CN112940145A - 一种动物用灵芝多糖的提取制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种动物用灵芝多糖的提取制备方法：将灵芝切片粉碎后采用乙酸乙酯索式提取除去脂肪，过滤得到沉淀加入表面活性剂失水山梨醇单月硅酸酯浸泡，调节pH后超声提取，提取液离心分离，取上清液用H2O2脱色、Sevage法除去蛋白质后浓缩、醇沉和冷冻干燥即得高纯灵芝多糖。本发明通过超声及改变超声过程中pH值使得糖蛋白的糖肽键断裂，另外采用表面活性剂失水山梨醇单月硅酸酯增加了灵芝多糖的溶解，显著提高了灵芝多糖的提取率。两者协同作用提高灵芝多糖得率且操作简单方便用时少，高效提取灵芝多糖的同时无毒无污染，能够显著提高家禽家畜免疫力，促进家禽家畜的生长，可广泛运用于家禽家畜，具有广阔的市场前景。
Description
技术领域
本发明属于灵芝多糖提取技术领域，具体涉及一种动物用灵芝多糖的提取制备方法。
背景技术
灵芝，在系统分类上隶属于菌物界，担子菌门，层菌纲，灵芝目，灵芝科。灵芝富含灵芝多糖、三萜类化合物、核苷、氨基酸、甾醇、生物碱等多种活性成分，具有多种生理功能，是一种不可多得的高级营养食品。灵芝多糖是灵芝主要活性成分之一，具有抗肿瘤、抗氧化自由基、抗衰老、提高免疫力、活血化瘀等作用。
灵芝主要药效成分为灵芝多糖(Ganoderma lucidiumPolysaccharide)，具有多种药理学活性功能及保健养生效果，目前，对灵芝进行了有效成分、药理和临床等方面的研究，就药理作用而言，灵芝具有多种药理活性成分，其灵芝中包含了多肽、多糖、三菇类、16种氨基酸(其中含有七种人体必需氨基酸)、蛋白质、甾类、甘露醇、香豆精苷、生物碱、有机酸(主含延胡索酸)等10类药理活性成分，以及微量元素Ge、P、Fe、Ca、Mn、Zn等。而且各药理活性成分在发挥保健及药理作用时各成分之间还体现有协同效应。已从它的子实体、菌丝体和孢子中分离出数十类。灵芝的菌丝体，是其营养体，它是由菌丝体的气生菌丝及分泌物共同组成的一种营养结构。菌丝呈细管状，管壁即细胞壁由葡聚糖、糖蛋白、蛋白质及几丁质微丝等成分组成。子实体灵芝的子实体，是其繁殖体，常因其粘附大量的孢子粉，而使盖面因灰褐色粉末覆盖而失去了光泽。灵芝在成熟时可产生数百分子孢子，这些孢子飘散在子实体周围似一阵烟雾一样围绕着灵芝子实体，因此称为孢子粉。灵芝孢子是灵芝的种子，浓缩了灵芝的精华，具有灵芝全部遗传活性物质，药理活性成分更具多样性。在电镜下孢子大小，只有8～12*6～7μm。灵芝多糖，能溶于水(温、热)，不溶于或难溶于醇(乙醇、甲醇)、醚、丙酮等有机溶剂，可溶于稀碱、稀酸溶液。由于灵芝孢子细胞壁由具有抗压、耐酸和不易酶解的几丁质、树脂和纤维素等成分组成，孢内药理活性成分难以外释，增加了人体对各有效成分的吸收利用难度。
发明内容
灵芝是一种名贵药用真菌，虽然灵芝多糖能够显著提高家禽家畜免疫力，促进其生长，但将灵芝直接用于家禽家畜无疑会大大提高饲养成本。因此，本发明采用生产制备过程中的劣质灵芝或灵芝残渣作为提取原料，降低成本的同时回收利用了劣质灵芝或灵芝残渣，减少了灵芝资源的浪费；同时针对现有灵芝多糖提取技术提取率低的问题，本发明提供了一种动物用灵芝多糖的提取制备方法：通过超声及改变超声过程中pH值脱除蛋白质的同时减少灵芝多糖的损失使得灵芝多糖的纯度和提取率大大提高，协同表面活性剂失水山梨醇单月硅酸酯的增加溶解作用也显著提高了灵芝多糖的得率。
本发明提供了一种动物用灵芝多糖的提取制备方法，包括：
S1、取灵芝切片粉碎，用乙酸乙酯索式提取除去脂肪，然后浸泡在生理盐水中，过滤收集沉淀；
S2、对S1所得沉淀按质量体积比1：(15-25)g/mL加入表面活性剂分散液，浸泡4-6小时获得料液；
