CN109528814A - 一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂及其制备方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物发酵中药技术领域，尤其涉及一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂及其制备方法和应用。一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，所述微生态制剂是由保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌在含有黄芪粉的发酵基质上制备而成，其中所述发酵基质按质量百分比计包括以下成分：黄芪粉1~20%，乳粉5~20%，蔗糖1~5%，酵母提取物0.01~0.5%。本发明微生态制剂通过微生物发酵黄芪粉，并选择合适的发酵温度和发酵时间，提高黄芪和益生菌的协同作用。本发明微生态制剂作为保健食品或功能性饮料，可用于缓解体力疲劳，改善机体新陈代谢，促进胃肠功能，增强机理免疫力。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵中药技术领域，尤其涉及一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂及其制 备方法和应用。
技术背景
在现代生活中，人们工作及生活的节奏日益加快，长期处于高压、精神紧张的状态，人 们经常发现自己精力不足，记忆力下降，思维迟钝，继而出现全身疲劳。疲劳发生后如果得 不到及时消除，将会逐渐积累，最终导致过劳，出现过度训练综合症和慢性综合症等，使机 体发生内分泌紊乱、免疫力下降，甚至出现器质性病变，成为威胁人类身心健康的重要因素。
传统中医理论认为疲劳多是耗气而虚、精血不足、水火不济所致，在《素问宣明五气篇》 中有“久视伤血，久卧伤气，久坐伤肉，久立伤骨，久行伤筋”之注，阐明了疲劳与脏腑机能 的密切关系。现代医学认为疲劳发生的机制是能源耗竭、代谢物堆积、内环境稳定性失调共 同作用导致的外在机体表现。
黄芪来源于豆科植物荚膜黄芪或蒙古黄芪的干燥根。是百姓经常食用的纯天然品，产于 中国华北诸省。清朝宫廷内称其为“补气诸药之最”，民间也流传着“常喝黄芪汤，防病保健康” 的顺口溜，意思是说经常用黄芪煎汤或用黄芪泡水代茶饮，具有良好的防病保健作用。自2002 已是我国保健食品原料(卫法监发【2002】51号)。具有补气固表，利尿托毒，排脓，敛疮 生肌的功效。用于气虚乏力，食少便溏，中气下陷，久泻脱肛，便血崩漏，表虚自汗，痈疽 难溃，久溃不敛，血虚萎黄，内热消渴。《本草逢原》载“黄芪能补五脏诸虚，治脉弦自汗， 泻阴火，去肺热，无汗则发，有汗则止”的功效。现代药理研究发现，黄芪中含有黄芪皂苷、 黄芪多糖、异黄酮类等化合物、硒元素及多种氨基酸，可参与多种机体的代谢。在临床使用 中，药理作用主要有调节免疫力、抗疲劳。其作用机制为黄芪能增强网状内皮系统的吞噬功 能，使血白细胞及多核白细胞数量明显增加，使巨噬细胞吞噬百分率及吞噬指数明显上升， 对体液免疫和细胞免疫均有促进作用。黄芪多糖能明显增加小鼠脾脏胸腺质量，对强的松龙 所致脾脏、胸腺质量减轻，有明显对抗作用。能使小鼠胸腺和脾脏内T细胞数量增加，促进 IgG的产生。能增强人体淋巴细胞、小鼠腹腔巨噬细胞和中性粒细胞的活化。其中黄酮类成 分与皂苷类成分指纹图谱色谱峰对抗疲劳呈增强作用，其药理作用是因为黄芪中黄酮类成分 有较好的清除自由基的能力和氧化活性。
乳酸菌是一类无芽孢、革兰氏染色阳性细菌的统称，是动物肠道内的常在菌，具有调节 消化道菌群平衡，提高机体免疫性能的作用，目前市场上常用的乳酸菌微生态制剂多以普通 培养基培养乳酸菌，然后以液体或粉剂形式存在。但是目前对于乳酸菌和黄芪作为添加剂的 使用通常是将二者简单的组合添加入畜禽的饲料或饮水中，或者用单一发酵菌种对黄芪药渣 及黄芪提取物的研究较多。普通的组合添加没有发挥乳酸菌的强大生物转化功能，也没有研 究发酵后中药活性成分的变化情况，更没有将其用于保健食品的开发。
中国发明专利申请(申请号201310214814.0)公开了复合中草药乳酸菌发酵饮料及其制 备方法。其制备方法包括以下步骤：a.将中草药饮片黄芪、知母、茯苓加水煎煮后过筛得到 黄芪汁、知母汁、茯苓汁，混合得到中草药药汁；b.取乳粉6～8％(w/w)、蔗糖9～11％(w/w)、 黄原胶0.6～0.8％(w/w)、水29.4～40％(w/w)、中草药药汁40.2～55％(w/w)，混合后均质灭菌， 得到混合液；c.将驯化后的嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌制备成发酵剂；d.向步骤b所得混合 液中接种发酵剂，在40～42℃下发酵即得复合中草药乳酸菌发酵饮料。本发明所生产的复合 中草药乳酸菌发酵饮料，可以提高中草药的利用率，增加饮料营养价值。该方法采用高糖发 酵，且采用中草药药汁进行发酵，无法获得黄芪原生发酵有效活性物质。
