KR100813914B1

KR100813914B1 - 장내 생균제 공동-발효 배양물에 의한 천연 의약의 전환과변형

Info

Publication number: KR100813914B1
Application number: KR1020017016660A
Authority: KR
Inventors: 빙신 위; 리산 동; 시아올린 선; 홍 왕
Original assignee: 빙신 위
Priority date: 2000-04-26
Filing date: 2001-04-26
Publication date: 2008-03-14
Also published as: EP1279727A1; EP1279727B1; JP5000066B2; DE60139122D1; WO2002012446A1; CN1273839A; EP1279727A4; AU6890201A; JP2004505625A; KR20020038596A

Abstract

본 발명은 천연 의약(즉, 중국 전통 약초, Chinese traditional herb)의 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생체 공학 이론에 비추어 이간의 장관내 마이크로-생태계(micro-ecosystem)과 비슷한 장내 생균제(probiotic) 발효 배양(이 배양에 의해 천연 의약의 생물 활성이 증가되며 그의 독성이 감소되거나 제거됨)에 의해 식물 또는 동물 기원 천연 의약의 생물-전환 또는 생물-변형 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 천연의 중국 약초 제제의 제조 방법의 용도에 관한 것이다.

Description

장내 생균제 공동-발효 배양물에 의한 천연 의약의 전환과 변형{The conversion and modification of natural medicines by intestinal probiotics co-fermentation cultures}

본 발명은 천연 의약(즉, 중국 전통 약초, Chinese traditional herb)의 제제를 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생체 공학 이론에 비추어 인간의 장관내 마이크로-생태계(micro-ecosystem)과 비슷한 장내 생균제(probiotic) 발효 배양(이 배양에 의해 천연 의약의 생물 활성이 증가되며 그의 독성이 감소되거나 제거됨)에 의해 식물 또는 동물 기원 천연 의약의 생물-전환 또는 생물-변형 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 천연의 중국 약초 제제의 제조 방법의 용도에 관한 것이다.

중국 약초 의약은 그의 정확한 기구, 말하자면 약리 효과가 아직 잘 알려져 있지 않지만, 동양, 특히 중국에서 수 천년간 임상적으로 사용되어 왔다. 인간의 마이크로생태계에 대한 연구 개발로, 인간의 장내 미생물의 마이크로생태적 변경은 중국 전통 의학의 관점에서 "질병"에 밀접하게 관련될 수 있다고 믿어져 오고 있다. 특히, 중국 약초 의약을 이용한 조절은 장관에서 이로운 세균와 유해 세균 사이의 균형을 개선할 수 있다. 한편, 균형화된 장내 마이크로에코-환경은 천연 의 약의 흡수, 전환, 및 이동을 용이하게 할 것이며 이로서 그의 생물학적 효과를 개선할 것이다.

중국 약초 의약의 효능은 그 의약내에 함유된 화학 물질에 의존한다. 탕약(decoction liquor), 중국 전통 의약의 의미로, 즉 수추출물의 형태로 인체에 경구 투여할 때, 이것은 마침내 다양한 이동 경로로 흡수될 것이다: (1) 원형(antetype) 화합물이 순환계에서 흡수되며 그의 약리 효과를 나타내고; (2) 그의 약리 효과를 나타내기 전에 원형 화합물이 흡수된 다음 간-장내 순환, 조직 또는 혈액내에서 일련의 공정을 수행하고; (3) 원형 화합물이 흡수되지 않고 땀과 요로 배출되며; (4) 원형 화합물이 정상 장내 세균의 활성 결과로서 장내 세균 대사 효소에 의해 화학적으로 전환된다.

이러한 방식으로, 이 의약의 흡수율, 이동율 및 생물학적 활성이 감소된 독성 부작용과 함께 수반하여 증가되며, 바람직한 약리 효과를 나타낸다. 따라서, 임상적 연구뿐만 아니라 실험실에서 약물동력학 연구에 관해 인간의 장내 혐기성 생물 및 대사 전환에 의해 천연 의약의 정확한 공정을 완전히 연구하는 것이 중국 전통 의약의 작용 기구를 예시하는데 매우 중요하다.

1950년대이래, 다양한 동물 모델과 방법이 장내 정상 플로라(flora)에 의한 천연 의약 또는 그의 활성 성분 및 그 구조적 변형에 관한 전환을 연구하는데 사용되어 왔다. 천연 의약에 대해 생체 내에서 흡수, 이동, 대사산물 및 효능에 중요한 역할을 하는, 탕약(즉, 수추출물)의 형태로 투여된, 장내 정상 플로라에 의해 천연 의약으로 생물-전환 및 구조적 변형을 위해 복잡한 대사 과정이 존재한다는 사실이 생체 내 또는 시험관내 연구에 의해 입증된 바 있다.

예를 들어, Dooth A.N. et al.(J. Biol. Chem., 223:251. 1956)는 케르세틴을 생쥐에 경구 투여한 후, B 사이클 분해 생성물, 이를테면 3,4-디하이드록시-페닐아세테이트가 요에서 검출될 수 있다는 사실을 보고하였다. 반대로, 항생제(이를테면 네오마이신)이 동물에 미리 투여된다면, 이들 케르세틴 대사 생성물이 요에서 검출될 수 없었다. 실험 결과는 이들 대사 생성물이 장내 세균의 색전성(embolic) 전환에 의해 생성된다는 것을 나타낸다.

Drasar와 Hill(Human Instestinal Flora, Academic press, 1974)은 또한 일단 쥐에게 항생제가 복부내로 투여되어 장내 세균을 억제한다면, 실험 쥐에 중국 약초인, 독성이 큰 알몬드 글리코사이드를 함유한 알몬드를 경구 투여할 때 쥐에서 알몬드 글리코사이드에 대한 독성 반응이 관찰될 수 없다는 것을 입증하였다. 또한, 알몬드 글리코사이드가 생쥐의 분리된 장내 세균과 함께 배양되면, 이 알몬드 글리코사이드가 페닐에탄올니트릴로 가수분해될 수 있으며 차례로, 가외로 검출될 수 있는 독성의 하이드로시안산으로 분해된다는 것을 보여준다(참조, Scheline R.K., Pharmacol. Rev., 25:451, 1973).

또한 감초(glycyrrhizia)의 주요 성분인 리퀴르틴(liquirtin)은 유박테리움(Eubacterium sp. CLH)에 의해 그의 생성물, 글루쿠로니다제(glucuronidase)의 도움하에 에녹솔론(enoxolone)으로 전환될 수 있다. 또한, 콩과종(leguminous species)으로부터 식물 유래된 이소플라본 화합물이 염소(caprine)로부터 장내 함유물로 배양에 의해 구조적으로 변형될 수 있다는 사 실이 관찰되었다. 특히, 바이오카닌(biochanin) A가 염료 게니테인(genitein)으로 전환되면서 7-하이드록시-4-메틸이소플라본이 대두 글리코사이드 리간드와 에푸올(epuol)로 전환된다. 말하자면, 염소의 함유물에서 장내 플로라가 이소플라본 화합물을 생물-전환하는 능력을 가지고 있다(참조, Niissou, A., et al., Biochem. Biophys. Acta, 148:92, 1967).

상기 실험 모두는 특히 위장관에 의해 체내로 흡수될 때, 알려지고/지거나 알려지지 않은 구조를 가진 천연 의약이 그의 흡수 전에 그의 장내 플로라 또는 대사산물의 작용에 의해 어느 정도 구조적으로 변형되어야 하며 그후 그의 생물학적 활성의 기능에서 변형되어야 한다는 사실을 의미한다.

그러나, 지금까지 알려지지 않는 구조를 가진 천연 의약, 특히 그의 활성 성분을 활성화하고, 유도하고, 전환하고/하거나 변형하도록 알려진 생균제를 이용하여 경구 투여 후 생물학적 기능이 향상되는 천연 의약 조성물에 대해 시험관내 과정 또는 가공에 대해 선행 기술에 이러한 기록은 없다. 더구나, 임상에 그 결과물을 성공적으로 적용하기 전에 의약의 생물학적 활성을 향상시키도록 생균제의 회분식 접종함으로써 시험관내 발효에 의한 천연 의약 제제의 과정에 대해 발견된 기록은 없다.

