CN106905064A - 一种银耳栽培培养基及其制备方法、银耳栽培方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及银耳栽培领域，尤其涉及一种银耳栽培培养基及其制备方法、银耳栽培方法。本发明将棉籽壳、麸皮、木屑、玉米芯、豆粕、菜籽粕、豆秸粉、美藤果壳粉、甘蔗渣、石膏粉、尿素、过磷酸钙、维生素、KH₂PO₄和MgSO₄按照特定比例混合，经枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌、产朊假丝酵母渥堆发酵得到银耳栽培培养基。实验结果表明，采用本发明提供的培养基栽培得到的银耳能够高产多糖，提取得到的多糖经刚果红验证具有三股螺旋构型，因而具有广阔的应用前景和药用价值。

Description

一种银耳栽培培养基及其制备方法、银耳栽培方法

技术领域

本发明涉及食品加工领域，尤其涉及一种银耳栽培培养基及其制备方法、银耳栽培方法。

背景技术

银耳(Tremella fuciformis Berk)，又名白木耳，主产于四川、贵州、湖北、陕西、福建、浙江等地区。银耳子实体主要含有蛋白质、碳水化合物、维生素和多种氨基酸等多种营养物质，可供药用和滋补食品用。近年来，银耳子实体的主要活性成分之一银耳多糖逐渐成为研究的热点。现代研究证实银耳多糖主要是以a-(l-3)-D-甘露糖为主链的杂多糖，其生物活性十分广泛，包括具有免疫调节、抗肿瘤、抗氧化衰老、降血糖血脂、抗凝血血栓、抗溃疡、促进蛋白质合成、抗病毒、促进神经细胞生长及改善记忆力等功效。

多糖的特定空间构像是其产生生物学活性所必需的。关于多糖三股螺旋构型对生物学活性的影响有不同报道，多数报道认为，三股螺旋构型是多糖最具活性的空间构像。如有研究发现，香菇多糖三股螺旋链构象对体内、体外抗肿瘤活性起重要的作用，一旦螺旋链破坏，抗肿瘤活性显著下降，甚至消失。因此，制备具有三股螺旋构象的银耳多糖对提高银耳的药用价值具有重要的作用。

目前，对于银耳多糖的研究主要集中在栽培培养基优化、多糖提取和纯化、及其性质和结构等方面。相关专利包括：中国专利申请公布号CN105754002，CN102826884，CN104350952，CN104871815，CN103798057，CN103626572等。这些专利主要通过优化银耳栽培培养基组成和改良银耳多糖提取工艺，以进一步提高银耳多糖的产量和品质。但其中大部分专利都鲜有涉及到三螺旋高级结构等方面。

公开号为CN102336840的发明专利“一种三股螺旋银耳多糖及其制备方法和应用”，首次公开了三股螺旋构型的银耳多糖，其通过水提醇沉提取银耳多糖的粗提物，再经酶-Sevage结合法去蛋白、透析、阴离子交换层析和凝胶过滤层析纯化、真空冷冻干燥得到一种三股螺旋的银耳多糖。银耳栽培用的培养基组成及栽培方法是影响银耳多糖组成和结构的重要因素，尤其是栽培培养基的组成。然而，该方法并未涉及栽培银耳的培养基和栽培方法，而仅仅是通过银耳多糖的提取和纯化工艺获得三股螺旋结构的银耳多糖，但并不能提高银耳中这种结构的多糖含量，因此难以进一步推广、应用。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种银耳栽培培养基及其制备方法、银耳栽培方法，采用该培养基栽培得到的银耳中银耳多糖和三股螺旋构型的银耳多糖含量较高，易于推广和应用。

