CN105175568A - 一种提取银杏白果多糖的方法及其产品 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提取银杏白果多糖的方法其产品，本发明以银杏白果为原料，经石油醚脱脂后，加入复合酶（纤维素酶和果胶酶）超声后灭酶，再加入中性蛋白酶水解，使银杏白果中的多糖游离到上清液中，上清液经Sevage试剂除蛋白，无水乙醇沉淀后，加水复溶，然后利用季铵盐进一步纯化银杏白果多糖，再经透析袋脱盐处理，最后冷冻干燥，从而制备出高活性的银杏白果多糖产品。采用本发明的方法可以直接制得具有降血糖、抗氧化活性的银杏白果多糖，可以将其作为天然功能因子加入到食品，或直接作为保健品食用。

Description

一种提取银杏白果多糖的方法及其产品

技术领域

本发明属于天然产物多糖的分离提取领域，具体涉及一种提取银杏白果多糖的方法及其产品。

背景技术

银杏属裸子植物银杏科银杏属植物，为亚热带、温带树种，在我国广泛栽培，是我国主要的经济树种之一。银杏白果是银杏的主要经济器官，其资源量大、售价高、销路畅，表现出明显的经济优势。研究发现银杏制剂有对防治心脑血管疾病、老年痴呆症和对抗血小板活化因子的作用，目前已经研制开发了银杏植物药制剂、功能性食品、保健品和化妆品。

有研究表明白果中含有丰富的营养物质，主要有：碳水化合物类(60％)、蛋白质类(13％)、脂类物质(4％)、糖类(6％)，同时白果中还含有维生素、无机盐以及人体需要但自身不能合成的9种氨基酸。现研究表明，白果蛋白及脂肪具有抗氧化、抗衰老等作用。而银杏白果多糖也是白果中一种重要的活性成分，它具有免疫调节、抗肿瘤、抗衰老、抗炎等多种活性作用。

目前，银杏白果多糖的提取大都采用热水浸提或水煎煮，其提取方法简单，不会引起多糖降解，但一般只能提取胞壁外多糖，所得多糖生物活性较低。近年有文献报道，利用超声波或微波提取，但提取率及纯度较低，对原料的利用率低。且粗多糖中蛋白的去除一般采用Sevag法，此法只能除去少量蛋白质，效率不高，需反复多次，多糖损失较大，且在某种度上会影响银杏白果多糖的生物活性。在多糖分离纯化方面，多采用凝胶过滤法分离纯化多糖，成本高，工作量大，技术操作繁杂，不宜应用于工业生产中。

发明内容

本发明的目的在于克服上述现有技术缺陷，提供一种可以用于工业化生产高效率和操作简单的，且可用于食品工业的白果多糖的提取方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：

一种提取银杏白果多糖的方法，包括以下步骤：

(1)超声协同酶处理提取银杏白果多糖：脱脂银杏白果粉加水后制备成反应液，所述反应液中添加复合酶进行水解，复合酶水解的同时对反应液进行超声处理，所述复合酶为果胶酶和纤维素酶，超声处理后灭活复合酶，调节体系pH值，加入蛋白酶进行水解，水解后灭活蛋白酶，离心处理，得上清液为银杏白果多糖溶液；

(2)醇沉、除蛋白纯化得银杏白果粗多糖：步骤(1)所得的银杏白果多糖溶液添加乙醇进行沉淀，复溶沉淀加入Sevag试剂除蛋白，再次加入乙醇后沉淀、洗涤干燥沉淀得银杏白果粗多糖；

(3)溶解步骤(2)所得的银杏白果粗多糖添加季铵盐再次沉淀进行分离纯化；

(4)脱盐处理；

(5)冷冻干燥得银杏白果精多糖。

进一步的，步骤(1)中所述反应液中脱脂银杏白果粉的质量浓度为4.0％-10％，果胶酶添加量为35-55U/g_{脱脂银杏白果粉}，纤维素酶添加量为30-60U/g_{脱脂银杏白果粉}，添加复合酶前调解反应液pH值为5.0-6.0，复合酶水解温度为45-65℃，超声功率为250-450W，每次复合酶水解并结合超声提取的时间为10-50min，超声两次。

进一步的，步骤(1)中灭活复合酶后加入蛋白酶前调解反应液pH值至7.0，蛋白酶的种类为中性蛋白酶，蛋白酶添加量为150-350U/g_{脱脂银杏白果粉}，调节中性蛋白酶的水解温度为50-60℃。

进一步的，步骤(1)中灭活复合酶后加入蛋白酶前调解反应液pH值至7.0，蛋白酶的种类为中性蛋白酶，蛋白酶添加量为150-350U/g_{脱脂银杏白果粉}，调节中性蛋白酶的水解温度为50-60℃，蛋白酶水解反应时间为1-3h。