中国发明专利申请(申请号201510846425.9)提供了黄芪发酵产物及生产该黄芪发酵产 物的方法，其中，将在培养基中培养并增殖的乳酸菌引酵物或酵母引酵物接种到混合有黄芪、 糖和水的混合物中以使其发酵，然后测量通过发酵获得的发酵物料的pH，并将pH在预定范 围内的发酵物料过滤并干燥以获得黄芪发酵产物。该专利采用单一发酵菌种对黄芪进行发酵， 目的是获得黄芪发酵产物。
发明内容
为了解决上述的技术问题，本发明的第一个目的是提供一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制 剂，该微生态制剂采用保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌联合发酵黄芪，可以大幅增加有效成分 黄芪多糖。本发明的第二个目的是提供上述的微生态制剂的制备方法，本发明的第三个目的 是提供上述的微生态制剂的应用。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，所述微生态制剂是由保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌 在含有黄芪粉的发酵基质上制备而成，其中所述发酵基质按质量百分比计包括以下成分：
作为进一步改进，所述微生态制剂是由保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌在含有黄芪粉的发 酵基质上制备而成，其中所述发酵基质按质量百分比计包括以下成分：
作为进一步改进，保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌接种比例为接种比例为1％-5％，其中保 加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌比例按1:5-5:1混合，菌液浓度为OD600＝0.4-0.7之间。
作为进一步改进，所述黄芪粉为过40目以上标准筛的微粉；所述的乳粉采用脱脂乳粉或 等量鲜牛奶。
作为进一步改进，所述的保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌为经黄芪药液驯化而成；驯化过 程为以5％-50％的黄芪药液-脱脂乳梯度发酵驯化。
作为进一步改进，黄芪药液的制备如下：取一定量黄芪粉添加蒸馏水煎煮3次，合并滤 液后浓缩；菌种驯化如下：将复苏的单一乳酸菌接种至以黄芪药液-脱脂乳混合培养基中培养 至完全；取发酵液接种至更高浓度黄芪药液与脱脂乳的混合培养基中再次培养至发酵完全， 依次提高黄芪药液浓度；种子液培养如下：取驯化好的乳酸菌接种至基础MRS培养基中培养 至OD600＝0.4-0.7之间。
作为进一步改进，所述发酵温度为37-43℃，发酵时间为48-96h。
作为进一步改进，将发酵液离心分离上清，离心转速为2000-3000rpm/min。
作为进一步改进，本发明也可以添加其他的重要成分用于黄芪粉复配，或者，添加pH 调节剂用于调节发酵的pH。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用了以下的技术方案：
一种制备所述的微生态制剂的方法，该方法包括以下步骤：
步骤一：黄芪粉的制备：取蒙古黄芪中药饮片，去除残留灰尘和沙子，用中药粉碎机粉 碎；
步骤二：黄芪药液的制备：取一定量黄芪粉添加蒸馏水煎煮3次，合并滤液后浓缩；
步骤三：菌种驯化：将复苏的单一乳酸菌接种至以黄芪药液-脱脂乳混合培养基中培养至 完全；取发酵液接种至更高浓度黄芪药液与脱脂乳的混合培养基中再次培养至发酵完全，依 次提高黄芪药液浓度；
步骤四：种子液培养：取驯化好的乳酸菌接种至基础MRS培养基中培养至OD600＝0.4-0.7 之间；
步骤五：发酵培养基的制备：取一定量黄芪粉，按配方制备发酵培养基，121℃，0.1MPa 灭菌20min；
步骤六：乳酸菌发酵黄芪微生态制剂的制备：将保加利亚乳杆菌种子液和嗜酸乳杆菌种 子液按比例接入发酵培养基培养；
步骤七：乳酸菌发酵黄芪微生态制剂的分离：将发酵液离心分离上清，即得。