본 발명자들은 항암 천연 의약뿐만 아니라 장내 생균제 제제의 개발에 장기간의 노력을 기초로, 다양한 천연 의약 조성물의 수추출물과 조합하여 다양한 장내 생균제를 발효시켰고, 여기서 본 발명에서 사용된 장내 생균제가 인체내에서 광범위하게 논쟁을 이끌어내고 이 생균제가 정확한 활성을 가지고 있음을 알아냈다. 놀랍게도 이 천연 의약 조성물의 생체내 약리 활성이 장내 생균제와 그의 대사산물에 의한 발효 처리 후에 실질적으로 향상되었다. 본 발명을 상기 발견을 기초로 완성한다.

[발명의 요약]

본 발명의 목적 하나는 하나 이상의 장내 생균제를 회분 식으로 천연 의약의 추출물을 함유한 배양 배지에 접종하고; 적합한 발효 조건하에 이를 배양하는 것을 포함하는, 천연 의약 제제의 제조방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 바람직한 일 예에서, 상기 방법은 하나 이상의 장내 생균제의 공동-발효 배양물을 제조한 다음; 하나 이상의 천연 의약의 기제조된(pre-made) 추출물 또는 가공되지 않은 천연 의약의 분말을 이 배양 배지에 첨가하고; 또한 혼합하고 생성된 혼합물을 배양시키는 단계를 포함한다.

본 발명의 다른 바람직한 일 예에서, 상기 방법은 하나 이상의 천연 의약의 기제조된 추출물 또는 가공되지 않은 천연 의약의 분말을 적합한 배양 배지에 첨가한 다음; 하나 이상의 장내 생균제를 회분 식으로 생성된 혼합물에 접종하고 이를 공동-발효에 의해 배양하는 단계를 포함한다.

본 발명의 추가 바람직한 일 예에서, 상기 생균제는 비피도박테리움(Bifidobacterium), 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 프로피오니움(Propionium), 류코노스톡(Leuconostoc), 및 바실러스(Bacillus)로 구 성된 그룹의 종으로부터 선택된 하나 이상의 인간 장내 비병원성 생균제이다.

본 발명의 추가 바람직한 일 예에서, 상기 생균제는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 류코노스톡 시트로보룸(Leuconostoc citrovorum), 프로피오니박테리움 쉐르마니(Propionibacterium shermanii), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)로 구성된 그룹의 종으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 일 예에서, 상기 천연 의약 제제는 예방 및/또는 치료 효과를 가지며 하나 이상의 인간의 정상 장내 세균 및 그의 대사산물에 의해 가공되거나 변형될 수 있는 하나 이상의 식물 또는 동물 기원 의약 또는 그들의 배합물을 포함한다.

본 발명의 바람직한 일 예에서, 상기 천연 의약 제제는 하나 이상의 천연 의약의 수추출물 또는 유기-용액 추출물, 또는 의약의 가공되지 않은 고형 분말이다.

본 발명의 바람직한 일 예에서, 상기 유기 용액은 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, 메틸에테르, 에틸 에테르, 디메틸에테르, 아세톤, 디클로로메탄, 클로로포름, 아세토니트릴, 또는 그들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다.

본 발명의 바람직한 일 예에서, 상기 천연 의약 제제는 생기(vital QI) 유지를 위한 병원 인자의 제거; 기 활성화에 의한 지혈; 지라 활성화 및 신장 강화; 단단한 덩어리 연화 및 어혈(blood stasis) 제거; 가래 해소 및 습기 제거; 염증 완화 및 독소 제거; 정기(vital essence) 및 혈액 생성 촉진; 이뇨 촉진 및 생기 활성화를 위한 약제; 또는 그들의 혼합물로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 본 발명에서 사용된, 인체의 생체 에너지 또는 기능 활성을 의미하는 "QI", "지라", 및 "신장", 등과 같은 용어는 중국 전통 의학의 모든 개념이며 이 분야의 기술에 숙련된 자에게 명백하다.

[발명의 구성]

본 발명은 천연 의약의 조성물을 제조하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 생체 공학 이론에 비추어 인간의 장관내 마이크로-생태계와 비슷한 장내 생균제 공동-발효 배양(이 배양에 의해 천연 의약의 생물 활성이 개선되며 그의 독성이 감소되거나 제거됨)에 의해 식물 또는 동물 기원 천연 의약의 생물-전환 또는 생물-변형 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 천연 의약 제제를 제조하는데 상기 방법의 용도에 관한 것이다.

천연 중국 전통 약초의 수탕약이 오랜 역사에 걸쳐 중국 전통 의약의 가공 중에 가장 광범위하게 사용된 조 의약의 가공 방법이라는 사실은 잘 알려져 있다. 그러나, 수탕약 공정(즉, 중국 전통 의약의 탕약화 공정)은 단순하나 본래 결점이 있다. 특히, 의약중 수용성 성분은 충분히 용해되지 못하며, 반면에 대부분의 지용성 성분은 이러한 공정 중에 폐기된다. 최근 수 십 년간, 서양 의약에 대한 현대의 약제 제조 기술, 이를테면 에탄올 또는 다른 유기 용액 추출 기술은 전통적인 수추출과 병행하여 도입된 바 있다. 유감스럽게도, 몇 가지 문제점, 이를테면 유기 용액의 잔류, 좋지 않은 흡수 및 의약의 열악한 활성이 이들 방법을 사용할 때 발생된다.

1990년대에, 소장에서 흡수가 용이하도록, 경구 투여된 의약의 위장 이동 과정과 비슷하게 하려는 소위 "반-생체 공학적 추출"(여기서, 중국 약초중 활성 성분은 각각 산성 수용액과 염기성 수용액으로 추출됨)을 이용하여 중국 전통 의약을 제조한다고 추정되고 있다. 그러나, 인간의 위장의 내부 환경은 적절하게 단순화되어 있지 않으며 중국 약초 자체내의 성분의 복잡성을 고려하지 않고 있다.

사실상, 인간의 위장은 전체적으로 인간 세포의 마이크로 생태계의 몇 배 이상으로 많은 약 100 종류의 이롭거나 유해한 세균을 포함한 마이크로 생태계이다. 또한, 중국 약초 의약의 각 처방전은 화학적 합성 약물의 처방전과 같은 단일 화합물이 아니라 서로 다른 다양한 화학 물질을 포함한 복합 "공급원"을 포함하고 있다. 따라서, 위장내 산 및/또는 염기 조건을 간단히 모방함으로써 중국 전통 의약을 가공하는 것은 가공된 중국 전통 의약의 효과에 대해 예상된 효과를 전혀 성취할 수 없다.

본 발명자들은 마이크로 생태학적 제제 및 중국 약초 제제의 개발에서 오랜 역사적 경험을 기초로 하여, 상기 천연 의약 제제에 대한 본 출원의 공정이 실질적으로 이들의 생체내 예상 약리 활성을 증가시키며 그의 비특이적 물리학적 독성을 어느 정도 감소시킬 것이라는 사실을 알아냈다. 상기 공정은 장내 생균제 배양물을 선택하고, 3 종류의 생균제를 중국 약초 의약의 기제조된 수탕약 제제에 첨가한 다음, 생성된 혼합물을 공동-배양함으로써 다양한 천연 의약을 조작하는 단계를 포함한다.

본 발명의 목적 하나는 생체 공학 이론에 비추어 인간의 장관내 마이크로-생태계와 비슷한, 장내 생균제 공동-배양 배양물에 의해 식물- 또는 동물-유래 천연 의약의 생물-전환 및/또는 생물-변형 방법을 제공하며, 이 방법에 의해 상기 천연 의약의 생물학적 활성이 개선되고 그의 독성이 감소되거나 제거된다. 상기 방법은 다음 단계를 포함한다:

(1) 종래의 방법에 따라 식물- 또는 동물-유래 천연 의약의 추출물을 각각 제조한 다음, 생성물을 혼합하기 전에 감압 하에 농축하고;

(2) 선택된 생균제를 회분식으로 단계 (1)의 천연 의약의 추출물을 함유하는 발효조(fermenter)에 연속적으로 접종하고; 적합한 발효 조건하에 생성된 혼합물을 배양한 다음;

(3) 발효가 종료될 때, 임의로, 발효 배양물을 가열하거나 가열하지 않아 배양물을 수집하기 전에 그 속에 있는 생균제를 사멸시킨다.