S3、调节S2所得料液pH为6.0-8.0，然后超声提取3次后合并提取液，得到灵芝多糖提取液；
S4、将灵芝多糖提取液离心分离，取上清液用H2O2脱色、Sevage法除去蛋白质后浓缩、醇沉和冷冻干燥即得高纯灵芝多糖。
作为优选，S1所述灵芝可以是生产制备过程中的劣质灵芝或灵芝残渣。
作为优选，S2所述表面活性剂分散液为1.0％-1.5％的失水山梨醇单月硅酸酯分散液。
作为优选，S3所述超声提取的条件是：在40-65℃、250-400W下超声提取，提取时间10-20min。
作为优选，S4所述离心分离是以4000-5500r/min离心6-10min。
作为优选，S4所述Sevage法除去蛋白质具体是：在H2O2脱色后混合液中加入混合液体积1/4的用氯仿和正丁醇按5：1比例配制成的Sevage试剂充分振摇30-50min，离心1min，将两相分离，继续在水相中加入其体积1/4的Sevage试剂，重复5-6次直至两相交界处无乳白色变性蛋白质析出，无凝聚物生成。
作为优选，S4所述浓缩、醇沉为将Sevage法除蛋白所得水相浓缩至四分之一体积，加入3-4倍体积的95％乙醇溶液，静置12h。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明通过超声及改变超声过程中pH值使得糖蛋白的糖肽键断裂，从而分离蛋白质与灵芝多糖，脱除蛋白质的同时减少了灵芝多糖的损失，提高灵芝多糖提取率同时增加了制得灵芝多糖的纯度；另外采用表面活性剂失水山梨醇单月硅酸酯增加了灵芝多糖的溶解，同样显著提高了灵芝多糖的提取率。两者协同作用提高灵芝多糖得率且操作简单方便用时少，高效提取灵芝多糖的同时无毒无污染，能够显著提高家禽家畜免疫力，促进家禽家畜的生长，可广泛运用于家禽家畜，具有广阔的市场前景。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的说明，但本发明并不限于以下实施例。所述方法如无特别说明均为常规方法，所述原材料如无特别说明均能从公开商业途径获得。
实施例1
本实施例提供了一种动物用灵芝多糖的提取制备方法，包括：
S1、取生产制备过程中的劣质灵芝或灵芝残渣切片粉碎，用乙酸乙酯索式提取除去脂肪，然后浸泡在生理盐水中，过滤收集沉淀；
S2、对S1所得沉淀按质量体积比1：20g/mL加入1.2％的失水山梨醇单月硅酸酯分散液，浸泡5小时获得料液；
S3、调节S2所得料液pH为7.0，然后超声提取(55℃、350W，提取15min)3次后合并提取液，得到灵芝多糖提取液；
S4、将灵芝多糖提取液离心分离(5000r/min，8min)，取上清液用H2O2脱色、Sevage法除去蛋白质(在H2O2脱色后混合液中加入混合液体积1/4的用氯仿和正丁醇按5：1比例配制成的Sevage试剂充分振摇40min，离心1min，将两相分离，继续在水相中加入其体积1/4的Sevage试剂，重复5-6次直至两相交界处无乳白色变性蛋白质析出，无凝聚物生成)将Sevage法除蛋白所得水相浓缩至四分之一体积，加入4倍体积的95％乙醇溶液，静置12h，最后冷冻干燥即得高纯灵芝多糖。
实施例2
本实施例提供了一种动物用灵芝多糖的提取制备方法，包括：
S1、取生产制备过程中的劣质灵芝或灵芝残渣切片粉碎，用乙酸乙酯索式提取除去脂肪，然后浸泡在生理盐水中，过滤收集沉淀；
S2、对S1所得沉淀按质量体积比1：15g/mL加入1.0％的失水山梨醇单月硅酸酯分散液，浸泡4小时获得料液；
S3、调节S2所得料液pH为6.0，然后超声提取(45℃、280W，提取12min)3次后合并提取液，得到灵芝多糖提取液；
