种于CMC液体培养基，进行摇瓶培养，在30℃，

150r/min条件下培养三天；

（5）用接种环将摇瓶菌液接种于CMC固体培养基进行划线纯化，30℃恒温培养箱培养三天；

（6）重复步骤（4）(5)多次以得到单个菌落，即得降解纤维素功能菌株；

（7）单个菌株直接接种于放有滤纸条的富集培养基内，待培养基内滤纸条崩解，即为降解能力较强的菌株；

（8）在50℃下pH为4 .8的柠檬酸缓冲溶液，利用DNS法测定还原糖来表征CMCase，β-Gase和FPAase活性。

本发明还涉及一种分离筛选降解纤维素功能菌株的方法，所述的纤维素液体培养基是由 10 .0g/L 的羧甲基纤维素钠、4g/L (NH4) 2SO4、0 .5g/L MgSO4·7H2O、2 .0g/LKH2PO4、0 .5g/L NaCl、1g/L蛋白胨，调pH 至 6 .5 ；所述的纤维素固体培养基是在上述组分基础上，加入 20g 的琼脂制成。

本发明还涉及一种降解纤维素的菌株形成微球的方法，按照以下步骤实现(1)挑取纯化后的菌落于纤维素液体培养基中在30℃，150r/min条件下培养12h得到菌悬液。

(2)取步骤(1)菌悬液50μl于装有100mL纤维素液体培养基250mL锥形瓶中，然后在30℃，160r/min条件下培养，一段时间后出现均匀菌丝球。

本发明还涉及一种降解纤维素的菌株形成微球的条件优化，按照以下步骤实现

（1）对培养基碳源进行优化，以葡萄糖，蔗糖，可溶性淀粉，羧甲基纤维素钠作为不同碳源。

表1不同碳源下培养48h菌丝球生长状况

（2）对培养基氮源进行优化，以硫酸铵，氯化铵，蛋白胨，胰蛋白胨作为不同氮源

（3）对接种浓度进行优化，以10μl/ml、30μl/ml、50μl/ml、70μl/ml、90μl/ml、100μl/ml、120μl/ml、150μl/ml

本发明以纯化过后以滤纸条为纤维素降解指示物，当培养基内指示物崩解，即可

得到高效的纤维素降解菌。本发明的纤维素降解灰黄青霉菌对纤维素具备较好的降解能力。

作为优选，所述滤纸条规格为1×6cm。

作为优选，所述灰黄青霉在50℃的条件下CMCase，β-Gase和FPAase活性分别为135.68U/mL ,166 .67U/mL和53 .03U/mL。

作为优选，所述灰黄青霉采用-20℃低温冷冻甘油保藏法保藏（保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号；保藏时间：2020年8月6日；分类命名：灰黄青霉；拉丁文名称：Penicillium griseofulvum；保藏中心登记入册编号：CGMCC No：19940）。

