CN109294984B

CN109294984B - 一种体内高效扩增nk细胞的香菇多糖胶囊及其制备方法

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Publication number: CN109294984B
Application number: CN201811249215.1A
Authority: CN
Inventors: 张仁刘; 刘少敏; 谢华; 郭传功
Original assignee: HUBEI CHUANGLI PHARMACEUTICAL CO Ltd
Current assignee: HUBEI CHUANGLI PHARMACEUTICAL CO Ltd
Priority date: 2018-10-25
Filing date: 2018-10-25
Publication date: 2022-03-11
Anticipated expiration: 2038-10-25
Also published as: CN109294984A

Abstract

本发明涉及医药技术领域，具体地说是涉及一种体内高效扩增NK细胞的香菇多糖胶囊及其制备方法，包括香菇粉45～80份、飘拂草粉50～75份、大豆粉10～15份、磷酸三钙3～5份、稳定剂1～3份、抗氧剂0.1～0.25份、防腐剂0.02～0.05份、保湿剂6～9份。该方法结合了有促进机体NK细胞体内增殖、分化，提高身体免疫力作用的飘拂草生物活性物质和增强NK细胞活性的香菇多糖，使本发明的香菇多糖胶囊具有显著的抗肿瘤功效，且该配方中添加的大豆粉能够提高机体对生物活性成分的吸收。本发明的制备方法简单，提取出的香菇多糖及飘拂草生物活性物质高，几乎不存在杂质及有害物质，应用于肿瘤治疗安全性高、疗效好。

Description

一种体内高效扩增NK细胞的香菇多糖胶囊及其制备方法

技术领域

本发明涉及医药技术领域，具体地说是涉及一种体内高效扩增NK细胞的香菇多糖胶囊及其制备方法。

背景技术

香菇多糖胶囊主要成分为香菇菌多糖。香菇菌多糖具有免疫增强作用，其机制在体内虽无直接杀伤肿瘤细胞作用，但可通过增强机体的免疫功能而发挥抗肿瘤活性。在体内能使脾脏和腹腔的NK细胞活性增强，其活性与白细胞介素类或干扰素诱导剂有协同作用。

肿瘤免疫治疗被国内外医学界公认为第四大肿瘤治疗法，其中自体免疫细胞(T细胞、NK细胞)治疗技术属国家卫生部首批允许临床应用的第三类医疗技术。近年来，自然杀伤细胞(natural killer cell，NK)免疫治疗技术在世界范围内正在成为一种可靠的抗癌疗法，适用于多种恶性肿瘤的临床治疗且副作用小，不损伤正常组织。

NK细胞是机体抵抗恶性肿瘤和病毒感染的重要免疫细胞，无需有抗体存在或者预先致敏便可直接杀伤肿瘤细胞，是肿瘤免疫治疗的重要效应细胞。NK细胞表达CD56但缺失CD3，通常用CD3-CD56+来标志和定义NK细胞。NK细胞对于不同来源的肿瘤细胞都具有很强的杀伤作用，在肿瘤的免疫细胞治疗方面有着良好的发展和应用前景。NK细胞在外周血中约占淋巴细胞的5％-10％，所占比例很少。患者体内如何获得足够数量的高杀伤性的NK细胞是NK细胞应用于临床的重要保证。

目前，体外促进NK细胞的方法有很多，有在培养体系中加入动物血清进行培养，也有研究者将K562细胞通过基因修饰后经过辐照，然后作为饲养层细胞在体外刺激NK细胞的生长。上述方法虽然能够刺激NK细胞高效扩增，但是体外促进NK细胞用于抗肿瘤涉及成分复杂的动物血清，取材过程中有可能带入支原体、病毒，对NK细胞培养造成不确定性以及不安全性，从而影响肿瘤治疗效果。