S4、将灵芝多糖提取液离心分离(4200r/min，6min)，取上清液用H2O2脱色、Sevage法除去蛋白质(在H2O2脱色后混合液中加入混合液体积1/4的用氯仿和正丁醇按5：1比例配制成的Sevage试剂充分振摇30min，离心1min，将两相分离，继续在水相中加入其体积1/4的Sevage试剂，重复5-6次直至两相交界处无乳白色变性蛋白质析出，无凝聚物生成)将Sevage法除蛋白所得水相浓缩至四分之一体积，加入3倍体积的95％乙醇溶液，静置12h，最后冷冻干燥即得高纯灵芝多糖。
实施例3
本实施例提供了一种动物用灵芝多糖的提取制备方法，包括：
S1、取生产制备过程中的劣质灵芝或灵芝残渣切片粉碎，用乙酸乙酯索式提取除去脂肪，然后浸泡在生理盐水中，过滤收集沉淀；
S2、对S1所得沉淀按质量体积比1：25g/mL加入1.5％的失水山梨醇单月硅酸酯分散液，浸泡6小时获得料液；
S3、调节S2所得料液pH为8.0，然后超声提取(60℃、400W，提取20min)3次后合并提取液，得到灵芝多糖提取液；
S4、将灵芝多糖提取液离心分离(5200r/min，10min)，取上清液用H2O2脱色、Sevage法除去蛋白质(在H2O2脱色后混合液中加入混合液体积1/4的用氯仿和正丁醇按5：1比例配制成的Sevage试剂充分振摇50min，离心1min，将两相分离，继续在水相中加入其体积1/4的Sevage试剂，重复5-6次直至两相交界处无乳白色变性蛋白质析出，无凝聚物生成)将Sevage法除蛋白所得水相浓缩至四分之一体积，加入4倍体积的95％乙醇溶液，静置12h，最后冷冻干燥即得高纯灵芝多糖。
对比例1
取生产制备过程中的劣质灵芝或灵芝残渣切片粉碎，用乙酸乙酯索式提取除去脂肪，然后浸泡在生理盐水中，过滤收集沉淀；沉淀加水，70℃热水浸提4小时，过滤浓缩，加入4倍体积的95％乙醇溶液，静置12h，最后冷冻干燥。(传统热水浸提法)
对比例2
取生产制备过程中的劣质灵芝或灵芝残渣切片粉碎，用乙酸乙酯索式提取除去脂肪，然后浸泡在生理盐水中，过滤收集沉淀；沉淀加水调节pH为8.0，然后超声提取(60℃、400W，提取20min)3次后合并提取液，得到灵芝多糖提取液；将灵芝多糖提取液离心分离(5200r/min，10min)，取上清液用H2O2脱色、Sevage法除去蛋白质(在H2O2脱色后混合液中加入混合液体积1/4的用氯仿和正丁醇按5：1比例配制成的Sevage试剂充分振摇50min，离心1min，将两相分离，继续在水相中加入其体积1/4的Sevage试剂，重复5-6次直至两相交界处无乳白色变性蛋白质析出，无凝聚物生成)将Sevage法除蛋白所得水相浓缩至四分之一体积，加入4倍体积的95％乙醇溶液，静置12h，最后冷冻干燥(除不加表面活性剂失水山梨醇单月硅酸酯分散液外，与实施例3相同)
对比例3
取生产制备过程中的劣质灵芝或灵芝残渣切片粉碎，用乙酸乙酯索式提取除去脂肪，然后浸泡在生理盐水中，过滤收集沉淀；对所得沉淀按质量体积比1：25g/mL加入1.5％的失水山梨醇单月硅酸酯分散液，浸泡6小时获得料液；调节所得料液pH为8.0，离心分离(5200r/min，10min)，取上清液用H2O2脱色、Sevage法除去蛋白质(在H2O2脱色后混合液中加入混合液体积1/4的用氯仿和正丁醇按5：1比例配制成的Sevage试剂充分振摇50min，离心1min，将两相分离，继续在水相中加入其体积1/4的Sevage试剂，重复5-6次直至两相交界处无乳白色变性蛋白质析出，无凝聚物生成)将Sevage法除蛋白所得水相浓缩至四分之一体积，加入4倍体积的95％乙醇溶液，静置12h，最后冷冻干燥即得高纯灵芝多糖(除不超声提取外，与实施例3相同)
对比例4