在本发明提供的制备一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂方法的较佳实施例中，步骤一所 述去除尘土和沙子的具体方法为将蒙古黄芪中药饮片放入干燥箱中60-70摄氏度，烘制5-6 小时，烘干后的黄芪饮片过16目筛，粉碎的黄芪粉过40目筛备用。
在本发明提供的制备一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂方法的较佳实施例中，步骤二所 述的黄芪药液煎煮方法具体为，料液比1:10，100℃回流煎煮3次，每次45min，合并滤液后 蒸发浓缩至1g/ml，即每毫升药液相当于1克鲜药。
在本发明提供的制备一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂方法的较佳实施例中，步骤三中 黄芪药液-脱脂乳培养基比例为体积比，即培养基中所含黄芪药液比例，依次使用5％、10％、 15％、20％、30％、40％、50％黄芪药液-脱脂乳培养基。
在本发明提供的制备一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂方法的较佳实施例中，步骤四种 子液配方具体为1000mLMRS培养基中含蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g，葡萄糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，pH为 6.8。种子液培养条件为50-80rpm/min，培养温度40℃。
在本发明提供的制备一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂方法的较佳实施例中，步骤五中 发酵培养基具体为每100mL蒸馏水或脱脂乳中添加黄芪粉4-10g。
在本发明提供的制备一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂方法的较佳实施例中，步骤六中 接种比例为1％-5％，其中保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌比例按1:5-5:1混合。
在本发明提供的制备一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂方法的较佳实施例中，步骤六中 发酵温度为37-43℃，发酵时间为48-96h。
在本发明提供的制备一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂方法的较佳实施例中，步骤六中 添加脱脂乳的培养基为静置培养，不添加脱脂乳的培养基发酵转速为30-80rpm/min。
在本发明提供的制备一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂方法的较佳实施例中，步骤七中 分离上清得到乳酸菌发酵液，其离心转速为2000-3000rpm/min。
在本发明提供的制备一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂方法的较佳实施例中，步骤七中 分离到的乳酸菌发酵液中乳酸菌含量≥106cfu/mL，黄芪多糖含量比水煎法提取的黄芪多糖含 量提高34.2％以上，黄芪总皂苷比水煎法提取的得率提高19.1％以上。
为了实现上述的第三个目的，本发明采用了以下的技术方案：
上述的微生态制剂用于制备缓解体力疲劳，改善机体新陈代谢，促进胃肠功能或增强机 理免疫力的保健品或食品或药品中的应用。
本制备工艺操作步骤简单，方法简便，应用广泛，不仅可以应用于黄芪，还可应用于其 他中药材，利用益生菌发酵转化，提高中药有效成分释放率，为传统中药材发挥功效的基础 上为其中注入益生菌发挥协同作用，相比直接将乳酸菌和黄芪作为添加剂的使用，或者用单 一发酵菌种对黄芪药渣及黄芪提取物的研究中，更大程度的提高了黄芪多糖等活性物质和乳 酸菌的含量，简化提取步骤，缩短生产时间，降低生产成本。
本发明制备一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂在益生菌-黄芪的转化体系中，黄芪与益生 菌中的物质相互融合、相互配伍，既保留了各自的营养、药用功能和活性成分，又有其功效 的叠加和功效成分的整合，形成了类似于传统医学中的“小复方”，它是在传统医学理论指导 下的现代生物技术产品，是传统中医理论的创新产物。
本发明制备一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂的产品可作为保健食品或功能性饮料，用 于缓解体力疲劳，改善机体新陈代谢，促进胃肠功能，增强机理免疫力，预防疾病的发生。