因此，开发一种既能使患者体内NK细胞高效扩增又能增强NK细胞活性的香菇多糖胶囊及其制备方法十分必要。

发明内容

本发明为了克服现有技术的上述不足，提供了一种体内高效扩增NK细胞的香菇多糖胶囊及其制备方法，结合了有促进机体NK细胞体内增殖、分化，提高身体免疫力作用的飘拂草生物活性物质和增强NK细胞活性的香菇多糖，使本发明的香菇多糖胶囊具有显著的抗肿瘤功效。且本发明的制备方法简单，提取出的香菇多糖及飘拂草生物活性物质高，几乎不存在杂质及有害物质，应用于肿瘤治疗安全性高、疗效好。

为了实现上述目的，本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一个目的在于提出一种体内高效扩增NK细胞的香菇多糖胶囊，包括香菇粉45～80份、飘拂草粉50～75份、大豆粉10～15份、磷酸三钙3～5份、稳定剂1～3份、抗氧剂0.1～0.25份、防腐剂0.02～0.05份、保湿剂6～9份。

进一步地，包括香菇粉60～70份、飘拂草粉55～60份、大豆粉12～13份、磷酸三钙4份、稳定剂2份、抗氧剂0.125份、防腐剂0.35份、保湿剂7.5份。

更进一步地，所述稳定剂选自硬酯酸镁、硬酯酸钾、亚磷酸醋、环氧大豆油、介氨基巴豆酸醋中的任一种。

更进一步地，所述抗氧剂选自D-木糖、木糖醇、EDTA、EDTA二钠盐、二叔丁基对甲苯酚、苯乙醇、苯甲醇中的至少一种。

本发明的第二个目的在于提出一种香菇多糖胶囊的制备方法，所述方法用于制备上述任一项所述的体内高效扩增NK细胞的香菇多糖胶囊，包括以下步骤：

(1)取制备好的香菇菌粉，加入占香菇菌粉重量1-2倍的水，浸泡3-4小时，再在140～180℃的亚临界水温下浸提4～8分钟，重复浸提2～4次；

(2)将步骤(1)中的浸提液浓缩至60℃下相对密度为1.15～1.25的浸膏，加入乙醇沉淀，离心得沉淀；将沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2～4倍蒸馏水溶解，过截留分子量为100万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；

(3)取制备好的飘拂草粉、占飘拂草粉质量3～4倍水、占飘拂草粉质量0.4-0.6倍乙醇混合后加入蒸馏器，然后加入提取助剂，加温至70～75℃，蒸馏提取70～90min，得到油水混合物；将油水混合物精馏，收集78～81℃的馏分备用；

(4)将制备好的大豆粉在占大豆粉重量1～1.2倍的水中浸泡3～4小时，再将混合物料一起移入酶解液中进行酶解；

(5)过滤步骤(4)中的混合物料，滤渣置于pH为9～10的碱性溶液中浸泡10～20分钟后升温至70～75℃，搅拌反应15～20分钟；混合物再一次过滤，得到的滤渣置于pH为6.0～6.5的酸性溶液中浸泡10～20分钟；混合物第三次过滤后，滤渣依次移入清水中清洗、取出、沥干、脱水、低温干燥备用；

(6)将步骤(5)中的脱水物料与磷酸三钙、稳定剂、抗氧剂、防腐剂混合均匀，过100目筛，用高速混合制粒机混合制粒得颗粒；

(7)将步骤(2)中的滤液、步骤(3)中的馏分、步骤(6)中的颗粒和保湿剂充分混合，继续搅拌制粒，所得颗粒干燥后填装入空心胶囊中即可，每粒重0.5g。

进一步地，所述步骤(3)中的提取助剂选自亮氨酸、甘油或乳酸中的任意一种，所述亮氨酸的加入量占飘拂草质量的0.2～0.4倍，所述甘油的加入量占飘拂草质量的0.2～0.3倍，所述乳酸的加入量占飘拂草质量的0.3～0.4倍。

