CN104522815B - 一种益生菌发酵玛咖组合物及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种益生菌发酵玛咖组合物及其制备方法和应用,该组合物由玛咖、枸杞、覆盆子经过粉碎、水提、酶解、并由多株肠道益生菌双歧杆菌和乳杆菌发酵后制得,该发酵组合物可用于制备改善性功能和抗疲劳的食品、保健品和饮品。通过对小鼠的试验和观察,证明该益生菌发酵玛咖组合物具有显著地提高小鼠的抗疲劳能力和明显的改善小鼠性功能的作用。
Description
技术领域
本发明涉及一种多株肠道益生菌发酵玛咖组合物及其制备方法,属于功能性保健饮品领域。
背景技术
玛咖(Maca,Lepidiummeyenii)原产于海拔3500—4500米的南美安第斯山区,为十字花科(Cruciferae)独行菜属(Lepidium)植物。玛咖在南美的食用历史已经有5800多年,传统上作为食物和草药,可改善性功能,提高生育力,抗疲劳,抗肿瘤和用于治疗抑郁症、哮喘症和女性更年期综合征等。中国现已经在新疆塔什库尔干县和云南丽江一带开始种植,2011年卫生部第13号公告批准玛咖粉作为新资源食品。
玛咖中含有丰富的营养成分,干燥玛咖根中含蛋白质10.2%、还原糖9-12%、碳水化合物59%,矿物质钾、钙、铁、锌的含量尤为突出。玛咖的氨基酸结构合理,其中有重要生理活性的支链氨基酸含量较高,玛咖脂肪含量不高,但不饱和脂肪酸如亚油酸、亚麻酸等在脂肪酸中的比例可达到52%以上。玛咖中的蛋白质、氨基酸、糖类物质、矿物质等对玛咖抗贫血、抗运动中血糖下降、抗疲劳等功效具有重要作用。玛咖多糖也是玛咖中含量较丰富的活性物质,玛咖多糖具有一定的清除超氧自由基及对羟自由基的抑制作用。
玛咖的生物碱是玛咖的重要次生代谢物质,玛咖酰胺和玛咖烯是1999年美国华裔植物学家ZhengBL从玛咖提取物中得到的两种活性物质,它们含氨基基团与脂肪酸形成的特殊的酰胺键,属于酰胺类生物碱。玛咖酰胺是玛咖独一无二的植物成分。玛咖烯是一种无环酮酸,极性比较小,一般易存在于玛咖的已烷或氯仿提取物中,但甲醇也可以溶解。这两种活性物质对调节人的内分泌系统有重要的作用,相当于人体的荷尔蒙,能全面调理人体机能,平衡内分泌,改善性功能。1980年,Johns等在玛咖中发现了芥子油苷(glucosinolates,β-thioglucoside-N-hydroxysulfates)和具有挥发性的异硫氰酸酯类物质。研究表明异硫氰酸酯类物质主要有异硫氰酸对甲氧基苄酯(P-methoxybenzylisothiocyanate)、异硫氰酸苄酯(benzylisothiocyanate)。芥子油苷是玛咖的一种含硫和氮的亲水性阴离子次生代谢产物,其分子中有1个多变的侧链(R)和1个硫代β-D-吡喃型葡萄糖基,芥子油苷在芥子酶或胃肠道中的细菌酶的作用下会产生氰类、唑烷硫酮、硫氰酸酯及异硫氰酸酯。据推测玛咖中的芥子油苷与异硫氰酸苄酯可能与其提高生育力和增强性功能有关,也有不少报道表明这两种物质具有抗癌效果,如它们对胃癌、食道癌、肺癌、白血病等均有一定的作用。
枸杞子为茄科植物枸杞(LyciumchinenseMill.)或宁夏枸杞(LyciumbarbarumL.)的干燥成熟果实,在我国主要产于河北和宁夏,日本,朝鲜,欧洲及北美也有分布。它在祖国传统医学中具有重要的地位,其药用价值备受历代医家的推崇。《本草纲目》记载:“枸杞,补肾生精,养肝,明目。坚精骨,去疲劳,易颜色,变白,明目安神,令人长寿。”《神农本草经》中就指出:久服坚筋骨;《名医别录》谓枸杞擅长“补益精气”,《食疗本草》也记载枸杞“能益人,去虚劳”。”现代免疫学和临床医学多项试验表明,宁夏枸杞具有提高机体免疫调节功能、抗氧化、抗衰老、抗疲劳、抗癌、抗肿瘤、降“三高”、保护肝肾和神经系统等功效,还可以加速有害物质的排泄,尤其对重金属及致癌物质的排泄速度。1988年我国卫生部正式公布枸杞既是食品又是药品。其主要含有生物碱类,黄酮及其苷类,有机酸类,香豆素类,木脂素类和枸杞多糖等活性成分。