具体实施方式：
下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然， 所描述的实施例仅是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例， 本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明 保护的范围。
实施例1：
乳酸菌发酵黄芪微生态制剂的制备方法，所述制备乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂的方法 S1包括如下步骤：
步骤S11、黄芪粉的制备：取蒙古黄芪中药饮片，去除残留灰尘和沙子，用中药粉碎机 粉碎。
具体地，取蒙古黄芪中药饮片放入干燥箱中60-70摄氏度，烘制5-6小时，取烘干后的 黄芪饮片过16目筛，粉碎的黄芪粉过40目筛备用。
步骤S112、黄芪药液的制备：取一定量黄芪粉添加蒸馏水煎煮3次，合并滤液后浓缩。
具体地，黄芪粉与蒸馏水料液比1:10，100℃回流煎煮3次，每次45min，合并滤液后蒸 发浓缩至1g/ml，即每毫升药液相当于1克鲜药。
步骤S13、菌种驯化：将复苏的单一乳酸菌接种至以黄芪药液-脱脂乳混合培养基中培养 至完全；取发酵液接种至更高浓度黄芪药液与脱脂乳的混合培养基中再次培养至发酵完全， 依次提高黄芪药液浓度。
具体地所述黄芪药液-脱脂乳培养基比例为体积比，即培养基中所含黄芪药液比例，依次 使用5％、10％、15％、20％、30％、40％、50％黄芪药液-脱脂乳培养基进行菌种驯化发酵。
步骤S14、种子液培养：取驯化好的乳酸菌接种至基础MRS培养基中培养至 OD600＝0.4-0.7之间。
具体地种子液配方为1000mLMRS培养基中含蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母提取物5g， 葡萄糖5g，乙酸钠5g，柠檬酸二铵2g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，pH 为6.8。种子液培养条件为50-80rpm/min，培养温度40℃。
步骤S15、发酵培养基的制备：取一定量黄芪粉，按照黄芪粉：乳粉：蔗糖：酵母提取物＝75g:100g:20g:1g的配方添加适量蒸馏水至1L，混合均匀，121℃，0.1MPa灭菌20min。
步骤S16、乳酸菌发酵黄芪微生态制剂的制备：将保加利亚乳杆菌种子液和嗜酸乳杆菌 种子液按比例接入发酵培养基培养。
具体地接种比例为1％-5％，其中保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌比例按1:5-5:1混合，发酵 温度为37-43℃，发酵时间为48-96h，添加脱脂乳的培养基为静置培养，不添加脱脂乳的培 养基发酵转速为30-80rpm/min。
步骤S17、乳酸菌发酵黄芪微生态制剂的分离：将发酵液离心分离上清，即得。
具体地分离上清得到乳酸菌发酵液，其离心转速为2000-3000rpm/min。
比较以黄芪粉添加量7.5g/100mL，43℃培养48h时，接种比例为3％时，不同发酵菌种 发酵黄芪粉时发酵液粗多糖和总皂苷增率。
表1不同发酵菌种发酵黄芪粉时发酵液粗多糖和总皂苷增率
注：不含脱脂乳*接种比为保加利亚乳杆菌+嗜酸乳杆菌(1:1)，其他条件一致
本发明提供的乳酸菌发酵黄芪微生态制剂的制备方法S1的有益效果是：
本制备工艺操作步骤简单，方法简便，应用广泛，不仅可以应用于黄芪，还可应用于其 他中药材，利用益生菌发酵转化，提高中药有效成分释放率，为传统中药材发挥功效的基础 上为其中注入益生菌发挥协同作用，相比直接将乳酸菌和黄芪作为添加剂的使用，或者用单 一发酵菌种对黄芪药渣及黄芪提取物的研究中，更大程度的提高了黄芪多糖等活性物质和乳 酸菌的含量，分离到的乳酸菌发酵液中乳酸菌含量≥106cfu/mL，黄芪多糖含量比水煎法提取 的黄芪多糖含量提高34.2％以上，黄芪总皂苷比水煎法提取的得率提高19.1％以上，简化提 取步骤，缩短生产时间，降低生产成本。
实施例2:
本发明乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂在增强免疫力动物实验中的应用效果。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物：70只清洁级雄性Balb/c小鼠及鼠粮，购于河北医科大学实验动物中心。
1.1.2剂量分组：将实施例1制备的乳酸菌发酵黄芪发酵液折合生药5g/天，10g/天，20g/ 天的人体服用计量10倍作为小鼠用药剂量，设置低中高三个剂量组；以匹多莫德颗粒为阳性 药物设置阳性剂量组；以生理盐水设置空白剂量组。