进一步地，所述步骤(4)中酶解液为含有纤维酶的水溶液，所述纤维酶的重量百分比浓度为1.0～1.5％，pH为7.3～8.3。

更进一步地，所述步骤(4)中酶解温度为25～28℃，酶解时间为1～2小时。

与现有技术相比，本发明的有益效果在于：

(1)现有技术研究表明，香菇菌多糖在体内无直接杀伤肿瘤细胞作用，但可通过提高NK细胞活性和增强抗体依赖性巨噬细胞毒作用来增强机体的免疫功能从而发挥抗肿瘤活性，而肿瘤患者体内的NK细胞较正常人更少，且处于抑制状态；而本专利的技术方案通过试验表明飘拂草生物活性物质能够促进体内NK细胞的增殖，并且飘拂草生物活性物质对体内NK细胞的促进与药物浓度密切相关。本发明的技术方案结合了有促进机体NK细胞体内增殖、分化，提高身体免疫力作用的飘拂草生物活性物质和增强NK细胞活性的香菇多糖，使本发明的香菇多糖胶囊具有显著的抗肿瘤功效。

(2)本发明配方中的大豆粉中所含有的蛋白质、脂肪、糖类是人体必需的营养成分，具有滋补、益胃、清肺润肠等功效，同时，脂肪成分中含有丰富的卵磷脂类化合物，卵磷脂的分子结构与肠上皮细胞膜中的磷脂分子结构相似，当卵磷脂与细胞膜交换或直接嵌入式，可以增加肠上皮细胞膜的吸收性，增强得菇多糖、飘拂草生物活性物质的吸收性。磷酸三钙能够补钙的同时，可以作为颗粒的抗结剂，提高颗粒的分散均匀性。

(3)本发明提供的制备方法对香菇菌粉、飘拂草粉和大豆粉分别进行生物活性物质的提取，最大程度地提取了各原料的有效成分和其生物活性；采用亚临界水提取法提取香菇粉中的香菇多糖，最大程度地保留了有效成分的活性的同时，也使香菇中的蛋白质、淀粉等变性，给后续的分离、纯化带来方便，有效提高香菇多糖纯度。在提取大豆粉的生物活性物质时，控制酶解条件酶解破除细胞壁，滤渣依次采取碱性热水和酸性热水浸提，极大的提高生物活性物质的溶出率；本发明的制备方法工艺合理，操作简单，成分保留全面，产品安全性好，提高了对原料的利用程度。本发明的香菇粉、飘拂草粉、大豆粉对其他原料形成简单包覆形成的香菇多糖胶囊，能够提高人体对生物活性成分的吸收，能够促进体内NK细胞增殖与增强NK细胞活性，且几乎不存在杂质及有害物质，应用于肿瘤治疗安全性高、疗效好。

附图说明

图1为实施例6中受试药物对荷瘤小鼠血清中TNF-α水平的影响曲线图；

图2为实施例6中受试药物对荷瘤小鼠血清中IL-2水平的影响曲线图；

图3为实施例6中受试药物对荷瘤小鼠血清中IL-4水平的影响曲线图；

图4为实施例6中受试药物对荷瘤小鼠血清中IFN-γ水平的影响曲线图。

具体实施方式

展示一下实例来具体说明本发明的某些实施例，且不应解释为限制本发明的范围。对本发明公开的内容可以同时从材料、方法和反应条件进行改进，所有这些改进，均应落入本发明的的精神和范围之内。

实施例1：

1.香菇多糖胶囊配方

香菇粉45g、飘拂草粉50g、大豆粉10g、磷酸三钙3g、硬酯酸镁1g、木糖醇0.1g、山梨酸0.02g、山梨醇6g。

2.制备方法

(1)取制备好的香菇菌粉，加入50g水中，浸泡3小时，再在140～180℃的亚临界水温下浸提5分钟，重复浸提2次；

(2)将步骤(1)中的浸提液浓缩至60℃下相对密度为1.15g/cm³的浸膏，加入20ml乙醇沉淀，离心得沉淀；将沉淀依次用100g无水乙醇、100g丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用100g蒸馏水溶解，过截留分子量为100万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；