覆盆子(RubuschingiiHu),即掌叶覆盆子,系蔷薇科(Rosaceae)悬钩子属植物,主产于浙江、福建,此外在安徽、江西、江苏等省也有分布,因其主要分布于华东又称华东覆盆子,以其未成熟干燥果实为药用部位,具有补肾、固精、缩尿之功效,用于肾虚遗尿、小便频数、阳痿早泄、遗精滑精等。现代药理研究表明,覆盆子具有温肾助阳作用、抗诱变、抗氧化、改善记忆、延缓衰老、增强免疫活性、抑菌等药理作用。此外,曾有文献报道,从大鼠、兔的阴道涂片及内膜切片可以观察到覆盆子给药后似有雌激素样作用。迄今为止,已报道的覆盆子化学成分主要有:覆盆子酸(Fupenzicacid)、鞣花酸(Ellagicacid)、β-谷甾醇、劳丹型(Labdane)二萜苷goshonosideF5、黄酮类化合物以及三萜酸等。
人体肠道中寄居着大量的微生物种群,其中益生菌对人体健康起着至关重要的作用。益生菌可以分解代谢上消化道系统不能分解代谢的食物成分,产生短链脂肪酸,为胃肠粘膜细胞提供营养物质。同时对于口服药物尤其是天然药物的某些成分可以进行分解代谢,将药物的前体物质转化成为活性药物成分而发挥作用。目前益生菌制剂主要是单纯含有活的益生菌以及益生菌菌体的制剂。
目前对于玛咖产品的开发,在国际市场上出现了玛咖酒、玛咖酱、玛咖口香糖等多种形式的玛咖产品。但现在更多地玛咖用途是将玛咖根干燥后磨成粉末或进行提取浓缩后制成保健食品和药品。国际市场上已有几十种玛咖保健产品从美国、日本、澳大利亚、西班牙、秘鲁、英国、台湾、香港等地推出,主要用于增强精力、提高生育力、改善性功能、治疗更年期综合症等。玛咖产品的开发主要是经过提取玛咖或者直接粉碎与其他成分制成产品,未见有玛咖及其组合物经益生菌发酵制成的产品。
发明内容
本发明提供了一种益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物及其制备方法,具体涉及玛咖、枸杞、覆盆子提取物经酶解、多株肠道益生菌发酵后制得的发酵组合物,以及该发酵组合物在制备用于改善性功能和抗疲劳的食品、保健食品中的应用,属于功能性保健饮品领域。
本发明的一个目的是提供一种益生菌发酵玛咖组合物,技术方案如下:
玛咖与枸杞子和覆盆子经过水提、酶解后,经益生菌发酵处理,得到益生菌发酵玛咖组合物;所述的玛咖、枸杞子、覆盆子各成分在益生菌发酵玛咖组合物中的重量g/体积ml百分比分别为:玛咖1.0-10%、枸杞子2.0-8.0%、覆盆子2.0-8.0%;所述的酶解使用的酶为高温淀粉酶;所述的益生菌为双歧杆菌和乳杆菌。
优选的,所述的玛咖、枸杞子、覆盆子各成分在益生菌发酵玛咖组合物中的重量g/体积ml百分比分别为:玛咖3.0%、枸杞子3.0%、覆盆子3.0%。
优选的,所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌或婴儿双歧杆菌;所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或植物乳杆菌。所述菌种来源于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC中国,北京)或者从正常人的粪便或肠粘膜组织中分离得到这些细菌菌株。
进一步地,为了改善组合物的口感,在益生菌发酵玛咖组合物中添加有甜味剂蔗糖和三氯蔗糖,其在益生菌发酵玛咖组合物中的重量g/体积ml百份比分别为蔗糖3.0%、三氯蔗糖0.008%。
本发明的另一个目的是提供一种益生菌发酵玛咖组合物的制备方法,包括以下步骤:
(1)粉碎:将玛咖粉碎细度在100目以上,枸杞子、覆盆子混合进行粉碎,枸杞子、覆盆子粉碎细度在10目以上,将玛咖粉与枸杞子、覆盆子粉混合,得三种原料的混合粉;
通常采用普通的粉碎技术制备玛咖、枸杞子、覆盆子混合粉,经粉碎后,药材的比表面积增加,从而更有利于药物有效成分的溶出,大大增加了药材有效成分的提取率。
(2)制备提取物:取玛咖、枸杞子、覆盆子复合粉,加入复合粉重量的10-16倍的水浸泡30分钟,于115℃左右加热40分钟高压提取,温度降至85~90℃,调节pH5.5左右,加入高温淀粉酶酶解,灭酶,过滤,减压浓缩,向过滤去除残渣的酶解提取液中添加一定量的葡萄糖和无机盐,调节pH6.5-7.0,灭菌,得到玛咖、枸杞子、覆盆子复合提取物。