본 발명에 따른 상기 생균제는 비피도박테리움(Bifidobacterium) , 락토바실러스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 프로피오니움(Propionium), 류코노스톡(Leuconostoc), 및 바실러스(Bacillus)로 구성된 그룹으로부터 선택될 수 있는, 인간의 장내에 있는 하나 이상의 본래 유익한, 비독성 세균일 수 있다.

일 예로서, 바람직한 균주는 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 비피도박테리움 인판티스(Bifidobacterium infantis), 비피도박테리움 롱검(Bifidobacterium longum), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 락토바실러스 불가리쿠스(Lactobacillus bulgaricus), 락토바실러스 카세이(Lactobacillus casei), 락토바실러스 델브루에키(Lactobacillus delbrueckii), 락토바실러스 플란타럼(Lactobacillus plantarum), 스트렙토코커스 써모필러스(Streptococcus thermophilus), 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis), 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium), 류코노스톡 시트로보룸(Leuconostoc citrovorum), 프로피오니박테리움 쉐르마니(Propionibacterium shermanii), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis), 및 바실러스 리케니포미스(Bacillus licheniformis)로 구성된 그룹의 종을 포함하나 이들에 한정되지 않는다.

전형적으로, 생균제의 종 또는 균주의 선택에 특히 한정되지 않는다. 생체 공학 및 생태학적 균형을 고려할 때, 바람직하게는 인간의 장내 서로 다른 위치에서 세포군화하고(colonize) 기능상 서로 상보적인 2개 이상(균주 9개 이하)의 생균제가 선택된다. 일예로, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve)를 포함한 비피도박테리움(Bifidobacterium), 및 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)을 포함하는 3 종류의 생균제 그룹이 본 발명에서 사용된다.

락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움(Bifidobacterium) (비피도박테리움 비피덤(Bifidobacterium bifidum), 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve)를 포함함), 및 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)이 모두 정상의 장내 플로라에 속한다고 잘 알려져 있다. 이들은 장내에서 서로 다른 부위에 위치하고 있으며 소장과 결장에서 각각 특정 부위에서 우세한 기능을 가지고 있다. 특히, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)는 바람직하게도 장내에서 비타민을 합성하고, 음식 소화를 보조하며, 숙주에서 대사작용을 용이하게 하고 숙주의 락토스 내성을 증가시키는 회장에 위치하고 이다. 비피도박테리움(Bifidobacterium)에 대해, 이것은 주로 결장에서 세포군화하고 가장 중요한 생리적 세균으로서, 숙주에서 영양물 섭취, 성장 및 발육, 생물학적 혐오 및 면역학적 기능을 용이하게 한다. 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)은 맹장에서 우세하게 발견되며 혈청내 콜레스테롤 수준을 강력하게 감소시키는 기능을 나타낸다. 말하자면, 본 발명의 이들 바람직한 3개의 생균제는 인체내에 광범위하게 분포되어 있으며 실질적인 생리적 활성을 가지고 있다. 본 발명자에 의해 상기에 설명된 3개의 생균제 선택은 본 발명의 기준으로서 작용하는 생체 공학 이론에 의해 완전히 밝혀지고 있다는 사실이 확인된다.

별도로, 상기 생균제의 생존을 용이하게 하기 위해, 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 프로피오니박테리움 쉐르마니(Propionibacterium shermanii), 및 류코노스톡 시트로보럼(Leuconostoc citrovorum)을 포함하는 3개 생균제의 그룹이 또한 사용될 수 있다. 특히, (1) 장내에서 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에 의해 생성된 과도한 락테이트는 프로피오니박테리움(Propionibacterium)에 의해 프로판산과 이산화탄소로 전환될 수 있으며, 이로서 사상균과 효모의 성장이 방지되며; (2) 내장에서 효모의 성장에 의해 생성된 유해 대사산물인 아세트알데히드를 가수분해하기 위한 알코올 탈수소 효소는 프로피오니박테리움 쉐르마니(Propionibacterium shermanii)에 의해 합성될 수 있으며; (3) 류코노스톡 시트로보럼(Leuconostoc citrovorum)은 간단한 당과 시트레이트를 동화작용하여 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)와 프로피오니박테리움 쉐르마니(Propionibacterium shermanii)의 성장에 이로운 이산화탄소를 생성할 수 있다.

본 발명에서 사용된 중국 전통 약초 조성물은 하나 이상의 식물- 또는 동물-기원 중국 약초를 가진 의약을 뜻하며, 상기 중국 약초는 변형되지 않은 기본 조직 구조를 가진 조 약물, 또는 그의 수추출물 또는 유기용액 추출물일 수 있다. 본 발명에서 사용된 유기 용액은 알코올, 이를테면 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, n-부탄올, 이소부탄올; 에테르, 이를테면 메틸에테르, 에틸 에테르, 디메틸에테르; 아세톤; 디클로로메탄; 클로로포름; 아세토니트릴; 에틸 포메이트, 에틸 아세테이트 또는 이들의 혼합물을 포함하나 이들에 한정되지 않는다. 바람직하게는, 상기 중국 약초는 환경 안전성과 발효 조작면에서 천연 의약의 수추출물이다.

약리학적 기능의 관점에서, 본 발명에 따른 시험관 내 발효에 의해 처리될 수 있는 상기한 천연 의약 조성물은 다음을 포함하지만 이에 제한되지 않는다: 생기 유지를 위한 병원균 인자를 제거하는 약제; 기 활성화에 의한 지혈; 지라 활성화 및 신장 강화; 단단한 덩어리의 연화 및 어혈의 제거; 가래 해소 및 습기 제거; 염증 완화 및 독소 제거; 정기 및 혈액의 생성; 이뇨 촉진 및 생기 활성화를 위한 약제; 또는 이들의 혼합물.

본 생균제의 배양 및 증식에 유용한 배지는 탄소 공급원, 질소 공급원, 및 필수 비타민뿐만 아니라 박테리아 성장에 필요한 미네랄을 함유하는 공지된 어떠한 종래의 배지도 사용될 수 있다. 대규모 공업적 생산 비용을 감소시키기 위해, 생산 공정은 단순화되고 배지는 콩 이소플라본, 가용성 식이섬유 및 스타치오스 및 라피노스와 같은 콩 올리고당 등이 추가로 공급된다. 콩의 싹을 달인 증류주, 효소적 단백분해적 쇠고기 브로쓰, 이스트 추출물, 탄수화물, 및 미네랄이 본 발명에서 바람직하다. 본 발명에 사용되는 배지는 증류주 배지 내에 약 25% v/v인 콩 싹 달인 증류주, 및 부가적으로 탄소 공급원(글루코스 및 수크로스), 질소 공급원(효소 분해된 브로쓰 및 이스트 추출물) 및 미네랄과 같은 기타 기본 성분을 함유한다. 본 발명의 대표적인 배지는 2.5% 효소분해된 쇠고기 브로쓰, 1.3% 이스트 추출물, 25% 콩 달인 증류주, 1.3% 글루코스, 1.3% 수크로스, 0.05% MgSO₄, 0.05%, CaCO₃, 0.03% K₂HPO₄, 0.03% KH₂PO₄, 0.03% NaCl(중량 기준, w/w)로 구성된다.

배지 내의 콩 싹 달인 증류주는 질소 및/또는 탄소 공급원이 아니고, 콩 이소플라본, 가용성 섬유 및 콩 올리고당(스타치오스 및 라피노스와 같은)의 공급원으로서의 역할을 함을 유의해야 한다. 다이진(daizin), 염료 제니테인, 및 다이드제인(daidzein)을 포함하는 식물-유래 에스트로겐은 항-자유 라디칼 효과, 혈액 지방 수준의 감소, 심혈관계 질병 위험의 감소, 내분비계 장애로 인한 폐경기 여성의 골다공증 예방과 같은 유용한 기능을 갖는다. 상기 콩 싹 달인 증류주 내에 함유되는 가용성 섬유는 장내 중성 지방 및 콜레스테롤의 흡수를 차단하고, 위-장관 연동운동을 촉진시키고, 변비를 방지하고 탄수화물의 흡수를 지연 또는 억제할 수 있다. 부가적으로, 상기 콩 싹 달인 증류주에 의해 장내 플로라 사이의 균형을 회복시키는 것이 유리한데, 왜냐하면 거기에 함유된 콩 올리고당은 장 락토바실러스(Lactobacillus)에 의해서만 사용될 수 있고, 장내 유해 박테리아에 의해서는 거의 사용될 수 없기 때문이다.