1.2实验方法
1.2.1实验分组
经过一周适应性饲养后，选取18～22g，状态良好的60只小鼠，随机分为空白组、阳性 组、低剂量组、中剂量组和高剂量组共5个组，每组10只。
1.2.2小鼠免疫器官指数的测定
小鼠分组饲养，自由饮食、饮水，连续给药30天后，脱颈处死小鼠，取出胸腺、脾脏用 生理盐水漂洗干净血渍，滤纸吸干后称重。计算胸腺、脾脏指数。脾脏指数或胸腺指数＝肝重 或脾重(mg)/体重(g)。
1.2.3碳廓清实验检测单核巨噬细胞功能
小鼠分组饲养，自由饮食、饮水，连续给药30天后，放入灯箱内烤5分钟，使其尾静脉 充分扩张。按每10g体重0.1mL自小鼠尾静脉注射印度墨汁(用生理盐水稀释4倍后使用)。 准确计时带墨汁注入2min、10min后，分别在眼内眦取血20μL，立即置于装有2mL0.1％碳酸钠溶液的小试管中，混匀。处死小鼠取其肝脏和脾脏，用滤纸吸干脏器表面的血污，称重。用721型分光光度计在600nm波长处测定光密度值，以碳酸钠溶液作为空白对照。以吞噬指数表示小鼠碳廓清的能力，并按下式计算吞噬指数a。
1.2.4数据处理
数据统计学分析数据结果用SPSS 20.0统计分析软件进行单因素方差分析和多重比较， 数据统计学分析结果均以平均值±标准差表示。
2结果
2.1乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠免疫器官指数的影响
乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂小鼠连续灌胃30天后，处死小鼠摘取胸腺、脾脏，测定免 疫器官指数，结果如表1所示。由表1可以看出，就胸腺指数而言，阳性组和高剂量组与空 白组相比均有显著性差异(P＜0.05)，阳性组与高剂量组相比无显著性差异(P＞0.05)，低 剂量组和中剂量组与空白组相比均无显著性差异(P＞0.05)。脾脏指数阳性组、中剂量组和 高剂量组与空白组相比均有显著性差异(P＜0.05)，而低剂量与空白组相比无显著性差异(P ＞0.05)。即实施例1所述的乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠免疫器官指数有增强作用。
表1乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠免疫器官指数的影响(n＝10)
注：与空白组比较，*P＜0.05
2.2碳廓清试验检测乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠单核巨噬细胞功能的影响
乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂小鼠连续灌胃30天后，按1.2.3所述碳廓清试验方法，计 算吞噬指数，结果见表2。由表2可以看出，阳性组、中剂量组和高剂量组与空白组相比均 有显著性差异(P＜0.05)，中剂量组和高剂量组与阳性组相比无显著性差异(P＞0.05)，低 剂量组与空白组相比较无显著性差异(＞0.05)。即实施例1所述的乳酸菌发酵黄芪的微生 态制剂能显著提高小鼠单核巨噬细胞吞噬指数。
表2乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠单核巨噬细胞功能的影响(n＝10)
注：与空白组比较，*P＜0.05
3讨论
本实验结果表明，乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠免疫力的提高有很好的效果。
3.1乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠免疫器官指数的影响
胸腺是机体重要的淋巴器官，其功能与免疫紧密相关；脾脏是体内最大的外周免疫器官， 参与全身的体液免疫和细胞免疫。本实施例二研究发现，乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂组成 的“小复方”对小鼠免疫器官的发育起到明显的促进作用。其中胸腺指数中剂量组的比空白组 显著提高约38.5％，脾脏指数中剂量组和高剂量组分别比空白组显著提高23.4％和17.4％。胸 腺指数和脾脏指数的增加，说明乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂能促进免疫器官的发育，进而 影响了小鼠的免疫功能，且按照中剂量10g/天的人体服用量的效果较优。