(3)取制备好的飘拂草粉、150g水、20g乙醇混合后加入蒸馏器，然后加入10g亮氨酸作提取助剂，加温至70～71℃，蒸馏提取70min，得到油水混合物；将油水混合物精馏，收集78～81℃的馏分备用；

(4)将制备好的大豆粉在10g水中浸泡3小时，再将混合物料一起移入酶解液中在25～28℃进行酶解1小时，酶解液为含有纤维酶的水溶液，纤维酶的重量百分比浓度为1.0～1.5％，pH为7.3～8.3。

(5)过滤步骤(4)中的混合物料，滤渣置于pH为9～10的碱性溶液中浸泡10分钟后升温至70～75℃，搅拌反应15分钟；混合物再一次过滤，得到的滤渣置于pH为6.0～6.5的酸性溶液中浸泡10分钟；混合物第三次过滤后，滤渣依次移入清水中清洗、取出、沥干、脱水、低温干燥备用；

(6)将步骤(5)中的脱水物料与磷酸三钙、硬酯酸镁、山梨酸、木糖醇混合均匀，过100目筛，用高速混合制粒机混合制粒得颗粒；

(7)将步骤(2)中的滤液、步骤(3)中的馏分、步骤(6)中的颗粒和山梨醇充分混合，继续搅拌制粒，所得颗粒干燥后填装入空心胶囊中即可，每粒重0.5g。

实施例2：

1.香菇多糖胶囊配方

香菇粉65g、飘拂草粉60g、大豆粉12.5g、磷酸三钙4g、环氧大豆油2g、D-木糖0.175g、山梨酸0.035g、山梨醇7.5g。

2.制备方法

(1)取制备好的香菇菌粉，加入97.5g水中，浸泡3.5小时，再在140～180℃的亚临界水温下浸提6分钟，重复浸提4次；

(2)将步骤(1)中的浸提液浓缩至60℃下相对密度为1.20g/cm3的浸膏，加入40ml乙醇沉淀，离心得沉淀；将沉淀依次用195g无水乙醇、195g丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用195g蒸馏水溶解，过截留分子量为100万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；

(3)取制备好的飘拂草粉、195g水、40g乙醇混合后加入蒸馏器，然后加入15g甘油作提取助剂，加温至70～71℃，蒸馏提取70min，得到油水混合物；将油水混合物精馏，收集78～81℃的馏分备用；

(4)将制备好的大豆粉在13.75g水中浸泡3小时，再将混合物料一起移入酶解液中在25～28℃进行酶解1小时，酶解液为含有纤维酶的水溶液，纤维酶的重量百分比浓度为1.0～1.5％，pH为7.3～8.3。

(5)过滤步骤(4)中的混合物料，滤渣置于pH为9～10的碱性溶液中浸泡15分钟后升温至70～75℃，搅拌反应18分钟；混合物再一次过滤，得到的滤渣置于pH为6.0～6.5的酸性溶液中浸泡15分钟；混合物第三次过滤后，滤渣依次移入清水中清洗、取出、沥干、脱水备用；

实施例3：

1.香菇多糖胶囊配方

香菇粉80g、飘拂草粉75g、大豆粉15g、磷酸三钙5g、亚磷酸醋3g、EDTA二钠盐0.25g、山梨酸0.05g、山梨醇9g。

2.制备方法

(1)取制备好的香菇菌粉，加入160g水中，浸泡4小时，再在140～180℃的亚临界水温下浸提8分钟，重复浸提3次；

(2)将步骤(1)中的浸提液浓缩至60℃下相对密度为1.25g/cm3的浸膏，加入80ml乙醇沉淀，离心得沉淀；将沉淀依次用320g无水乙醇、320g丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用320g蒸馏水溶解，过截留分子量为100万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；