进一步的，步骤(4)的具体操作为：将步骤(3)所得的复溶溶液装入分子量2-14kDa透析袋内进行脱盐。

一种使用所述的方法得到的银杏白果精多糖。

进一步的，所述银杏白果精多糖纯度为65-80％。

进一步的，所述银杏白果精多糖重均分子量为2.020×10⁴g/mol。

进一步的，所述银杏白果精多糖的单糖组成为甘露糖、鼠李糖和葡萄糖，其物质的量的比为8.25:1.00:1.53。

所述银杏白果精多糖应用于降血糖、抗氧化的保健品及药物的制备。

本发明的有益效果是：

1)本发明采用超声波协同酶法提取多糖具有条件温和、杂质易除、得率高、操作简便、无副作用、无二次污染、在某种程度上可提高多糖的生物活性等优点。

2)通过本发明提取方法可以直接获得得率及纯度较高的银杏白果多糖，可以直接制得具有天然抗氧化和降血糖活性的银杏白果多糖，可以将其作为天然降血糖功能因子加入到食品或作为抗氧剂加入化妆品等日常用品中，还可以直接作为天然保健品食用。

3)本发明先利用蛋白酶将蛋白水解，再用Sevag法去除蛋白，只需两次处理就可以很好的去除蛋白，效率高。在多糖分离纯化方面，多采用凝胶过滤法分离纯化多糖，成本高，工作量大，技术操作繁杂，不宜应用于工业生产中，而本发明中用季铵盐法分离纯化多糖，操作方便、成本低，适合应用于工业生产中。

4)本发明利用超声波协同酶法，建立了快速、高效率、低成本的白果多糖的提取技术，能够满足工业化大规模生产的要求。

附图说明

图1为不同提取方式对银杏白果多糖提取率的影响；

图2为不同提取方式提取的银杏白果多糖DPPH自由基清除率的比较；

图3为不同提取方式提取的银杏白果多糖羟自由基清除率的比较；

图4为不同提取方式提取的银杏白果多糖还原力的比较；

图5为不同提取方式提取的银杏白果多糖对葡萄糖苷酶抑制率影响的比较；

图6为不同提取方式提取的银杏白果多糖的全波长扫描图谱；

图7为扫描电镜下的热水提取的银杏白果多糖形貌；

图8为扫描电镜下的超声提取的银杏白果多糖形貌；

图9为扫描电镜下的酶法提取的银杏白果多糖形貌；

图10为扫描电镜下的超声协同酶技术提取的银杏白果多糖形貌；

图11为热水提取的银杏白果多糖的多角度激光散色光谱；

图12为超声提取的银杏白果多糖的多角度激光散色光谱；

图13为酶法提取的银杏白果多糖的多角度激光散色光谱；

图14为超声协同酶技术提取的银杏白果多糖的多角度激光散色光谱；

图15为单糖标准品高效液相色谱分离图谱；

图16为热水提取的银杏白果多糖水解物高效液相色谱分离图；

图17为超声提取的银杏白果多糖水解物高效液相色谱分离图；

图18为酶法提取的银杏白果多糖水解物高效液相色谱分离图；

图19为超声协同酶技术提取的银杏白果多糖水解物高效液相色谱分离图。

具体实施方式

实施例1

一种提取银杏白果多糖的方法，包括以下步骤：

(1)超声协同酶处理提取银杏白果多糖：脱脂银杏白果粉加水后添加复合酶制备成反应液，同时对反应液进行超声处理，所述复合酶为果胶酶和纤维素酶，超声处理后灭活复合酶，保持液料比和酶解温度恒定，调节体系pH，加入蛋白酶水解蛋白，水解后灭酶，离心处理，得上清液为银杏白果多糖溶液；

(2)醇沉、除蛋白纯化得银杏白果粗多糖：步骤(1)所得的银杏白果多糖溶液添加乙醇进行沉淀，复溶沉淀加入Sevag试剂除蛋白，再次加入乙醇后沉淀、洗涤干燥沉淀得银杏白果粗多糖；

(3)溶解步骤(2)所得的银杏白果粗多糖添加季铵盐再次沉淀进行分离纯化；

(4)脱盐处理；

(5)冷冻干燥得银杏白果精多糖。

步骤(1)中所述反应液中脱脂银杏白果粉的质量浓度为4.0％-10％，果胶酶添加量为35-55U/g_{脱脂银杏白果粉}，纤维素酶添加量为30-60U/g_{脱脂银杏白果粉}，复合酶水解温度为45-65℃，添加复合酶前调解反应液pH值为5.0-6.0，超声功率为250-450W，超声时间为10-50min，超声两次。

步骤(1)中灭活复合酶后加入蛋白酶前调解反应液pH值至7.0，蛋白酶的种类为AS1.398中性蛋白酶，蛋白酶添加量为150-350U/g_{脱脂银杏白果粉}，调节中性蛋白酶的水解温度为50-60℃，蛋白酶水解反应时间为1-3h。

