CN103059162B - 一种高效提取香菇多糖的新方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高效提取香菇多糖的新方法。其中以香菇子实体或香菇柄为原料，采用亚临界水提取技术，经过超滤浓缩、乙醇沉淀和脱色干燥的工艺后，得到香菇粗多糖，接着经过阴离子交换树脂除去蛋白质，精制后的香菇多糖纯度可达90％以上。本发明的方法大大缩短了提取周期，最大程度地保留了有效成分的活性，能显著提高提取效率，并且与其他提取方法相比具有无毒无害、节能环保的优势，应用前景广阔。
Description
技术领域
本发明涉及植物有效成分提取的领域，具体地涉及一种香菇多糖的提取和纯化方法。
技术背景
香菇[Lentinus edodes(Berk.)Sing]又名香覃、厚菇，为担子菌纲伞形科真菌，素有“山珍之王”之称，集食用、药用于一身，是高蛋白、低脂肪的营养保健食品。早在《本草纲目》中就有记载，香菇“性平、味甘，能益气不饥，治风破血，化痰理气，益味助食，理小便不禁”。
香菇多糖(lentinan，简称LNT)是香菇中提取的一种重要的有效药用组分，是一种以D-(1→3)葡萄糖残基为主链、(1→6)葡萄糖残基为侧链的葡聚糖。自从1969年Chihara等首次用热水从香菇子实体中提取纯化出香菇多糖并确认其具有明显的抗肿瘤作用(Chihara et al，inhibition of mousesarcoma 180by polysaccharides from lentinus edodes(Berk.)Sing，Nature，1969，222：687-688)以来，大量研究工作表明香菇多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、调节免疫、抗炎症等功能，并能减轻放疗和化疗的毒副作用，提高患者的生活质量和延长存活时间。由于香菇多糖的医学功效广泛且几乎没有任何副作用，因而被认为是继手术、放疗、化疗之后的第4种生物免疫疗法。
现有的香菇多糖提取工艺主要包括：传统热水浸提法、稀酸(碱)浸提法、酶解提取、超声波辅助浸提法、酶法等(例如参见李珺等，香菇多糖的分离纯化方法研究进展，《北方园艺》，2008(12)：84-85；刘树兴等，香菇多糖提取工艺的研究，《西北轻工业学院学报》，2002，20(2)：23-25；CN 101851356A；CN1153179A，等)。然而，这些方法都存在着周期长、提取率不高、有效成分损耗较大等缺点。
为了克服现有技术的上述缺点和不足，本发明的发明人研究出了一种新型的香菇多糖提取工艺，其中采用亚临界流体提(Sub-criticalfluid extraction，SFE)技术。亚临界水又称超加热水、高压热水或热液态水，是指在一定的压力下将水加热到100℃以上临界温度374℃以下的高温仍然保持液体状态的水体。常温常压下水的极性较强，而在亚临界状态下微观结构的氢键、离子水合、离子缔合、簇状结构等理化性质发生了变化，使水的极性大大降低，这样就可以通过控制亚临界水的温度和压力，使水的极性在较大范围内变化，从而将溶质按照极性由高到低提取出来，实现天然产物中有效成分从水溶性成分到脂溶性成分的连续提取，同时可实现选择性提取(例如参见郭娟等，亚临界水萃取技术在天然产物提取中的研究进展，《现代化工》，2007(12)：19-24，等)。这种提取方法大大缩短了提取周期，最大程度地保留了有效成分的活性，并能显著提高提取效率。此外，由于亚临界水提取是以价廉、无污染的水作为提取剂，因此与其他提取方法相比具有无毒无害、节能环保的优势，应用前景广阔。
发明内容
本发明的目的是提供一种工艺简单、成本低、绿色环保的香菇多糖提取和纯化方法。
