CN104072543A - 一种呋喃半乳寡糖及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种呋喃半乳寡糖，其特征在于：该呋喃半乳糖的结构简式为[→5)-β-D-Galf-(1→5)-β-D-Galf-(1→]n，由不同聚合度n为2～7的呋喃构形的半乳糖通过β-(1→5)连接方式依次连接，本发明还公开了其制备方法和应用，与现有技术相比，本发明的有益效果在于：采用真菌灰黄青霉的发酵液中分离得到一种结构新颖的半乳甘露聚糖，其独特之处在于其半乳糖全部以呋喃构型存在，其氢键具有高效性及立体多样性，含有呋喃构型的糖复合物及其衍生物很有可能成为候选药物，具有潜在的生物及化学应用价值，并且本发明的制备方法具有方法稳定、精密度高、重现性好，易于掌握的特点。

Description

一种呋喃半乳寡糖及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种以深海真菌灰黄青霉的胞外甘露半乳聚糖为原料制备的呋喃半乳寡糖及其制备方法和应用。

背景技术

海洋特征寡糖主要是指通过化学和生物酶法从海洋动物多糖、藻类多糖和微生物多糖中降解获得的寡糖。海洋寡糖与陆地寡糖相比，具有结构特异和生物活性广泛，和人类健康、重大疾病的发生发展关系密切的特点。早期海洋寡糖的制备主要是为了结构分析，而目前则是用于活性和构效关系研究，开发海洋寡糖类药物及其功能制品。如海洋中褐藻胶寡糖及其衍生物具有抗心脑血管疾病、抗老年痴呆症等；卡拉胶寡糖及其衍生物具有抗病毒、抗肿瘤活性等；琼胶寡糖则具有抗氧化和抗糖尿病活性等；甲壳胺寡糖及其衍生物具有抗动脉粥样硬化、提高机体免疫等。这些结构和功能独特的海洋寡糖具备十分广阔的开发应用前景。除了对海洋药物产业的贡献，结构和功能独特的海洋寡糖在其它领域还具备广阔的开发空间，在食品、化妆品、军工及农业等行业均有应用。随着研究的不断深入，新的寡糖资源和生物功能被不断发现。从不同海洋生物中获得结构特异和活性丰富的海洋特征寡糖，开发海洋寡糖资源仍然是海洋寡糖研究的重要方向。

微生物具有发酵条件可控，发酵产物稳定的优势。从不同海洋环境中发掘新型海洋微生物多糖和寡糖资源也是海洋多糖的研究热点之一。从采自太平洋2481m左右的深海海底底泥中分离得到的一株真菌灰黄青霉(Penicillium griseofulvum)的发酵液中分离得到一种结构新颖的半乳甘露聚糖(Galactomannan),含有聚合度约为8的长链呋喃半乳糖[→5)-β-D-Galf-(1→5)-β-D-Galf-(1→]n结构。独特之处在于其半乳糖全部以呋喃构型存在。单糖具有吡喃和呋喃两种构型，但从自然界发现的糖类物质中一直以来只有吡喃构型，因为吡喃构型的糖立体选择上最为稳定，近几十年才发现呋喃构型的糖。一经发现呋喃构型的糖复合物吸引了广泛的注意。因为呋喃构型的六碳己糖只存在于低等生物中主要是细菌和真菌包括一些病原微生物，在哺乳动物体内不存在，以及其氢键的高效性及立体多样性，具有潜在的生物及化学应用价值。因此，含有呋喃构型的糖复合物及其衍生物很有可能成为候选药物。

自然界中呋喃糖复合物还包括一些糖蛋白、糖肽和糖脂，如今对其生物学功能和生物活性研究还不是很透彻，其生物学功能可能与维持微生物细胞壁的稳定性和与微生物的致病力有关。目前研究的重点主要是对呋喃糖进行结构修饰或者合成特异结构的呋喃糖衍生物用于微生物呋喃糖合成相关酶类的功能研究和抗菌药物的新靶点开发，即通过抑制合成呋喃糖的相关变构酶和糖基转移酶达到抑制一些病原体细胞壁合成，使其丧失致病力。对呋喃糖生物活性的深入报道也不多，已有的报道显示一些呋喃寡糖衍生物具有体外抗肿瘤活性，一些选凝素也能够识别特定结构的呋喃糖，提示我们具有独特立体选择性结构的呋喃糖复合物可能存在特异的生物活性。目前发现的呋喃构型的糖中以呋喃半乳糖(Galf)为主。呋喃半乳寡糖具有独特的性质，到目前为止，国内外尚未有对呋喃半乳寡糖进行制备和免疫调节等生物活性研究和报道。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种深海真菌来源特征寡糖的呋喃半乳寡糖。