결론적으로, 본 발명의 하나의 특징은 콩 싹 달인 증류주를 생균제용 배지의 주요 성분 중의 하나로서 사용하는 것이다. 본 발명에 따른 생균제 배지 내의 콩 이소플라본 및 가용성 섬유 함량은 각각 약 20-40 μg/ml 및 30-100 μg/ml의 범위이다.

콩 싹 달인 증류주를 제조하기 위해, 본 발명의 배지 내의 주요 성분 중의 하나인, 신선하고 성숙한 콩은 콩의 조직이 팽창하기 약 5-6시간 전에 두 배 분량의 따뜻한 물 내에 담가둔다. 상기 콩은 약 25-27℃에서 약 60-72 시간동안 추가로 보존시켜 싹이 3-8 cm 길이로 자라게 한다. 결과적인 싹 및 팽창된 콩은 수집되고 싹튼 콩 리터 당 3리터의 물의 비로 테이프 물에 부가시킨다. 혼합물을 이후 오토클레이브 내에서 30분 동안 105-121℃에서 가열시킨다. 이후, 콩 싹 달인 증류주가 이중 층 필터 천을 사용하여 추가 여과시켜 얻어진다.

본 발명에 따른 배지의 또다른 주요 성분은 프로티아제-처리된 신선한 쇠고기 및 소 간 조직의 가수분해물이다. 본 브로쓰는 쇠고기 뿐만 아니라 다양한 효소가 풍부한 소 간 조직도 사용된다는 점에서 종래의 브로쓰와 다르다. 부가적으로, 돼지 또는 소 췌장으로부터 얻어진 저 트립신 제조물이 본 브로쓰의 제조 공정 중에 또한 사용될 수 있다. 효소분해된 쇠고기 브로쓰를 제조하기 위해, 선택된 쇠고기 및 간 조직은 5:2(부피)의 비로 혼합되고 이후 잘게 썬다. 이후, 잘게 썬 혼합물을 1-1.5 배의 물에 부가시키고 잘 혼합하고 추가로 약 60분 동안 약 100℃에서 가열시켰다. 아래에서 기술된 방법에 의해 제조되는 조 트립신 제조물의 부가 이전에, 상기 혼합물의 온도를 38-41℃로 냉각시킨다. 결과물은 pH 7-9 하에 서 약 1시간 동안 추가로 분해시킨다. 가수분해 후, 단백분해된 쇠고기 브로쓰가 2000rpm에서의 원심 분리 후 상청액을 수집하여 얻어진다.

조 트립신 제조물은 다음의 단계에 따라 쇠고기 및 소 간 조직으로 부터 제조된다: 먼저, 소, 말, 염소 또는 돼지와 같은 동물로부터의 췌장을 균질화시키고 이후 무수 에탄올 및 끓인 물와 1:1:3의 비로 혼합시키고, 72 시간동안 교반시키면서 추가로 보존시킨다. 얻어진 상청액의 pH를 진한 염산으로 약 5.5로 맞추기 전에, 상청액을 500 rpm에서 10분 동안 원심분리시킨 후 수집한다. 이런 식으로, 소기의 조 트립신 제조물이 얻어진다.

종래의 기술에 따라 얻어진 천연 의약 조성물의 물- 또는 유기 용액- 추출물이 기질로서 상기에서 얻어진 배지 내로 부가되고 철저히 혼합시킨다. 상기 기질 증류주 및 천연 의약추출물을 포함하는 결과의 혼합물을 약 10분 동안 끓도록 가열시키고, 이후 약 37℃로 냉각시킨다. 이 온도에서, 상기 혼합물은 인간 정상 장내 플로라의 하나 또는 그 이상의 생균제로 접종시키는데, 인간 정상 장내 플로라는 비피도박테리움(Bifidobacterium), 락토바실루스(Lactobacillus), 스트렙토코커스(Streptococcus), 엔테로코커스(Enterococcus), 프로피오늄(Propionium), 류코노스톡(Leuconostoc), 및 바실루스(Bacillus)로 구성된 그룹으로부터 선택된다. 이후 결과물을 약 37℃및 pH 6.2 하에서 약 18-24 시간 동안 추가로 발효시켰다. 발효가 종료될 때 배지 시스템은 실온까지 냉각시키고 생균제 발효에 의해 처리된 증류주(즉, 여과액) 형태의 천연 의약이 얻어지기 이전에 여과시킨다.

별도로, 본 출원과 동일자로 출원된 동시 계류 중 출원의 상세한 설명에 다르면, 천연 공급원 또는 그 혼합물로부터의 하나 또는 그 이상의 의약이 적절한 때에 총 박테리아 배지에 함입된다. 상기 공정에서, 상기 의약은 배지 내의 박테리아 또는 그 대사물에 의해 전환되거나 변형된다. 처리를 위한 상기 적절한 시간은 생균제 공동 발효 종료로부터 24시간 및 전체 발효 시스템을 가열시킴에 의해 박테리아가 죽기 전 사이이다. 이후, 결과적인 혼합물을 생리학적 조건을 흉내낸, 즉, pH 6.2, 37℃인 발효 조건 하에서 또다시 약 18시간동안 발효시켰다.

발효 중, 천연 의약 추출물 중의 하나 또는 그 이상의 성분이 혐기성 생균제 및 그 대사물에 의해 구조적으로 변형되거나 또는 대사적으로 전환될 수 있다. 이런 식으로, 천연 의약의 불활성화된 화합물은 활성화된 화합물로 전환되고, 덜 활성화된 분자는 높은 생물학적 활성을 갖는 분자 또는 수집물로 전환되고, 더욱이 높은 독성 부작용(특히 동물 유래 천연 화합물)을 갖는 일부 화합물은 독성이 적어지거나 독성이 없어진 화합물 또는 그 수집물로 전환될 것이다.

천연 항암 의약의 전환에서 생균제로서 락토바실루스 아시도필루스(Lactobacilus acidophilus), 비피도박테리움 비피둠(Bifodobacterium bifidum) 및 엔테로코커스 페아시움(Enterococcus feacium)이 상기에서 기술되었지만, 예를 들면 선택된 생균제 및 발효 프로토콜에 의존하는 특정 조건 하의 특정 천연 의약과 같이, 장내 환경을 모방하는 기타 성분을 사용하는 기타 배지 및 발효 프로토콜도 또한 전환에 유용할 수 있다.

본 발명의 하나의 구체예에서, 항암 천연 약제로서 콜라 코리 아이스니(Colla corii aisni) 및, 라딕스 아스트라갈리(radix astragal), 라딕스 레만니에(Radix rehmanniae), 라딕스 코도노프시스(Radix codonopsis), 가노데르마 루시둠(Ganoderma lucidum), 라도시아 세라(Rabdosia serra), 라딕스 스쿠텔라리에 (Radix scutellariae), 허니-프라이드 폴리움 에리아보트아(honey-fried Folium eriabotryae), 리조마 파미티스(Rhizoma phragmitis), 파리스 폴리필라(Paris polyphylla), 등을 포함하는 식물 유래 성분 및 두꺼비 피부(toadskin), 봄빅스 바트리티카투스(Bombyx batryticatus), 오스 에울로타에(Os eulotae (snail)), 스콜피온(Scorpio), 스콜로펜드라(Scolopendra (Centipede)), 도마뱀 등을 포함하는 동물 유래 성분으로 구성된 약제학적 조성물이 바람직하다. 상기 조성의 제조물은 실시예 2에서 더욱 상세히 논의될 것이다.