步骤(3)的具体操作为：取银杏白果粗多糖溶于蒸馏水中，加入等体积的3％十六烷基三甲基溴化铵，34～36℃下保温静置3～6h，产生沉淀，4℃离心收集沉淀，将沉淀用9.5％～10.5％NaCl溶液溶解后，加入无水乙醇，产生白色沉淀，离心，收集沉淀，并用去离子水溶解得复溶溶液。

步骤(4)的具体操作为：将步骤(3)所得的复溶溶液装入分子量2-14kDa透析袋内进行脱盐。

通过上述方法制备得到银杏白果精多糖。银杏白果精多糖纯度为65-80％。银杏白果精多糖重均分子量为2.020×10⁴g/mol。银杏白果精多糖的单糖组成为甘露糖、鼠李糖和葡萄糖，其物质的量的比为8.25:1.00:1.53。

该银杏白果精多糖可应用于降血糖、抗氧化的保健品及药物的制备。

实施例2

在实施例1的基础上进一步优化。

一种超声协同酶技术提取银杏白果多糖的方法，其特征包含以下步骤：

(1)超声协同酶处理提取银杏白果多糖：

a：在室温条件下，将白果剥壳、去红皮，用高速粉碎机将其粉碎并真空干燥、脱脂，即得脱脂白果粉备用。

b：称取一定量的脱脂白果粉，用蒸馏水配置成质量浓度为4.0％-10％的体系，然后使用HCl调节pH至5.0-6.0，调节酶解温度为50-60℃，添加复合酶，即果胶酶添加量为35-55U/g(每克白果粉添加果胶酶35-55U)和纤维素酶添加量为40-60U/g(每克白果粉添加纤维素酶40-60U)后，同时对其反应液进行超声处理，超声功率为250-400W，每次超声时间为10-50min，超声两次。在超声结束后，在温度为90℃条件下，加热灭酶30秒。

c：利用NaOH调节步骤b中灭酶后反应液的pH至7.0，调节酶解温度为50-60℃，添加AS1.398中性蛋白酶，其添加量为150-350U/g，水解反应时间为1-3h，酶解反应后，在温度为90℃条件下，加热灭酶30秒；在4000r/min条件下，离心10min后，获得上清液，即为白果多糖溶液；

(2)醇沉、除蛋白纯化得银杏白果粗多糖：

将步骤(1)中所得多糖溶液50℃旋转蒸发浓缩至原体积的1/5，然后加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀，静置过夜，离心得沉淀；将沉淀加水复溶后，在多糖溶液中，以体积比1:4加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝5:1v/v)，混合物剧烈振摇30min，离心(4000r/min，10min)，除去水层和试剂层交界处的变性蛋白，重复操作几次，直至不出现白色胶状物；再在多糖溶液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀，离心得沉淀；将沉淀分别用无水乙醇、丙酮和乙醚相继洗涤，再冷冻干燥得银杏白果粗多糖；

(3)溶解粗多糖添加季铵盐再次沉淀分离纯化：

取一定量的粗多糖溶于蒸馏水中，加入等体积的3％十六烷基三甲基溴化铵，35℃下保温静置4h，产生沉淀，4℃，4000r/min离心20min，收集沉淀；将沉淀用10％NaCl溶液溶解后，加入3倍的无水乙醇，产生白色沉淀，离心，收集沉淀，并用去离子水溶解得复溶溶液；

(4)脱盐处理：

将步骤(3)的复溶溶液装入分子量2-14kDa透析袋内进行脱盐；

(5)冷冻干燥得银杏白果精多糖：

将脱盐溶液冷冻干燥即制得银杏白果多糖精制品。

实施例3

在实施例2的基础上进一步优化条件。

一种超声协同酶技术提取银杏白果多糖的方法，其特征包含以下步骤：

(1)超声协同酶处理提取银杏白果多糖：

a：在室温条件下，将白果剥壳、去红皮，用高速粉碎机将其粉碎并真空干燥、脱脂，即得脱脂白果粉备用。

b：称取一定量的脱脂白果粉，用蒸馏水配置成质量浓度为6.7％的体系，然后使用HCl调节pH至5.5，调节酶解温度为55℃，添加复合酶，即果胶酶添加量为46U/g(每克白果粉添加果胶酶46U)和纤维素酶添加量为45U/g(每克白果粉添加纤维素酶45U)后，同时对其反应液进行超声处理，超声功率为350W，超声两次，每次为30min；在超声结束后，在温度为90℃条件下，加热灭酶30秒。

c：利用NaOH调节步骤b中灭酶后反应液的pH至7.0，调节酶解温度为55℃，添加AS1.398中性蛋白酶，其添加量为280U/g(每克白果粉添加蛋白酶280U)，水解反应时间为2h，酶解反应后，在温度为90℃条件下，加热灭酶30秒；在4000r/min条件下，离心10min后，获得上清液，即为白果多糖溶液；