本发明所要解决的第二个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种利用深海真菌灰黄青霉的胞外甘露半乳聚糖为原料制备呋喃半乳寡糖的制备方法。

本发明所要解决的第三个技术问题是针对上述的技术现状而提供一种呋喃半乳寡糖在免疫调节药物中的应用。

一种呋喃半乳寡糖，其特征在于：该呋喃半乳糖的结构简式为[→5)-β-D-Galf-(1→5)-β-D-Galf-(1→]n，由不同聚合度n为2～7的呋喃构形的半乳糖通过β-(1→5)连接方式依次连接。

一种呋喃半乳寡糖的制备方法，包括步骤：

a、菌种的发酵：以深海真菌灰黄青霉菌为出发菌株，采用斜面菌种进行液体摇瓶培养；

b、真菌胞外多糖的提取：包括①过滤、②脱色、③醇沉、④透析、⑤纯化，其中：

①过滤：取步骤a的发酵液经滤纸抽滤除去菌丝体及其中的粗杂质，再萃取除去脂溶性小分子物质；

②脱色：采用活性炭脱色，在80-100℃水浴中0.5-1.5％活性炭缓慢加入到过滤后的发酵液中保温并搅拌5-10min，待溶液冷却至室温后，用漏斗抽滤至干即可；

③醇沉：脱色后的溶液浓缩至原体积1/10-1/5，加入原体积1/5-1/3体积的有机溶剂，剧烈震荡后离心，吸出上层水相后，将80％-95％的乙醇缓慢加入到浓缩液中，使乙醇终浓度达到70％-80％，把醇沉后的溶液放入冰箱中静置过夜；

④透析：步骤③所得的沉淀部分用滤纸抽滤，并脱水脱色后于40℃-60℃烘箱烘干，取烘干粉末溶于蒸馏水后离心的上清液置于孔径为3500Da-5000Da的透析袋在自来水中透析40h-50h，再用去离子水透析20h-30h，收集透析后的提取液，将透析液浓缩冻干即得到胞外多糖粗品；

⑤纯化：将步骤④所得多糖溶液配制成水溶液，离心后进行梯度洗脱，经分析、分别收集合并各含糖组分，减压浓缩，透析脱盐，冻干，得到目标多糖。

c、呋喃半乳寡糖的制备：先将步骤b的多糖5.0mg-7.0mg，溶于0.01-0.05mol/L三氟乙酸溶液中，混匀后于80℃-100℃的水浴中反应1.5h-3h，中和后备用，再采用凝胶层析柱对降解寡糖样品进行分离与在线检测，根据检测曲线分别按峰收集各峰对应部分，脱盐后冻干即得呋喃半乳寡糖。

进一步地，所述步骤a中，的斜面菌种培养，培养基组成是以g/100ml计:所述步骤a中的斜面菌种培养，培养基组成是以g/100ml计:马铃薯15-25，葡萄糖1-3，琼脂15-25，加水定容至至1L，pH值为自然，斜面菌种培养温度25-33℃，培养150-250小时。

进一步地，所述步骤a中，摇瓶培养，培养基组成是以g/100ml计:麦芽糖1-10，甘露醇2-5，葡萄糖1-5，谷氨酸钠1-3，KH₂PO₄0.05-1，MgSO₄0.03-2，酵母膏0.3-1和玉米浆0.1-4，加水定容至1L，pH调至5.5-6.5，25℃-28℃静置培养7d-10d。

进一步地，所述步骤b中的步骤③醇沉中所述的有机溶剂为氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1。