놀랍게도, 암의 성장 저해에 대한 어떠한 실질적인 효과도, 본 발명에 따른 생균제로 추가의 발효 없이 상기 항암 천연 의약이 실험 S 180 육종 모델 동물 또는 H22 헤파토카시노마 모델 동물에 직접 투여된 세번의 실험에서 관찰될 수 없었는데, 여기서 계산된 저해율은 30% 이하이다. 유사하게, 암 성장 저해에 대한 어떠한 검출가능한 효과도, 상기에서 기술된 발효 배양물을 그대로 투여할 경우, 심지어 상기 배양물이 상기에서 기술된 방법에 따라 제조된 상기 세 개의 생균제뿐만 아니라 콩 이소플라본 및 가용성 섬유를 포함할 때조차도 관찰되지 않았다. 또다른 경우에서, 식물- 및 동물- 유래 의약의 상기에서 언급된 수 추출물이 1:1의 비로 상기 발효 배양물에 부가되고, 이후 결과의 혼합물이 약 18-25시간 동안 39℃±1℃에서 혐기 조건 하에서 발효된다. 이런 식으로 제조된 총 천연 의약의 추출물의 생균제 발효 생성물은 암의 성장에 실질적인 저해 활성을 나타낸다는 것이 놀랍게도 발견되었다(실시예 3 및 4 참조).

어떠한 확립된 이론에 제한되고자 하지 않고, 상기한 결과는 천연 의약, 특히 공지되거나 비공지된 구조를 갖는 일부 천연 식물- 및 동물- 유래 의약이 생체 내 또는 시험관 내 정상 장내 박테리아에 의해 특정한 화학적 변형 또는 생물적-전환한 후에만 숙주에 의해 흡수될 수 있으며, 이에 의해 생물학적 활성이 기능을 유지할 수 있다는 것을 입증한다.

예시적으로, 실시예 2 및 3은 적절한 영양 배지에서 세 개의 생균제를 사용하여 발효시킴으로써 13종의 식물 유래 성분 및 6종의 동물 유래 성분의 추출물을 함유하는 약제학적 조성물의 처리 방법을 아래에서 더욱 상세히 설명한다.

부가적으로, 살아있는 암 잠복 모델 동물은 상기 항암 약제학적 조성물의 활성이 본 발명의 장내 생균제로 발효된 후, 그러한 처리를 하지 않는 동일한 약제학적 조성물에 비해 급격히 증가됨을 입증하는데도 또한 사용된다.

결과적인 본 발명의 약제학적 조성물은 종래의 화학적 요법 및 방사선 용법을 포함하는, 종래의 항암 처리에 대해 잠재적인 보조제로서 유용하고, 또한 화학적 치료 및/또는 방사선치료를 어느 정도 받는 환자에서 부작용을 감소시키거나 제거하는데도 또한 유용하다(실시예 4 및 5 참조).

암-잠복 마우스에 대한 또다른 연구에서, 항암 천연 의약은 본 발명에 따른 생균제로 공동 발효시킨 후 암에 걸린 마우스에서 면역학적 기능을 향상시키는 능력을 가짐이 추가로 입증되었다. 특히, (1) 암에 걸린 마우스 내의 대식 세포의 식균 작용 활성이 급격히 증가되고; (2) T 세포, conA의 유사분열 인자에 기인한 림프구 전환이 또한 향상된다(데이타는 제시되지 않음).

그러므로, 확립된 이론에 제한됨 없이, 본 발명자는 다양한 악성 증식성 질병의 예방 및 치료에 부가하여, 본 발명의 중국 전통 약초 의약은 포유동물, 바람직하게는 인간 내의 조혈 간 세포(stem cell)의 증식 및 발육을 촉진하는 능력을 갖는다.

동물 뿐만 아니라 세포 수준에 대한 실험의 주요 결과는 본 발명의 제조물을 투여함으로써 화학적 치료 및/또는 방사선 치료를 받는 환자의 말초 혈관 내의 호중구 및 적혈구 수준을 회복되거나 효율적으로 유지될 수 있음을 나타낸다. 부가적으로, 본 주요 실험 결과는 화학적 치료 및/또는 방사선치료에 기인한 골수 간세포의 성장 및 분화 저해의 경감에 유용한 것뿐만 아니라, 본 제조물은 다양한 백혈병 및 빈혈의 치료에도 유용함을 암시한다.

본 발명은 다음의 실시예 및 첨부된 청구범위를 조합하여 완전히 설명되는데, 첨부됨 청구범위의 범위 또는 정신을 벗어 나지 않고 수많은 변화 및 변형이 이루어질 수 있음은 당업자에게 명백하다.

실시예

실시예1. 장내 생균제의 공동-발효 배양물의 제조

설명을 위해, 본 실시예는 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 비피도박테리움 비피덤(Bifdobacterium bifidum), 및 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)의 회분식 접종에 의해 동일 배지 내에서 공동-발효 배양물을 제조하는 방법 및 공동-발효 방법을 제공한다.

1. 생균제 균주의 선택

비피도박테리움(Bifidobacterium)은 포유동물, 특히 사람 내의 가장 중요한 생리학적 박테리아의 하나로서 소장 하부 및 대장 내에서 주로 분포한다. 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve)는 사람에서의 영양, 성장, 발육, 및 면역학적 기능에 매우 중요하다. 위-장관에서, 대부분의 상기 박테리아는 회장에 위치한다. 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)에 대해서는, 락토바실러스 애시도필러스가 비타민, 특히 비타민 B의 생물학적 합성에 수반되고 식품 소화를 촉진하고, 영양 대사를 촉진 할뿐만 아니라 숙주의 락토스 내성을 향상시킨다. 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)는 맹장에 주로 위치하고 콜레스테롤의 대사를 촉진시키고 따라서 혈액 내 콜레스테롤 수준을 감소시킨다.

그러므로, 본 발명의 세가지 생균제, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 및 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)의 선택은 이들이 인간 장에 모두 널리 분포하고 생물학적 활성에 대해 서로 상보적이라는 사실에 기초한다.

본 발명의 세가지 생균제, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 및 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)는 중국 우한(Wuhan)의 China Center for Type Culture Collection(CCTCC)로부터 모두 입수가능하다. 이들 박테리아는 종래의 방법에 의해 건강한 개체 내의 장의 대소변 또는 점막으로부터 또한 분리될 수 있다.

2. 배지의 조성 및 이의 제조

배지는 다음으로 구성된다(리터 당): 25 ml의 단백분해된 쇠고기 브로쓰, 15g 이스트 추출물, 250ml 콩 싹 달인 증류주, 12g 글루코스, 13g 수크로스, 5g MgSO₄, 3g CaCO₃, 3g NaCl, 3g K₂HPO₄, 및 3g KH₂PO₄.

본 발명의 배지에 사용된 단백분해된 쇠고기 브로쓰 및 콩 싹 달인 증류주는 발명의 상세한 설명에서 기술된 방법에 따라서 제조된다. 상기 배지 내의 구성성분은 121℃에서 30분 동안 압열 멸균하여 사용하기 전에 철저히 혼합시킨다.

3. 배취 내 접종에 의한 공동 발효 방법

상기 상세한 설명에 따른 100ml의 오토클레이브된 배지는 약 40℃로 가열시키고, 이후 생물체의 습윤 중량에 기초하여 계산된 총 배지 중량에 대해 0.8%(w/w) 비율로 1000g(습윤 중량) 활성 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve)를 접종시켰다. 결과의 혼합물의 발효는 39℃에서 7.5 시간동안 혐기성 조건 하에서 수행된다. 배지의 pH 값이 5.0으로 감소될 때, 적절한 양의 0.5N NaOH 용액을 교반시키면서 부가시켜 약 6.2로 조정하고, 교반시키면서 활성화된 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)를 20분에 걸쳐 추가로 접종시켰다. 상기 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)의 양은 생물체에 대해 계산되어 약 950 g(습윤 중량)이다. 배지는 동일한 온도에서 또다시 6시간 동안 발효시킨다. 상기 배지의 pH가 다시 약 5.5로 감소되면, 0.5 N NaOH 용액을 부가시키고 이에 의해 pH 값을 6.2로 조정하고, 이후 생물체 내에서 계산된 약 850g(습윤 중량)의 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus)를 이에 접종시키고 동일한 온도에서 발효를 유지한다. 탱크 내의 총 박테리아 함량이 약 3.5-3.8로 감소된 pH와 함께 6.5 × 10⁸/ml 이상으로 도달되면, 배지의 온도를 순환수의 온도를 조절하여 이후 약 32℃로 냉각시키고, 발효 생성물의 생물학적 전환이 이루어지도록 약 2 시간동안 유지한다.

