CN102336840B - 一种三股螺旋银耳多糖及其制备方法和应用 - Google Patents
一种三股螺旋银耳多糖及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种三股螺旋银耳多糖及其制备方法和应用，制备方法步骤包括：水提醇沉提取银耳多糖组分，经酶-Sevage结合法去蛋白、透析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化，真空冷冻干燥分离纯化组分即为银耳多糖。利用本发明制备银耳多糖，不影响其天然结构和活性，该方法对设备要求较低、成本低，利于工业生产上大规模的推广、开发和使用。本发明对纯化后多糖进行组分分析、结构鉴定及抗氧化活性研究，发现本发明银耳多糖有较强的清除羟自由的活性，是潜在的抗氧化物质。
Description
技术领域
本发明涉及多糖领域，具体涉及一种三股螺旋银耳多糖及其制备方法和应用。
背景技术
银耳(Tremella fuciformis Berk)，又名白木耳、雪耳，其内含有碳水化合物、蛋白质、维生素和多种氨基酸等，是滋补强壮、扶正固本的良药。银耳子实体由数片至10余片薄而多皱褶的瓣片组成，呈菊花形、牡丹花形或绣球形，直径3-15cm，白色或类黄色，表面光滑，有光泽，基蒂黄褐色；角质，硬而脆；浸泡水中膨胀，有胶质，气微，味淡，新鲜时软，干后收缩；多生于栎及其他阔叶树腐本上。据国内外的药理作用研究，银耳多糖具有可以调节动物的肠道有益菌群从而增强免疫力的作用；通过调节体液免疫、细胞免疫和细胞因子增强免疫系统的调节能力；直接或间接的对肿瘤细胞具有杀伤作用，是潜在的抗肿瘤药物；能清除自由基延缓衰老的作用；调节血糖血脂水平，缓解由于高血糖血脂引起的一系列疾病；此外银耳多糖还有抗凝血血栓、抗溃疡、促进蛋白质合成、抗病毒、促进神经细胞生长及改善记忆力等多方面的活性。
现有的银耳多糖的制备方法多采用酸碱或微波提取，可以增加多糖的提取率。
现有的银耳多糖的制备方法如：中国专利ZL200810240804.3中公开了一种银耳提取物及其制备方法，是用去离子水浸泡银耳后，调节pH值至8.5-9.0之间，于85-95℃恒温反应，过滤浓缩后，得到银耳提取物。中国专利申请CN200410072865.5中公开了几种均一体银耳(孢子)多糖及其提取方法和以该化合物为活性成分的药物组合物，提取方法包括：将银耳孢子发酵物经水煮、醇沉或不同浓度的NaOH水溶液梯度提取，经柱层析分离、纯化得到含量在90％以上碱提银耳多糖ATF-A、ATF-B、ATF-C、ATF-D，水提银耳多糖WTF-A、WTF-B。中国专利ZL02144648.2中公开了银耳多糖，其制备方法和以该化合物为活性成分的药物组合物，其制备方法包括：将银耳孢子、银耳子实体加水搅拌均匀制成水溶液，离心后取上清液经活性炭过柱两次，用水洗至无色，过滤后水浴加热，冷却至室温后冷藏，将树脂、鞣质等杂质除去；离心后取上清液，醇沉至浓度为60％，缓慢加入，充分搅拌后离心；取上清液醇沉至浓度为80％，充分搅拌再离心，收集沉淀物配液后G4漏斗过滤，分装灭菌，冻干制成成品。中国专利申请CN200410072864.0中公开了具有多种生物活性的均一体银耳多糖修饰物及其制备方法和含它们的制剂。中国专利ZL 200710014978.3中公开了一种银耳多糖的酶法逆向提取工艺，将银耳浸于水中，调节pH至7.3-7.6，将膨胀后的银耳移入酶解液中进行酶解，酶解温度为35-38℃，pH7.5-8.5，时间1-2H，从酶解液中移出酶解后的银耳，置于碱性溶液中，浸泡后，升温至90-98℃，持续0.5-1.0H，搅动，除去液面浮出的泡沫残渣，将絮状固形物移出，置于酸性溶液中，浸泡20-40分钟，移出絮状固形物，置于弱碱溶液中，浸泡10-20分钟，再移入清水，取出，沥干，脱水，低温干燥，得银耳多糖。