本发明提供了一种银耳栽培培养基，由水和包括以下质量分数的原料经微生物发酵制成：

所述微生物为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌和产朊假丝酵母。

优选地，所述培养基由水和包括以下质量分数的原料经微生物发酵制成：

所述微生物为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌和产朊假丝酵母。

产朊假丝酵母(Candida utilis)，又叫产朊圆酵母或食用圆酵母，其蛋白质和维生素B的含量均高于一般的酿酒酵母，可以以尿素和硝酸作为氮源，在培养基中不需要加入任何生长因子即可生长，它能利用五碳糖和六碳糖，有氧条件下不产酒精，既能利用造纸工业的亚硫酸废液，还能利用糖蜜、木材水解液等生产出人畜可食用的蛋白质。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Baclicuslincheniformis)和假单胞菌(Pseudomonas sp.)具有产纤维素酶等特性，可初步降解银耳栽培基料中纤维素原料，其人畜无害，已广泛应用于秸秆发酵、饲料发酵等方面。

优选地，以湿基计，所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌和产朊假丝酵母接种量为均10⁶-10⁸cfu/g。在本发明提供的具体实施例中，以湿基计，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌接种量为10⁷cfu/g，产朊假丝酵母的接种量为10⁶cfu/g。

在本发明中，本发明提供的培养基经枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌和产朊假丝酵母发酵得到。其中，枯草芽孢杆菌优选为枯草芽孢杆菌GM1，地衣芽孢杆菌优选为地衣芽孢杆菌GH1，假单胞菌优选为假单胞菌P-01，产朊假丝酵母优选为产朊假丝酵母Y-9。

本发明提供的银耳栽培培养基，在对培养基组分进行了优化、设计的基础上，将培养基组分与特定的微生物枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌和产朊假丝酵母进行发酵，获得银耳栽培培养基，实验结果表明，该银耳栽培培养基特别适合银耳的生长，栽培得到的银耳能够高产多糖，且提取得到的多糖中三股螺旋构型的银耳多糖含量较高，因而具有广阔的应用前景和药用价值。

在本发明中，所述培养基的含水量优选为50～60wt％，更优选为52％～56％。在本发明提供的实施例中，所述培养基的含水量为54～56wt％。

本发明还提供一种制备本发明所述银耳栽培养基的制备方法，包括以下步骤：

a)、将棉籽壳、麸皮、木屑、玉米芯、豆粕、菜籽粕、豆秸粉、美藤果壳粉、甘蔗渣和石膏粉混匀，得到干料；

b)、将尿素、过磷酸钙、维生素B₁、KH₂PO₄、MgSO₄和水混合，加入步骤a)得到的干料中，搅拌混匀，得到混合料；

c)、在所述混合料中接种枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌和产朊假丝酵母，渥堆发酵，得到银耳栽培培养基。

在本发明提供的制备方法中，首先将棉籽壳、麸皮、木屑、玉米芯、豆粕、菜籽粕、豆秸粉、美藤果壳粉、甘蔗渣和石膏粉混匀，得到干料；然后将尿素、过磷酸钙、维生素B₁、KH₂PO₄、MgSO₄和水混合，加入步骤a)得到的干料中，搅拌混匀，得到混合料。在本发明提供的制备方法中，尿素、过磷酸钙、维生素B₁、KH₂PO₄、MgSO₄和水混合后，优选分次加入步骤a)得到的干料中，用铁铲来回翻动多次，搅拌混匀。

得到混合料后，在混合料中接种枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌和产朊假丝酵母，渥堆发酵。其中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌和产朊假丝酵母接种量均为10⁶-10⁸cfu/g。在本发明提供的具体实施例中，枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌接种量为10⁷cfu/g，产朊假丝酵母的接种量为10⁶cfu/g。在本发明中，渥堆发酵的时间优选为2～5天，更优选为3～4天。在本发明中，渥堆发酵的温度优选为25-40℃，更优选为35-37℃。渥堆发酵结束后，得到银耳栽培培养基。

在本发明中，发酵结束后得到银耳栽培培养基的含水量优选控制在为50～60wt％，更优选为52％～56％。培养基的pH优选控制在5.5～6.5,更优选为5.8～6.0。在本发明提供的实施例中，培养基的含水量为54～56wt％，pH为6.0。

本发明同时提供一种银耳栽培方法，采用本发明提供的银耳栽培培养基栽培银耳。采用本发明提供的银耳栽培培养基栽培银耳的具体过程为：首先以本发明的银耳栽培培养基为填料制料袋，灭菌，冷却后接种银耳菌种，得到菌袋；将接种银耳菌种的菌袋置于培养室中进行培养，依次经过萌发生长、快速生长、子实体生长和成熟生长四个培养阶段。