(2)醇沉、除蛋白纯化得银杏白果粗多糖：

将步骤(1)中所得多糖溶液50℃旋转蒸发浓缩至原体积的1/5，然后加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀，静置过夜，离心得沉淀；将沉淀加水复溶后，在多糖溶液中，以体积比1:4加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝5:1v/v)，混合物剧烈振摇30min，离心(4000r/min，10min)，除去水层和试剂层交界处的变性蛋白，重复操作几次，直至不出现白色胶状物；再在多糖溶液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀，离心得沉淀；将沉淀分别用无水乙醇、丙酮和乙醚相继洗涤，再冷冻干燥得粗多糖；

(3)溶解粗多糖添加季铵盐再次沉淀分离纯化：

取一定量的粗多糖溶于蒸馏水中，加入等体积的3％十六烷基三甲基溴化铵，35℃下保温静置4h，产生沉淀，4℃，4000r/min离心20min，收集沉淀；将沉淀用10％NaCl溶液溶解后，加入3倍的无水乙醇，产生白色沉淀，离心，收集沉淀，并用去离子水溶解；

(4)脱盐：

将步骤(3)的溶液装入分子量2-14kDa透析袋内进行脱盐；每隔3-4h更换一次去离子水，透析10-12h即可。

(5)冷冻干燥得银杏白果精多糖：

将脱盐溶液冷冻干燥即制得银杏白果多糖精制品。

提取产物分析：

1、多糖提取率的计算

多糖提取率(％)＝(c×V×D)÷m×100％

式中c代表由标准曲线计算所得银杏白果多糖的质量浓度，V为待测溶液体积，D为稀释倍数，m为准确称取银杏白果粉的质量。

2、采用本发明方法提取得到的银杏白果多糖精产品为乳白色粉状物，白果多糖的提取率和纯度分别达到4.1％和75％。

3、采用本发明方法提取得到的银杏白果多糖，在浓度为30mg/mL条件下，其还原能力、DPPH自由基清除能力、·OH自由基清除能力以及α-葡萄糖苷酶抑制活性，分别为0.673，86.03％，73.73％，80.12％。且在一定范围内，随着其浓度的增加，其抗氧化活性以及降血糖活性皆逐渐增强。

3、不同提取方法的多糖生物活性分析：

热水提取、超声提取、酶法提取和超声波协同酶法提取多糖所得率及其生物活性分别见图1～5。

从图1中的多重比较结果可知，在相同浓度(30mg/mL)下，四种提取方式提取的银杏白果多糖的提取率差异显著(P<0.05)。其中超声协同酶技术提取的银杏白果多糖的提取率为4.1％，是热水提取的4.7倍，而超声提取的银杏白果多糖的提取率为2.04％，酶法提取的银杏白果多糖的提取率为3.78％。说明单一的生物酶或超声辅助作用可在一定范围的提高银杏白果多糖的提取率，但效果并不理想，而超声协同酶技术将超声和生物酶有效地结合起来，可大大提高银杏白果多糖的提取率，可能是超声波的空化、机械粉碎、热学等作用，再加上生物酶破坏细胞壁，从而提高速度，缩短时间，极大地提高多糖的提取效率。

从图2中的多重比较结果可知，在相同浓度(30mg/mL)下，四种提取方式提取的银杏白果多糖都具有一定的DPPH自由基清除能力，但热水提取、超声提取、酶法提取和超声协同酶法提取的四种银杏白果多糖的DPPH自由基清除能力差异显著(P<0.05)。热水提取、超声提取、酶法提取和超声协同酶技术提取的银杏白果多糖对DPPH自由基清除率依次为12.12％、14.85％、62.12％、86.03％。可知超声协同酶技术提取的银杏白果多糖对DPPH自由基清除能力远远大于热水提取的银杏白果多糖。

从图3中的多重比较结果可知，在相同浓度(30mg/mL)下，热水提取、超声提取、酶法提取和超声协同酶技术提取的四种银杏白果多糖对Fe³⁺还原能力差异显著(P<0.05)。超声协同酶技术提取的银杏白果多糖对Fe³⁺还原能力远远大于热水提取的银杏白果多糖。

从图4中的多重比较结果可知，在相同浓度(30mg/mL)下，热水提取、超声提取、酶法提取和超声协同酶技术提取的四种银杏白果多糖对·OH自由基清除能力差异显著(P<0.05)。四种银杏白果多糖对·OH自由基清除能力大小顺序为：超声协同酶技术提取>酶法提取>热水提取>超声提取。

目前市面上某些药物利用抑制α-葡萄糖苷酶(AGC)以减慢单糖和多糖转化成人体可吸收的单糖，进而将血糖平缓地控制在一定的范围内来达到降血糖的目的。从图5中的多重比较结果可知，在相同浓度(30mg/mL)下，热水提取、超声提取、酶法提取和超声协同酶技术提取的四种银杏白果多糖对AGC抑制率差异显著(P<0.05)。超声协同酶技术提取的银杏白果多糖对AGC抑制率达80.12％，是超声提取的22.38倍。结果表明，超声协同酶技术提取的银杏白果多糖对AGC的抑制率较好，是一种潜在的降血糖可应用物质。