中国专利ZL 200510023427.4中公开了银耳杂多糖及其提取物、制备方法和用途，银耳杂多糖，其结构以α-(1-3)甘露糖为主链，主要由重量百分比为70-93％的中性总糖、6-28％的葡萄糖醛酸、0.1-3％的结合蛋白组成；该银耳杂多糖的平均分子量为85-160万道尔顿，其中分子量大于6000道尔顿的占90％(重量)以上。中国专利ZL200910059901.7中公开了一种以银耳次、残品及耳脚为原料制备银耳多糖的方法，将银耳次、残品及耳脚3～30重量份加水浸泡20～30MIN，沥干，置于温度-20～-10℃冷冻6～10H，然后粉碎至粒径1～3MM；将上述粉碎后的银耳粒料与水按固液比1∶40～80混合均匀，经功率700W，温度90～100℃微波处理15～25MIN，按总固液比1∶80定容；再将上述微波处理后的原料放入三角瓶中，在温度60～80℃水浴中振荡1～2H，经3000～5000RPM离心10～20MIN，取上层清液在真空度0.08～0.09MPA、温度55～65℃浓缩至20～30％体积，在温度10～20℃，搅拌加入2～3倍体积的冷藏无水乙醇沉淀粗多糖，静止沉淀后过滤，获得糖泥在真空度0.08～0.09MPA、温度55～65℃干燥6～10小时，获得粗多糖产品。
上述报道大多是关于多糖粗提取的方法，部分专利或专利申请对单一组分结构进行分析是关于银耳多糖的一级结构的探讨，并没有涉及到活性或高级结构的鉴定。
发明内容
本发明提供了一种三股螺旋银耳多糖。
一种三股螺旋银耳多糖，具有三股螺旋结构，各股螺旋结构以1→6连接的α-甘露糖为主链，以与主链1→2连接的β-岩藻糖为侧链，以与主链1→4连接的α-葡萄糖醛酸为侧链，以与主链1→2连接的α-木糖为侧链；包括重量百分含量为81.9％的总糖和重量百分含量为6.8％的葡萄糖醛酸，不含核酸和蛋白；其中所述的总糖的组成为甘露糖、木糖和岩藻糖，所述的甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖和岩藻糖的物质的量之比为5.78∶0.7∶1.10∶1；所述的三股螺旋银耳多糖25℃的特性粘度为1392.8ml/g。
所述的三股螺旋银耳多糖的侧链有多种不同的变化组合，如可具有如结构式I所示的结构单元：
结构式I所示的结构单元是以α-(1-6)甘露糖(Manp)为主链，其1位碳原子上连有2个α-(1-2)木糖(Xylp)为侧链，2位碳原子上连有2个β-(1-2)岩藻糖(Fucp)为侧链，4位碳原子上连有1个α-(1-4)葡萄糖醛酸(GlcAcp)为侧链。
本发明还提供了一种三股螺旋银耳多糖的制备方法，具有操作简单、易于控制的优点。
一种三股螺旋银耳多糖的制备方法，包括步骤：
(1)水提：将银耳子实体粉碎得到银耳子实体粉末，加入蒸馏水，每克银耳子实体粉末加入50mL-60mL蒸馏水，90℃-100℃浸提4小时-6小时后离心，取上清液；离心所得沉淀可按所述水提方法重复1-2次，合并上清液得到银耳多糖水提液；
(2)醇沉：向步骤(1)中的银耳多糖水提液中加入4倍-5倍银耳多糖水提液体积的乙醇水溶液，搅拌混匀，于2℃-5℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次银耳粗多糖；
所述的乙醇水溶液的体积百分浓度为90％-96％；
(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次银耳粗多糖的水溶液用蛋白酶酶解，灭酶并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液；
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为8000Da-14000Da的透析袋在自来水中透析40h-50h，再用去离子水透析40h-50h，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次银耳粗多糖；