取生产制备过程中的劣质灵芝或灵芝残渣切片粉碎，用乙酸乙酯索式提取除去脂肪，然后浸泡在生理盐水中，过滤收集沉淀；对所得沉淀按质量体积比1：25g/mL加入1.5％的失水山梨醇单月硅酸酯分散液，浸泡6小时获得料液；调节所得料液pH为5.0，然后超声提取(60℃、400W，提取20min)3次后合并提取液，得到灵芝多糖提取液；将灵芝多糖提取液离心分离(5200r/min，10min)，取上清液用H2O2脱色、Sevage法除去蛋白质(在H2O2脱色后混合液中加入混合液体积1/4的用氯仿和正丁醇按5：1比例配制成的Sevage试剂充分振摇50min，离心1min，将两相分离，继续在水相中加入其体积1/4的Sevage试剂，重复5-6次直至两相交界处无乳白色变性蛋白质析出，无凝聚物生成)将Sevage法除蛋白所得水相浓缩至四分之一体积，加入4倍体积的95％乙醇溶液，静置12h，最后冷冻干燥即得高纯灵芝多糖(除调节料液pH为5.0外，与实施例3相同)
对实施例1-3和对比例1-4获得的灵芝多糖采用HPLC法测定产品中灵芝多糖的含量，计算得率。结果如表1所示。
表1：灵芝多糖纯度及得率检测结果
| 序号 | 纯度 | 得率 |
| 实施例1 | 94％ | 0.825％ |
| 实施例2 | 86％ | 0.778％ |
| 实施例3 | 88％ | 0.791％ |
| 对比例1 | 76％ | 0.667％ |
| 对比例2 | 87％ | 0.746％ |
| 对比例3 | 81％ | 0.712％ |
| 对比例4 | 85％ | 0.774％ |
由上述结果可知，本发明通过采用表面活性剂失水山梨醇单月硅酸酯，显著提高了灵芝多糖的得率；另通过调整超声提取时的pH，结合超声提取使得糖蛋白与灵芝多糖分离，提高纯度的同时也提高了得率。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为包含在本发明的保护范围内。
Claims (7)
1.一种动物用灵芝多糖的提取制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
S1、取灵芝切片粉碎，用乙酸乙酯索式提取除去脂肪，然后浸泡在生理盐水中，过滤收集沉淀；
S2、对S1所得沉淀按质量体积比1：(15-25)g/mL加入表面活性剂分散液，浸泡4-6小时获得料液；
S3、调节S2所得料液pH为6.0-8.0，然后超声提取3次后合并提取液，得到灵芝多糖提取液；
S4、将灵芝多糖提取液离心分离，取上清液用H2O2脱色、Sevage法除去蛋白质后浓缩、醇沉和冷冻干燥即得高纯灵芝多糖。
2.根据权利要求1所述一种动物用灵芝多糖的提取制备方法，其特征在于，S1所述灵芝可以是生产制备过程中的劣质灵芝或灵芝残渣。
3.根据权利要求1所述一种动物用灵芝多糖的提取制备方法，其特征在于，S2所述表面活性剂分散液为1.0％-1.5％的失水山梨醇单月硅酸酯分散液。
4.根据权利要求1所述一种动物用灵芝多糖的提取制备方法，其特征在于，S3所述超声提取的条件是：在40-65℃、250-400W下超声提取，提取时间10-20min。
5.根据权利要求1所述一种动物用灵芝多糖的提取制备方法，其特征在于，S4所述离心分离是以4000-5500r/min离心6-10min。
6.根据权利要求1所述一种动物用灵芝多糖的提取制备方法，其特征在于，S4所述Sevage法除去蛋白质具体是：在H2O2脱色后混合液中加入混合液体积1/4的用氯仿和正丁醇按5：1比例配制成的Sevage试剂充分振摇30-50min，离心1min，将两相分离，继续在水相中加入其体积1/4的Sevage试剂，重复5-6次直至两相交界处无乳白色变性蛋白质析出，无凝聚物生成。
7.根据权利要求1所述一种动物用灵芝多糖的提取制备方法，其特征在于，S4所述浓缩、醇沉为将Sevage法除蛋白所得水相浓缩至四分之一体积，加入3-4倍体积的95％乙醇溶液，静置12h。
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