(3)发酵:当玛咖、枸杞子、覆盆子复合提取物温度降至39℃左右时,接种预培养的各约体积百分比为0.5%的一种或两种及以上双歧杆菌菌液,常规培养约3~8小时后,再次接种预培养的各约体积百分比为0.5%的一种或两种及以上乳杆菌菌液,继续发酵20~22小时。当pH值降至4.2以下时,降低发酵温度至28℃,继续发酵至pH降至4.0,结束发酵,稳定化处理,即得到益生菌发酵玛咖组合物。
上述制备方法中玛咖、枸杞子、覆盆子各成分在所述的益生菌发酵玛咖组合物中的重量g/体积ml百分比分别为玛咖1.0-10%、枸杞子2.0-8.0%、覆盆子2.0-8.0%。
上述制备方法中,所述的高温淀粉酶与复合粉的比例为30-40活力单位/重量g;所述的葡萄糖加入量为重量g/体积ml比0.5%;所述的无机盐为硫酸亚铁·7H2O5.0mg/100ml、硫酸锌·7H2O4.4mg/100ml、硫酸镁·7H2O50mg/100ml。
上述制备方法中,为了改善组合物的口感,可在步骤(2)中酶解过滤后添加一定量的甜味剂,所述的甜味剂为蔗糖3.0g/100ml、三氯蔗糖0.008g/100ml。
上述制备方法中,所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌或婴儿双歧杆菌;所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或植物乳杆菌。
根据本发明的优选实施方案,益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物总糖含量为20-100mg/ml,此发酵组合物含有益生菌菌体数量为:2.0~8.0×108个/ml(显微镜血球计数器直接计数法)(参见实施例1)。
本发明的再一个目的是提供本发明的益生菌发酵玛咖组合物在制备提高机体抗疲劳和改善性功能的保健品、食品或饮品中的应用。
可将本发明的发酵组合物直接制成食品或保健食品,适于易疲劳和性功能减退的人使用。
根据本发明的一个优选实施方案,按照本发明的方法制备的发酵组合物,可应用于制备抗疲劳和提高性功能的保健品或饮品。
例如,可按照已知的常规方法,将本发明的益生菌发酵玛咖组合物或其上清液,按照已知的常规方法,添加一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性,并对基本活性成分表现有辅助或协同作用,但彼此又互不拮抗的天然或合成的其他药物成份或其混合物,配制成适于口服给药的合剂、乳剂等。
也可将本发明的益生菌发酵玛咖组合物通过适当的干燥方法,制得固体粉末,添加一种或多种具有相同、相似或不同生物学活性,并对基本活性成分表现有辅助或协同作用,但彼此又互不拮抗的天然或合成的其他药物成份或其混合物中,配制成适于口服给药的胶囊、片剂、颗粒剂等剂型的药物。
有益效果:为检测本发明的多株益生菌发酵玛咖组合物的抗疲劳和改善性功能的效果,实验观察了发酵组合物对实验小鼠的爬杆时间、游泳时间、血清尿素氮、血乳酸、肝糖原的影响。结果显示本发明的益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物可以明显的延长小鼠的爬杆时间与游泳时间,血清尿素氮与血乳酸含量明显低于对照组,肝糖原含量高于对照组,说明益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物具有显著地提高小鼠的抗疲劳能力。同时实验观察了发酵组合物对雄性小鼠的交配潜伏期和交配次数的影响,结果显示试验样品可显著的降低小鼠交配潜伏期、提高小鼠的交配次数,说明益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物具有明显的改善小鼠性功能的作用。实验同时观察比较了益生菌发酵组合物与未经益生菌发酵的组合物对小鼠抗疲劳和改善性功能的作用,结果显示,益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物的功能高于未发酵组合物,说明本发明的制备方法提高了玛咖、枸杞子、覆盆子组合物的生理功能。
具体实施方式
实施例1:益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物A的制备