(3)取制备好的飘拂草粉、300g水、45g乙醇混合后加入蒸馏器，然后加入30g乳酸作提取助剂，加温至73～75℃，蒸馏提取70min，得到油水混合物；将油水混合物精馏，收集78～81℃的馏分备用；

(4)将制备好的大豆粉在18.0g水中浸泡4小时，再将混合物料一起移入酶解液中在25～28℃进行酶解1小时，酶解液为含有纤维酶的水溶液，纤维酶的重量百分比浓度为1.0～1.5％，pH为7.3～8.3。

(5)过滤步骤(4)中的混合物料，滤渣置于pH为9～10的碱性溶液中浸泡20分钟后升温至70～75℃，搅拌反应20分钟；混合物再一次过滤，得到的滤渣置于pH为6.0～6.5的酸性溶液中浸泡20分钟；混合物第三次过滤后，滤渣依次移入清水中清洗、取出、沥干、脱水备用；

实施例4：细胞增殖实验-体外实验

1.试验培养基：取实施例2中制备的香菇多糖胶囊中的粉末1.5μg溶解于150μlα-MEM完全培养基中作为本实施例的细胞培养基。

2.对照培养基：以实施例2中去除飘拂草后的配方来制备香菇多糖胶囊，并将该香菇多糖胶囊中的粉末1μg溶解于100μlα-MEM完全培养基中作为本实施例的对照培养基。

3.NK-92MI细胞培养：在α-MEM培养基中加入浓度为12.5％的FBS及马血清，置于37℃、5％CO₂、95％湿度的孵箱中常规培养。

4.试验过程

取对数期生长状态良好的NK-92MI细胞，1200r/min离心4min。PBS洗涤1次，1mlα-MEM完全培养基悬浮细胞并计数。调整细胞浓度至2×10⁵/ml备用。于96孔板各实验孔加入50μlα-MEM完全培养基，于第一药物浓度组各孔加入150μl试验培养基，混匀，每个药物浓度梯度设4个复孔。自第一药物浓度组取出50μl/孔加入到第二组含50μl/孔α-MEM完全培养基混匀，依次倍比稀释，共8个浓度梯度(10mg/l、5mg/l、2.5mg/l、1.25mg/l、0.625mg/l、0.3125mg/l、0.15625mg/l、0.078125mg/l)，对照孔中添加100μl对照培养基。最后每孔加入NK-92MI细胞(2×10⁵个/ml)50μl，于37℃、5％CO₂的孵箱常规培养3小时，490nm读取吸光度值(OD490nm)。

5.结论

对照组及0.078125mg/l～10mg/l药物浓度组OD值分别为1.009±0.051、1.101±0.042、1.156±0.041、1.400±0.028、1.404±0.021、1.412±0.024、1.338±0.031、1.004±0.028、1.018±0.021。从试验结果可以看出，与单纯的香菇多糖制剂相比，含有飘拂草的香菇多糖制剂能相对促进NK-92MI细胞增殖。且高浓度(2.5mg/l-10mg/l)时，含飘拂草的香菇多糖制剂明显抑制NK-92MI细胞的生长，且呈浓度梯度依赖性。当浓度低于0.3125mg/l时，其对NK-92MI细胞生长促进作用较小。