3.2乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠单核巨噬细胞功能的影响
单核巨噬细胞是机体重要的免疫细胞，具有抗感染、抗肿瘤和免疫调节等重要作用，可 以非特异性的吞噬杀伤多种病原微生物及感染因子。本研究发现乳酸菌发酵黄芪的微生态制 剂能提高小鼠的单核巨噬细胞对外源入侵物的吞噬能力，提高小鼠免疫力。其中中剂量和高 剂量单核巨噬细胞吞噬指数分别比空白组提高16.3％和18.3％。单核巨噬细胞细胞吞噬指数 的增加，说明乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂能促进单核巨噬细胞的吞噬能力，进而影响了小 鼠的免疫功能，且按照高剂量20g/天的人体服用量的效果较中剂量10g/天的人体服用量的效 果更优。
实施例3:
本发明乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂在缓解体力疲劳动物实验中的应用效果。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物：70只清洁级雄性昆明小鼠及鼠粮，购于河北医科大学实验动物中心。
1.1.2剂量分组：将实施例1制备的乳酸菌发酵黄芪发酵液折合生药5g/天，10g/天，20g/ 天的人体服用计量10倍作为小鼠用药剂量，设置低中高三个剂量组；以消疲灵颗粒为阳性药 物设置阳性剂量组；以生理盐水设置空白剂量组。
1.2实验方法
1.2.1实验分组
经过一周适应性饲养后，选取18～22g状态良好的60只小鼠，随机分为空白组、阳性组、 低剂量组、中剂量组和高剂量组共5个组，每组10只。
1.2.2小鼠负重游泳实验
小鼠分组饲养，自由饮食、饮水，连续给药30天，末次给药30min后，将尾根部负荷5％体重铅皮的小鼠置于游泳箱中游泳。水深不少于30cm，水温30±2℃，记录小鼠自游泳开始至力竭的时间，为小鼠负重游泳时间。以小鼠沉下水面＞10s不能自然浮起为力竭。。
1.2.3血清尿素氮测定
小鼠分组饲养，自由饮食、饮水，连续给药30天，末次给受试样品30min后，在温度为30±2℃的水中不负重游泳90min，休息60min后摘除眼球取全血0.5mL(不加抗凝剂) 置于4℃冰箱3h，血凝固后4000rpm/min离心15min，取血清。按照南京建成生物工程研究 所血尿素氮(BUN)测试盒(乙二酰肟法)操作步骤进行测定。
1.2.4肝糖原检测
小鼠分组饲养，自由饮食、饮水，连续给药30天，末次给药30min后处死动物，取肝脏经生理盐水漂洗后用滤纸吸干，精确称取小鼠同一部位肝脏100mg。按按照南京建成生物工程研究所肝/肌糖原测定试剂盒(比色法)操作步骤进行测定。
1.2.5数据处理
数据统计学分析数据结果用SPSS 20.0统计分析软件进行单因素方差分析和多重比较， 数据统计学分析结果均以平均值±标准差表示。
2结果
2.1乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠负重游泳时间的影响
乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂小鼠连续灌胃30天后，小鼠负重游泳时间如表3所示。阳 性组、中剂量组和高剂量组与空白组比较均有显著性差异(P＜0.05)，低剂量组与空白组比 较无显著性差异(P＞0.05)。
2.2乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠血清尿素氮的影响
乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂小鼠连续灌胃30天后，测定运动90min后，休息30min， 小鼠血清中的尿素氮含量，结果如表4。阳性组、中剂量组和高剂量组与空白组比较均有显 著性差异(P＜0.05)，低剂量组与空白组比较无显著性差异(P＞0.05)。
表3乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠负重游泳时间的影响(n＝10)
注：与空白组比较，*P＜0.05
表4乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠血清尿素氮的影响(n＝10)
注：与空白组比较，*P＜0.05
2.3乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠的肝糖原影响
乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂小鼠连续灌胃30天后，末次给药30min后处死，精确称 量肝脏100mg，测定肝糖原含量，结果如表5所示。中剂量组和阳性组与空白组比较有显著 性差异(P＜0.05)，低剂量组和高剂量组与空白组比较无显著性差异(P＞0.05)。