本发明的香菇多糖提取和纯化方法是以香菇为原料，采用处于亚临界状态的流体作为提取剂，提取出香菇粗多糖组分，再对所得粗多糖组分进行纯化，制备得到精制香菇多糖。
根据本发明的一个实施方案，所述原料可以是香菇的子实体或柄。
根据本发明的一个实施方案，所述处于亚临界状态的流体可以是亚临界水或亚临界稀碱溶液，所述稀碱溶液例如0.1～0.6mol/L的氢氧化钠溶液或氢氧化钾溶液。
根据本发明的一个实施方案，所述香菇粗多糖组分的提取工艺如下：
1)原材料预处理：取干燥后的香菇子实体或香菇柄，清洗除去其中的可见杂物后，用粉碎机粉碎，过40目筛备用；
2)亚临界水提：将步骤1)的香菇干粉置于提取罐中，加入20～30倍重量的水或稀碱溶液，在140～180℃的亚临界水温下浸提4～8分钟，重复浸提2～4次；
3)超滤浓缩：将步骤2)的浸提液用滤布过滤，并使用截留分子量为50,000Da的超滤膜对浸提液进行浓缩，至滤液重量为香菇粉重量的1.5～2.5倍为止；
4)乙醇沉淀：在步骤3)的滤液中加入5倍重量的预先冷却至4～8℃的乙醇(纯度为80％以上)，搅拌均匀，在4～8℃下静置24小时，接着4000r/min离心收集沉淀，从上清液中回收乙醇以循环使用；
5)脱色干燥：将步骤4)中收集到的沉淀物溶解于水中，加入1～3％的活性炭，持续搅拌4小时，接着4000r/min离心收集上清液，进行乙醇沉淀步骤，所得沉淀用乙醇清洗2次并使其冷冻干燥，得到香菇粗多糖组分；
根据本发明的一个实施方案，所述纯化主要是去除蛋白组分的过程，其包括：
6)树脂柱脱蛋白：将依照上述提取方法得到的香菇粗多糖溶解于pH8.5～9.5的缓冲液中，配制成5～8％(重量/体积)的粗多糖溶液，使其通过阴离子交换树脂柱，其中杂蛋白被吸附到树脂柱上，多糖溶液作为穿过峰流出；
7)乙醇沉淀：在步骤6)的流出液中加入5倍重量的预先冷却至4～8℃的乙醇(纯度为80％以上)，搅拌均匀，在4～8℃下静置24小时，接着4000r/min离心收集沉淀，从上清中回收乙醇以循环使用；
8)干燥：将步骤7)中所得沉淀用丙酮清洗2次并使其冷冻干燥，得到精制的香菇多糖。
根据本发明的一个实施方案，所述提取罐可以是搪瓷提取罐、不锈钢提取罐、搪玻璃反应罐。
根据本发明一个优选的实施方案，所述步骤2)中亚临界水提的最佳条件是温度为160℃，时间为5分钟，次数为2次。
根据本发明的一个实施方案，所述乙醇沉淀步骤优选使用食用乙醇、无水乙醇、95％乙醇。
根据本发明的一个实施方案，所述阴离子交换树脂柱的型号包括LX-67、717、D113、D201、D301、721、732、D301、HS0-402、201*7等。
根据本发明的一个实施方案，步骤6)中使用的缓冲液是Tris-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸-氯化钙、硼酸-碳酸钙缓冲液中的一种。
优选依据本发明的方法制备所得的制品中，香菇多糖的含量能够达到90％以上。
本发明采用亚临界水提取技术，并且经过发明人的多次尝试、大量实验，对温度、压力、时间、所采用试剂等工艺条件不断进行优化，使得本发明的方法具有以下优点和积极的效果：
(1)相对于传统方法，缩短了提取周期，使提取效率大幅提高，并且最大程度地保留了有效成分的活性。亚临界水提取法几乎没有能耗，而且亚临界水会使蛋白质、淀粉等变性，给后续的分离、纯化带来方便；
(2)提取过程节能环保，所得香菇多糖制品无毒、无害、无污染；
(3)采用阴离子交换树脂柱去除蛋白，与化学法、有机溶剂法相比，具有操作简单、无污染、成本低等优势，而且非常适于大规模生产；
(4)可同时产生香菇粗多糖和精制香菇多糖两种产品，适应市场的不同需要。香菇粗多糖除了含有香菇多糖外，还有氨基酸、蛋白质、微量元素等对人体有益的营养物质，可以作为食品中的营养补充剂和强化剂以及护肤品中的功能活性成分；精制香菇多糖纯度可达90％以上，可以制成保健产品和药品。