取干燥的玛咖30g,粉碎过100目筛,枸杞子30g、覆盆子30g混合,粉碎,过10目筛,将玛咖粉、枸杞子粉、覆盆子粉混合加12倍水浸泡30分钟,并于115℃高压提取40分钟,将原料料液温度降至为85~90℃,用氢氧化钠调节pH为5.5左右,加入高温淀粉酶2700单位(按照淀粉酶30单位/复合粉量g),加入时先用水将酶稀释,料液搅拌均匀,维持温度85-90℃,当指示剂碘液与未酶解的相比不明显变蓝,反应终止,100℃灭酶10分钟,将酶解液200目筛布过滤离心,收集离心液,并减压浓缩至复合粉的浓度为9.0%(重量g/体积ml),得原料酶解液。向酶解液中加入葡萄糖0.5%(重量/体积)、无机盐(硫酸亚铁·7H2O5.0mg/100ml、硫酸锌·7H2O4.4mg/100ml、硫酸镁·7H2O50mg/100ml,蔗糖3.0g/100ml、三氯蔗糖0.008g/100ml。调整pH7.0左右并115℃灭菌40分钟。得玛咖、枸杞子、覆盆子复合提取物。当提取物温度降至39℃左右时,接入预培养好的两歧双歧杆菌(正常人体分离,经中国科学院微生物研究所鉴定)和短双歧杆菌(AS1.2213)菌液,接种量均为0.5%(体积/体积)。发酵6小时后再接入预培养的德氏乳杆菌(AS1.1480)和植物乳杆菌(AS1.19)菌液,接种量均为0.5%(体积/体积)。37℃继续发酵20~22小时,当pH值降至4.2以下时,降低发酵温度,继续发酵至pH降至4.0,结束发酵。60℃水浴稳定化处理4小时,即得到益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物A。此发酵组合物含有益生菌菌体数量为:3.2×108个/ml(显微镜血球计数器直接计数法),总糖含量为35mg/ml。
实施例2:益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物B的制备
取干燥的玛咖50g,粉碎过100目筛,枸杞子40g、覆盆子20g混合,粉碎,过10目筛,将玛咖粉、枸杞子粉、覆盆子粉混合加14倍水浸泡30分钟,并于115℃高压提取40分钟,将原料料液温度降至为85~90℃,用氢氧化钠调节pH为5.5左右,加入高温淀粉酶3850单位(按照淀粉酶35单位/复合粉量g),加入时先用水将酶稀释,料液搅拌均匀,维持温度85-90℃,当指示剂碘液与未酶解的相比不明显变蓝,反应终止,100℃灭酶10分钟,将酶解液200目筛布过滤离心,收集离心液,并减压浓缩至复合粉的浓度为11.0%(重量g/体积ml),得原料酶解液。向酶解液中加入葡萄糖0.5%(重量/体积)、无机盐(硫酸亚铁·7H2O5.0mg/100ml、硫酸锌·7H2O4.4mg/100ml、硫酸镁·7H2O50mg/100ml,蔗糖3.0g/100ml、三氯蔗糖0.008g/100ml。调整pH7.0左右并115℃灭菌40分钟。得玛咖、枸杞子、覆盆子复合提取物。当提取物温度降至39℃左右时,接入预培养好的两歧双歧杆菌(正常人体分离,经中国科学院微生物研究所鉴定)和青春双歧杆菌(AS1.2190)菌液,接种量均为0.5%(体积/体积)。发酵6小时后再接入预培养的嗜酸乳杆菌(AS1.1854)和植物乳杆菌(AS1.19)菌液,接种量均为0.5%(体积/体积)。37℃继续发酵20~22小时,当pH值降至4.2以下时,降低发酵温度,继续发酵至pH降至4.0,结束发酵。60℃水浴稳定化处理4小时,即得到益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物B。此发酵组合物含有益生菌菌体数量为:4.2×108个/ml(显微镜血球计数器直接计数法),总糖含量为65mg/ml。
实施例3:益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物C的制备