表5乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠的肝糖原含量影响(n＝10)
注：与空白组比较，*P＜0.05
3讨论
3.1乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠负重游泳时间的影响
运动耐力的提高是抗疲劳能力加强最直接的表现，游泳时间的长短可以反应动物运动疲 劳的耐受程度。乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂的低剂量组、中剂量组和高剂量组的负重游泳 时间长短与剂量呈正相关，且中剂量和高剂量组与空白组比较有显著性差异。中剂量组和高 剂量组的负重游泳时间分比空白组延长了48.2％和224.3％。这说明乳酸菌发酵黄芪的微生态 制剂按照折合生药日用量＞10g/天可有效解了体力疲劳。
3.2乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠血清尿素氮的影响
机体长时间的、高强度的运动会导致正常的能量代谢受到破坏，加剧体内蛋白质和氨基 酸的分解代谢，从而使血中尿素含量增加。机体对负荷的适应能力越差，血中的尿素含量增 加就越明显。乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂可以促进机体维持正常的能量代谢，增强机体对 负荷的适应能力，抑制蛋白质和氨基酸的分解。中剂量和高剂量受试小鼠的血尿素氮含量比 空白组分别降低25.1％和16.7，低剂量受试小鼠比空白组虽无显著性差异，也降低了6.9％。 表明乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠负荷后的能量代谢、血尿素氮水平的维持有很好的 调节作用。
3.3乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂对小鼠的肝糖原影响
肝糖原是维持血液中葡萄糖正常水平的重要贮存物，机体抗疲劳的能力不同，其对肝糖 原的贮备能力亦不同。受试动物的肝糖原含量越高，说明该试样能通过增强肝糖原的贮备量， 以维持运动时所需的血糖水平，从而为机体提供较多的能量来达到抗疲劳的目的。乳酸菌发 酵黄芪的微生态制剂可以促进机体的肝糖原贮备量，增强机体对负荷的适应能力，维持小鼠 运动时的血糖水平。中剂量受试小鼠的肝糖原含量比空白组增加56.9％。表明乳酸菌发酵黄 芪的微生态制剂对小鼠负荷后的能量代谢、血糖水平的维持有很好的调节作用。
本发明提供的乳酸菌发酵黄芪微生态制剂产品可作为保健食品或功能性饮料，用于缓解 体力疲劳，改善机体新陈代谢，促进胃肠功能，增强机理免疫力，预防疾病的发生。
以上为对本发明实施例的描述，通过对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术 人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显 而易见的。本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实 施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施列，而是要符合与本文所公 开的原理和新颖点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂是由保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌在含有黄芪粉的发酵基质上制备而成，其中所述发酵基质按质量百分比计包括以下成分：
黄芪粉 1~20%
乳粉 5~20%
蔗糖 1~5%
酵母提取物 0.01~0.5%。
2.根据权利要求1所述的一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，其特征在于，所述微生态制剂是由保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌在含有黄芪粉的发酵基质上制备而成，其中所述发酵基质按质量百分比计包括以下成分：
黄芪粉 4~10%
乳粉 6~15%
蔗糖 2~4%
酵母提取物 0.02~0.2%。