附图说明
图1是亚临界水提法提取香菇多糖的工艺流程示意图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明做进一步的详细说明。应当理解的是，具体实施例仅是对为了本发明作出更清楚的说明，而不是对本发明的限制。
实施例1
取干燥后的香菇子实体，清洗除去其中的可见杂物后，用粉碎机粉碎，过40目筛。取10份重量的香菇粉置于不锈钢提取罐中，加入300份重量的水，迅速加热升温至160℃，并在该温度下维持5分钟后从提取罐下端释放出提取液，再加入300份重量的水，重复上述提取步骤一次。将两次提取出的提取液合并，冷却后用滤布过滤，再使用截留分子量为50,000的超滤膜对滤液进行浓缩，至滤液重量为香菇粉重量的2.0倍为止。在滤液中加入预先冷却至4℃的95％乙醇，搅拌均匀，在4～8℃下静置24小时，接着4000r/min离心收集沉淀，从上清中回收乙醇以循环使用。将沉淀物溶于水中，加入2％的活性炭，持续搅拌4个小时，接着4000r/min离心收集上清液，进行乙醇沉淀步骤，所得沉淀用乙醇清洗2次并使其冷冻干燥，得到香菇粗多糖组分。
将上述的香菇粗多糖溶解于0.1mol/L pH9.5的Tris-盐酸缓冲液中，配成5％(重量/体积)的粗多糖溶液，以10mL/min的流速通过721阴离子交换树脂柱，其中杂蛋白被吸附到树脂柱上，多糖溶液作为穿过峰流出。在流出液中加入预先冷却至4℃的95％乙醇，搅拌均匀，在4～8℃下静置24小时，接着4000r/min离心收集沉淀，从上清中回收乙醇以循环使用。所得沉淀用丙酮清洗2次并使其冷冻干燥，得到精制的香菇多糖。
实施例2
取干燥后的香菇柄，清洗除去其中的可见杂物后，用粉碎机粉碎，过40目筛。取10份重量的香菇粉置于不锈钢提取罐中，加入200份重量的水，迅速加热升温至160℃，并在该温度下维持6分钟后从提取罐下端释放出提取液，再加入200份重量的水，重复上述提取步骤一次。将两次提取出的提取液合并，冷却后用滤布过滤，再使用截留分子量为50,000的超滤膜对滤液进行浓缩，至滤液重量为香菇粉重量的1.5倍为止。在滤液中加入预先冷却至4℃的95％乙醇，搅拌均匀，在4～8℃下静置24小时，接着4000r/min离心收集沉淀，从上清中回收乙醇以循环使用。将沉淀物溶于水中，加入2％的活性炭，持续搅拌4个小时，接着4000r/min离心收集上清液，进行乙醇沉淀步骤，所得沉淀用乙醇清洗2次并使其冷冻干燥，得到香菇粗多糖组分。
将香菇粗多糖溶解于0.1mol/L pH9.0的硼酸-氯化钙冲液中，配成5％(重量/体积)的粗多糖溶液，以10mL/min的流速通过D113阴离子交换树脂柱，其中杂蛋白被吸附到树脂柱上，多糖溶液作为穿过峰流出。在流出液中加入预先冷却至4℃的95％乙醇，搅拌均匀，在4～8℃下静置24小时，接着4000r/min离心收集沉淀，从上清中回收乙醇以循环使用。所得沉淀用丙酮清洗2次并使其冷冻干燥，得到精制的香菇多糖。
实施例3
取干燥后的香菇子实体，清洗除去其中的可见杂物后，用粉碎机粉碎，过40目筛。取10份重量的香菇粉置于不锈钢提取罐中，加入350份重量的水，迅速加热升温至160℃，并在该温度下维持6分钟后从提取罐下端释放出提取液，再加入350份重量的水，重复上述提取步骤一次。将两次提取出的提取液合并，冷却后用滤布过滤，再使用截留分子量为50,000的超滤膜对滤液进行浓缩，至滤液重量为香菇粉重量的1.5倍为止。在滤液中加入预先冷却至4℃的80％食用乙醇，搅拌均匀，在4～8℃下静置24小时，接着4000r/min离心收集沉淀，从上清中回收乙醇以循环使用。将沉淀物溶于水中，加入2％的活性炭，持续搅拌4个小时，接着4000r/min离心收集上清液，进行乙醇沉淀步骤，所得沉淀用乙醇清洗2次并使其冷冻干燥，得到香菇粗多糖组分。