在本发明提供的银耳栽培方法中，接种时，优选菌龄为10d的银耳三级菌种进行接种。

在本发明提供的银耳栽培方法中，萌发生长的温度优选为26-28℃，空气湿度优选为55-65％，培养时间优选为1～3d。

在本发明提供的银耳栽培方法中，快速生长的温度优选为22-26℃，湿度优选为65-90％，培养时间优选为4～16d，培养过程中，每天通风2-4次，每次10-20min。

在本发明提供的银耳栽培方法中，子实体生长的温度优选为20～24℃，湿度优选为85～95％，培养时间优选为17～30d，培养过程中，每天通风3-4次，每次20-80min。

在本发明提供的银耳栽培方法中，成熟生长的温度优选为20～24℃，湿度优选为80～85％，培养时间优选为31～35d，培养过程中，每天通风3-4次，每次20-30min。

本发明还提供了一种由本发明栽培方法栽培得到的银耳，以及所述银耳在制备三股螺旋银耳多糖中的应用。

本发明将棉籽壳、麸皮、木屑、玉米芯、豆粕、菜籽粕、豆秸粉、美藤果壳粉、甘蔗渣、石膏粉、尿素、过磷酸钙、维生素、KH₂PO₄和MgSO₄按照特定比例混合，经枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌、产朊假丝酵母渥堆发酵得到银耳栽培培养基。本发明通过选择适宜的培养基组分与特定的微生物种类进行发酵获得的培养基，营养成分搭配合理，适宜银耳生长。实验结果表明，采用本发明提供的培养基栽培得到的银耳能够高产多糖，提取得到的多糖经刚果红验证具有三股螺旋构型，因而具有广阔的应用前景和药用价值。

附图说明

图1示本发明实施例1～2和对比例1栽培的得到的银耳中多糖得率，字母不同表示结果存在显著性差异(P<0.05)，实施例案例1～2分别代表实施例1～2栽培的得到的银耳中多糖得率，对比案例1代表对比例1栽培的得到的银耳中多糖得率；

图2示本发明实施例1～2和对比例1的银耳多糖与刚果红反应曲线图，其中，实施例案例1、2的曲线图分别代表本申请实施例1、2的银耳多糖与刚果红反应曲线图，对比案例1的曲线图代表对比例1的银耳多糖与刚果红反应曲线图；

图3示本发明实施例1～2和对比例1的银耳多糖对小鼠脾淋巴细胞增值率，字母不同表示结果存在显著性差异(P<0.05)，实施例案例1～2分别代表实施例1～2的银耳多糖对小鼠脾淋巴细胞增值率，对比案例1代表对比例1的银耳多糖对小鼠脾淋巴细胞增值率。

具体实施方式

本发明公开了一种银耳栽培培养基及其制备方法、银耳栽培方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

对所公开的实施例的说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1

(一)银耳栽培培养基配方：

棉籽壳74.5％，麸皮12％，木屑2.5％，玉米芯1％，豆粕2％，菜籽粕1.5％，豆秸粉0.5％，美藤果壳粉0.6％，甘蔗渣0.5％，石膏粉2％，尿素0.4％，过磷酸钙1.5％，维生素B10.001％，KH₂PO₄ 0.5％，MgSO₄ 0.5％

(二)培养基制备方法：

按上述配方称取棉籽壳、麸皮、木屑、玉米芯、豆粕、菜籽粕、豆秸粉、美藤果壳粉、甘蔗渣和石膏粉充分混匀，得到干料；将尿素、过磷酸钙、维生素B₁、KH₂PO₄、MgSO₄和水混合，分2次加入所述干料中，用铁铲来回翻动多次，搅拌混匀，得到混合料；在混合料中接种枯草芽孢杆菌GM1、地衣芽孢杆菌GH1、假单胞菌P-01和产朊假丝酵母Y-9，使得培养基中枯草芽孢杆菌GM1、地衣芽孢杆菌GH1、假单胞菌P-01的活菌含量为10⁷cfu/g(湿基)，产朊假丝酵母Y-9的活菌含量为10⁶cfu/g(湿基)，35-37℃条件下，渥堆发酵3d，根据堆料的含水量补充水分，加入酸调节pH，发酵结束后得到含水量为55％，pH为6.0的银耳栽培培养基。