实施例5：细胞增殖实验-动物实验

1.实验组给药药物：实施例2的香菇多糖胶囊内的颗粒

2.对照组1给药药物：以实施例2中去除飘拂草后的配方来制备香菇多糖胶囊内的颗粒

3.对照组2给药药物：以实施例2中去除大豆粉后的配方来制备香菇多糖胶囊内的颗粒

3.对照组3给药药物：购自湖北创力药业的香菇多糖胶囊

4.对照组4给药药物：生理盐水

5.给药：取清洁级C57BL/6小鼠50只，小鼠体重18～20g，随机分为5组，每组10只，分别为实验组，对照组1、对照组2、对照组3和对照组4。取生长旺盛的小鼠Lewis胃癌肿瘤细胞以常规方法制成匀浆约1～2×10⁷cfu/ml的癌细胞悬浮液，于每只小鼠的右腋皮下接种0.2ml癌细胞悬浮液，24h后，各组开始每日口服给药一次，实验组给药实施例2的香菇多糖胶囊内的颗粒，对照组1给药实施例2中去除飘拂草后的配方来制备香菇多糖胶囊内的颗粒，对照组2给药实施例2中去除大豆粉后的配方来制备香菇多糖胶囊内的颗粒，对照组3给药购自湖北创力药业的香菇多糖胶囊内的颗粒，对照组4给药生理水。给药剂量见下表1，连续给药10天。

表1实验组和对照组给药剂量

	实验组	对照组1	对照组2	对照组3	对照组4
						剂量(mg/kg)	2000	2000	2000	2000	1ml

6.标本取样：停药后于所有小鼠眼球后静脉丛毛细管取血，肝素抗凝，用于流式细胞仪检测。

7.流式细胞检测：采用二色免疫荧光标记法，分析从标本血样获得的细胞悬浮液中的CD3-/DX5+NK细胞。即取2μl的PE-Cy5.5-CD3和APC-DX5抗小鼠的抗体，与细胞在4℃下避光孵育30分钟后，用FACS洗剂缓冲液(PBS+0.01％NaN3+0.5％BSA)洗3次，即刻上机检测。流式细胞仪为FACSCalibur，采用的软件为CellQuest Software。每组样本重复3次。结果如表2所示。

表2 NK细胞数目变化情况

注：donor1、donor2、donor3为每组样本重复3次，每个数据均为每组10个样本中的平均值，实验组和对照组的增殖倍数、纯度之间均有显著差异，p<0.01。

8.结论：从表2中的数据可知，相较于对照组4，实验组和对照组1、2、3中香菇多糖能够一定程度上促进小鼠体内NK细胞增殖；相较于对照组1和对照组3，实验组和对照组2中的飘拂草的协同作用能够进一步促进NK细胞体内增殖、分化；并且，通过本实施例也可得出配方中添加的大豆粉能够显著促进生物活性物质的吸收，因此，本发明的技术方案结合了飘拂草促NK细胞体内增殖、分化的功能、香菇多糖促NK细胞活性和大豆粉的促吸收功能，使本发明的香菇多糖胶囊抗肿瘤效果显著，其效果明显优于市场上的香菇多糖胶囊产品。

实施例6：小鼠的免疫功能相关细胞因子活性实验

1.实验材料：TNF-αELISA试剂盒、IL-2ELISA试剂盒、IL-4ELISA试剂盒和IFN-γELISA试剂盒等。取清洁级C57BL/6荷瘤小鼠30只，小鼠体重18～20g，随机分为3组，每组10只，分别为实验组，阴性对照组和阳性对照组。

2.实验步骤：各组荷瘤小鼠每日口服给药一次，实验组给药实施例2的香菇多糖胶囊中的颗粒，阴性对照组给药生理盐水，阳性对照组给药湖北创力药业的香菇多糖胶囊中的颗粒，给药剂量见下表3，连续给药10天。将荷瘤小鼠眼球取血，离心，获得血清。测定血清中TNF-α、IL-2、IL-4和IFN-γ水平，使用SPSS统计软件进行统计处理。

表3实验组和对照组给药剂量

	实验组	阴性对照组	阳性对照组
				剂量(mg/kg)	2000	1ml	2000

3.实验结果

(1)实验组、阴性对照组和阳性对照组中给药药物对荷瘤小鼠血清中TNF-α水平的影响实验结果见图1、图2、图3和图4所示。图中所示，与阴性对照组相比，实验组给药和阳性对照组均能提高小鼠体内的TNF-α、IL-2、IL-4和IFN-γ水平。且由于实验组中的配方较阳性对照组添加了具有促进NK细胞体内增殖、分化的飘拂草，并且NK细胞的活性与TNF-α、IL-2、IL-4和IFN-γ有协同作用，所以实验组小鼠体内的TNF-α、IL-2、IL-4和IFN-γ水平增加更显著。因此，本发明的香菇多糖胶囊能增强小鼠的免疫功能相关细胞因子活性，从而达到增强体内NK细胞活性的作用。