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次银耳粗多糖用去离子水溶解得到二次银耳粗多糖水溶液，经二乙氨基乙基纤维素52(DEAE纤维素-52)离子交换层析柱层析，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集第一洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、透析和冻干得到白色疏松絮状三股螺旋银耳多糖，命名为TEP1。
为了达到更好的发明效果，优选：
步骤(1)中，离心的速度为3000转/分钟(rpm)-4000rpm，时间为15min-30min。
步骤(1)中，每克银耳子实体粉末加入50mL蒸馏水，96℃浸提4小时，离心的速度为4000rpm，离心的时间为20min。
(2)醇沉：向步骤(1)中的银耳多糖水提液中加入4倍银耳多糖水提液体积的乙醇水溶液，搅拌混匀，于4℃沉淀过夜，再于4000rpm离心20min，取离心所得沉淀得到一次银耳粗多糖；
所述的乙醇水溶液的体积百分浓度为95％。
步骤(3)中，所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶；
所述的有机溶剂为氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为5∶1。
步骤(5)中，所述的二次银耳粗多糖水溶液的浓度为5mg/mL～30mg/mL，流速为1ml/min。
步骤(5)中，所述的二乙氨基乙基纤维素52离子交换层析柱层析的条件为：采用梯度洗脱，洗脱液为0.1mol/L-0.6mol/L的NaCl水溶液，流速1ml/min。
步骤(5)中，所述的凝胶过滤层析的条件为：流速0.5ml/min，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的NaCl水溶液，其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2-3∶1。
所述的磷酸盐缓冲液的配制方法按照本领域通用的方法，一般可参照2005年版《中国药典》。
所述的三股螺旋银耳多糖具有清除羟自由基的能力，可用于制备抗氧化剂。
与现有技术相比，本发明具有如下优点：
本发明三股螺旋银耳多糖(TFP1)，经单糖组成鉴定发现该多糖是由甘露糖、木糖和岩藻糖组成，还含有葡萄糖醛酸，甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖和岩藻糖的物质的量之比为5.78∶0.7∶1.10∶1。FTIR证明TFP1是糖类，为α-构型，含有糖醛酸。核磁共振图谱显示其为α-构型，含有羧基和甲基结构，说明该样品中含有糖醛酸和甲基糖。该多糖粘度较高，特性粘度达1392.8ml/g，存在较长的侧链和分支，具有三螺旋结构。表现为较强的清除羟自由基的能力，反应体系中加入1.25mg样品时清除率达到57.1％，可用于制备抗氧化剂。
虽然现有的用酸碱或微波提取，可以增加多糖的提取率，但多糖的天然结构和活性容易被破坏，对研究其高级结构和活性不利。而用水煮提法不仅可以节约成本、减少污染，经多次提取可得到大部分的多糖组分。银耳多糖粘度大，在分离纯化上是个难题，本发明用一定比例的水煮提并结合低速离心法分离水提液和残渣，减少了由于粘度大而难以分离上清液和残渣或水提液过稀必须浓缩的步骤，水提液可以直接用乙醇沉淀得到较多的多糖。本发明三股螺旋银耳多糖的制备方法，从银耳子实体中水煮提醇沉多糖，酶-Sevage法去蛋白，透析，离子交换层析和凝胶过滤层析，冷冻干燥得到均一的多糖TFP1，经结构鉴定和清除羟自由基能力证明该方法得到的多糖能够保持其天然的结构和活性，而且还具有对设备要求低，节约成本，环境污染小的优点。
附图说明
图1为银耳多糖DEAE纤维素-52离子交换层析收集的洗脱液在490nm的吸光度曲线；
图2为TFP1Sephadex G-400凝胶过滤层析收集的洗脱液在490nm的吸光度曲线；