取干燥的玛咖80g,粉碎过100目筛,枸杞子50g、覆盆子20g混合,粉碎,过10目筛,将玛咖粉、枸杞子粉、覆盆子粉混合加16倍水浸泡30分钟,并于115℃高压提取40分钟,将原料料液温度降至为85~90℃,用氢氧化钠调节pH为5.5左右,加入高温淀粉酶6000单位(按照淀粉酶40单位/复合粉量g),加入时先用水将酶稀释,料液搅拌均匀,维持温度85-90℃,当指示剂碘液与未酶解的相比不明显变蓝,反应终止,100℃灭酶10分钟,将酶解液200目筛布过滤离心,收集离心液,并减压浓缩至复合粉的浓度为15.0%(重量g/体积ml),得原料酶解液。向酶解液中加入葡萄糖0.5%(重量/体积)、无机盐(硫酸亚铁·7H2O5.0mg/100ml、硫酸锌·7H2O4.4mg/100ml、硫酸镁·7H2O50mg/100ml,蔗糖3.0g/100ml、三氯蔗糖0.008g/100ml。调整pH7.0左右并115℃灭菌40分钟。得玛咖、枸杞子、覆盆子复合提取物。当提取物温度降至39℃左右时,接入预培养好的婴儿双歧杆菌(AS1.853)和短双歧杆菌(AS1.2213)菌液,接种量均为0.5%(体积/体积)。发酵6小时后再接入预培养的德氏乳杆菌(AS1.1480)和鼠李糖乳杆菌(AS1.22)菌液,接种量均为0.5%(体积/体积)。37℃继续发酵20~22小时,当pH值降至4.2以下时,降低发酵温度,继续发酵至pH降至4.0,结束发酵。60℃水浴稳定化处理4小时,即得到益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物C。此发酵组合物含有益生菌菌体数量为:5.8×108个/ml(显微镜血球计数器直接计数法),总糖含量为84mg/ml。
实验例1:本发明发酵组合物抗疲劳功能实验
本实施例旨在通过小鼠爬杆实验、小鼠负重游泳实验、血乳酸、血清尿素氮、肝糖原实验项目,观察多株益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物对小鼠的抗疲劳作用的影响。
取实施例制备的发酵组合物A、B、C,作为发酵供试样品,未接种发酵的同浓度的玛咖、枸杞子覆盆子组合物为各自未发酵供试样品。
实验动物:本实验选用山东中医药大学实验动物研究中心提供的1月龄健康昆明雄性二级小鼠。体重20±3g。随机分组。
剂量选择:受试物人体推荐剂量为100mL/日60kg体重的定型产品,小鼠的等效剂量相当人体推荐剂量的10倍。设人体推荐剂量的小鼠等效剂量,即食用定型产品16.7mL/日/kg日体重为中剂量,再按中剂量的0.5倍和2倍各设一个剂量组。8.3mL/日/kg体重(低剂量)、16.7mL/日/kg体重(中剂量)、和33.3mL/日/kg体重(高剂量),蒸馏水稀释后每日灌胃1.2mL,连续给予受试物25天后,测定各项指标。
仪器:爬杆架、游泳箱、754紫外分光光度计、ES-200电子天平、离心机、游泳箱、灌胃器等。
药品与试剂:尿素氮测定试剂盒(二乙酰一肟法)。
5%三氯乙酸(TCA)、葡萄糖标准液、浓硫酸、蒽酮试剂、4%硫酸铜溶液、1%氟化钠溶液、蛋白沉淀剂、1.5对羟基联苯溶液、乳酸标准液。
实验方法:
1、爬杆试验:末次给予受试物30min后,将小鼠放在爬杆架的有机玻璃棒上,使肌肉处于静力紧张状态,记录小鼠因肌肉疲劳从有机玻璃棒上跌落下来的时间。第三次跌落时中止实验。累计三次的时间为爬杆时间。
2、游泳试验:末次给予受试物30min后,给小鼠负体重5%的铅丝。将小鼠放于水深≥30cm,水温25℃的游泳箱中,记录小鼠自游泳开始至头部全部入水持续8秒不能浮出水面的时间,作为游泳时间。
3、血清尿素氮测定:末次给予受试物30min后,将小鼠放于温度为25℃的水中游泳90min,摘眼采血,取血清测定。用试剂盒法,按照表1操作。
表1
试剂 | 空白 | 标准 | 测定 |
BUN20mg/dL标准液(mL) | 0.02 | ||
样品(mL) | 0.02 | ||
二乙酰一肟应用液(mL) | 3.0 | 3.0 | 3.0 |
氯化铁-磷酸应用液(mL) | 2.5 | 2.5 | 2.5 |
充分混合,置沸水浴中煮沸10分钟,再于冷水中冷却。在520nm波长处测定,以蒸馏水调零。测定吸光度值:A标准、A样品、A空白。
4、血乳酸测定:末次给予受试物30min后,将小鼠放于温度为25℃的水中游泳60min后停止,安静15min后,摘眼采血。于5ml的离心管中加入0.48mL1%NaF溶液,准确吸取全血20uL加入试管底部。用试管上部清液清洗微量吸管数次,再加入1.5mL蛋白沉淀剂,震荡均匀,于3000r/min离心10min,取上清液,按照表2操作。
表2
空白管(mL) | 标准管(mL) | 测定管(mL) | |
沉淀剂-NaF混合液 | 0.5 | - | - |