综合图1-5的研究结果可知，与热水、超声、酶法等三种方法提取的银杏白果多糖比较，超声协同酶技术提取的银杏白果多糖在提取率、还原能力、DPPH自由基清除能力、·OH自由基清除能力以及α-葡萄糖苷酶抑制活性等方面显著提高(P<0.05)。本发明所得的银杏白果多糖提取率为4.1％，在银杏白果多糖浓度为30mg/mL条件下，其还原能力、DPPH自由基清除能力、·OH自由基清除能力以及α-葡萄糖苷酶抑制活性，分别为0.673，86.03％，73.73％，80.12％。且在一定范围内，随着其浓度的增加，其抗氧化活性以及降血糖活性皆逐渐增强。这表明本发明的一种采用超声协同酶技术提取银杏白果多糖的方法是提取白果多糖的有效方法。

4、不同提取方式的银杏白果多糖的结构的对比

4.1全波长光谱扫描

对四种银杏白果多糖的水溶液在190-700nm处进行全波长扫描，结果如图6，四种银杏白果多糖在210nm附近都有多糖的特征吸收峰，四者均在260-280nm范围内无明显吸收峰，证明四种银杏白果多糖多糖中均不含有蛋白质和核酸。

4.2红外光谱扫描

四种银杏白果多糖在40000-400cm^-1的红外光谱检测，四种银杏白果多糖样品在3400cm^-1附近出现宽的吸收峰，这是糖类的O-H伸缩振动的强吸收，表明四种银杏白果多糖皆存在分子间氢键。四种银杏白果多糖样品在2950-2830cm^-1处有较弱双吸收峰，可能样品中含有氨基糖。

热水、超声和酶法提取的银杏白果多糖在2800cm^-1附近出现较弱的吸收峰，表明该样品中存在多糖-CH₂的-CH伸缩振动，但吸收峰较弱，超声协同酶技术提取的银杏白果多糖在2800cm^-1附近出现尖而强的吸收峰，表明其-CH伸缩振动较强。超声协同酶技术提取的多糖在1740cm^-1附近有一较弱的吸收峰，这是C＝O的伸缩振动峰。

四种银杏白果多糖样品在1680-1600cm^-1附近都有吸收峰，热水、超声和酶法提取的银杏白果多糖的吸收峰的强度高于超声协同酶技术提取的银杏白果多糖，表明超声协同酶技术提取的银杏白果多糖中C＝O所引起的非对称伸缩振动峰较弱。

四种银杏白果多糖样品在1400-1200cm^-1之间存在C-H的变角振动区。四种银杏白果多糖样品在1200-1000cm^-1之间存在由C-O-H和吡喃环的C-O-C两种C-O形成的伸缩振动区，表明该样品为吡喃糖。超声协同酶技术提取的多糖在870cm^-1附近具有吸收峰，证明该多糖为β-葡萄吡喃糖。

4.3电镜观察

将四种银杏白果多糖放大2000倍和4500倍的照片如图7～10所示。从图7中可以看出，热水提取的银杏白果多糖中出现大量的小球状结构，结构紧密。

从图8中可以看出，超声提取的银杏白果多糖呈不规则的几何外形，表面凹凸不平，带有孔洞的褶皱结构。这说明银杏白果多糖分子见相互存在排斥力，分子间吸引力较为弱小。

从图9、10中可以看出，酶法和超声协同酶技术提取的银杏白果多糖呈海绵状，表面形貌光滑，分子聚集程度明显减少，说明酶法和超声协同酶技术使银杏白果多糖的结构发生了变化，使得分子间作用力减小，分子交联程度减弱，进而导致银杏白果多糖聚集体的形态发生变化，使银杏白果多糖的生物活性更好的发挥出来。

4.4分子量测定

从图11中可以看出，热水提取的银杏白果多糖出峰时间是14.68-18.05min，且峰形为单一对称峰，多角度激光信号显示该多糖存在分子量较大的聚合物，经软件计算，可得Mw(重均分子量)为4.20×10⁵，Mn(数均分子量)为3.65×10⁵，分子量分布系数(Mw/Mn)为1.15，(小于1.5)，分子量分布较窄，相对纯度为63.85％。

从图12中可以看出，超声提取的银杏白果多糖出峰时间是18.05-21.55mim，经软件计算，可得Mw为1.34×10⁴，Mn为1.25×10⁴，分子量分布(Mw/Mn)为1.08(小于1.5)，分子量分布较窄，相对纯度为63.39％。

从图13中可以看出，酶法提取的银杏白果多糖出峰时间是15.95-19.65mim，经软件计算，可得Mw为1.72×10⁴，Mn为1.20×10⁴，分子量分布(Mw/Mn)为1.44(小于1.5)，分子量分布较窄，相对纯度为97.83％。