图3为TFP1在200-400nm紫外扫描图谱；
图4为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化后单糖和糖醛酸标准品溶液的HPLC图谱；
图5为1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)衍生化后TFP1溶液的HPLC图谱；
图6为TFP1的红外光谱；
图7为TFP1的1H-NMR图谱；
图8为TFP1的13C-NMR图谱；
图9为I2/KI实验中TFP1的吸光度曲线；
图10为刚果红实验中TFP1在各碱性条件下最大吸收波长曲线；
图11为羟基自由基清除实验中清除率的曲线；
图12原子力显微镜测试图。
具体实施方式
实施例1
(1)水提取：将银耳子实体用自来水清洗干净，于50℃烘箱中烘干至恒重，粉碎得到银耳子实体粉末，加入蒸馏水，每克银耳子实体粉末加入50mL蒸馏水，混合均匀后于96℃恒温水浴锅中水浴浸提4小时，4℃4000rpm离心20min，取上清液；离心所得沉淀按所述水提方法重复2次，合并上清液得到银耳多糖水提液；
(2)醇沉：向步骤(1)中的银耳多糖水提液中加入4倍银耳多糖水提液体积的、体积百分浓度为95％乙醇水溶液，搅拌混匀，置于4℃冰箱中沉淀过夜，再于4℃4000rpm离心20min，取离心所得沉淀得到一次银耳粗多糖；
(3)去蛋白：将步骤(2)所得的一次银耳粗多糖溶于水，得到一次银耳粗多糖的水溶液，将木瓜蛋白酶溶液加到一次银耳粗多糖的水溶液中，木瓜蛋白酶的重量为一次银耳粗多糖重量的1％，然后在50℃水浴3h，再在100℃下灭酶15min，冷却至室温，10000rpm离心30min除去变性蛋白和酶；在离心所得上清液中加入二分之一上清液体积的Sevage试剂(氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为5∶1)，剧烈振摇15min，离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用Sevage试剂离心的步骤三次至无白色沉淀产生，得到提取液；
(4)透析：步骤(3)所得的提取液用孔径为8000Da-14000Da的透析袋在自来水中透析48h，再用去离子水透析48h，该过程可以除去寡糖、色素、有机溶剂、无机盐等，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次银耳粗多糖；
(5)纯化：将步骤(4)得到的二次银耳粗多糖用去离子水溶解得到5mg/mL的二次银耳粗多糖水溶液；
用去离子水平衡二乙氨基乙基纤维素52离子交换层析柱(3cm×26cm)，将二次银耳粗多糖水溶液经二乙氨基乙基纤维素52离子交换层析柱层析，上样量5ml，流速1ml/min，洗脱液为0.1mol/L-0.6mol/L NaCl溶液，梯度洗脱，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖(如图1)，收集第一洗脱峰的洗脱液；
将收集的第一洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析(Sephadex G-400)进一步纯化，层析柱的规格为3cm×100cm，上样量5ml，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液(PH7.0)+0.15mol/L NaCl(其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2∶1)，流速0.5ml/min，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰(如图2)，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、孔径为8000Da-14000Da的透析袋透析和冻干得到白色疏松絮状均一的三股螺旋银耳多糖，命名为银耳多糖TFP1。