乳酸标准应用液 | - | 0.5 | - |
样品 | - | - | 0.5 |
4%CuSO4 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
浓硫酸 | 3 | 3 | 3 |
充分混合,置沸水浴加热5min,取出后放入冰水冷却10min | |||
1.5%对羟基联苯 | 0.1 | 0.1 | 0.1 |
上述步骤完成后,摇匀,置30度水浴中30min(每隔10min振摇一次)。取出后放入沸水浴中加热90s,取出冷却至室温。在560nm处比色。空白管调零。
5、蒽酮法测定肝糖原
末次给予受试物30min后,立即处死。取肝脏用生理盐水漂洗后用滤纸吸干,精确称取肝脏200mg。加入4mLTCA,每管匀浆1min。将匀浆液倒入离心管,3000r/min离心15min,将上清液转移至另一试管内。在沉淀剂中加入4mLTCA,匀浆1min,再次离心15min,取上清液。并与第一次离心的上清液合并,充分混匀。取1mL上清液放入10ml离心管中,每管加入95%的乙醇4mL,充分混匀至两种液体间不留有界面。用干净塞子塞上,室温放置过夜。沉淀完全后,将试管于3000r/min离心15min。小心倒掉上清液并使试管倒立放置10min。用2mL蒸馏水溶解糖原。加水时将管壁的糖原洗下,震荡溶解后,取0.1ml溶液加蒸馏水0.9mL。
试剂空白:吸1mL蒸馏水到干净离心管中。
标准管:吸0.1mL标准液(含100mg/dL葡萄糖)和1.5ml蒸馏水放入同样的离心管中。
测定:将5mL蒽酮试剂用力加入各管,液流直接进入管子中央,保证充分混匀。从管子中注入蒽酮试剂时起,将管子放在冷水中,达到冷水温度后,将其浸入沸水浴15min。然后移到冰水浴,冷却到室温。将管内液体移入比色管,620nm波长,用空白管调零后测定吸光度。并测定标准管吸光度。根据肝脏重量换算成肝糖原含量(以g/100g肝表示)。
实验结果
1、小鼠爬杆试验
表3发酵组合物A、B、C与各自未发酵组合物对小鼠爬杆试验的影响(X±SD)
*与对照组相比较有显著差异(P<0.05)。
▲发酵组合物与未发酵组合物同浓度比较有显著性差异(P<0.05)。
实验结果(表3)表明,发酵组合物A、B、C各剂量组与未发酵组合物A、B高剂量组、中剂量组和未发酵组合物C高、中、低剂量组均有提高小鼠爬杆时间的作用;发酵组合物A、B、C与未发酵组合物A、B、C比较各剂量组均有显著性差异,说明益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子提取物可以提高小鼠的爬杆时间。
2、小鼠游泳试验
表4发酵组合物A、B、C与各自未发酵组合物对小鼠游泳试验的影响(X±SD)
*与对照组相比较有显著差异(P<0.05)。
▲发酵组合物与未发酵组合物同浓度比较有显著性差异(P<0.05)。
实验结果(表4)表明,发酵组合物A、B、C各剂量组与未发酵组合物A高剂量组、未发酵组合物B高、中剂量组、未发酵组合物C高、中、低剂量组均有提高小鼠游泳时间的作用;发酵组合物A、B、C与未发酵组合物A、B、C比较,各剂量组均有显著性差异,说明益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子提取物可以提高小鼠的游泳时间。
3、小鼠血清尿素氮
表5发酵组合物A、B、C与各自未发酵组合物对小鼠血清尿素氮的影响(X±SD)
*与对照组相比较有显著差异(P<0.05)。
▲发酵组合物与未发酵组合物同浓度比较有显著性差异(P<0.05)。
实验结果(表5)表明,发酵组合物A高、中剂量组、发酵组合物B、C高、中、低剂量组和未发酵组合物C高、中剂量组均有降低小鼠尿素氮的作用。
4、小鼠肝糖原
表6发酵组合物A、B、C与各自未发酵组合物对小鼠肝糖原的影响(X±SD)
*与对照组相比较有显著差异(P<0.05)。
▲发酵组合物与未发酵组合物同浓度比较有显著性差异(P<0.05)。
实验结果(表6)表明,发酵组合物A高剂量组、发酵组合物B高、中剂量组、发酵组合物C高、中、低剂量组和未发酵组合物B高剂量组、未发酵组合物C高、中、低剂量组有提高小鼠肝糖原的作用;发酵组合物B高、中剂量组与发酵组合物C各剂量组与未发酵组合物同浓度的比较有显著性差异。