将香菇粗多糖溶解于0.1mol/L pH9.0的硼酸-氯化钙冲液中，配成5％(重量/体积)的粗多糖溶液，以10mL/min的流速通过LX-67阴离子交换树脂柱，其中杂蛋白被吸附到树脂柱上，多糖溶液作为穿过峰流出。在洗出液中加入预先冷却至4℃的80％食用乙醇，搅拌均匀，在4～8℃下静置24小时，接着4000r/min离心收集沉淀，从上清中回收乙醇以循环使用。所得沉淀用丙酮清洗2次并使其冷冻干燥，得到精制的香菇多糖。
对由实施例1-3制得的香菇粗多糖和精制香菇多糖进行称重，并利用苯酚-硫酸法测定香菇多糖的含量，由此计算香菇多糖的得率和含量。结果显示于下面表1中。其中：
香菇粗多糖1＝实施例1的香菇粗多糖
精制香菇多糖1＝实施例1的精制香菇多糖
香菇粗多糖2＝实施例2的香菇粗多糖
精制香菇多糖2＝实施例2的精制香菇多糖
香菇粗多糖3＝实施例3的香菇粗多糖
精制香菇多糖3＝实施例3的精制香菇多糖
表1：实施例制备产品的技术指标
由表1可以看出，本发明的香菇多糖亚临界水提取技术以及纯化工艺能够获得较高的多糖含量，适于大规模商业化应用。
Claims (1)
1.一种高效提取香菇多糖的方法，其包括以香菇为原料，采用处于亚临界状态的流体作为提取剂，经过超滤浓缩、乙醇沉淀和脱色干燥提取出香菇粗多糖组分，再利用阴离子交换树脂对所得粗多糖组分进行纯化，制备得到精制香菇多糖；
其中所述原料是香菇的子实体或柄；
其中所述处于亚临界状态的流体可以是亚临界水或亚临界稀碱溶液；
其中香菇粗多糖组分的提取工艺包括：
1)原材料预处理：取干燥后的香菇子实体或香菇柄，清洗除去其中的可见杂物后，用粉碎机粉碎，过40目筛备用；
2)亚临界水提：将步骤1)的香菇干粉置于提取罐中，加入20～30倍重量的水或稀碱溶液，在140～180℃的亚临界水温下浸提4～8分钟，重复浸提2～4次；
3)超滤浓缩：将步骤2)的浸提液用滤布过滤，并使用截留分子量为50,000Da的超滤膜对浸提液进行浓缩，至滤液重量为香菇粉重量的1.5～2.5倍为止；
4)乙醇沉淀：在步骤3)的滤液中加入5倍重量的预先冷却至4～8℃的乙醇，搅拌均匀，在4～8℃下静置24小时，接着4000r/min离心收集沉淀，从上清液中回收乙醇以循环使用；
5)脱色干燥：将步骤4)中收集到的沉淀物溶解于水中，加入1～3％的活性炭，持续搅拌4小时，接着4000r/min离心收集上清液，进行乙醇沉淀步骤，所得沉淀用乙醇清洗2次并使其冷冻干燥，得到香菇粗多糖组分；
其中所述纯化包括：
1)树脂柱脱蛋白：将香菇粗多糖溶解于pH8.5～9.5的缓冲液中，配制成5～8％(重量/体积)的粗多糖溶液，使其通过阴离子交换树脂柱，其中杂蛋白被吸附到树脂柱上，多糖溶液作为穿过峰流出；
2)乙醇沉淀：在步骤1)的流出液中加入5倍重量的预先冷却至4～8℃的乙醇，搅拌均匀，在4～8℃下静置24小时，接着4000r/min离心收集沉淀，从上清中回收乙醇以循环使用；
3)干燥：将步骤2)中所得沉淀用丙酮清洗2次并使其冷冻干燥，得到精制的香菇多糖；
所述提取罐是搪瓷提取罐；
步骤2)中亚临界水提的条件是温度为160℃，时间为5分钟，次数为2次；
所述阴离子交换树脂柱的型号包括LX-67、717、D113、D201、D301、721、732、D301、201*7；
所述缓冲液是Tris-盐酸缓冲液、磷酸缓冲液、硼酸-氯化钙、硼酸-碳酸钙缓冲液中的一种，
所述精制香菇多糖的含量能够达到90％以上。
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