일단 발효가 완료되면, 상기에서 기술된 바와 같이 얻어진 생균제의 공동-발효 생성물은 특별한 응용목적에 따라서, (1) 추가로 동결건조시키기 전에 살아있는 공동-발효된 생균제를 수집하도록 원심분리시켜, 동결건조된 박테리아 분말을 함유하는 고형 약제 또는 영양 보조제가 얻어진다; (2) 전환되는 천연 의약의 추출물에 부가되어, 예상되는 생물학적 활성 및 기능을 갖는 본 발명의 제조물을 얻는다; 또는 (3) 약 39℃로 가열시켜 그 속의 증식 박테리아를 죽이고, 임의로 원심분리시켜 상청액을 수집함으로써, 생균제 공동-발효 생성물 및/또는 세포 파편이 얻어진다.

이렇게 얻어진 공동-발효 배양물의 상청액의 생화학적 분석 결과는 배양물의 상청액중의 가수분해된 아미노산의 함량은 23.322 mg/ml이하이었고, 여기에서, 비피도박테리움(Bifidobacterium) 및 락토바실러스(Lactobacillus)의 성장에 필요한 디설파이드 결합 함유 시스테인은 각각 1.8 mg/ml(가수분해된) 및 0.33 mg/ml(유리 형태)이다. 공동-발효 배양물의 상청액중의 총 탄수화물 함량은 약 0.04 mg/.ml이고, 여기에서, 환원된 당외에 비피도박테리움(Bifidobacterium)과 같은 생균제(probiotics)에 필수적인 올리고당 및 식이 섬유가 존재한다. 장내에서 후자는 혈당 수준을 억제하고, 변비 저하 뿐 아니라 중성 지질 및 콜레스테롤의 흡수를 방지하는 기능을 가지고 있다.

또한, 에틸 아세테이트 추출 및 HPLC 분석의 결과에 따르면, 박테리아는 콩 이소플라본의 생성물을 전환시킨다. 즉, 상기 배양물중의 상청액중의 다이아진(daidzin)은 80 mg/ml이하이다. 또한, 다양한 비타민(대부분 비타민 B, 약 40 mg/l) 및 특정양의 미네랄(P, Fe, Zn, Mg, K 및 Na를 각각 5.04, 5.36, 8.29, 88.83, 783, 283 mg/ml로 포함)이 상기 배양물중의 상청액에서 또한 발견된다.

상기 열거된 결과는 추가로 공동-발효 배양물중의 상청액이 박테리아의 성장에 필요한 모든 영양분을 제공하는 배양물 배지로서 작용할 수있다는 것을 나타낸다. 박테리아는 박테리아의 성장으로 박테리아의 대사에 의해 만들어진 산성 생성물의 축적의 결과로서 배양 시스템의 pH 값이 4.0 보다 낮게 감소될 때 까지 성장 및/또는 증식을 멈추지 않는다.

실시예 2: 항암 중국 전통 약초의 추출물의 제조

예시하기 위하여, 본 실시예는 약제의 본 공급원에 따라 각각 식물- 및 동물- 유래된 약제의 수추출물의 제조를 위한 방법을 기술한다.

1. 식물-유래된 약제의 추출물의 제조

하기 열거되고 중국 전통 약제 과학으로 통상적으로 처리된 13 종류의 성분을 5 리터 용기에서 혼합하고, 이는 라딕스 아스트라갈리(radix astragal) 12 g, 라딕스 레만니에(Radix rehmanniae) 20 g, 라딕스 코도노프시스(Radix codonopsis) 12 g, 가노데르마 루시둠(Ganoderma lucidum) 8 g, 라딕스 트리코산티스(Radix trichisanthis) 12 g, 라디옥스 글리시리제(Radiox glycyrrhizae) 5 g, 라도시아 세라(Rabdosia serra) 40 g, 라딕스 스쿠텔라리에(Radix scutellariae) 12 g, 허니-프라이드 폴리움 에리아보트아에(honey-fried Folium eriabotryae) 12 g, 리조마 파미티스(Rhizoma phragmitis) 12 g, 파리스 폴리필라(Paris polyphylla) 12 g, 세멘 쥬글란디스(Semen juglandis) 20 g, 헤르바 헤디오티스 디퓨사에(Herba hedyotis diffusae) 12 g을 포함한다. 1600 ml의 물을 생성된 혼합물(총 189 g)에 첨가하였다. 생성된 혼합물을 1.5 시간동안 달인후, 수추출물의 처음 부분(약 500 ml)를 따라내어 얻었다. 이어서, 또다른 1200 ml의 물을 상기 달인것의 잔류물을 포함하는 동이한 용기에 첨가하였다. 물 및 잔류물의 혼합물을 또다시 약 1.0 시간동안 달인후, 수추출물의 제 2 부분(약 400 ml)를 유사하게 얻었다. 마지막으로, 1200 ml의 물을 다시 동일한 용기에 첨가하고, 잔류물과 함께 0.5 시간동안 달여, 제 3 부분의 수추출물을 얻었다. 추출된 3개 부분을 모아서, 감압하에서 응축시켜 총 약 300 ml를 얻었다.

(2) 동물-유래된 약제의 제조

중국 전통 약제 분야에서 본 분야에서 공지된 방법으로 처리된,두꺼비 피부(toadskin) 20 g, 봄빅스 바트리티카투스 (Bombyx batryticatus)8 g, 오스 에울로타에((Os eulotae (snail)) 6 g, 스콜피온(Scorpio) 4 g, 스콜로펜드라((Scolopendra (Centipede)) 4 g, 도마뱀 4 g을 포함하는 천연 동물 유래된 약제의 6 종류를 2 리터 용기에 첨가하고, 혼합했다. 이 후 350 ml 물을 이에 첨가하고, 혼합물을 실온에서 약 12 시간 동안 담가 둔다. 거의 2분동안 1000 rpm에서 조직 분쇄기로 잘게 썰고, 분쇄된 혼합물을 약 15 시간동안 달였다. 수추출물을 따라 내었다. 또다른 250 ml 물을 첨가하고, 이어서 약 1시간동안 달여 제 2의 수추출물을 얻었다. 두 추출물을 모아서, 또다시 4-층 여과 장치로 여과하였다. 실온으로 냉각시킨후, 생성된 여과액을 30 g 콜라 코리 아이스니(Colla corii aisni)에 첨가하고, 첨가된 콜라 코리 아이스니(Colla corii aisni)가 용융될 때 까지 약 80℃로 가열하고, 이어서 감압하에서 응집시켜 총 200 ml로 만들었다.

실시예 3 : 장내 생균제(probiotics)에 의한 항암 천연 약제의 추출물로의 생물학적 전환

예시의 방법으로, 본 실시예는 장내 생균제에 의한 두 개 과정(하기에 상술됨)으로 천연 약제의 추출물 및/또는 그의 발효 생성물의 생물학적 전환을 위한 방법을 기술한다.

1. 실시예 1에 기술된 방법에 따라 제조된 비피도박테리움 부레베(Bifidobacterium breve), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 및 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)의 공동-발효 배양물을 제조하였다. 배양물중의 총 박테리아 양이 7.0 x 10⁸/ml 초과에 이를 때, 배양물을 상기 천연 약제의 생물학적 전환을 실질적으로 달성하기 위하여 약 2 시간동안 32℃하에서 살아있는 박테리아와 배합하여 유지시킨다. 이어서, 반응 시스템으로서 전 배양 혼합물을 약 39℃로 가열하고, 박테리아를 불활성화시키기 위하여 약 6시간동안 유지시켰다. 임의로 죽은 박테리아 및 큰 세포 조각을 원심 분리(10000 x g, 20분)에 의해 제거하였다. 상기 기술된 방법에 따라 천연 식물-유래된 약제 및 동물-유래된 약제를 생성된 배양물에 첨가하고, 여기에서, 식물-유래 약제 및 동물 유래 약제 및 배양물의 비는 약 5:3:2이다. 생성된 혼합물을 38-40℃로 가열하고, 약 18시간동안 혐기성 조건에서 발효시켰다. 발효가 끝났을 때, 배양 배지를 모으고, 원심분리하여 상청액을 얻었다. 따라서, 본 발명에 따라 생균제에 의해 전환된 항암 약제가 얻어졌다.