2.5小鼠血乳酸
表7发酵组合物A、B、C与各自未发酵组合物对小鼠血乳酸的影响(X±SD)
*与1对照组相比较有显著差异(P<0.05)。
▲发酵组合物与未发酵组合物同浓度比较有显著性差异(P<0.05)。
实验结果(表7)表明,发酵组合物A、B、C与未发酵组合物A、B、C各剂量组均能使小鼠运动后血乳酸含量下降;发酵组合物A中剂量组、发酵组合物B中、低剂量组、发酵组合物C高、低剂量组降低小鼠血乳酸含量优于各相对应未发酵组合物剂量组。
小鼠爬杆试验、游泳试验、血清尿素氮、肝糖原、血乳酸实验结果显示益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物具有一定的抗疲劳作用,并且益生菌发酵组合物与未发酵比具有更显著地作用,说明益生菌发酵可以提高玛咖、枸杞子、覆盆子组合物抗疲劳的作用。
实验例2:本发明发酵组合物改善性功能功能实验
本实施例旨在通过雄性小鼠交配潜伏期和20分中内的交配次数实验项目,观察多株益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物对小鼠的性功能的影响。
取实施例制备的发酵组合物A、B、C,作为发酵供试样品,未接种发酵的同浓度的玛咖、枸杞子覆盆子组合物为各自未发酵供试样品。
实验动物:本实验选用山东中医药大学实验动物研究中心提供的1月龄健康昆明二级小鼠(雄:雌=1:3),体重20±3g。随机分组。
剂量选择:受试物人体推荐剂量为100ml/日60kg体重的定型产品,小鼠的等效剂量相当人体推荐剂量的10倍。设人体推荐剂量的小鼠等效剂量,即食用定型产品16.7ml/日/kg日体重为中剂量,再按中剂量的0.5倍和2倍各设一个剂量组,即8.3ml/日/kg体重(低剂量)和33.3ml/日/kg体重(高剂量),每日灌胃1.2ml,连续给予受试物32天后,测定各项指标。
仪器:鼠笼、定时器。
药品与试剂:孕马血清。
检测方法:每天给雄性小鼠受试物一次,连续32天,雌性小鼠在试验前48小时肌肉注射50IU/ml孕马血清10IU0.2ml,使雌性小鼠性周期达到同步。雄性小鼠在最后一次给受试物30min后,将雌、雄小鼠合笼,并置于暗处观察。记录合笼至第一次交配的时间(交配潜伏期),以及20min内交配次数。
结果
对小鼠交配潜伏期的影响见表8.
表8发酵组合物A、B、C与各自未发酵组合物对小鼠交配潜伏期的影响(X±SD)
*与对照组相比较有显著差异(P<0.05)。
▲发酵组合物与未发酵组合物同浓度比较有显著性差异(P<0.05)。
实验结果(表8)表明,发酵组合物A、B、C与未发酵组合物A、B、C各剂量组均有降低交配潜伏期的作用;发酵组合物A高剂量组、发酵组合物B高、中剂量组、发酵组合物C高、中、低剂量组优于各自相对应未发酵剂量组。
2、对小鼠交配次数的影响
表9发酵组合物A、B、C与各自未发酵组合物对小鼠交配次数的影响(X±SD)
*与1对照组相比较有显著差异(P<0.05)。
▲发酵组合物与未发酵组合物同浓度比较有显著性差异(P<0.05)。
实验结果(表9)表明,发酵组合物A高、中剂量组、发酵组合物B、C各剂量组与未发酵组合物A高剂量组、未发酵组合物B、C各剂量组均能提高小鼠交配次数。
结论:益生菌发酵玛咖、枸杞子、覆盆子组合物具有改善性功能的作用,并且,实验说明玛咖、枸杞子、覆盆子组合物经过益生菌发酵,可以提高玛咖、枸杞子、覆盆子的组合物改善小鼠性功能的作用。
Claims (10)
1.一种益生菌发酵玛咖组合物,其特征在于,将玛咖与枸杞子和覆盆子经过水提、酶解后,经益生菌发酵处理,得到所述的益生菌发酵玛咖组合物;
所述的玛咖、枸杞子、覆盆子各成分在益生菌发酵玛咖组合物中的重量g/体积ml百分比分别为:玛咖1.0-10%、枸杞子2.0-8.0%、覆盆子2.0-8.0%;
所述组合物的制备方法如下:
(1)粉碎:将玛咖粉碎细度在100目以上,枸杞子、覆盆子混合进行粉碎,枸杞子、覆盆子粉碎细度在10目以上,将玛咖粉与枸杞子、覆盆子粉混合,得三种原料的混合粉;