下面是对TFP1结构鉴定或性能分析的实施例：
实施例2：组分检测
将实施例1制得的银耳多糖TFP1，用苯酚-硫酸法检测TFP1总糖含量为81.9％，用考马斯亮兰法(Bradford法)检测不含蛋白，用间羟苯酚法检测糖醛酸含量为6.8％。1mg/mlTFP1水溶液进行200-400nm紫外扫描，结果见图3，在260nm和280nm处，没有明显吸收峰，说明该样品中不含核酸和蛋白。
实施例3：单糖组成
实施例1制得的银耳多糖TFP15mg，加入2mol/L硫酸2ml，置于具塞试管中、氮气封口，100℃水解12h，冷却至室温，用硫酸钡中和，离心，上清液冻干得到冻干粉(即银耳多糖TFP1水解样品)，待衍生化。将各种单糖和糖醛酸标准品溶在0.3M(mol/L)氢氧化钠水溶液中配制每种单糖和糖醛酸浓度为5mmol/L(mM)的单糖和糖醛酸标准品溶液，将银耳多糖TFP1水解样品溶在0.3M氢氧化钠水溶液中配制银耳多糖TFP1水解样品浓度为5mmol/L的TFP1溶液，然后分别取75ul单糖和糖醛酸标准品溶液、取75ulTFP1溶液，各加入50ul 0.5M PMP甲醇液，混匀，70℃水浴100min，冷却至室温，加入75ul、0.3M HCl水溶液中和，10000rpm离心3min，将上清液转移至另一干净离心管，加水至1ml，加入等体积氯仿，充分震荡，静置分层后收集水相，为了除去PMP、过剩反应试剂等杂质，收集的水相，重复“加水至1ml，加入等体积氯仿，充分震荡，静置分层”的步骤三次，过0.22um膜，分别得到PMP衍生化后单糖和糖醛酸标准品溶液和PMP衍生化后TFP1溶液，待HPLC检测。
HPLC条件：柱子inertsil-ODS-SP(5μm，4.6×250mm)，检测波长245nm，流速1.0ml/min，柱温：室温，注入体积：20μl PMP衍生化后单糖和糖醛酸标准品溶液或10μl PMP衍生化后TFP1溶液，流动相A(乙腈)∶流动相B(0.05mol/L磷酸盐缓冲液(PH6.9))＝17∶83(体积比)。
如图4和图5，对应单糖和糖醛酸标准品，TFP1单糖组成为甘露糖、木糖和岩藻糖，还含有葡萄糖醛酸，甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖和岩藻糖的物质的量之比为5.78∶0.7∶1.10∶1，说明TFP1是以甘露糖为主链，并含有分支的多糖。
实施例4：FITR
取5mg实施例1制得的银耳多糖TFP1，用KBr压片，美国Nicolet5700红外光谱仪4000-600cm-1红外扫描。
如图6，1021.8cm-1O-H变角振动，C-H的吸收峰比较弱，在3000-2800cm-1之间，所以2930.0cm-1C-H伸缩振动，1249.1cm-1和1365.7cm-1是C-H变角振动，该化合物为糖类。O-H伸缩振动在3600-3200cm-1出现一宽峰，所以3259.2cm-1是O-H伸缩振动；1718.9cm-1是-COOH中的C＝O伸缩振动，1631.1cm-1是-COO中的C＝O非对称伸缩振动，1365.7cm-1是-COO中的C＝O对称伸缩振动，1718.9cm-1是葡萄糖醛酸，800.34cm-1是甘露糖的吸收峰，872.17cm-1附近是α-构型，894.15cm-1弱吸收峰证明少量β-构型存在。
实施例5：核磁共振
取30mg实施例1制得的银耳多糖TFP1溶于1ml氘水中，瑞士Bruker-AVIII500M进行500MHz NMR扫描。
1H-NMR见图7，TFP1的异头H-1化学位移大于4.95ppm，表示单糖残基构型为α-型。3.1-4.5ppm是糖环上H-2-H-6质子的化学位移，共振峰堆积较难解析。