3.根据权利要求1所述的一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，其特征在于，保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌接种比例为接种比例为1%-5%，其中保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌比例按1:5-5:1混合，菌液浓度为OD600=0.4-0.7之间。
4.根据权利要求1所述的一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，其特征在于，所述黄芪粉为过40目以上标准筛的微粉；所述的乳粉采用脱脂乳粉或等量鲜牛奶。
5.根据权利要求5所述的一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，其特征在于，所述的保加利亚乳杆菌和嗜酸乳杆菌为经黄芪药液驯化而成；驯化过程为以5%-50%的黄芪药液-脱脂乳梯度发酵驯化。
6.根据权利要求6所述的一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，其特征在于，
黄芪药液的制备如下：取一定量黄芪粉添加蒸馏水煎煮3次，合并滤液后浓缩；
菌种驯化如下：将复苏的单一乳酸菌接种至以黄芪药液-脱脂乳混合培养基中培养至完全；取发酵液接种至更高浓度黄芪药液与脱脂乳的混合培养基中再次培养至发酵完全，依次提高黄芪药液浓度；
种子液培养如下：取驯化好的乳酸菌接种至基础MRS培养基中培养至OD600=0.4-0.7之间。
7.根据权利要求1所述的一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，其特征在于，所述发酵温度为37-43℃，发酵时间为48-96 h。
8.根据权利要求1所述的一种乳酸菌发酵黄芪的微生态制剂，其特征在于，将发酵液离心分离上清，离心转速为2000-3000 rpm/min。
9.一种制备权利要求1~8任意一项权利要求所述的微生态制剂的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
步骤一：黄芪粉的制备：取蒙古黄芪中药饮片，去除残留灰尘和沙子，用中药粉碎机粉碎；
步骤二：黄芪药液的制备：取一定量黄芪粉添加蒸馏水煎煮3次，合并滤液后浓缩；
步骤三：菌种驯化：将复苏的单一乳酸菌接种至以黄芪药液-脱脂乳混合培养基中培养至完全；取发酵液接种至更高浓度黄芪药液与脱脂乳的混合培养基中再次培养至发酵完全，依次提高黄芪药液浓度；
步骤四：种子液培养：取驯化好的乳酸菌接种至基础MRS培养基中培养至OD600=0.4-0.7之间；
步骤五：发酵培养基的制备：取一定量黄芪粉，按配方制备发酵培养基，121℃，0.1 MPa灭菌20 min；
步骤六：乳酸菌发酵黄芪微生态制剂的制备：将保加利亚乳杆菌种子液和嗜酸乳杆菌种子液按比例接入发酵培养基培养；
步骤七：乳酸菌发酵黄芪微生态制剂的分离：将发酵液离心分离上清，即得。
10.根据权利要求1~8所述的微生态制剂用于制备缓解体力疲劳，改善机体新陈代谢，促进胃肠功能或增强机理免疫力的保健品或食品或药品中的应用。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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| PE01 | Entry into force of the registration of the contract for pledge of patent right | ||
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Denomination of invention: A Microecological Preparation for Lactic Acid Bacteria Fermentation of Astragalus membranaceus and Its Preparation Method and Application Effective date of registration: 20230703 Granted publication date: 20210824 Pledgee: Inner Mongolia Bank Co.,Ltd. Hohhot Ordos East Street Branch Pledgor: INNER MONGOLIA MENGTAI BIOLOGICAL ENGINEERING CO.,LTD. Registration number: Y2023150000107 |