(三)栽培管理方法：

1)制料袋：

以上述银耳栽培培养基为填料，采用半自动螺旋压料式装料机将料填装到离袋口8cm，每个料袋填湿料1kg，用棉线绑扎3圈。采用直径1.2cm打穴器在料袋单面打穴，每袋打3个等距离穴，穴口直径1.2cm，深2cm，并用布擦去袋表面的杂质。将食用菌专用胶布剪成3.3cm×3.3cm的小方块，贴封穴口，穴口四周封严压密。

2)料袋灭菌、冷却：

采用常压蒸气灭菌，于100℃维持18h，冷却待用。

3)接种：

选取菌龄10d的银耳三级菌种进行接种。先用灭菌的接种刀把菌种表层的银耳原基挖弃，把捣碎表层2cm层，再把下层较疏松的香灰菌丝层6cm挖起与之混合均匀。同时，用一下块消毒后的塑料布封住瓶口并扎紧。

4)栽培管理：

将接种好的菌袋至于培养室中进行培养，各个阶段调控管理如表1所示。

表1 本发明中银耳栽培各个阶段调控管理

5)采收：

栽培结束后，选择朵直径16cm，朵鲜重250g，耳片完全展开并呈粉白色，于晴天上午采收。

(四)银耳多糖提取：

采收后的银耳将采收后的银耳干燥后用粉碎机粉碎，过40目筛，得到银耳粉末；得到的银耳加入蒸馏水，以料:水(w/v)＝1:50搅拌混匀，在96℃的恒温水浴锅提取4h，4℃4000rpm离心20min分离，取上清液，真空旋转蒸发浓缩；加入4倍体积的95％乙醇，搅拌混匀，过夜沉淀，离心分离，弃上清，用95％乙醇洗涤沉淀一次，沉淀冷冻干燥得到多糖粗制品。用蒸馏水溶解，加入木瓜蛋白酶溶液，50℃水浴加入3h，然后100℃下将酶灭活15min，10000rpm离心30min除去变性蛋白和酶。在多糖溶液中加入等体积的Sevage试剂，剧烈震荡15min，4℃6000min离心20min，取上清液重复去蛋白6次至无明显蛋白层出现。50℃旋转蒸发真空浓缩；用8000-14000Da透析袋透析，将得到的溶液进行冷冻干燥，最终得到银耳多糖。

实施例2

(一)、银耳栽培培养基配方：

棉籽壳40.5％，麸皮1.5％，木屑20％，玉米芯16.5％，豆粕3％，菜籽粕10％，豆秸粉1％，美藤果壳粉1％，甘蔗渣1％，石膏粉2.9％，尿素0.1％，过磷酸钙0.5％，维生素B₁0.005％，KH₂PO₄ 0.8％，MgSO₄ 1.2％。

(二)培养基制备方法：

按上述配方称取棉籽壳、麸皮、木屑、玉米芯、豆粕、菜籽粕、豆秸粉、美藤果壳粉、甘蔗渣和石膏粉充分混匀，得到干料；将尿素、过磷酸钙、维生素B₁、KH₂PO₄、MgSO₄和水混合，分3次加入所述干料中，用铁铲来回翻动多次，搅拌混匀，得到混合料；在混合料中接种枯草芽孢杆菌GM1、地衣芽孢杆菌GH1、假单胞菌P-01和产朊假丝酵母Y-9，使得每克培养基中枯草芽孢杆菌GM1、地衣芽孢杆菌GH1、假单胞菌P-01的活菌含量为10⁸cfu/g(湿基)，产朊假丝酵母Y-9的活菌含量为10⁶cfu/g(湿基)，35-37℃条件下，渥堆发酵3d，根据堆料的含水量补充水分和加入酸调节pH，发酵结束后得到含水量为55％，pH为6.0的银耳栽培培养基。