2. 기술된 본 발명의 상세한 사항에 따라 제조된 새롭게 만들어진 배양 배지(25 ml의 단백분해된 쇠고기 브로쓰, 15 g 이스트 추출물, 250 ml 콩 싹을 달인 증류주 12 g 글루코즈, 13 g 슈크로즈, 5 g MgSO₄, 3 g CaCO₃, 3 g NaCl, 3 g K₂HPO₄, 및 3 g KH₂PO₄)에, 상기 기술된 천연 식물- 및 동물-유래된 약제의 무균적 추출물을 첨가하고, 여기에서, 배양 배지, 식물-유래된 약제 및 동물 유래된 약제의 비는 5:3:2이다. 추출물 및 배양 배지가 완전히 혼합되면, 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus) 및 엔테로코커스 파에칼리스(Enterococcus faecalis)를 회분식으로, 즉 실시예 1에 기술된 것과 같은 방법으로 및 양으로 접종하였다. 생성된 혼합물을 38-40℃에서 약 20시간동안 혐기성 하에 발효시켰다. 발효가 완결되었을 때, 배양 배지를 모으고, 원심분리하여 상청액을 분리하였다. 따라서, 본 발명에 따른 생균제로 전환된 항암 약제가 얻어졌다.

실시예 4: 장내 생균제의 발효 전환에 의한 항암 약제의 추출물의 생물학적 활성에 대한 효과

본 실시예는 장내 생균제에 의한 시험관내에서의 전환후 항암 천연 약제의 추출물의 생물학적 활성에 대한 개선에 관한 것이다.

암-잠복 모델 동물로서 S180 육종 또는 H22 헤파토카시노마가 피하 이식된 종 Kunming 마우스를 사용하여, 대량 투여량 또는 소량 투여량 중 하나의 방법으로 상기 장내 생균제에 의해 전환되거나 전환되지 않은 항암 천연 약제의 추출물에 관한 암 성장에 대한 억제 활성을 관찰하였다.

이를 위하여, 고체 종양 모델 동물을 얻기 위하여 약 18-25g 중량의 120 마리 마우스에 1x10⁷ 세포/ml의 S180 육종 또는 H22 헤파토카시노마(0.2 ml/마우스)를 오른쪽 겨드랑이에 피하 이식하였다. 결과적인 모델 동물을 12 그룹으로 임의로 그룹지었다. 처리 그룹의 각 동물에 천연 약제의 비발효된(1:1 희석) 또는 발효된(1:4로 희석) 추출물을 매일 경구 투여하였다.

네가티브 대조군 그룹의 동물에는 동일한 양의 테이프 물을 투여하고, 포지티브 대조군 그룹에서는, 동물에 화학적 합성 항암제, 사이클로포스파미드(CTX)를 피하투여하였다.

천연 약제의 추출물의 투여는 암 세포 이식날로부터 4일째, 즉, 고체 종양이 손으로 잡히는 시기에 시작하였다. 10일에 걸쳐 계속 투여후, 동물 및 고체 중량을 각각 측정하고, 이어서 암의 억제율을 계산하였다. 암의 두가지 형에 대한 치료 시험은 3중으로 수행하였다. S180 육종 보유 동물 모델 또는 H22 헤파토카시노마 보유 동물 모델에 대한 실험 결과가 표 1 및 표 2에 각각 열거된다.

표 1 : 장내 생균제의 공동발효 배양물에 의해 전환되거나 비전환된 항암 약제의 추출물에 관련하여 S180 육종 보유 마우스 모델에 대한 억제 활성 효과의 결과

* 열거된 데이터는 3중 실험의 결과의 평균±표준 오차(X±SD)이다.

표 2 : 장내 생균제의 공동-발효 배양물에 의해 전환되거나 비전환된 항암 약제의 추출물에 관련하여 H22 헤파토카시노마 보유 마우스 모델에 대한 억제 활성 효과의 결과

처리 실험에서, 시험된 샘플의 억제율이 30%보다 높으면, 상기 샘플은 항암(또는 암 억제) 활성을 갖는 것으로 여겨지고, 그렇지 않으면, 상기 샘플은 항암(또는 암 억제) 활성을 갖지 않는다. 표 1 및 2에서 열거된 데이터에 따르면, 장내 정상적 플로라 또는 그의 대사물, 식물- 및 동물-유래된 약제의 추출물에 의해 생물학적 변환을 받지않은 것은 억제율이 단지 10.5 내지 29.5%인 통계적으로 유의적인 항암(또는 암 억제) 활성을 나타내지 않았다. 놀랍게도, 본 발명의 장내 생균제와 공동 발효한 후, 본 발명에 따른 추출물의 생물학적 활성은 실질적으로 상승되고, 즉 억제율이 생균제 및 그의 대사물의 생화학적 구조 변형 및 효소적 전환에 기인하여 40% 초과하였다.

실시예 5.

통상적인 화학적 치료 및 암에 대한 방사선 치료에 대한 장내 생균제 및 그 의 대사물에 의해 전환되거나 변형된 항암 천연 약제 제조물의 효과

본 실시예에서, 상기 기술된 암-잠복 마우스 모델을 사용하여, 다음 결과가 얻어진다.

(1) 암에 대한 통상적인 화학적 치료 및 방사선 치료에 대한 발효된 천연 약제 제조물의 상승 효과가 본 제조물이 통상적인 화학적 치료 및 방사선 치료를 수반하여 투여 됐을 때, 관찰되었고;

(2) 통상적인 화학적 및 방사선 치료법에 의해 야기되는 독성 또는 부작용을 방지 또는 완화하는 것과 관련하여 본 발명의 능력이 또한 확인되었다.

1. 상기 목적을 위하여, 약 18-22g 중량의 80마리 마우스(반은 수컷, 반은 암컷)에 고체 종양 모델 마우스를 얻기 위하여 염수중의 H22 헤파토카시노마의 현탁액(1:3 희석, 1 x 10⁷ 세포/ml, 0.2 ml/마우스)을 오른쪽 겨드랑이에 피하 이식하였다. 결과적인 모델 마우스를 임의로 8개 그룹으로 그룹지웠다.

처음 4개 그룹에서 각 마우스를 항암 화학제, 플리오로우라실(5-Fu, 15 mg/kg)의 효력에 대한 본 천연 약제 제조물의 효과를 관찰하기 위하여 처리하고, 나머지 4개 그룹중의 마우스는 암에 대한 방사선 치료 효력에 대한 본 조성물의 효력에 대해 관찰되었다(전 신체에 대한 ⁶⁰Co 방사선 조사, 4.5 그레이/일/동물).

양 동물 그룹(각 그룹에서의 4개의 소집단)에 대한 조합 치료는 종양 세포 이식 다음날로부터 출발하여 7일동안 계속하였다. 특히, 소집단 2중의 동물에는 본 제조물을 투여하였고, 소집단 4의 동물은 항암 화학적 제제의 투여 또는 ⁶⁰Co 방사선 조사(처리 그룹)와 조합하여 본 제조물로 처리하였다; 반면에, 소집단 3중의 동물에는 항암 화학제를 피하 주사하거나 ⁶⁰Co 방사선 조사(포지티브 대조군 그룹) 하였고, 소집단 1중의 동물에는 동 부피의 물을 주사하거나 ⁶⁰Co 방사선 조사의 온화한 투여량을 주었다(네가티브 대조군 그룹).

7일에 걸쳐 연속적으로 투여후, 동물 및 고체 종양의 중량을 각각 측정하고, 이어서, 암의 억제률을 계산하였다. 암에 대한 화학적 치료법 또는 방사선 치료에 대한 본 조성물의 상승 효과가 하기의 Burgi의 교정 등식에 따른 억제율로 계산되었다.