实施例7：小鼠抗C-26结肠癌活性实验

取清洁级C57BL/6小鼠30只，小鼠体重18～20g，随机分为3组，每组10只，分别为实验组，阴性对照组和阳性对照组。

取生长旺盛的小鼠C-26结肠癌肿瘤细胞以常规方法制成匀浆约1～2×10⁷cfu/ml的癌细胞悬浮液，于每只小鼠的右腋皮下接种0.2ml癌细胞悬浮液，24h后，各组开始每日口服给药一次，实验组给药实施例2的香菇多糖胶囊中的颗粒，阴性对照组给药生理盐水，阳性对照组给药湖北创力药业的香菇多糖胶囊中的颗粒，给药剂量见下表4，连续给药10天。停药后次日处死所有动物，截取足趾称重并计算肿瘤抑制率。肿瘤生长抑制率按下列公式计算，抑制率(％)＝(阴性对照组瘤重-实验组/阳性对照组瘤重)/阴性对照组瘤重×100。

表4

	剂量(mg/kg)	动物增重(g)	瘤重(g)	抑制率(％)
					阴性对照	1ml	3.1	2.89±0.17	—
阳性对照	2000	3.2	1.69±0.15	46.9
					实验组	2000	2.9	1.02±0.02	79.8

由上表可知，市场上的出售的香菇多糖胶囊对小鼠C-26结肠癌的抑制率达46.9％，而本发明的方法制备的香菇多糖胶囊对小鼠C-26结肠癌的抑制率高达79.8％，其抗肿瘤效果明显优于现有技术中香菇多糖胶囊。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种体内高效扩增NK细胞的香菇多糖胶囊，其特征在于，包括香菇多糖65重量份、飘拂草粉生物活性提取物质60重量份、大豆粉生物活性提取物质12.5重量份、磷酸三钙4重量份、稳定剂2重量份、抗氧剂0.175重量份、防腐剂0.035重量份、保湿剂7.5重量份；

香菇多糖的制备方法为：

取制备好的香菇菌粉，加入占香菇菌粉重量1-2倍的水，浸泡3-4小时，再在140～180℃的亚临界水温下浸提4～8分钟，重复浸提2～4次；将获得的浸提液浓缩至60℃下相对密度为1.15～1.25g/ cm³的浸膏，加入乙醇沉淀，离心得沉淀；将沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2～4倍蒸馏水溶解，过截留分子量为100万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；

飘拂草粉生物活性提取物质的制备方法为：

取制备好的飘拂草粉、占飘拂草粉质量3～4倍水、占飘拂草粉质量0.4-0.6倍乙醇混合后加入蒸馏器，然后加入提取助剂，加温至70～75℃，蒸馏提取70～90min，得到油水混合物；将油水混合物精馏，收集78～81℃的馏分备用，所述的提取助剂选自亮氨酸、甘油或乳酸中的任意一种，所述亮氨酸的加入量占飘拂草质量的0.2～0.4倍，所述甘油的加入量占飘拂草质量的0.2～0.3倍，所述乳酸的加入量占飘拂草质量的0.3～0.4倍；