13C-NMR见图8，δ＜20ppm即15.650ppm有碳信号，说明TFP1中含甲基糖。95-110ppm共振范围内有4个共振信号，分别为97.336、102.191、102.337、102.365，为异头碳C-1，说明TFP1至少有四种不同单糖残基和/或糖醛酸残基组成，异头碳的化学位移均小于103ppm，也进一步验证了单糖残基是α-型，与红外光谱中结果一致。对甘露糖残基而言，C6化学位移在69.2ppm，证明为1→6连接的α-型；对岩藻糖残基，异头碳C-1(97.336ppm)说明存在β-构型，且存在1→2连接；对葡萄糖醛酸残基而言，羧基特征信号碳位于165-180nm，图谱中174.189ppm处有一明显的信号，说明含糖醛酸，与液相色谱中单糖检测含葡萄糖醛酸吻合，与主链以1→4连接；对木糖而言，C2-C6的化学位移与标准品对照得知该糖与主链以1→2连接。具体结构单元如结构式I所示。
实施例6：粘度测定
本发明用乌式粘度法测定实施例1制得的银耳多糖TFP1的特性粘度，25℃下水作为溶剂，样品浓度为1mg/ml。TFP1经测定计算其特性粘度[η]＝1392.8ml/g。
实施例7：I2/KI实验
碘试剂为含0.02％(质量百分浓度)I2的0.2％(质量百分浓度)的KI水溶液，TFP1水溶液浓度为1mg/ml。取2ml TFP1水溶液，加入1.2ml碘试剂，混匀后分光光度计300-700nm扫描。
如图9，I2/KI的最大吸收在351nm，而565nm并没有最大吸收，说明TFP1存在较长的侧链和较多的分支。
实施例8：刚果红实验
取5mg实施例1制得的银耳多糖TFP1加入2ml去离子水和2ml 80μmol/L刚果红试剂，逐渐加入4.0mol/L NaOH水溶液，使溶液中TFP1浓度在大于0且小于等于0.5mol/L范围，在400-600nm进行紫外扫描，测各碱性条件下最大吸收波长。
如图10，随着NaOH的浓度升高，在一定范围内多糖TFP1+刚果红试剂最大吸收相对于刚果红本身最大吸收波长升高，说明TFP1具有三螺旋结构。
本发明建立了银耳多糖提取纯化的方法，获得均一多糖，并初步研究其一级和高级结构，对进一步进行生物活性及构效关系的探讨有重要的意义。
实施例9：抗氧化活性
本发明检测了实施例1制得的银耳多糖TFP1清除羟自由基的能力。
空白对照：反应体系中含FeSO4水溶液(8mM)0.5ml、H2O2水溶液(6mM)0.8ml、H2O 0.5ml和水杨酸钠水溶液(20mM)0.2ml。反应1h后562nm测吸光度。
样品：反应体系中含FeSO4水溶液(8mM)0.5ml、H2O2水溶液(6mM)0.8ml、H2O 0.5ml、不同浓度样品TFPl水溶液1ml和水杨酸钠水溶液(20mM)0.2ml。反应1h后562nm测吸光度。
不含水杨酸钠体系：反应体系中含FeSO4水溶液(8mM)0.5ml、H2O2水溶液(6mM)0.8ml、H2O 0.5ml和不同浓度样品TFP1水溶液1ml。反应1h后562nm测吸光度。
清除率(％)＝[1-(A1-A2)/A0]×100
A0：空白对照的吸光度；
A1：样品的吸光度；
A2：不含水杨酸钠体系的吸光度；
如图11所示，样品在1.25mg/ml时清除率达到57.1％，所以本发明得到的多糖TFP1具有良好的清除羟自由基的能力。
实施例10：原子力显微镜测试
将质量百分浓度为5％-10％的实施例1制得的银耳多糖TFP1水溶液涂抹在云母片上测试，从结果中可以看出溶液中分子呈直链棒状(见图12)，表现较好的刚性。
Claims (10)
1.一种三股螺旋银耳多糖，具有三股螺旋结构，各股螺旋结构以1→6连接的α-甘露糖为主链，以与主链1→2连接的β-岩藻糖为侧链，以与主链1→4连接的α-葡萄糖醛酸为侧链，以与主链1→2连接的α-木糖为侧链；包括重量百分含量为81.9℅的总糖和重量百分含量为6.8℅的葡萄糖醛酸，不含核酸和蛋白；其中所述的总糖的组成为甘露糖、木糖和岩藻糖，所述的甘露糖、葡萄糖醛酸、木糖和岩藻糖的物质的量之比为5.78:0.7:1.10:1；所述的三股螺旋银耳多糖25℃的特性粘度为1392.8ml/g。