从图14中可以看出，超声协同酶技术提取的银杏白果多糖出峰时间是16.05-21.55mim，经软件计算，可得Mw为2.02×10⁴，Mn为1.37×10⁴，分子量分布(Mw/Mn)为1.48(小于1.5)，分子量分布较窄，相对纯度为96.18％。

4.5单糖组成测定

Man、Rha、Glc、Gal、Xyl、Ara6种标准品进行PMP衍生化，产物进行高效液相色谱分析，分离结果见图15。可以看出6种标准单糖在20min内可以得到良好的分离，且峰形对称。

表1单糖标准品的分离检测

以单糖浓度对峰面积作图，绘制标准曲线，各单糖的线性回归方程见表1。结果表明，各单糖的标准曲线线性良好，R²≥0.99，线性范围为100mg/L到1000mg/L。

经计算，甘露糖和鼠李糖间的校正因子为f_M/R＝3.04，鼠李糖和葡萄糖间的校正因子为f_R/G＝1.25，甘露糖和葡萄糖间的校正因子为f_M/G＝3.80。

图16是热水提取的银杏白果多糖经PMP衍生后的高效液相色谱分离图。由图可见，热水提取的银杏白果多糖是由甘露糖组成的单一的均单糖。

图17是超声提取的银杏白果多糖经PMP衍生后的高效液相色谱分离图。由图可见，超声提取的银杏白果多糖是由甘露糖和鼠李糖组成，根据分析和计算方法，可求得该多糖中甘露糖和鼠李糖的摩尔比为16.87:1.00。

图18是酶法提取的银杏白果多糖经PMP衍生后的高效液相色谱分离图。由图可见，酶法提取的银杏白果多糖是由甘露糖和葡萄糖组成，根据分析和计算方法，可求得该多糖中甘露糖和葡萄糖的摩尔比为6.41:1.00。

图19是超声协同酶技术提取的银杏白果多糖经PMP衍生后的高效液相色谱分离图。由图可见，超声协同酶技术提取的银杏白果多糖是由甘露糖、鼠李糖和葡萄糖组成，根据分析和计算方法，可求出该多糖中甘露糖、鼠李糖和葡萄糖的摩尔比为8.25:1.00:1.53。

本实施例的实验条件的确定：

1.确定酶的添加顺序

为确定酶的添加顺序，将复合酶(纤维素酶和果胶酶)和中性蛋白酶进行前后添加，控制反应体系质量浓度为5.0％，提取时间为2h，体系pH为6.0，提取温度为60℃，其余步骤同实施例1，根据银杏白果多糖的提取率，来研究酶的添加顺序对银杏白果多糖提取率的影响，具体试验结果见表2。

表2酶的添加顺序对银杏白果多糖提取率的影响

由表2可以看出，先添加复合酶再添加中性蛋白酶所得的多糖提取率为3.21％左右，高于先添加中性蛋白酶后加复合酶，因此，酶的添加顺序选择为先添加复合酶再加中性蛋白酶。

2.确定复合酶的复合配比

选取果胶酶用量(A)、纤维素酶用量(B)、中性蛋白酶用量(C)三因素，采用L₉(3³)正交表设计正交试验，以银杏白果多糖提取率为指标，确定复合酶的最佳配比。

表3复合酶配比正交试验设计结果

从正交试验结果(表3)得出，三因素影响多糖提取率的大小分别为A>C>B，即果胶酶＞中性蛋白酶＞纤维素酶，最佳配比组合为：A₂B₁C₃，即适宜的酶的比例为果胶酶46U/g，纤维素酶45U/g，中性蛋白酶280U/g。经三次重复试验得出银杏白果多糖提取率为3.5％。

3.响应面优化复合酶法提取银杏白果多糖

利用响应面法优化复合酶法提取银杏白果多糖，具体试验结果见表4、5。

表4复合酶法提取银杏白果多糖工艺优化中心组合试验设计及结果

表5复合酶法提取银杏白果多糖工艺优化的回归分析结果

注：*.P<0.05，差异显著；**.P<0.01，差异高度显著；***.P<0.001，差异极度显著。

结果分析：

由表4、5分析可知：该模型的F＝45.87，P<0.0001，表明实验所采用的二次模型是极显著的，在统计学上是有意义的。失拟项用来表示所用模型与实验拟合的程度，即二者差异的程度。本试验P＝0.0992>0.05，对模型是有利的，无失拟因素存在，因此可用该回归方程代替试验真实点对试验结果进行分析。

因素A提取温度的P＝0.0008<0.001，说明因素A提取温度对提取率％的影响是极显著的；因素B时间的P＝0.0319<0.05，因素CpH的P＝0.0268<0.05，因素D液料比的P＝0.0378<0.05，说明因素B、C、D对提取率％的影响是显著的。而A的2次方，B的2次方，C的2次方，D的2次方的P值均小于0.01，说明A²、B²、C²、D²对提取率均有高度显著影响。