进一步地，所述步骤b中的步骤③醇沉中所述的乙醇加入浓缩液中的体积比为5:1。

进一步地，所述步骤b中的步骤⑤采用梯度洗脱，洗脱液为以0.1-0.5mol/L的NaCl水溶液，流速为1mL/min。

本发明还提供一种呋喃半乳寡糖在制备免疫调节药物中的应用。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：采用真菌灰黄青霉的发酵液中分离得到一种结构新颖的半乳甘露聚糖,含有聚合度约为8以下的长链呋喃半乳糖[→5)-β-D-Galf-(1→5)-β-D-Galf-(1→]n结构，独特之处在于其半乳糖全部以呋喃构型存在，其氢键具有高效性及立体多样性，含有呋喃构型的糖复合物及其衍生物很有可能成为候选药物，具有潜在的生物及化学应用价值，并且本发明的制备方法具有方法稳定、精密度高、重现性好，易于掌握的特点，同时，其分析分法避免了传统方法因必须进行多步分离纯化和多种波谱手段分析而带来的耗时、费力、成本高、无法快速检测的缺陷。

附图说明

图1为本发明的胞外多糖部分酸水解后寡糖在Bio-Gel P4的凝胶纯化图；

图2为本发明的各寡糖组分的单糖组成色谱图；

图3为本发明的呋喃半乳二糖的ESI-CID-MS质谱图；

图4为本发明的呋喃半乳二糖的ESI-CID-MSMS二级质谱图；

图5为本发明的1,5连接呋喃半乳寡糖质谱断裂模式示意图；

图6为本发明的1,5呋喃半乳寡糖的¹³C-NMR图谱；

图7为本发明的呋喃半乳寡糖对巨噬细胞吞噬中性红作用的曲线图。

具体实施方式

以下通过结合附图及实施例对本发明作进一步说明。

实施例1菌种的发酵

1.1来源：

以中国海洋大学医药学院提供的深海真菌灰黄青霉菌，为出发菌株，采用斜面菌种进行液体摇瓶培养；

1.2培养基：

斜面培养基，该马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基组成是以g/100ml计:马铃薯15，葡萄糖2，琼脂20，加水定容至至1L，pH值为自然，斜面菌种培养温度25℃，培养160小时。

摇瓶培养，培养基组成是以g/100ml计:麦芽糖2，甘露醇2，葡萄糖1，谷氨酸钠1，KH₂PO₄0.05，MgSO₄0.03，酵母膏0.3和玉米浆0.1，加水定容至1L，pH调至6.5，28℃静置培养8d。

1.3培养方法：按上述配方配制好马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基，将深海真菌灰黄青霉菌菌株原种4℃保存在培养基上；发酵时，菌株孢子接种于含有300mL培养液的1000mL锥形瓶中进行摇瓶培养。

1.4真菌胞外多糖的提取：海洋真菌Penicillium griseofulvum的发酵液经布氏漏斗双层滤纸抽滤除去菌丝体及其中的粗杂质，用乙酸乙酯萃取除去脂溶性小分子物质，然后用活性炭脱色，即在100℃水浴中1.5％活性炭缓慢加入到发酵液中保温并搅拌7min，待溶液冷却至室温后，用含有硅藻土滤饼的布氏漏斗抽滤至干即可。脱色后的溶液浓缩至原体积1/10，并加入多糖1/5体积的Sevag液(氯仿：正丁醇＝4:1，v/v)。剧烈震荡后离心，上层为多糖层，发酵液中变性蛋白会出现在上下两层的界面处。吸出上层水相，重复上述操作两次后，将预冷的95％的乙醇缓慢加入到浓缩液中(乙醇与浓缩液的体积比为5:1)，使乙醇终浓度达到80％，边加边搅拌，多糖以白色絮状沉淀析出，把醇沉后的溶液放入冰箱中静置过夜。倾去上层清液，取沉淀部分用布氏漏斗二层滤纸抽滤，并依次用无水乙醇、丙酮数次脱水脱色后于40℃烘箱烘干。取烘干粉末溶于适量蒸馏水后离心后的上清液置于截留分子量为3500Da的透析袋中透析2d，电导率仪测试透析后外液至恒定值时停止透析，将透析液浓缩冻干即得到胞外多糖粗品。

1.5真菌胞外多糖的分离纯化：将多糖溶液配制成50mg/ml的水溶液2mL，离心后采用Q Sepharose Fast Flow柱层析(2.6cm×50cm)连于快速蛋白质纯化系统进行洗脱。流动相分别以水、0.1、0.25、0.35mol/L的NaCl洗脱，流速为1mL/min，采用部分收集器收集0.1mol/L的NaCl洗脱组分，用苯酚-硫酸法分析并分别收集合并各含糖组分，减压浓缩，透析脱盐，冻干，得到目标多糖。