2.根据权利要求1所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，包括步骤：
（1）水提：将银耳子实体粉碎得到银耳子实体粉末，加入蒸馏水，每克银耳子实体粉末加入50mL-60mL蒸馏水，90℃-100℃浸提4小时-6小时后离心，取上清液；离心所得沉淀按所述水提方法重复1-2次，合并上清液得到银耳多糖水提液；
（2）醇沉：向步骤（1）中的银耳多糖水提液中加入4倍-5倍银耳多糖水提液体积的乙醇水溶液，搅拌混匀，于2℃-5℃沉淀过夜，离心，取离心所得沉淀得到一次银耳粗多糖；
所述的乙醇水溶液的体积百分浓度为90℅-96%；
（3）去蛋白：将步骤（2）所得的一次银耳粗多糖的水溶液用蛋白酶酶解，灭酶并离心除去变性蛋白和酶，离心所得上清液再用有机溶剂离心除去下层有机相和中间的蛋白层，重复用有机溶剂离心的步骤直至无白色沉淀产生，得到提取液；
（4）透析：步骤（3）所得的提取液用孔径为8000Da-14000Da的透析袋在自来水中透析40h-50h，再用去离子水透析40h-50h，收集透析后的提取液，真空冷冻干燥得二次银耳粗多糖；
（5）纯化：将步骤（4）得到的二次银耳粗多糖用去离子水溶解得到二次银耳粗多糖水溶液，经二乙氨基乙基纤维素52离子交换层析柱层析，收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖，收集第一洗脱峰的洗脱液经凝胶过滤层析，凝胶过滤层析所收集的洗脱液用苯酚-硫酸法检测多糖峰，收集含多糖的洗脱液，经浓缩、透析和冻干得到白色疏松絮状三股螺旋银耳多糖。
3.根据权利要求2所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，离心的速度为3000rpm-4000rpm，时间为15min-30min。
4.根据权利要求2所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，每克银耳子实体粉末加入50mL蒸馏水，96℃浸提4小时，离心的速度为4000rpm，离心的时间为20min。
5.根据权利要求2所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，其特征在于，（2）醇沉：向步骤（1）中的银耳多糖水提液中加入4倍银耳多糖水提液体积的乙醇水溶液，搅拌混匀，于4℃沉淀过夜，再于4000rpm离心20min，取离心所得沉淀得到一次银耳粗多糖；
所述的乙醇水溶液的体积百分浓度为95%。
6.根据权利要求2所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，其特征在于，步骤（3）中，所述的蛋白酶为木瓜蛋白酶；
所述的有机溶剂为氯仿和正丁醇，其中氯仿和正丁醇的体积比为5:1。
7.根据权利要求2所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述的二次银耳粗多糖水溶液的浓度为5mg/mL～30mg/mL，流速为1ml/min。
8.根据权利要求2所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述的二乙氨基乙基纤维素52离子交换层析柱层析的条件为：采用梯度洗脱，洗脱液为0.1mol/L-0.6mol/L的NaCl水溶液，流速1ml/min。
9.根据权利要求2所述的三股螺旋银耳多糖的制备方法，其特征在于，步骤（5）中，所述的凝胶过滤层析的条件为：流速0.5ml/min，洗脱液为0.05mol/L磷酸盐缓冲液和0.15mol/L的NaCl水溶液，其中磷酸盐缓冲液与NaCl水溶液的体积比为2-3:1。
10.一种权利要求1所述的三股螺旋银耳多糖在制备抗氧化剂中的应用。
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