本发明还涉及一种秸秆纤维素降解灰黄青霉应用方法，具体步骤为：

(1)用来降解水稻秸秆，将水稻秸秆用蒸馏水清洗后磨成细粉，过40目筛子备用；

（2）将灰黄青霉接种于液体培养基中，接种量为1‰，在30℃150r/min条件下摇瓶培养5d；

（3）上述液体培养基用秸秆粉代替CMC作为碳源（秸秆粉10g/L) ；

（4）培养5d后测得秸秆降解率为27%。

附图说明

图1为不同碳源下培养48h菌丝球生长状况；

图2为不同碳源下培养48h菌丝球生长状况。

具体实施方式

具体实施方式对本发明做进一步的描述。

实施例1

(一)菌种筛选

（1）得到菌群；

(2)菌群在通用培养基PDA中活化富集；

(3)取100μl富集液稀释后涂布于CMC培养基平板上，之后于30℃培养箱中倒置恒

温培养，3天后观察，平板上出现菌落；

（4）挑取形态不同的单个菌落，接种于CMC液体培养基，进行摇瓶培养，在30℃，

150r/min条件下培养三天；

（5）用接种环将摇瓶菌液接种于CMC固体培养基进行划线纯化，30℃恒温培养箱培养三天；

（6）重复步骤（4）(5)多次以得到单个菌落，即得单个降解纤维素功能菌株。

(二)滤纸崩解试验

在富集培养基内放置两片规格为1×6cm滤纸条，在其中一片滤纸条上直接接种本

发现菌株，接种有菌株的滤纸条崩解。

说明本发明的菌株对纤维素具备较好的降解能力。

(三)菌种鉴定

所得的灰黄青霉的ITSrDNA如下所示：

TCCGAAGCTGTGGAAGGATCATTCGGGAGTGCGGGCCCCTCGGGGGCCAACCTCCCACCCGTGTTGCCCGAACCTATGTTGCCTCGGCGGGCCCCGCGCCCGCCGACGGCCCCCCTGAACGCTGTCTGAAGTTGCAGTCTGAGACCTATAACGAAATTAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCCCGCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTAGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACCCCCAACCTTTAATTATCTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCGGAGGAAC。

(四)产纤维素酶、滤纸酶活力、β-糖苷酶的测定

在1 .5ml的1％CMC溶液中加入0 .5ml粗酶上清液，50℃保温30min。在反应液中加入 1 .5ml DNS，沸水浴10min，冰水冷却，加入10mL蒸馏水,充分混匀。以灭活酶为对照，测540nm处的吸光度。

反应体系为柠檬酸缓冲液(pH 4 .8)1 .4ml，滤纸屑0 .1g ,50℃预热5min后，加入 0 .5ml粗酶液，50℃保温30min。加入含1 .5ml DNS液的反应管中，沸水浴10min，冰水终止反应，加入10mL蒸馏水,充分混匀。以灭活酶为对照，测540nm处的吸光度。

在1 .5 ml的1％水杨苷溶液中加入0 .5ml粗酶上清液，50℃保温30min。在反应液中加入 1 .5ml DNS，沸水浴10min，冰水冷却加入10mL蒸馏水,充分混匀，。以灭活酶为对照，测540nm处的吸光度。

在上述条件下，酶活力的定义：1ml酶液于50℃，pH4 .8条件下，进行酶解反应，每分钟产生1μg还原糖（以葡萄糖计）的纤维素酶含量定义为一个酶活力单位。

公式为：酶活力=X*N*1000/(A*T)U/mL

X:由葡萄糖标准曲线获得的葡萄糖含量，mg

N：酶液的稀释倍数

T：酶促的反应时间，min

A：所加酶液的量，mL

经测定，该菌株在50℃的条件下CMCase，β-Gase和FPAase活性分别为135 .68U/mL,166 .67U/mL和53 .03U/mL。

五、具体应用方法

（1）用于秸秆降解

将灰黄青霉接种于液体培养基中，接种量为1‰，在30℃150r/min条件下摇瓶培养5d。

上述液体培养基用秸秆粉代替CMC作为碳源（秸秆粉10g/L)

培养5d后测得秸秆降解率为27%。

（2）形成菌丝球

挑取纯化后的菌落于纤维素液体培养基中在30℃，150r/min条件下培养12h得到

菌悬液。

取上述步骤菌悬液50μL于装有100mL纤维素液体培养基250mL锥形瓶中，然后在30℃，160r/min条件下培养，24-48h后出现菌丝球。

所产菌丝球可用作生物载体吸附废水里污染物，可吸附染料，也可固定其他生物作为共生体，此菌株在CMC培养基中有较好的降解纤维素的酶的活性。灰黄青霉产生的青霉可抑制细菌生长。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (1)

1.一种灰黄青霉(Penicilliumgriseofulvum)，其特征在于：所述灰黄青霉采用-20℃低温冷冻甘油保藏法保藏，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址：北京市朝阳区北辰西路号院3号；保藏时间：2020年8月6日；分类命名：灰黄青霉；拉丁文名称：Penicilliumgriseofulvum；保藏中心登记入册编号：CGMCCNo：19940；所述灰黄青霉的ITSrDNA如下所示：TCCGAAGCTGTGGAAGGATCATTCGGGAGTGCGGGCCCCTCGGGGGCCAACCTCCCACCCGTGTTGCCCGAACCTATGTTGCCTCGGCGGGCCCCGCGCCCGCCGACGGCCCCCCTGAACGCTGTCTGAAGTTGCAGTCTGAGACCTATAACGAAATTAGTTAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCGGAGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCCGTCCCCCCCGCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCACCCGCTCTAGTAGGCCCGGCCGGCGCCAGCCGACCCCCAACCTTTAATTATCTCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGGCGGAGGAAC。

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