实施例2呋喃半乳寡糖的制备及组成测定：

2.1呋喃半乳寡糖的制备

将多糖5.0mg，溶于1mL0.01mol/L的三氟乙酸(TFA)溶液中，混匀后于100℃的水浴中反应1.5h，中和后备用。采用Bio-Gel P4(100×1.6cm)凝胶层析柱根据分子量的大小对降解寡糖样品进行分离。流动相为0.2mol/L NH₄HCO₃溶液，流速为0.15mL/min，采用示差检测器在线检测，自动部分收集器收集样品，根据检测曲线分别按峰收集各峰(F1-F6)对应部分，脱盐后冻干即得寡糖，结果如图1所示：F0为全排阻样品，不在寡糖的范围之列，F1为呋喃半乳6糖，F2为呋喃半乳5糖，F3为呋喃半乳4糖，F4为呋喃半乳3糖，F5为呋喃半乳2糖，F6为单糖。

2.2呋喃半乳寡糖的单糖组成测定

采用(1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮)PMP柱前衍生化方法对寡糖进行单糖组成分析，对等摩尔配制的单糖标准品和各寡糖全水解后产物进行PMP衍生，然后进行液相色谱分析，色谱条件为：色谱柱：安捷伦Agilent XDB-C18色谱柱；柱温：35℃；流动相：磷酸盐缓冲液(pH6.7)/CH3CN(83:17，V:V)；流速：1.0mL/min；检测器：DAD(245nm)。

实施例3呋喃半乳寡糖的质谱鉴定

3.1寡糖的质谱检测

本发明采用E电喷雾离子化碰撞诱导解离串联质谱(ESI-CID-MS/MS)，对寡糖的结构进行分析鉴定。在质谱的分析过程中，N₂作为溶剂的吹干气体和喷雾气体，流速分别为250L/h和15L/h，离子源和溶剂挥发温度分别是80℃和150℃。样品溶解在乙腈/水(1:1，v/v)中浓度约为5-10pM，注射5μL样品进行质谱分析。流动相为乙腈水(1:1，v/v)，在泵的动力下，从注射器以10μL/mi的流速注入。测试中，锥孔电压维持在50eV，而毛细管电压为3KV。在碰撞诱导分裂二级质谱(CID-MS/MS)对产物离子的扫描中，为了使分子离子峰的强度最大化，需要一个锥孔80eV电压。氩气作为碰撞气体提供了1.7bar的压力，同时为了得到最好的反应序列的碎片信息，碰撞能量保持在25-42eV，结果如图2、3和4所示。从图2的结果表明：F6-F2分别对应2糖至7糖。从图3的一级质谱可以看出呋喃半乳二糖的[M-H]^-峰341.1和377.1处的[M+Cl]^-，对图4的二级质谱片段断裂特征进行对比和归纳判断，由于环间断裂同时出现与分子离子峰差值为60，90，108，120的碎片离子峰，其判断可能为β-(1→5)连接的呋喃半乳寡糖。

3.2呋喃半乳寡糖的NMR鉴定

将5.0mg多糖样品用1mL D₂O溶解，减压旋转蒸发干燥交换2次，将活泼氢用氘置换。用约0.5mL D₂O溶解后置于核磁管，于25℃JNM-ECP600核磁共振波谱仪测定其¹³C-NMR，以氘代丙酮为内标，¹³C定在31.07ppm。

通过¹³C-NMR鉴定发现只有β-D-Galf的端基碳的化学位移才能向低场位移至105ppm以上，β呋喃半乳糖的核磁在107和105.7ppm附近出现两个特征信号，为非还原端及还原端的端基碳信号，82.58ppm为β-D-Galf的C4为信号，这三个信号均为β-D-Galf的特征信号如下表所示：

1,5呋喃半乳寡糖的¹³C-NMR分析

实施例4呋喃半乳寡糖的巨噬细胞调节活性

巨噬细胞是机体免疫系统的重要细胞成份，当巨噬细胞受到活化信号的刺激时，即可活化而发挥免疫效应，中性红法检测巨噬细胞吞噬功能是通过巨噬细胞对中性红的吞噬量来反映巨噬细胞的吞噬能力，是快速筛选巨噬细胞吞噬功能调节成分的常用细胞模型。在对如实施例1制得的寡糖混合进行体外活性筛选的过程中发现，呋喃半乳寡糖可以明显促进小鼠巨噬细胞RAW264.7吞噬中性红(结果如图7所示)，以进一步说明本发明的含有呋喃构型的糖复合物及其衍生物很有可能成为候选药物，具有潜在的生物及化学应用价值。