Q=E(A+B)/EA+EB-EAxEB

여기에서, E(A+B)는 조합된 치료의 암 억제율이고, EA 및 EB는 본 조성물 투여, 또는 화학적 치료(또는 방사선 치료) 단독의 암 억제율이다.

결과: (1) Q가 0.85보다 낮으면, 이는 조합된 치료사이에 항원 효과(antigenic effect)로 여겨지고; (2) Q가 0.85 내지 1.15 사이이면, 이는 가법의 효과로 여겨지며, (3) Q가 1.15 이상이면, 이는 조합된 치료사이에 상승 효과가 있는 것으로 여겨진다. 각각의 결과가 각각 표 3 및 표 4에 열거된다.

표 3 암-잠복 마우스(H22 헤파토카시노마)에 대한 항암 화학제와 조합한 본 제조물의 치료 효과의 결과

* Q=0.99, 5-Fu와 조합된 본 제조물의 투여시 암 보유 마우스(H22 헤파토카시노마)에 대한 가법의 효과이다.

표 4 암-보유 마우스(H22 헤파토카시노마)에 대한 방사선치료(⁶⁰Co 방사선 조사)와 조합한 본 제조물의 치료 효과의 결과

* Q=0.93, ⁶⁰Co 방사선 조사와 조합된 본 제조물의 투여시 암-보유 마우스(H22 헤파토카시노마)에 대한 가법 효과이다

표 3 및 4에 열거된 데이터로부터 결론진 바, 암에 대한 통상적인 화학적 치료 또는 방사선 치료와 함께 본 항암 제조물에 의한 조합 치료의 효과는 암 억제율에서 단일 치료 단독의 것보다 훨씬 우수하다. 또한, 이러한 조합 치료는 0.85 내지 1.95의 Q값으로부터 추론된 가법 효과를 갖는다.

2. 다른 한편, 약 18-22 g 중량의 80마리 마우스(반은 수컷, 반은 암컷)를 각 그룹에는 4개 소집단을 두어 2개 그룹으로 임의로 그룹지었다.

처리 그룹(소집단 3 및 4)의 동물은 매일 본 발명에 따른 항암 제조물의 중간 투여량 또는 소량 투여량으로 7일동안 계속 섭취시키고, 동시에 (1) 항암 화학제, 사이클로포스파미드(CTX)를 첫날 단일 투여량으로(60 mg/Kg) 대상 동물에 투여하였다(표 5 참조); 또는 (2) ⁶⁰Co 방사선 조사(4.5 그레이)를 7일간 매일 계속하였다.

네가티브 대조군 그룹(소집단 1)의 동물에는 동부피의 물이 제공되고, 포지티브 그룹(소집단 2)에는 동등량의 화학제 또는 방사선 치료제 단독이 제공되었다. 7일후, 헤모글로빈의 함량 및 백혈구(WBC), 적혈구(RBC) 및 혈소판(BPC)의 계수가 꼬리 정맥으로부터의 말초 혈액을 샘플링한후 결정되었다. 그 결과가 표 5 및 6에 나타나 있다.

표 5 화학적 치료에 의해 야기된 말초 혈액에서의 혈액상 손상에 대한 본 제조물의 보호 효과의 결과

표 6 방사선 치료에 의해 야기되는 말초 혈액에서의 혈액상 손상에 대한 본 제조물의 보호 효과의 결과

화학제, CTX, 및 ⁶⁰Co 방사선 조사는 대상 동물에서 조혈 시스템을 파괴하여 WBC, RBC, Hb, 및 BPC의 파괴를 일으키고, 여기에서, WBC의 양 및 Hb 함량은 방사선 치료에 의해 강하게 영향을 받는다. 이는 표 5 및 6에 있는 결과에 의해 방사선 치료 또는 화학적 치료에 의해 야기된 상기 손상이 본 발명에 따른 생균제의 발효에 의해 처리된 본 제조물에 의해 효과적으로 제거되거나 개선될 수 있다는 것이 나타난다.

실시예 6: 인간 골수 세포의 증식에 대한 본 제조물의 효과

예시의 목적으로, 본 실시예는 인간 골수 세포의 증식에 대한 본 제조물의 효과를 기술한다. 여기에서, 상기 조성물은 장내 생균제 및 그의 대사물에 의해 전환되거나 변형된다.

감소된 T 세포 비접착 인간 골수 세포의 세포 배양물을 15% 인간 혈청 알부민으로 보충된 한천 평판에 40,000 세포/평판의 양으로 평판 배양하고, 0.5 ml의 본 제조물이 첨가되었다. 평판을 5% CO₂, 5% O₂ 환경에서 10일 동안 인큐베이션 했다. 인큐베이션 종료시, 세포군집의 수를 도립 현미경을 사용하여 계수하였고, 결과는 과립형 백혈구, 적혈구, 단핵세포, 및 대식세포 세포군의 CFU-GEMM로; 과립형 백혈구-대식세포 세포군의 CFU-GM로; 및 적혈구 세포군에 대한 CRU-E로 세포군 형성 단위로 표현된다.

본 발명의 천연 약제 조성물 또는 시토킨(과립형 백혈구 세포군 자극 인자, G-CSF)의 보충없이 각 평판에 바탕으로 1 단위 에포에틴(epoetin)을 첨가하고, 적혈구의 세포군 단위를 계수하여 결정하였다. 상업적으로 사용되는 G-CSF(1000 pg/ml) 및 GM-GSF(1200 pg/ml)이 포지티브 대조군으로 사용되고, PBS 완충제(1 ml)가 네가티브 대조군으로 사용되었다. 결과가 표 7 에 나타나 있다.

표 7은 인간 골수 세포의 증식에 대한 천연 약제 조성물의 효과의 결과

Claims

천연 의약 추출물을 함유하는 배양 배지에 장내 생균제(probiotics)를 접종하고, 상기한 것을 공동-발효(co-fermentation)에 의해 배양하는 것을 포함하며,

상기 장내 생균제는 비피도박테리움 브레베(Bifidobacterium breve), 락토바실러스 애시도필러스(Lactobacillus acidophilus), 및 엔테로코커스 파에시움(Enterococcus faecium)으로 구성된 그룹으로부터 선택되며;

상기 천연 의약은 콜라 코리 아이스니(Colla corii aisni), 라딕스 아스트라갈리(radix astragal), 라딕스 레만니에(Radix rehmanniae), 라딕스 코도노프시스(Radix codonopsis), 가노데르마 루시둠(Ganoderma lucidum), 라도시아 세라(Rabdosia serra), 라딕스 스쿠텔라리에 (Radix scutellariae), 허니-프라이드 폴리움 에리아보트아(honey-fried Folium eriabotryae), 리조마 파미티스(Rhizoma phragmitis), 파리스 폴리필라(Paris polyphylla), 두꺼비 피부(toadskin), 봄빅스 바트리티카투스(Bombyx batryticatus), 오스 에울로타에(Os eulotae (snail)), 스콜피온(Scorpio), 스콜로펜드라(Scolopendra (Centipede)) 및 도마뱀으로 구성된 그룹으로부터 선택되는, 천연 의약 제제의 제조방법.
제1항에 있어서, 장내 생균제의 공동-발효 배양물을 제조한 후; 배양 배지에 천연 의약의 기제조된(pre-made) 추출물 또는 가공되지 않은(non-processed) 천연 의약의 분말을 첨가한 후; 생성된 혼합물을 추가로 혼합하고 배양하는 단계를 포함하는 방법.
제1항에 있어서, 천연 의약의 기제조된 추출물 또는 가공되지 않은 천연 의약의 분말을 배양 배지에 첨가한 후; 생성된 혼합물에 장내 생균제를 회분식으로 접종하고 상기한 것을 공동-발효에 의해 배양하는 것을 포함하는 방법.
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제1항에 있어서, 천연 의약 제제가 천연 의약 또는 그들의 배합물의 수추출물 또는 유기용매 추출물, 또는 의약의 가공되지 않은 고형 분말인 방법.
제7항에 있어서, 유기 용매가 메탄올, 에탄올, n-프로판올, 이소프로판올, 메틸에테르, 에틸에테르, 디메틸에테르, 아세톤, 디클로로메탄, 클로로포름, 아세토니트릴, 또는 그들의 혼합물인 방법.
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