交互项AB、CD的P值分别为：0.0010，0.0005均小于0.001，所以交互项AB、CD对提取率有极度显著性影响。交互项BC的P＝0.0048，小于0.01，所以交互项BC对提取率有高度显著性影响。交互项AC的P＝0.0103，小于0.05，所以交互项AC对提取率有显著性影响。而交互项AD、BD的P值分别为0.4491，0.3285，均大于0.05，所以交互项AD、BD对提取率没有影响。

利用响应面设计优化了超声协同酶技术提取银杏白果多糖提取率的最佳工艺条件，建立了银杏白果多糖提取的数学模型，较适宜工艺条件为提取温度为55℃、提取时间为2h、体系质量浓度为6.7％、体系pH5.5，经验证银杏白果多糖提取率平均值为3.78％，与模型预测值基本一致，模型的可靠性得以验证。

4.蛋白酶水解温度的确定

蛋白酶酶解过程中，酶解温度为45℃时，银杏白果多糖提取率为1.22％，蛋白去除率为54％，随着酶解温度的升高，银杏白果多糖提取率逐渐增大，蛋白去除率也逐渐增大。当酶解温度为55℃时，银杏白果多糖提取率达到最大(3.13％)，而蛋白去除率也接近最高，表明适当地提高温度可以提高酶的活性，促进多糖中的蛋白分解，进而提高蛋白去除率；但当酶解温度再升高时，银杏白果多糖提取率和蛋白去除率皆逐渐下降，这可能是由于超过一定温度时，酶解温度的升高会导致酶活性的降低或酶部分失活，多糖损失量变大，因此选择酶解温度55℃。

5.蛋白酶水解时间的确定

在一定的酶解时间内，银杏白果多糖提取率和蛋白去除率逐渐升高，可能As.1398中性蛋白酶在这段时间内充分作用使多糖中的蛋白分解或将蛋白中包裹的多糖释放出来，从而使银杏白果多糖充分浸出，当酶解时间超过2.0h时，银杏白果多糖提取率呈现平缓趋势不再升高，而蛋白去除率缓缓下降，因此选择酶解时间为2.0h。

6.确定超声协同酶技术提取多糖的最佳条件

控制体系质量浓度为6.7％，体系pH为5.5，提取温度为55℃，酶的比例为果胶酶46U/g，纤维素酶45U/g，中性蛋白酶280U/g的条件下，研究超声协同酶技术对银杏白果多糖的提取率影响的最佳条件，具体试验结果见表6、7。

表6超声协同酶技术正交试验设计方案及结果

表7正交试验数据方差分析表

注：*.P<0.05，差异显著。

通过极差分析可以看出，三个因素对银杏白果多糖提取率的影响效果从大到小顺序依次为功率>超声次数>提取次数。最佳提取工艺为A₂B₂C₂，即超声功率为350W，时间为30min，超声次数为2次，此时银杏白果多糖提取率为4.02％。

从方差分析表6可以看出，F_A>F_C>F_B，而F_A>F_0.05(2,2)说明超声功率对白果多糖提取率影响显著；而F_C、F_B<F_0.05(2,2)说明超声时间和提取次数对多糖提取率影响不显著，从高效省时可考虑选用超声时间为30min，提取次数为2次，故选用超声功率为350W，时间为30min，超声次数为2次，作为银杏白果多糖提取率的最佳工艺。经三次重复试验得出银杏白果多糖提取率为4.1％。

实施例4

在实施例2的基础上进一步具体实验条件。

一种超声协同酶技术提取银杏白果多糖的方法，其特征包含以下步骤：

(1)超声协同酶技术提取银杏白果多糖：

a：在室温条件下，将白果剥壳、去红皮，用高速粉碎机将其粉碎并真空干燥、脱脂，即得脱脂白果粉备用。

b：称取一定量的脱脂白果粉，用蒸馏水配置成质量浓度为6.0％的体系，然后使用HCl调节pH至6.0，调节酶解温度为60℃，添加复合酶，即果胶酶添加量为40U/g(每克白果粉添加果胶酶40U)和纤维素酶添加量为40U/g(每克白果粉添加纤维素酶40U)后，同时对其反应液进行超声处理，超声功率为300W，每次超声时间为20min，超声两次；在超声结束后，在温度为90℃条件下，加热灭酶30秒。

c：利用NaOH调节步骤b中灭酶后反应液的pH至7.0，调节酶解温度为60℃，添加蛋白酶，其添加量为200U/g(每克白果粉添加蛋白酶200U)，水解反应时间为1h，酶解反应后，在温度为90℃条件下，加热灭酶30秒；在4000r/min条件下，离心10min后，获得上清液，即为白果多糖溶液。