(2)制备提取物:取玛咖、枸杞子、覆盆子复合粉,加入复合粉重量的10-16倍的水浸泡30分钟,于115℃加热40分钟高压提取,温度降至85~90℃,调节pH5.5,加入高温淀粉酶酶解,灭酶,过滤,减压浓缩,向过滤去除残渣的酶解提取液中添加一定量的葡萄糖和无机盐,调节pH6.5-7.0,灭菌,得到玛咖、枸杞子、覆盆子复合提取物;
(3)发酵:当玛咖、枸杞子、覆盆子复合提取物温度降至39℃时,接种预培养的体积百分比各为0.5%的一种或两种及以上双歧杆菌菌液,常规培养3~8小时后,再次接种预培养的体积百分比各为0.5%的一种或两种及以上乳杆菌菌液,继续发酵20~22小时;当pH值降至4.2以下时,降低发酵温度至28℃,继续发酵至pH降至4.0,结束发酵,稳定化处理,即得到益生菌发酵玛咖组合物。
2.根据权利要求1所述的益生菌发酵玛咖组合物,其特征在于,所述的玛咖、枸杞子、覆盆子各成分在益生菌发酵玛咖组合物中的重量g/体积ml百分比分别为:玛咖3.0%、枸杞子3.0%、覆盆子3.0%。
3.根据权利要求1所述的益生菌发酵玛咖组合物,其特征在于,所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌或婴儿双歧杆菌;所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或植物乳杆菌。
4.根据权利要求1-3任一项所述的益生菌发酵玛咖组合物,其特征在于,在益生菌发酵玛咖组合物中还添加有甜味剂,所述的甜味剂为蔗糖和三氯蔗糖,其在益生菌发酵玛咖组合物中的重量g/体积ml百份比分别为蔗糖3.0%、三氯蔗糖0.008%。
5.权利要求1所述的益生菌发酵玛咖组合物的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)粉碎:将玛咖粉碎细度在100目以上,枸杞子、覆盆子混合进行粉碎,枸杞子、覆盆子粉碎细度在10目以上,将玛咖粉与枸杞子、覆盆子粉混合,得三种原料的混合粉;
(2)制备提取物:取玛咖、枸杞子、覆盆子复合粉,加入复合粉重量的10-16倍的水浸泡30分钟,于115℃加热40分钟高压提取,温度降至85~90℃,调节pH5.5,加入高温淀粉酶酶解,灭酶,过滤,减压浓缩,向过滤去除残渣的酶解提取液中添加一定量的葡萄糖和无机盐,调节pH6.5-7.0,灭菌,得到玛咖、枸杞子、覆盆子复合提取物;
(3)发酵:当玛咖、枸杞子、覆盆子复合提取物温度降至39℃时,接种预培养的体积百分比各为0.5%的一种或两种及以上双歧杆菌菌液,常规培养3~8小时后,再次接种预培养的体积百分比各为0.5%的一种或两种及以上乳杆菌菌液,继续发酵20~22小时;当pH值降至4.2以下时,降低发酵温度至28℃,继续发酵至pH降至4.0,结束发酵,稳定化处理,即得到益生菌发酵玛咖组合物。
6.根据权利要求5所述的益生菌发酵玛咖组合物的制备方法,其特征在于,所述的玛咖、枸杞子、覆盆子各成分在益生菌发酵玛咖组合物中的重量g/体积ml百分比分别为:玛咖1.0-10%、枸杞子2.0-8.0%、覆盆子2.0-8.0%。
7.根据权利要求5所述的益生菌发酵玛咖组合物的制备方法,其特征在于,步骤(2)所述的高温淀粉酶与复合粉的比例为30-40活力单位/重量g;所述的葡萄糖加入量为重量g/体积ml比0.5%;所述的无机盐为硫酸亚铁·7H2O5.0mg/100ml、硫酸锌·7H2O4.4mg/100ml、硫酸镁·7H2O50mg/100ml。
8.根据权利要求5所述的益生菌发酵玛咖组合物的制备方法,其特征在于,步骤(2)中酶解过滤后还添加一定量的甜味剂,所述的甜味剂为蔗糖3.0g/100ml、三氯蔗糖0.008g/100ml。
9.根据权利要求5-8任一项所述的益生菌发酵玛咖组合物的制备方法,其特征在于,步骤(3)所述的双歧杆菌选自两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、青春双歧杆菌或婴儿双歧杆菌;所述的乳杆菌选自嗜酸乳杆菌、德氏乳杆菌、干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌或植物乳杆菌。
10.权利要求1-4任一项所述的益生菌发酵玛咖组合物在制备提高机体抗疲劳和改善性功能的保健品或食品中的应用。
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