银耳的栽培管理方法、银耳多糖提取方法与实施例1相同。

对比例1

以木屑为基质袋栽培四川银耳，栽培管理方法和银耳多糖提取方法与实施例1相同。

实施例3 银耳多糖含量的检测

采用硫酸-苯酚法测定实施例1～2、对比例1栽培得到的银耳中总糖含量，见图1，结果表明，相比对比例1栽培得到的银耳，本发明实施例1和实施例2栽培得到的银耳中多糖得率分别提高了19.01％和16.72％(P<0.05)。

实施例4 刚果红鉴定实验

分别取5mg实施例1～2、对比例1提取得到的银耳多糖，加2mL去离子水和2mL 80μmol/L刚果红试剂，逐渐加入4.0mol/L NaOH，使溶液中碱浓度在0-0.5mol/L，用400-600nm进行紫外扫描，测各碱性条件下最大吸收波长。

如图2所示，随着NaOH的浓度升高，刚果红与对比案例1的银耳多糖形成的络合物的最大吸收波长相应减小，但相对于刚果红本身最大吸收波长减小的缓慢，说明对比例1提取得到的银耳多糖不具有三螺旋结构。而实施例1和实施例2提取得到的银耳多糖在0.1mol/L与0.25mol/LNaOH浓度时，最大吸光值增加，说明本申请实施案例1和实施例2提取得到的银耳多糖中存在三股螺旋结构。

实施例5 银耳多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响

实验分为空白对照组、实验组和对照组，其中，空白对照组加入RPMI-1640完全培养液100μL，实验组分别加入100μL由实施例1～2的银耳多糖配制的母液(浓度为50μg/mL)，对照组加入100μL由对比例1的银耳多糖配制的母液(终浓度为50μg/mL)。

取96孔细胞培养板，每孔加入制备好的小鼠脾淋巴细胞悬液100μL，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养3-4h。取出细胞培养板，按照上述分组分别加入100μL空白对照组、实验组和对照组的溶液，使培养液中银耳多糖的终浓度为25μg/mL，每个分组设6个复孔，培养48h，测定银耳多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响，结果见图3。

结果表明，相比对比例1的银耳多糖，本发明实施例1和实施例2的银耳多糖对小鼠脾淋巴细胞的增值率分别提高了6.64％和5.23％(P<0.05)，进一步说明本发明实施例1和实施例2的银耳多糖中存在三股螺旋结构，具有更高的生物学活性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种银耳栽培培养基，其特征在于，由水和包括以下质量分数的原料经微生物发酵制成：

所述微生物为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌和产朊假丝酵母。

2.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，由水和包括以下质量分数的原料经微生物发酵制成：

所述微生物为枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌和产朊假丝酵母。

3.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，以湿基计，所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌和产朊假丝酵母接种量为均10⁶-10⁸cfu/g。

4.根据权利要求1所述的培养基，其特征在于，所述培养基的含水量为50～60wt％。

5.根据权利要求1～4任一所述的培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

a)、将棉籽壳、麸皮、木屑、玉米芯、豆粕、菜籽粕、豆秸粉、美藤果壳粉、甘蔗渣和石膏粉混匀，得到干料；

b)、将尿素、过磷酸钙、维生素B₁、KH₂PO₄、MgSO₄和水混合，加入步骤a)得到的干料中，搅拌混匀，得到混合料；

c)、在所述混合料中接种枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌和产朊假丝酵母，渥堆发酵，得到银耳栽培培养基。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中，所述枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、假单胞菌和产朊假丝酵母接种量均为10⁶-10⁸cfu/g。

7.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤c)中，所述渥堆发酵的时间为4～6天。

8.一种银耳栽培方法，其特征在于，采用权利要求1～4任意一项所述的培养基以及权利要求5～7任意一项所述的制备方法制备得到的培养基栽培银耳。

9.权利要求8所述的栽培方法栽培得到的银耳。

10.权利要求9所述的银耳在制备三股螺旋银耳多糖中的应用。