(2)醇沉、除蛋白纯化得银杏白果粗多糖：

将(1)中所得多糖溶液50℃旋转蒸发浓缩至原体积的1/5，然后加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀，静置过夜，离心得沉淀；将沉淀加水复溶后，在多糖溶液中，以体积比1:4加入Sevag试剂(氯仿：正丁醇＝5:1v/v)，混合物剧烈振摇30min，离心(4000r/min，10min)，除去水层和试剂层交界处的变性蛋白，重复操作几次，直至不出现白色胶状物；再在多糖溶液中加入3倍体积的无水乙醇进行沉淀，离心得沉淀；将沉淀分别用无水乙醇、丙酮和乙醚相继洗涤，再冷冻干燥得粗多糖。

(3)溶解粗多糖添加季铵盐再次沉淀分离纯化：

取一定量的粗多糖溶于蒸馏水中，加入等体积的3％十六烷基三甲基溴化铵，35℃下保温静置4h，产生沉淀，4℃，4000r/min离心20min，收集沉淀；将沉淀用10％NaCl溶液溶解后，加入3倍的无水乙醇，产生白色沉淀，离心收集沉淀，并用去离子水溶解的复溶溶液；

(4)脱盐：

将步骤(3)的复溶溶液装入分子量2-14kDa透析袋内进行脱盐；每隔3-4h更换一次去离子水，透析10-12h即可。

(5)冷冻干燥得银杏白果精多糖：

将脱盐溶液冷冻干燥即制得银杏白果多糖精制品。

结果验证：

1、多糖提取率的计算如实施例1所述。

2、采用本发明方法提取得到的白果多糖精产品为乳白色粉状物，白果多糖的提取率和纯度分别达到3.5％和65％。

Claims (10)

1.一种提取银杏白果多糖的方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)超声协同酶处理提取银杏白果多糖：脱脂银杏白果粉加水后制备成反应液，所述反应液中添加复合酶进行水解，复合酶水解的同时对反应液进行超声处理，所述复合酶为果胶酶和纤维素酶，超声处理后灭活复合酶，调节体系pH值，加入蛋白酶进行水解，水解后灭活蛋白酶，离心处理，得上清液为银杏白果多糖溶液；

(2)醇沉、除蛋白纯化得银杏白果粗多糖：步骤(1)所得的银杏白果多糖溶液添加乙醇进行沉淀，复溶沉淀加入Sevag试剂除蛋白，再次加入乙醇后沉淀、洗涤干燥沉淀得银杏白果粗多糖；

(3)溶解步骤(2)所得的银杏白果粗多糖添加季铵盐再次沉淀进行分离纯化；

(4)脱盐处理；

(5)冷冻干燥得银杏白果精多糖。

2.根据权利要求1所述的提取银杏白果多糖的方法，其特征在于：步骤(1)中所述反应液中脱脂银杏白果粉的质量浓度为4.0％-10％，果胶酶添加量为35-55U/g_{脱脂银杏白果粉}，纤维素酶添加量为30-60U/g_{脱脂银杏白果粉}，添加复合酶前调解反应液pH值为5.0-6.0，复合酶水解温度为45-65℃，超声功率为250-450W，每次复合酶水解并结合超声提取的时间为10-50min，超声两次。

3.根据权利要求1所述的提取银杏白果多糖的方法，其特征在于：步骤(1)中灭活复合酶后加入蛋白酶前调解反应液pH值至7.0，蛋白酶的种类为中性蛋白酶，蛋白酶添加量为150-350U/g_{脱脂银杏白果粉，}调节中性蛋白酶的水解温度为50-60℃，蛋白酶水解反应时间为1-3h。

4.根据权利要求1所述的提取银杏白果多糖的方法，其特征在于：步骤(3)的具体操作为：取银杏白果粗多糖溶于蒸馏水中，加入等体积的3％十六烷基三甲基溴化铵，34～36℃下保温静置3～6h，产生沉淀，4℃离心收集沉淀，将沉淀用9.5％～10.5％NaCl溶液溶解后，加入无水乙醇，产生白色沉淀，离心，收集沉淀，并用去离子水溶解得复溶溶液。

5.根据权利要求4的提取银杏白果多糖的方法，其特征在于：步骤(4)的具体操作为：将步骤(3)所得的复溶溶液装入分子量2-14kDa透析袋内进行脱盐。

6.一种使用权利要求1～5中任意一项所述的方法得到的银杏白果精多糖。

7.根据权利要求6所述的银杏白果精多糖，其特征在于：所述银杏白果精多糖纯度为65-80％。

8.根据权利要求6所述的银杏白果精多糖，其特征在于：所述银杏白果精多糖重均分子量为2.020×10⁴g/mol。

9.根据权利要求6所述的银杏白果精多糖，其特征在于：所述银杏白果精多糖的单糖组成为甘露糖、鼠李糖和葡萄糖，其物质的量的比为8.25:1.00:1.53。

10.权利要求6所述的银杏白果精多糖应用于降血糖、抗氧化的保健品及药物的制备。