Claims (8)

1.一种呋喃半乳寡糖，其特征在于：该呋喃半乳糖的结构简式为[→5)-β-D-Galf-(1→5)-β-D-Galf-(1→]n，由不同聚合度n为2～7的呋喃构形的半乳糖通过β-(1→5)连接方式依次连接。

2.根据权利要求1所述的呋喃半乳寡糖的制备方法，包括步骤：

a、菌种的发酵：以深海真菌灰黄青霉菌为出发菌株，采用斜面菌种进行液体摇瓶培养；

b、真菌胞外多糖的提取：包括①过滤、②脱色、③醇沉、④透析、⑤纯化，其中：

①过滤：取步骤a的发酵液经滤纸抽滤除去菌丝体及其中的粗杂质，再萃取除去脂溶性小分子物质；

②脱色：采用活性炭脱色，在80-100℃水浴中0.5-1.5％活性炭缓慢加入到过滤后的发酵液中保温并搅拌5-10min，待溶液冷却至室温后，用漏斗抽滤至干即可；

③醇沉：脱色后的溶液浓缩至原体积1/10-1/5，加入原体积1/5-1/3体积的有机溶剂，剧烈震荡后离心，吸出上层水相后，将75％-95％的乙醇缓慢加入到浓缩液中，使乙醇终浓度达到70％-80％，把醇沉后的溶液放入冰箱中静置过夜；

④透析：步骤③所得的沉淀部分用滤纸抽滤，并脱水脱色后于40℃-60℃烘箱烘干，取烘干粉末溶于蒸馏水后离心的上清液置于孔径为3500Da-5000Da的透析袋在自来水中透析40h-50h，再用去离子水透析20h-30h，收集透析后的提取液，将透析液浓缩冻干即得到胞外多糖粗品；

⑤纯化：将步骤④所得多糖溶液配制成水溶液，离心后进行梯度洗脱，经分析、分别收集合并各含糖组分，减压浓缩，透析脱盐，冻干，得到目标多糖。

c、呋喃半乳寡糖的制备：先将步骤b的多糖5.0mg-7.0mg，溶于0.01-0.05mol/L三氟乙酸溶液中，混匀后于80℃-100℃的水浴中反应1.5h-3h，中和后备用，再采用凝胶层析柱对降解寡糖样品进行分离与在线检测，根据检测曲线分别按峰收集各峰对应部分，脱盐后冻干即得呋喃半乳寡糖。

3.根据权利要求2所述的呋喃半乳寡糖的制备方法，其特征在于：所述步骤a中的斜面菌种培养，培养基组成是以g/100ml计:马铃薯15-25，葡萄糖1-3，琼脂15-25，加水定容至至1L，pH值为自然，斜面菌种培养温度25-33℃，培养150-250小时。

4.根据权利要求2所述的呋喃半乳寡糖的制备方法，其特征在于：所述步骤a中，摇瓶培养，培养基组成是以g/100ml计:麦芽糖1-10，甘露醇2-5，葡萄糖1-5，谷氨酸钠1-3，KH₂PO₄0.05-1，MgSO40.03-2，酵母膏0.3-1和玉米浆0.1-4，加水定容至1L，pH调至5.5-6.5，25℃-28℃静置培养7d-10d。

5.根据权利要求2所述的呋喃半乳寡糖的制备方法，其特征在于：所述步骤b中的步骤③醇沉中所述的有机溶剂为氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为4:1。

6.根据权利要求2所述的呋喃半乳寡糖的制备方法，其特征在于：所述步骤b中的步骤③醇沉中所述的乙醇加入浓缩液中的体积比为5:1。

7.根据权利要求2所述的呋喃半乳寡糖的制备方法，其特征在于：所述步骤b中的步骤⑤采用梯度洗脱，洗脱液为以0.1-0.5mol/L的NaCl水溶液，流速为1mL/min。

8.一种权利要求1所述的呋喃半乳寡糖在制备免疫调节药物中的应用。