大豆粉生物活性提取物质的制备方法为：

将制备好的大豆粉在占大豆粉重量1～1.2倍的水中浸泡3～4小时，再将混合物料一起移入酶解液中进行酶解，在25～28℃酶解1小时，所述酶解液为含有纤维酶的水溶液，所述纤维酶的重量百分比浓度为 1.0～1.5%，pH为7.3～8.3；过滤酶解得到的混合物料，滤渣置于pH为9～10的碱性溶液中浸泡10～20分钟后升温至70～75℃，搅拌反应15～20分钟；混合物再一次过滤，得到的滤渣置于pH为6.0～6.5的酸性溶液中浸泡10～20分钟；混合物第三次过滤后，滤渣依次移入清水中清洗、取出、沥干、脱水备用。

2.根据权利要求1所述的一种体内高效扩增NK细胞的香菇多糖胶囊，其特征在于，所述稳定剂选自硬酯酸镁、硬酯酸钾、亚磷酸醋、环氧大豆油、介氨基巴豆酸醋中的任一种。

3.根据权利要求1所述的一种体内高效扩增NK细胞的香菇多糖胶囊，其特征在于，所述抗氧剂选自D-木糖、木糖醇、EDTA、EDTA二钠盐、二叔丁基对甲苯酚、苯乙醇、苯甲醇中的至少一种。

4.一种香菇多糖胶囊的制备方法，其特征在于，所述方法用于制备权利要求1-3任一项所述的体内高效扩增NK细胞的香菇多糖胶囊，包括以下步骤：

（1）取制备好的香菇菌粉，加入占香菇菌粉重量1-2倍的水，浸泡3-4小时，再在140～180℃的亚临界水温下浸提4～8分钟，重复浸提2～4次；

（2）将步骤（1）中的浸提液浓缩至60℃下相对密度为1.15～1.25 g/ cm³

的浸膏，加入乙醇沉淀，离心得沉淀；将沉淀依次用2～4倍重量的无水乙醇、丙酮分别洗涤，将洗涤后的沉淀用2～4倍蒸馏水溶解，过截留分子量为100万的中空纤维膜，收集透过液离心，过滤，取滤液备用；

（3）取制备好的飘拂草粉、占飘拂草粉质量3～4倍水、占飘拂草粉质量0.4-0.6倍乙醇混合后加入蒸馏器，然后加入提取助剂，加温至70～75℃，蒸馏提取70～90min，得到油水混合物；将油水混合物精馏，收集78～81℃的馏分备用，所述的提取助剂选自亮氨酸、甘油或乳酸中的任意一种，所述亮氨酸的加入量占飘拂草质量的0.2～0.4倍，所述甘油的加入量占飘拂草质量的0.2～0.3倍，所述乳酸的加入量占飘拂草质量的0.3～0.4倍；

（4）将制备好的大豆粉在占大豆粉重量1～1.2倍的水中浸泡3～4小时，再将混合物料一起移入酶解液中进行酶解，在25～28℃酶解1小时，所述酶解液为含有纤维酶的水溶液，所述纤维酶的重量百分比浓度为 1.0～1.5%，pH为7.3～8.3；

（5）过滤步骤（4）中的混合物料，滤渣置于pH为9～10的碱性溶液中浸泡10～20分钟后升温至70～75℃，搅拌反应15～20分钟；混合物再一次过滤，得到的滤渣置于pH为6.0～6.5的酸性溶液中浸泡10～20分钟；混合物第三次过滤后，滤渣依次移入清水中清洗、取出、沥干、脱水备用；

（6）将步骤（5）中的脱水物料与磷酸三钙、稳定剂、抗氧剂、防腐剂混合均匀，过100目筛，用高速混合制粒机混合制粒得颗粒；

（7）将步骤（2）中的滤液、步骤（3）中的馏分、步骤（6）中的颗粒和保湿剂充分混合，继续搅拌制粒，所得颗粒干燥后填装入空心胶囊中即可，每粒重0.5g。

5.如权利要求1-3任一项所述的一种体内高效扩增NK细胞的香菇多糖胶囊用于制备促进NK细胞体内增殖的药物的用途，其特征在于，采用浓度为0.3125 mg/l-2.5 mg/l时用于体内扩增NK细胞。